pmid: "38717445"
title: "Melhora das comorbidades psicológicas associadas ao metaboloma em pacientes com síndrome do intestino irritável recebendo um probiótico."
authors: "Martin FP, Cominetti O, Berger B, Combremont S, Marquis J, Xie G, Jia W, Pinto-Sanchez MI, Bercik P, Bergonzelli G"
journal: "Gut microbes"
pubdate: "2024"
doi: "10.1080/19490976.2024.2347715"
source: "PMC Full Text"

Melhora das comorbidades psicológicas associadas ao metaboloma em pacientes com síndrome do intestino irritável recebendo um probiótico.

Autores

Martin FP, Cominetti O, Berger B, Combremont S, Marquis J, Xie G, Jia W, Pinto-Sanchez MI, Bercik P, Bergonzelli G

Periodico

Gut microbes (2024)

Conteudo

Melhora das comorbidades psicológicas associadas ao metaboloma em pacientes com síndrome do intestino irritável recebendo um probiótico
Resumo
Nosso estudo randomizado, controlado por placebo, recente em pacientes com Síndrome do Intestino Irritável (SII) com diarreia ou hábitos intestinais alternados mostrou que o probiótico Bifidobacterium longum (BL) NCC3001 melhora os escores de depressão e diminui a reatividade emocional cerebral. No entanto, as vias metabólicas envolvidas permanecem incertas. Esta análise teve como objetivo investigar as vias bioquímicas subjacentes aos efeitos benéficos do BL NCC3001 usando perfil metabolômico. Os pacientes receberam probiótico (1x 10^10 UFC, n=16) ou placebo (n=19) diariamente por 6 semanas. Ansiedade e depressão foram medidas usando a Escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão. A atividade cerebral em resposta a estímulos emocionais negativos foi avaliada por Ressonância Magnética Funcional. A abundância fecal do probiótico foi quantificada por qPCR. A medição quantitativa de painéis específicos de metabólitos plasmáticos hospedeiro-microbianos foi realizada por metabolômica baseada em espectrometria de massa. A abundância do probiótico nas fezes foi associada a melhorias nos escores de ansiedade e depressão e a uma diminuição na ativação da amígdala. O tratamento com probiótico aumentou os níveis de ácido butírico, triptofano, N-acetil triptofano, ácidos biliares conjugados com glicina e ácidos graxos livres. A concentração de ácido butírico correlacionou-se com menores escores de ansiedade e depressão e diminuição da ativação da amígdala. Além disso, a concentração de ácido butírico correlacionou-se com a abundância do probiótico nas fezes. Em pacientes com SII sem constipação, as melhorias nas comorbidades psicológicas e na reatividade emocional cerebral foram associadas a um aumento da abundância de BL NCC3001 nas fezes e a metabólitos plasmáticos específicos, principalmente o ácido butírico. Esses achados sugerem a importância de um probiótico prosperar no intestino e destacam o ácido butírico como um potencial marcador bioquímico que liga o metabolismo microbiano aos efeitos benéficos no eixo intestino-cérebro.
Por milênios, a medicina tradicional reconheceu as relações profundas e complexas entre o intestino e o cérebro. Mais recentemente, evidências científicas crescentes confirmaram a existência do eixo intestino-cérebro (EIC), a comunicação bidirecional entre o intestino e o cérebro que envolve vias de sinalização endócrina, neural e imunológica. Acredita-se que a microbiota intestinal interaja com essas vias e contribua com sinalização adicional, de modo que o conceito é regularmente estendido ao eixo microbiota-intestino-cérebro. A microbiota tem sido associada à modulação da homeostase intestinal e até mesmo a processos que afetam o desenvolvimento, fisiologia, comportamento e psicologia do cérebro. Foi demonstrado que bactérias intestinais produzem e degradam compostos neuroativos como aminas biogênicas, ácido γ-aminobutírico (GABA), serotonina, triptofano e ácidos graxos de cadeia curta, como o ácido butírico, que podem atingir o cérebro via circulação e a barreira hematoencefálica e/ou ativar vias neurais.
A síndrome do intestino irritável (SII) é um distúrbio digestivo comum caracterizado por dor abdominal e hábitos intestinais alterados, e é frequentemente acompanhada por comorbidades psiquiátricas. Distúrbios como a SII, anteriormente descritos como distúrbios gastrointestinais funcionais, foram recentemente definidos como distúrbios da interação intestino-cérebro. A perturbação do EIC bidirecional é cada vez mais reconhecida como um modelo conceitual da fisiopatologia da SII, envolvendo disfunção dos sistemas nervosos entérico, autônomo e central (SNC). De fato, o estresse pode desencadear o início ou agravar a gravidade dos sintomas da SII (modelo top-down). Por outro lado, os sintomas intestinais podem promover ou agravar distúrbios psicológicos (por exemplo, depressão e ansiedade) e diminuir a qualidade de vida relacionada à saúde (modelo bottom-up).
Evidências recentes obtidas de camundongos livres de germes colonizados com microbiota humana apoiam um papel das bactérias intestinais na patogênese da SII, incluindo sua comorbidade psicológica. Em múltiplos estudos caso-controle, alterações na composição e função da microbiota foram associadas a vários estados de doença, desde condições gastrointestinais até neurológicas. Postulou-se que a modulação do microbioma intestinal ou o consumo de probióticos específicos pode levar a mudanças benéficas nas funções do SNC.
Anteriormente, demonstramos que, em pacientes com SII com diarreia ou hábitos intestinais mistos, uma intervenção de 6 semanas com o probiótico Bifidobacterium longum subsp. longum (BL) NCC3001 reduziu os escores de depressão e as respostas a estímulos emocionais negativos em múltiplas áreas cerebrais, incluindo a amígdala e regiões fronto-límbicas, em comparação com o placebo. Descobrimos que os metabólitos intestinais foram alterados pelo consumo de BL NCC3001, apesar de não haver grande impacto na composição da microbiota. Notavelmente, o grupo probiótico apresentou níveis urinários reduzidos de metilaminas e metabólitos derivados da tirosina em comparação com o grupo placebo. Essas observações sugerem uma mudança no metabolismo bacteriano de aminas e aminoácidos, incluindo uma diminuição na produção do co-metabólito hospedeiro-bacteriano 4-cresol sulfato. Essa molécula inibe a dopamina β-hidroxilase, uma enzima envolvida na conversão de dopamina em noradrenalina. No entanto, os mecanismos moleculares precisos subjacentes aos efeitos benéficos do BL NCC3001 no cérebro permanecem pouco compreendidos. Aqui, aplicamos uma abordagem de perfil metabólico quantitativo direcionado para análise plasmática combinada com uma medida da abundância fecal de BL NCC3001 e as integramos com desfechos clínicos e de imagem cerebral para gerar insights mais profundos sobre os potenciais mecanismos envolvidos no efeito central do BL NCC3001.

Resultados
Pacientes do estudo e amostras biológicas
Dos 38 pacientes que completaram o estudo (BL NCC3001 = 18, placebo = 20), a análise metabolômica das amostras de sangue foi realizada nos 36 participantes cujas amostras estavam disponíveis tanto para pré quanto para pós-intervenção (BL NCC3001 = 18, placebo = 18). A abundância de BL NCC3001 nas fezes foi avaliada em 35 participantes (BL NCC3001 = 16, placebo = 19) e a ativação da amígdala foi medida em 25 participantes (BL NCC3001 = 11, placebo = 14).

Quantificação de BL NCC3001 e associação com desfechos clínicos
Abundância relativa fecal de BL NCC3001 e associações com desfechos clínicos.
Usando um ensaio de PCR quantitativo, determinamos a abundância relativa de BL NCC3001 nas fezes dos participantes (Figura 1a). Uma alta abundância de BL NCC3001 foi detectada apenas no grupo BL NCC3001, exceto por um sujeito no grupo placebo na terceira visita (final do tratamento).
A redução de dois pontos ou mais nos escores HADD (Figura 1b) ou HADA (Figura 1e) – usados como desfecho primário do ensaio – foi associada a um aumento na abundância de BL NCC3001 (teste de Wilcoxon; p = 0,003 e p = 0,034, respectivamente). A diminuição em ambos os escores (Figuras 1c e f) correlacionou-se com a abundância de BL NCC3001 (rho = 0,55, p = 6e-04 e rho = -0,4, p = 0,018, respectivamente). A diminuição da ativação da amígdala em resposta a estímulos negativos, avaliada por Ressonância Magnética Funcional (fMRI), também foi correlacionada com a abundância do probiótico (rho = -0,48, p = 0,016, Figura 1d).

Efeito da intervenção probiótica nos metabólitos sanguíneos
Gráficos de amostras e variáveis do OPLS.
Visão geral das alterações nos ácidos graxos e ácidos biliares plasmáticos.
Visão geral das alterações no triptofano plasmático, N-acetil triptofano e associações com desfechos clínicos.
Visão geral das alterações no ácido butírico plasmático e associações com desfechos clínicos e contagens fecais de BL NCC3001.
Visão geral das diferenças nos metabólitos plasmáticos de acordo com o tratamento e o tempo.
Metabólitos (unidade) Parâmetros OPLS. Concentrações sanguíneas (Média (DP)) Valor-p Pré Valor-p Pós Coeff VIP Placebo Pré Placebo Pós BL NCC3001 Pré BL NCC3001 Pós Ácido araquídico (ng/mL) 0.34 1.32 258.1 (233.6) 143.4 (142.9) 212 (143.7) 241.5 (147.6) 0.476 0.057 Ácido araquidônico (ng/mL) 0.29 1.24 74831.5 (33085.7) 73022.8 (23563.8) 85945.1 (44065.4) 95695.5 (43008.9) 0.403 0.043 Ácido butírico (ng/mL) 0.48 1.83 91.5 (45.9) 72.0 (29.6) 65 (25) 103.5 (37.2) 0.038 0.008 Ácido docosatrienoico (ng/mL) 0.26 1.28 14736.4 (6929.5) 14035.0 (6178.5) 14103.9 (4891.4) 18435.1 (7955) 0.752 0.064 Ácido eicosapentaenoico (ng/mL) 0.27 1.18 389870.2 (148890.7) 387660.8 (140034.1) 436787.9 (195879.5) 475388.7 (171320.1) 0.429 0.077 Ácido etilmetilacético (ng/mL) 0.39 1.48 30.2 (63.9) 34.5 (71.8) 33.6 (67.3) 89 (88.2) 0.881 0.050 GCA (nM) 0.43 1.63 331.2 (632.3) 258.7 (158) 385.2 (291.2) 602.2 (786.1) 0.739 0.085 GCDCA (nM) 0.47 1.76 1069.2 (1042.4) 980.8 (707.6) 1371.9 (887.7) 1807.2 (1632.6) 0.347 0.061 GUDCA (nM) −0.30 1.16 35.6 (61.1) 69.7 (128.5) 54.9 (106) 17.6 (23.4) 0.508 0.108 L-Asparagina (ng/mL) 0.21 1.17 9083.2 (4325.8) 9021.8 (4593.8) 9555.4 (2702.9) 10726 (1283.3) 0.694 0.155 L-Triptofano (ng/mL) 0.37 1.58 16181.8 (4381.5) 15788.6 (4257.6) 17504.5 (1917.2) 17740.3 (1537.6) 0.244 0.081 Ácido málico (ng/mL) −0.21 1.19 255.1 (302.9) 497.9 (679.3) 340.7 (472.3) 331.4 (404.5) 0.528 0.372 N-acetil-triptofano (ng/mL) 0.40 1.75 36953.1 (12532.5) 35349.5 (11388.5) 40921.5 (8513.5) 41968.6 (6827.7) 0.271 0.044 Ácido oleico (ng/mL) 0.24 1.35 407483.2 (119185) 372474.5 (120852.2) 377034.6 (140261.3) 447659.5 (140379.6) 0.491 0.131 Ácido palmítico (ng/mL) 0.31 1.46 166557.1 (46476.1) 156101.2 (44850.9) 169164.7 (46423.7) 189971.6 (40260.8) 0.868 0.024 Ácido esteárico (ng/mL) 0.35 1.54 126420.4 (42195.5) 117539.2 (29871.9) 123284.8 (46273.5) 141693.9 (34051.4) 0.834 0.028 TUDCA (nM) −0.38 1.46 29.1 (27.4) 51.6 (36) 26.9 (25) 30.3 (20.4) 0.806 0.052
Legenda: Coeff: Coeficiente de correlação OPLS, VIP: Importância da Variável na Projeção OPLS; valor-p: teste de Wilcoxon para amostras pareadas entre o grupo placebo e BL NCC3001 pós-intervenção.
A análise discriminante OPLS foi aplicada utilizando um componente preditivo e um componente ortogonal para modelar as diferenças metabólicas sanguíneas entre os dois grupos (Figura 2). O modelo foi estatisticamente robusto apenas para a análise pós-tratamento (R2X = 0,19, R2Y = 0,76, Q2Y = 0,26, onde R2X: variância explicada nos dados metabolômicos (metabólitos plasmáticos), R2Y: variância explicada entre grupos (placebo e probiótico) e Q2Y: robustez do modelo). Antes do tratamento, não houve diferença entre os dois grupos (Q2Y <0) (Tabela 1), e quando considerados separadamente, nenhum dos metabólitos foi significativamente diferente, exceto o ácido butírico, que foi ligeiramente maior no grupo placebo (p = 0,0378, veja abaixo). Pacientes recebendo BL NCC3001 por 6 semanas apresentaram concentrações plasmáticas mais elevadas de várias espécies de ácidos graxos (por exemplo, ácido araquidônico, palmítico e esteárico; p < 0,05, Figuras 3a–c), do aminoácido N-acetil-triptofano (p < 0,05, Figura 4d) e do ácido butírico (p < 0,05, Figura 5a), em comparação com pacientes recebendo placebo. Essas mudanças acompanharam tendências de concentrações mais elevadas do ácido graxo de cadeia ramificada ácido etilmetilacético, várias espécies de ácidos biliares conjugados com glicina, como ácido glicocólico (GCA) e ácido glicoquenodesoxicólico (GCDCA), e ácidos graxos (por exemplo, ácidos araquídico, docosatrienoico e eicosapentaenoico), e no aminoácido triptofano (p < 0,1, Figuras 3c,d,e e 4a). Pacientes recebendo BL NCC3001 também apresentaram menor concentração plasmática do ácido biliar TUDCA (p = 0,052).

Associações de metabólitos com desfechos clínicos e abundância fecal de BL NCC3001
Vários metabólitos foram associados a mudanças nos desfechos clínicos e na abundância de BL NCC3001 (Tabela Suplementar S1). Houve uma forte correlação entre os níveis de ácido butírico e a redução no escore HADD no grupo BL NCC3001 e em toda a população do estudo (rho = −0,67, p = 0,002 e rho= −0,66, p = 0,00001, respectivamente; Figura 5c). Os níveis de ácido butírico em toda a população do estudo também se correlacionaram com uma diminuição na ativação da amígdala (rho= −0,50, p = 0,016, Figura 5d) e nos escores HADA (rho= −0,35, p = 0,034, Figura 5b).
A diminuição na ativação da amígdala também foi fortemente associada a níveis plasmáticos mais elevados de triptofano (rho= −0,66, p = 0,031 e rho= −0,56, p = 0,006, respectivamente; Figura 4c), N-acetil triptofano (rho= −0,66, p = 0,031 e rho= −0,56, p = 0,006, respectivamente; Figura 4f) e do ácido graxo ácido pentadecanoico (rho= −0,66, p = 0,031 e rho= −0,55, p = 0,007, respectivamente) no grupo BL NCC3001 e em toda a população do estudo (Tabela 1). Os aumentos nos níveis plasmáticos de triptofano (rho= −0,33, p = 0,047, Figura 4b), N-acetil triptofano (rho= −0,33, p = 0,047, Figura 4e) e ácido araquídico (rho= −0,36, p = 0,029) também foram correlacionados com escores HADD reduzidos em toda a população do estudo (Tabela Suplementar S1).
O nível plasmático de ácido butírico foi positivamente associado à abundância de BL NCC3001 medida nas fezes (rho = 0,59, p = 0,016 e rho = 0,56, p = 0,00064, Figura 5e) no grupo BL NCC3001 e na população total do estudo, respectivamente.
Discussão
Mostramos anteriormente neste estudo randomizado controlado por placebo que a administração de BL NCC3001 por 6 semanas reduziu os escores de depressão e diminuiu as respostas a estímulos de medo em múltiplas áreas cerebrais envolvidas no processamento de emoções, incluindo a amígdala e regiões fronto-límbicas. Aqui, demonstramos que essas alterações foram associadas à abundância de BL NCC3001 medida nas fezes e aos níveis plasmáticos de vários metabólitos, incluindo ácido butírico, triptofano, N-acetil triptofano, ácidos biliares conjugados com glicina e ácidos graxos livres. Destes, o ácido butírico foi fortemente correlacionado com menores escores de ansiedade e depressão e diminuição da ativação da amígdala, sugerindo que ele pode desempenhar um papel fundamental no efeito benéfico do probiótico.
As medições da abundância de BL NCC3001 nas fezes revelaram que houve, de modo geral, boa adesão à ingestão do probiótico. Curiosamente, um alto nível de BL NCC3001 foi detectado em um paciente do grupo placebo ao final do tratamento. Embora Bifidobacterium longum subsp. longum seja comum na microbiota intestinal adulta, esse aumento acentuado sugere que o paciente provavelmente consumiu um produto alimentar ou suplemento probiótico contendo uma cepa muito próxima, uma vez que foi detectado pelo nosso ensaio direcionado a uma região cromossômica específica da cepa da bactéria. A assinatura genômica da cepa detectada nesta amostra foi investigada posteriormente por três ensaios de PCR direcionados a outras regiões específicas da cepa do cromossomo NCC3001 (os locais de inserção de elementos genéticos móveis), que foram todos positivos, demonstrando ainda mais a relação desta cepa com BL NCC3001 (dados não mostrados). Vale notar que o mesmo participante do estudo apresentou melhora nos escores HADD e HADA, consistente com a especificidade da cepa do efeito probiótico.
A suplementação com BL NCC3001 modulou a composição bioquímica do plasma sanguíneo, da qual apenas alguns metabólitos se alteraram e se correlacionaram com melhorias na reatividade da amígdala, ansiedade ou escores de depressão – nomeadamente ácidos biliares, ácidos graxos de cadeia curta e aminoácidos.
Entre as principais alterações metabólicas não associadas a desfechos clínicos estavam o aumento dos ácidos graxos plasmáticos, o que pode estar relacionado a outros fatores externos, como estilo de vida. Aqui, a administração de BL NCC3001 aumentou os ácidos graxos saturados e poli-insaturados (PUFAs), nomeadamente palmitato (C16), estearato (C18), araquidonato (C20:4) e oleato (C18:1), possivelmente modulando a absorção e biodisponibilidade de ácidos graxos. Pacientes com SII foram relatados como tendo uma composição distinta de ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) em biópsias intestinais e amostras de sangue. Foi demonstrado que os PUFAs regulam a função cerebral através de múltiplos mecanismos, incluindo o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, regulações neuroendócrinas e imunes. O ácido araquidônico pode impactar a fisiopatologia da depressão ao afetar o transporte de serotonina, enquanto o ácido oleico no sangue está associado a uma menor incidência de depressão, embora seus mecanismos subjacentes não sejam bem compreendidos. O BL NCC3001 aumentou os níveis de dois ácidos biliares primários, GCA e GCDCA, que se correlacionaram com a melhora nos escores de ansiedade. Os probióticos podem exercer alguns de seus benefícios, direta ou indiretamente, através de funções metabólicas relacionadas à absorção de ácidos biliares e recirculação entero-hepática, fatores que se mostraram prejudicados em 40% dos pacientes com SII. A mudança no padrão de ácidos biliares em direção a glicina-conjugados pode ser explicada por uma redução na atividade da hidrolase de sais biliares por bactérias no intestino delgado. Como a conjugação dos ácidos biliares aumenta sua solubilidade e propriedades de emulsificação lipídica, níveis mais elevados de GCA e GCDCA, e ácidos graxos no grupo BL NCC3001 podem indicar aumento da emulsificação e absorção lipídica. Estudos recentes sugeriram que os ácidos biliares têm efeitos neuroprotetores em modelos da doença de Huntington e da doença de Alzheimer. Após absorção e circulação sanguínea, os ácidos biliares podem exercer seus efeitos centrais através das vias de sinalização dos receptores de ácidos biliares FXR e TGR5. O receptor acoplado à proteína G TGR5 é expresso em várias regiões cerebrais e atua como um receptor de neuroesteroides, sugerindo uma possível interação entre neuroesteroides e ácidos biliares. Os neuroesteroides classicamente atuam modulando o tônus GABAérgico. De fato, recentemente foi demonstrado que o CDCA antagoniza os receptores GABAA e NMDA.
Nossos dados mostraram que o metabolismo do triptofano também pode desempenhar um papel importante na mediação dos benefícios centrais do BL NCC3001, uma vez que o probiótico aumentou os níveis plasmáticos circulantes tanto de L-triptofano (+8%) quanto de N-acetil-triptofano (+18%). Embora as concentrações de N-acetil-triptofano sejam mais que o dobro das de triptofano, ambos os metabólitos estão correlacionados com a diminuição da reatividade da amígdala e menor ansiedade em pacientes com SII. O triptofano, um precursor da serotonina, medeia a atividade serotoninérgica no cérebro e exerce efeitos benéficos na cognição, humor e ansiedade. O N-acetil-triptofano exerce um efeito neuroprotetor ao bloquear a neuroinflamação mediada pela substância P, reduzir o estresse oxidativo, exibir propriedades antiapoptóticas e contribuir para a melhora das funções motoras e cognitivas em modelos de doença de Parkinson. Como as concentrações plasmáticas desses aminoácidos dependem estritamente de fontes alimentares, as alterações induzidas pelo BL NCC3001 são indicativas de uma mudança no metabolismo de proteínas e aminoácidos aromáticos pela microbiota intestinal, uma característica já revelada pela perturbação do metabolismo do 4-cresol sulfato descrita anteriormente.

As alterações no ácido butírico e no ácido 2-metilbutírico plasmáticos induzidas pela intervenção probiótica são um indicador adicional de uma mudança no metabolismo de proteínas e carboidratos (incluindo fibras e carboidratos complexos) pela microbiota intestinal. Descobrimos que a concentração plasmática de ácido butírico estava correlacionada tanto com a abundância fecal de BL NCC3001 quanto com melhorias nos escores de depressão e na reatividade da amígdala. Hipotetizamos que o BL NCC3001 aumenta a produção de ácido butírico por alimentação cruzada, uma vez que as bifidobactérias são produtoras de acetato que alimentam de forma cruzada as bactérias colônicas produtoras de ácido butírico. Sabe-se que o ácido butírico reverte o comportamento depressivo, aumenta a concentração de serotonina e a expressão do BDNF e restaura as deficiências da barreira hematoencefálica. Além disso, o ácido butírico contribui para a síntese de dopamina e norepinefrina, bem como para a função dopaminérgica, modulando os genes da tirosina hidroxilase e da dopamina-β-hidroxilase. Adicionalmente, alterações relacionadas ao ácido butírico na microbiota têm sido associadas a mudanças na neuroinflamação através da modulação da ativação da microglia, o que também pode contribuir para os benefícios observados. No entanto, nenhuma das outras espécies de Bifidobacterium spp previamente testadas em um modelo murino melhorou o comportamento semelhante à ansiedade (WO2009127566). Portanto, além da contribuição do BL NCC3001 para uma cadeia de alimentação cruzada produtora de butirato, outros fatores que não são conservados em todas as bifidobactérias podem explicar a especificidade observada do efeito, como a capacidade desta cepa de sobreviver no trato gastrointestinal e/ou a produção de metabólitos distintos (aqui relatados ou não descritos).
Embora este tenha sido o primeiro ensaio randomizado a mostrar que a abundância fecal de BL NCC3001 e vários metabólitos plasmáticos estavam associados à melhora das comorbidades psicológicas em pacientes com SII, existem algumas limitações que são importantes de serem enfatizadas. Primeiro, este foi um estudo piloto com um número limitado de participantes, que incluiu apenas pacientes com SII com diarreia ou fenótipos de fezes mistas. Vale ressaltar que estamos atualmente conduzindo um ensaio confirmatório em uma coorte maior de pacientes (NCT05054309), incluindo aqueles com SII com constipação. Este ensaio multicêntrico realizado no Canadá também oferecerá a oportunidade de validar nossos resultados com base em um tamanho amostral maior. Em termos de limitações técnicas, a análise do lipidoma seria necessária para permitir um estudo abrangente de todos os níveis de ácidos graxos saturados e insaturados e suas implicações para os transtornos depressivos. Além disso, a especificidade de cepa do método de quantificação da abundância fecal de BL NCC3001 por qPCR é válida desde que não haja uma cepa muito próxima no ambiente microbiano, conforme discutido acima. Vale notar que não utilizamos um ensaio de quantificação que distinguisse células vivas de células mortas. Um cálculo rápido permite mostrar que as diferenças nas abundâncias de BL NCC3001 medidas nas fezes refletem a capacidade do probiótico de prosperar no intestino (ver discussão suplementar) e, portanto, a viabilidade das células detectadas não é importante no contexto atual.
Em conclusão, a melhora nas comorbidades psicológicas e a diminuição da reatividade emocional cerebral em pacientes com SII não constipada foram associadas a um aumento na abundância de BL NCC3001 detectada nas fezes e a vários metabólitos plasmáticos, principalmente o ácido butírico. Essas novas descobertas sugerem que a capacidade do probiótico BL NCC3001 de prosperar no trato gastrointestinal é um requisito importante para seus efeitos benéficos e que o ácido butírico pode ser um biomarcador bioquímico que liga o metabolismo do probiótico à sua bioatividade.
Materiais e métodos
Desenho do estudo clínico
Conduzimos um estudo piloto randomizado, duplo-cego, controlado por placebo, de centro único, em pacientes adultos com SII com diarreia ou padrão de fezes mistas diagnosticados com base nos critérios de Roma III. O estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa do Hamilton Health Sciences e do St Joseph's Health Care, e todos os participantes forneceram consentimento informado. Este estudo foi registrado no ClinicalTrials.gov em 13 de janeiro de 2011 (NCT01276626). Esses pacientes também apresentavam ansiedade e/ou depressão leve a moderada com base na escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão (HAD) (pontuação HADA ou HADD 8–14).
Este estudo incluiu quatro visitas hospitalares. Na visita de triagem, foram avaliados o histórico clínico e os sintomas, e realizados exame físico e exames de sangue completos. Na segunda visita, os critérios de inclusão e exclusão e os sintomas foram reavaliados, e amostras basais de fezes, urina e sangue foram coletadas. Os sintomas psicológicos e intestinais foram avaliados utilizando os questionários HADS e Birmingham IBS, respectivamente, e um estudo de ressonância magnética funcional (fMRI) foi conduzido. Os pacientes foram randomizados para receber BL NCC3001 seco por pulverização (1x 10¹⁰ UFC/1 grama de pó com maltodextrina) ou placebo contendo 1 g de maltodextrina, a ser tomado diariamente no café da manhã por um período de 6 semanas. Os pacientes foram instruídos a não alterar seus hábitos alimentares ou ingestão de fibras. Os produtos do estudo eram indistinguíveis em termos de embalagem, cor, sabor e consistência. A adesão foi medida registrando a ingestão do tratamento pelos participantes, ou seja, os sachês vazios foram recolhidos ao final da intervenção (terceira visita). A avaliação dos sintomas, o estudo de fMRI e a coleta de amostras foram repetidos na terceira visita. O sangue foi coletado em EDTA, e o plasma foi obtido por centrifugação. Finalmente, os sintomas dos pacientes foram reavaliados em uma visita de acompanhamento (4 semanas após a conclusão do tratamento).

Desfechos do estudo clínico
O desfecho primário foi uma redução nos escores de ansiedade (HADA) e/ou depressão (HADD) de ≥ 2 pontos na escala HAD ao final do tratamento. Esses pontos de corte foram baseados nas diferenças clinicamente importantes previamente estabelecidas para os escores de ansiedade e depressão na escala HAD de 1,3 e 1,4, respectivamente. Os desfechos secundários incluíram, entre outros, melhora nos escores de ansiedade e depressão (HADA e HADD, dados contínuos), alterações nos padrões de ativação cerebral medidos por fMRI, metabolômica plasmática e contagens fecais de BL NCC3001.

Análise metabolômica
A análise metabolômica foi realizada em amostras de plasma-EDTA coletadas antes e ao final do tratamento para medir painéis específicos de ácidos biliares e outros metabólitos microbianos do hospedeiro-intestino. As amostras foram extraídas e preparadas de acordo com métodos publicados anteriormente. Todos os padrões para análise de ácidos biliares foram obtidos da Steraloids, Inc. (Newport, RI, EUA) e TRC Chemicals (Toronto, ON, Canadá). As amostras da curva de calibração foram preparadas em uma matriz em branco e processadas da mesma forma que as amostras biológicas reais. Um sistema de cromatografia líquida de ultra-performance acoplada à espectrometria de massas em tandem (UPLC-MS/MS) (ACQUITY UPLC-Xevo TQ-S, Waters Corp., Milford, MA) foi utilizado para quantificar ácidos biliares em amostras de plasma humano com base em protocolos publicados anteriormente. A aquisição de dados foi realizada usando MassLynx versão 4.1 e a quantificação de ácidos biliares foi realizada usando o gerenciador de aplicativos TargetLynx versão 4.1 (Waters, Milford, MA, EUA). Para outras análises de metabólitos microbianos do hospedeiro-intestino, as amostras foram analisadas usando um método direcionado de perfil metabólico hospedeiro-microbiano previamente publicado, empregando cromatografia gasosa-espectrometria de massas (LECO, Saint Joseph, MI). Este segundo método permitiu a quantificação de 63 metabólitos, incluindo aminoácidos e derivados, ácidos carboxílicos, ácidos graxos, hidroxiácidos, cetoácidos e aromáticos.
Análise da abundância fecal de BL NCC3001
O DNA fecal foi extraído usando o QIAamp FAST DNA Stool Mini Kit (51604, Qiagen, Alemanha). As concentrações de DNA foram medidas usando o método de fluorescência PicoGreen (Thermo Fisher).
Uma região cromossômica que abrange o sítio de inserção de um elemento móvel foi previamente usada para detectar especificamente a cepa BL NCC3001. Um ensaio TaqMan MGB direcionado a essa região específica da cepa foi projetado (Primer Express 3.0, Applied Biosystems) para medir a abundância do probiótico em amostras fecais (BL NCC3001_Fw 5’-GTGATAACCTCAACAACCGACAAC-3’, BL NCC3001_Pr (FAM) 5’- ATCTGCCCTTAACGGC-3’ (MGB), BL NCC3001_Rev 5’- GCATCACCTCGTTCTCGACAA-3’). O MasterMix LightCycler® 1536 DNA Green Master (05573092001, Roche) foi utilizado com uma concentração final de 0,9 µM para cada primer e 0,25 µM da sonda. Cada ponto de dados foi executado em triplicata técnica, e uma curva padrão foi construída em diluições seriadas de 10 vezes do DNA genômico de BL NCC3001. O ensaio foi realizado em um ciclador LC480 II (Roche) sob as seguintes condições de PCR: 7 min a 95°C para ativação da Taq, 10 s a 95°C para desnaturação e 30 s a 60°C para anelamento e extensão por 40 ciclos, seguido de resfriamento por 30 s a 40°C.
Outro ensaio TaqMan MGB foi utilizado para normalizar a abundância de BL NCC3001 em relação à carga bacteriana.
Análise estatística
A análise quimiométrica foi realizada nos dados metabolômicos usando o pacote de software SIMCA-P+ (versão 16.0, Sartorius Stedim Biotech, Suécia). Foram empregadas a análise de componentes principais (PCA) e uma modificação da Regressão de Mínimos Quadrados Parciais (PLSR), que remove toda a informação ortogonal à variável resposta durante o processo de ajuste. Esta variante, Projeção Ortogonal a Estruturas Latentes (O-PLS), fornece modelos mais esparsos (melhorando sua interpretabilidade) com o mesmo grau de ajuste que a PLSR. A Importância da Variável na Projeção (VIP) foi usada para destacar o peso das variáveis individuais no modelo, com um valor acima de 1 usado como limiar por convenção. A análise univariada foi conduzida usando testes t não pareados e pareados para comparações de grupos, e correlações de Spearman entre metabólitos e HAD, endpoints amigdalianos e contagens bacterianas foram calculadas. A análise estatística foi realizada usando R 4.0.5 (2021-03-31). Os dados foram visualizados usando os pacotes R ggplot2 (2_3.3.5) e ggpubr (0.4.0), particularmente aplicando suas respectivas funções, ggboxplot e ggscatter. A correlação de Spearman e os testes exatos de Wilcoxon de postos sinalizados foram usados para determinar os níveis de significância entre os metabólitos e a abundância fecal de BL NCC3001 após intervenções e endpoints clínicos.
Acesso aos dados
Os autores considerarão o compartilhamento de dados anonimizados dos participantes mediante solicitação dirigida ao autor correspondente. O patrocinador, investigadores e colaboradores revisarão e aprovarão as solicitações com base no rigor científico e na conformidade ética da proposta.
Material Suplementar
Declaração de divulgação
GB, BB, SC, JM, FPM e OC são funcionários da Société des Produits Nestlé S.A., Suíça. WJ, GX e PB receberam apoio à pesquisa da Société des Produits Nestlé, SA. PB é titular da Cátedra Richard Hunt-AstraZeneca em Gastroenterologia.
Material suplementar
Os dados suplementares deste artigo podem ser acessados online em https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2347715
Referências
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Papel da microbiota intestinal e metabólitos na homeostase intestinal e doenças humanas
O eixo microbiota-intestino-cérebro
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Bactérias moduladoras de GABA da microbiota intestinal humana
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O papel dos ácidos graxos de cadeia curta na comunicação microbiota-intestino-cérebro
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