# Unidade 2 - Imunopatologia das Doencas Autoimunes e Hipersensibilidades
Modulo de Formacao Tecnica e Fundamentacao Cientifica - Acervo Integrativia.
Introducao Geral a Unidade
O estudo de Imunopatologia das Doencas Autoimunes e Hipersensibilidades na disciplina de Imunologia Clinica e Diagnostico Sorologico estabelece as bases conceituais, metodologicas e praticas indispensaveis para a formacao e atuacao tecnica do profissional biomedico e de saude, integrando a fundamentacao cientifica aos protocolos laboratoriais, interpretacao analitica e conduta clinica integrada.
2 GONADOTROFINA CORIÔNICA HUMANA
A gonadotrofina coriônica humana (hCG) é um hormônio popularmente conhecido para detectar uma gestação. Trata-se de um hormônio produzido, em condições fisiológicas, durante a gestação. Inicialmente, sua produção ocorre via sinciciotrofoblastos, e representa uma sinalização essencial para a manutenção da gestação. Ao longo do primeiro mês e meio de gravidez, é o hCG que sinaliza a manutenção do corpo lúteo. O corpo lúteo, por sua vez, produz progesterona, um hormônio responsável por manter a gestação ao longo das primeiras semanas de gravidez. A progesterona tem esse papel devido a sua capacidade de espessamento do endométrio e inibição das contrações uterinas, características que favorecem a implantação e a manutenção do óvulo fertilizado no útero (Figura 1). Além da produção de progesterona no estágio inicial da gestação, o hCG liga-se a receptores específicos que estimulam a angiogênese (criação de vasos sanguíneos) no endotélio uterino (NWABUOBI et al., 2017). Contudo, o corpo lúteo não permanece viável ao longo de toda gestação, o que significa que, após algum tempo, será necessário que outra estrutura mantenha a secreção de hormônios da gestação. De acordo com Silverthorn (2017, p. 829): “A menos que o embrião em desenvolvimento envie um sinal hormonal, o corpo lúteo degenerase, os níveis de estrogênio e progesterona caem e o embrião é eliminado do corpo junto com as camadas superficiais do endométrio durante a menstruação”. Assim, a partir da 8ª semana de desenvolvimento fetal, é a placenta que passa a secretar hormônios que impedirão a menstruação ao longo da gestação, como estrogênio, progesterona, hormônio lactogênio placentário humano e gonadotrofina coriônica humana. Durante esse período, as concentrações desses hormônios na corrente sanguínea sofrem grandes variações, a fim de permitir que ocorram as adaptações físicas e metabólicas necessárias para a boa evolução da gestação (SANARMED, 2019). FIGURA 1 – VARIAÇÃO DOS NÍVEIS HORMONAIS DURANTE A GRAVIDEZ FONTE: https://bit.ly/3QWkf02. Acesso em: 20 jan. 2021.
2.1 DOENÇA TROFOBLÁSTICA GESTACIONAL
1 O hormônio gonadotrofina coriônica humana (hCG) é encontrado em amostras de
sangue ou urina de mulheres grávidas. Assinale a alternativa CORRETA: a) ( ) Os testes rápidos, comercializados em farmácias, são utilizados como testes confirmatórios de gestação, uma vez que a amostra utilizada é a urina. b) ( ) A análise quantitativa não é capaz de estimar o tempo de gestação da paciente. c) ( ) Dosagem de BhCG em amostras de soro permite uma detecção mais precoce da gestação, quando comparada a dosagens realizadas em amostras de urina. d) ( ) Testes realizados em amostras de urina permitem detecção de gestação em até duas semanas após a fecundação.
2 A gonadotrofina coriônica humana é um hormônio essencial para que o embrião
permaneça viável, uma vez que é responsável pela manutenção do corpo lúteo, que, por sua vez, produz progesterona, hormônio que auxiliará no sucesso das etapas iniciais da gestação. Apesar de sua semelhança a outros hormônios, como o LH e o FSH, o hCG pode ser medido em amostras de soro sem que esses hormônios interfiram na dosagem. Explique como é possível realizar a detecção de hCG sem a interferência desses hormônios.
3 Cite uma vantagem e uma desvantagem da execução de testes de gravidez em
amostras de urina.
4 Considere o texto a seguir:
5 O teste que detecta, seletivamente, a presença do hCG e é usado como diagnóstico de
gravidez. Reagentes imunológicos secos são dispostos em uma membrana e reagem à medida que as amostras migram. Considerando o resultado válido indicativo de ausência de gestação, assinale a alternativa CORRETA: a) ( ) Linha teste ausente e linha controle presente. b) ( ) Linha teste ausente e linha controle ausente. c) ( ) Linha teste presente e linha controle presente. d) ( ) Linha teste presente e linha controle ausente.
TOXOPLASMOSE
TÓPICO 2 —
1 INTRODUÇÃO
A toxoplasmose integra um grupo de doenças infecciosas investigadas durante o período pré-natal. Por ser uma doença que, na maioria dos infectados, é assintomática, pode trazer grandes prejuízos ao desenvolvimento fetal. É essencial identificar se a gestante foi infectada, e se ela está no estágio agudo ou crônico da infecção. Por isso, surgem questões como quem é o agente infeccioso por trás de uma doença que pode acarretar prejuízos ao feto, como evitar a contaminação por esse agente infeccioso, como os imunoensaios podem auxiliar o corpo clínico na identificação dessa condição e qual o estado imunológico da paciente. A seguir, descobriremos mais sobre as dinâmicas relacionadas à toxoplasmose e sua importância no contexto gestacional.
2 TOXOPLASMOSE
A toxoplasmose é uma doença causada por um protozoário chamado Toxoplasma gondii, que infecta a maioria das espécies endotérmicas, incluindo os seres humanos. Os únicos hospedeiros definitivos para Toxoplasma gondii são os membros da família Felidae (que compreende principalmente os gatos domésticos). • Animais endotérmicos: utilizam todo o calor que produzem internamente para manter a temperatura corporal estável. É importante lembrar que o corpo depende de uma série de reações químicas que dependem de uma temperatura ideal. Por termos a capacidade de manter a nossa temperatura estável, nossas reações podem ocorrer e a homeostase é mantida. • Protozoário: microrganismos compostos por apenas uma célula, dotado de núcleo, e que precisam de outros seres vivos para obter nutrição. • Hospedeiros definitivos: são seres em que o toxoplasma é capaz de se amadurecer e passar por reprodução sexuada. • Hospedeiros intermediários: são seres em que o toxoplasma é capaz de se reproduzir apenas de forma assexuada. • Ciclo heteróxeno: é um ciclo que necessita de um ou mais hospedeiros intermediários. NOTA
2.1 CICLO BIOLÓGICO
O ciclo de vida do parasita é heteroxeno, caracterizado por diversas etapas, sendo que o T. gondii estará presente de diferentes maneiras, chamados de estágios evolutivos (Figura 4): • Taquizoítos: também chamados de trofozoítos, essa forma evolutiva ocorre na infecção aguda. Como o próprio nome indica (taqui- = “rápido” em grego), é uma forma evolutiva que se reproduz rapidamente dentro de diversos tipos celulares e nas células epiteliais (exceto aquelas pertencentes ao trato gastrointestinal) do hospedeiro intermediário. Sua multiplicação acontece por endodiogenia, que é um modo especializado de multiplicação assexuada, no qual duas células-filhas são formadas dentro da célula-mãe. Ao fim da reprodução, a membrana plasmática da célula hospedeira é rompida, o que permite que os novos parasitas cheguem ao meio extracelular e, a partir daí, passem a se disseminar pela corrente sanguínea e pelo sistema linfático para outros tecidos (SOUZA et al., 2014). • Oocistos: são as formas infectantes do T. gondii, resultado do ciclo sexuado do parasita que ocorre no epitélio gastrointestinal dos felinos. São liberados no meio externo pelas fezes. • Bradizoítos: também conhecidos como merozoítos, são formas evolutivas de reprodução lenta (bradi- = lento, em grego), que aparecem dentro de cistos teciduais. Os bradizoítos utilizam o cisto como um artifício de proteção contra a resposta imune. De acordo com Souza e Belfort Jr. (2014, p. 35), “embora os cistos teciduais se desenvolvam em diversos órgãos como pulmões, fígado e rins, eles são prevalentes nos tecidos muscular e nervoso, incluindo o cérebro, olhos e músculos esquelético e cardíaco”. Os cistos teciduais podem permanecer latentes por toda a vida do hospedeiro sem causar uma resposta inflamatória ou imunológica, evitando, assim, sua destruição. Durante o curso da infecção, os cistos teciduais podem romper-se, e com a diferenciação de bradizoítas em taquizoítas (conversão), reinvadem outras células hospedeiras e se rediferenciam em bradizoítas (interconversão), formando um novo cisto tecidual (SOUZA; BELFORT JR., 2014, p. 35). FIGURA 4 – FORMAS EVOLUTIVAS DO TOXOPLASMA GONDII: OOCISTO 1000X (1); TAQUIZOÍTOS LIVRES 1000X (2); E CISTO COM BRADIZOÍTOS 1000X (3) FONTE: Hornink et al. (2013, p. 86) A B C
QUADRO 1 – ETAPAS DO CICLO DE VIDA DO TOXOPLASMA GONDII FONTE: CDC (2020) (1) Apesar da eliminação dos oocistos produzidos ocorrer somente após 1 a 3 semanas, um grande número deles é eliminado nas fezes de gatos. No ambiente, os oocistos levam de 1 a 5 dias para esporular e se tornar infectantes. (2) Estágio em que os hospedeiros intermediários presentes na natureza se tornam infectados após ingerir solo, água ou plantas contaminadas com esses oocistos. (3) Após a ingestão, os oocistos originam taquizoítos nos enterócitos (intestino). Essa forma evolutiva localiza-se, predominantemente, no tecido nervoso e muscular, e forma cistos tissulares denominados bradizoítos. (4) Os gatos se tornam infectados após consumir hospedeiros intermediários, como roedores que contenham bradizoítos. Além disso, também podem ser infectados diretamente pela ingestão de oocistos esporulados. (5) Animais criados para consumo humano também podem ser infectados após ingestão de oocistos esporulados no ambiente. (6) Os humanos podem ser infectados pela ingestão de carnes malcozidas contendo bradizoítos. (7) Os humanos podem ser infectados pelo consumo de alimentos e/ou água contaminados com fezes de gatos ou oriundos de solo contaminado. (8) Os humanos podem ser infectados via transplante de órgãos ou transfusão sanguínea (mais raro). (9) Os humanos podem ser infectados via transplacentária, ou seja, a infecção presente na mãe passa para o feto. Com base nas etapas descritas sobre o ciclo de vida do T. gondii, é possível compreender como podemos prevenir a infecção por este parasita. Assim, os cuidados profiláticos estão relacionados a evitar beber água não tratada, usar luvas ao realizar jardinagem ou qualquer tipo de contato com o solo ou areia, ensinar as crianças a importância da lavagem de mãos na prevenção de infecções, manter caixas de areia externas cobertas (uma vez que gatos podem defecar nelas), alimentar gatos apenas com rações ou alimentos bem cozidos, não fornecer alimentos crus ou com pouco cozimento aos gatos, manter a liteira (caixa de areia do gato) higienizada diariamente.
2.2 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
2.3 LABORATÓRIO CLÍNICO NA TOXOPLASMOSE
2.3.1 Infecção recente
2.3.2 Transição imunológica
2.3.3 Infecção latente ou crônica
Para facilitar a visualização e a compreensão da técnica de ELISA, assista a seguinte animação, desenvolvida pelo canal Open Michigan: https://youtu.be/RRbuz3VQ100. GIO Microparticle Enzyme Immunoassay), para realizar a determinação quantitativa IgG e IgM anti-Toxoplasma. Nessa técnica, as amostras de soro ou plasma são tratadas com tampão que neutraliza fator reumatoide (FR), removendo, assim, a possível interferência gerada por esse complexo antígeno-anticorpo, evitando resultados falso-positivos para IgM (COSTA, 2007). Fator reumatoide (FR) é um autoanticorpo que interage com a região Fc de IgGs, ou seja, ele se liga em na sua porção “Fc”, que é uma porção que não se altera nos anticorpos. IMPORTANTE
1 A toxoplasmose é uma doença causada por um protozoário chamado de Toxoplasma
gondii, que infecta a maioria das espécies endotérmicas, incluindo os seres humanos. Assinale a alternativa INCORRETA: b) ( ) Gera mais prejuízos em pacientes imunodeprimidos. c) ( ) Em imunocompetentes, é predominantemente assintomática. d) ( ) Quando adquirida no primeiro trimestre de gestação, pode gerar sérios prejuízos no desenvolvimento do feto.
2 Sobre o Toxoplasma gondii e seu ciclo de vida, classifique V para as sentenças
3 Cite os estágios evolutivos do toxoplasma e explique suas características.
4 A toxoplasmose causada pelo Toxoplasma gondii adquire especial relevância quando
infecta gestantes, devido ao elevado risco de prejuízos potenciais ao feto. Assim, o Ministério da Saúde indica que todas as gestantes passem por investigação de anticorpos da classe IgG e IgM desde o início do acompanhamento pré-natal. Sobre a detecção de anticorpos IgM e IgG, assinale a alternativa CORRETA: ( ) A detecção de imunidade vacinal contra toxoplasma é identificada pela presença de anticorpos de IgG de alta avidez. ( ) A detecção de anticorpos de IgG de baixa avidez no início da gestação é indicativo de bom prognóstico. ( ) A detecção de IgG reagente e IgM reagente é confirmatório de infecção prévia à gestação, o que indica proteção fetal. ( ) Resultados sorológicos que não especificam se a infecção é aguda têm indicação de realização de teste de avidez de IgG.
5 Explique qual a importância dos testes de avidez IgG para toxoplasmose.
TÓPICO 3 —
CITOMEGALOVÍRUS E RUBÉOLA
1 INTRODUÇÃO
2 CITOMEGALOVÍRUS
O citomegalovírus (CMV) é um vírus que pertence à família herpesviridae, sendo considerado um herpesvírus humano. De acordo com Stephens et al. (2015, p. 54), “O nome da família vem de um verbo grego herpein, que significa ‘rastejamento’”, logo, refere-se ao fato de os membros da família causarem infecções latentes recorrentes com progressão lenta. Por isso, também pode ser encontrado na literatura como herpesvírus humano tipo 5 (HHV-5). Os agentes virais pertencentes a esse grupo possuem algumas características que merecem destaque, como: • Latência: quando o vírus continua no organismo, sem que o hospedeiro apresente sintomas clínicos relacionados a ele. • Recorrência: quando o vírus pode gerar manifestações clínicas novamente. • Cronicidade: quando a infecção viral é passível de tratamento, porém sem que o paciente se cure. Quando o CMV infecta pacientes imunocompetentes, ou seja, pacientes que estão com o sistema imune funcionando normalmente, na maioria dos casos, não ocorre o aparecimento de sintomas. Existem diferentes vias de infecção, mas nenhuma delas envolve hospedeiro intermediário, pois o único hospedeiro é o ser humano. A transmissão do CMV pode ocorrer de forma (FERREIRA; MORAES, 2013):
2.1 LABORATÓRIO CLÍNICO APLICADO AO
CITOMEGALOVÍRUS Os imunoensaios aplicados à investigação do CMV são baseados na pesquisa sorológica de anticorpos específicos para CMV. Assim como na toxoplasmose, os anticorpos utilizados, quando avaliados em conjunto, fornecem elementos a respeito da infecção. Dada à característica de reativação do CMV, os marcadores sorológicos permitem também compreender se o paciente está passando por um episódio de reativação viral, como resultado de uma fase de maior vulnerabilidade imunológica. Nesse contexto, a detecção de anticorpos IgM e IgG antiCMV corresponde a um dos principais instrumentos diagnósticos para compreender o estágio desta infecção. Em pacientes com idade igual ou superior a um ano (quando os anticorpos maternos não estão mais presentes na circulação), a detecção de anticorpos IgG antiCMV indica que houve infecção em algum momento da vida, porém não determina quando ocorreu esta infecção. Os anticorpos IgM antiCMV podem ser detectados no soro da gestante a partir da segunda semana de infecção, podendo permanecer detectável no sangue por até 18 meses. O IgM antiCMV também pode ser detectado em casos de reativação do vírus, o que também enfraquece a ideia de que paciente positivo para esse anticorpo está necessariamente passando pela fase aguda de uma primeira infecção. Nesse caso, pode-se pensar na detecção de IgM antiCMV como um alerta para que outros exames sorológicos sejam solicitados para esclarecer o estágio da infecção.
Se a detecção de IgM não é confirmatória para infecção recente nem a IgG pode confirmar isso, para evidenciar com clareza se a presença de IgM antiCMV corresponde a uma infecção primária, é indicado que sua interpretação seja combinada com a avaliação da avidez de IgG antiCMV. Assim, quando uma paciente possui anticorpos IgM contra o CMV e anticorpos IgG com baixa avidez, temos resultados confiáveis que evidenciam infecção primária. A sorologia para IgG e IgM é comumente realizada pelo ensaio imunoenzimático ELISA. No caso desses ensaios, a presença de fator reumatoide e outros herpesvírus pode gerar reações cruzadas e, com isso, resultados falso-positivos. Além disso, o aumento da sensibilidade das metodologias, com o avanço tecnológico, permite que IgM antiCMV sejam detectados por meses após a fase inicial em que sua produção foi estimulada, o que pode ser um eventual fator de confusão no momento da interpretação desses resultados.
3 RUBÉOLA
Então, quem deve se vacinar? • Pessoas de 6 meses a 49 anos de idade. • Pessoas de 12 meses a 29 anos precisam tomar a segunda dose após 30 dias de ter tomado a primeira dose. Esquema vacinal De acordo com a Sociedade Brasileira de Imunização (SBIm), o esquema de vacinação brasileiro envolve a administração de duas doses. Dessa forma, o recomendado é que a primeira dose seja administrada logo após a criança completar um ano de idade, então, o tempo máximo recomendado é de até 15 meses de vida, podendo ser aplicada a partir dos seis meses. Nesses casos, geralmente, é aplicada a vacina tríplice viral. Assim, o ideal é administrar a segunda dose entre 4 e 6 anos, apesar de não haver limite de idade para a aplicação desta dose. Para continuar a sua leitura, acesse: http://hermespardini.com.br/ blog/?p=395. É importante ressaltar que, a gravidade das anomalias resultantes da rubéola congênita é maior quando a infecção ocorre nos estágios iniciais da gestação. Isso porque, nesse estágio, o feto fica mais vulnerável por estar em estágios iniciais de formação de suas estruturas. Nesse contexto, é importante que a infecção seja investigada e o status imunológico da gestante, perante essa infecção, seja detectado e acompanhado. Assim, o laboratório clínico é um importante aliado da equipe médica.
3.1 LABORATÓRIO CLÍNICO APLICADO À RUBÉOLA
1 Os seres humanos são os únicos hospedeiros do rubivírus, que se dissemina por via
respiratória, a partir de secreções nasofaríngeas contaminadas. Assinale a alternativa CORRETA: a) ( ) O Toxoplasma gondii é o agente etiológico da rubéola. b) ( ) A rubéola é uma doença que exige tratamento medicamentoso para que seja curada. c) ( ) A rubéola é uma doença benigna e autolimitada. d) ( ) A primo-infecção por rubéola em gestantes no primeiro trimestre não causa nenhum prejuízo ao desenvolvimento fetal.
2 Explique qual é a importância do teste de avidez IgG em investigações sorológicas.
3 Descreva os três estágios presentes na infecção por citomegalovírus.
4 Considerando investigações sorológicas para rubéola, os ensaios imunoenzimáticos
(ELISA) são uma das principais metodologias para detectar anticorpos lgM e lgG antirrubéola e os testes de avidez para lgG. Analise as sentenças a seguir: I- A presença de IgG específica antivírus da rubéola, com alta avidez, em amostra de soro da paciente demonstra imunidade para a rubéola. II- Exposição prévia ao período gestacional de rubéola é diagnosticada pela presença apenas de IgM específica antivírus da rubéola numa amostra de soro da paciente. III- Títulos de anticorpos IgG específicos antivírus da rubéola, independentemente da avidez, progressivamente aumentados nos lactantes indicam proteção à infecção. IV- A infecção aguda de rubéola é diagnosticada pelo aumento dos títulos de IgG específica antivírus da rubéola, com baixa avidez. Assinale a alternativa CORRETA: a) ( ) As sentenças I e II estão corretas. b) ( ) As sentenças I e IV estão corretas. c) ( ) As sentenças I, III e IV estão corretas. d) ( ) As sentenças II, III e IV estão corretas.
5 A infecção congênita por citomegalovírus tem, na maioria dos casos, recém-nascidos
assintomáticos. Considerando a sequela tardia dessa infecção, que pode ser reduzida com o diagnóstico laboratorial precoce e terapia medicamentosa, assinale a alternativa CORRETA: a) ( ) A calcificação parenquimatosa difusa. b) ( ) A microcefalia. c) ( ) A surdez. d) ( ) A coriorretinite multilateral.
TÓPICO 4 —
METODOLOGIAS UTILIZADAS PARA DIAGNÓSTICO E PROGNÓSTICO DO PRÉ-NATAL
1 INTRODUÇÃO
2 IMUNOCROMATOGRAFIA
2.1 FLUXO LATERAL
2.2 DUPLA MIGRAÇÃO OU DUPLO PERCURSO (DPP)
2.3 IMUNOCONCENTRAÇÃO
3 ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
O ELISA (do inglês, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) é um imunoensaio no qual a ligação antígeno-anticorpo é acompanhada por mensuração de atividade enzimática presente na reação. O reagente de cor é uma enzima que gera mudança de coloração se o teste for positivo, e a mudança na coloração é medida por metodologia espectrofotométrica. Trata-se de uma metodologia utilizada para diferentes finalidades, como a detecção viral, a medida de antígenos ou anticorpos e a dosagem hormonal. De acordo com Voltarelli (2009, p. 83): Trata-se de técnica imunoenzimática sensível, heterogênea (múl tiplas fases), para a quantificação de antígenos ou anticorpos. Um dos reagentes é imobilizado na fase sólida, enquanto outro pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da imunológica do anticorpo. A fase sólida pode ser constitu ída por partículas de agarose, poliacrilamida, dextrano, poliestireno etc. Placas plásticas são as mais difundidas por permitirem múltiplos ensaios e automação. O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos, podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros forem bem padronizados. Existem diferentes métodos de ELISA, que são (Figura 12): • ELISA direto: em kits que pesquisam antígenos, os anticorpos são fixados em uma placa composta por material rígido, como poliestireno. Esse anticorpo fixado reagirá com antígenos presentes na amostra. Em seguida, é adicionado anticorpo específico, dessa vez, marcado com enzima. A placa, então, é incubada, ou seja, tem todas suas regiões mantidas a uma mesma temperatura, para que a reação ocorra em todas as regiões da placa (também conhecidas como poços) de modo uniforme. Por fim, um substrato (molécula que reage com a enzima presente no kit reagente) é adicionado. Esse substrato é um cromógeno, ou seja, quando reage com a enzima forma um produto colorido. A coloração que se forma é medida por espectrofotômetro, que, a partir da intensidade da cor presente, mensura a quantidade do antígeno presente na amostra. • ELISA indireto: mensura a concentração de anticorpos na amostra. Isso acontece quando a amostra, contendo anticorpos, reage com seu antígeno específico, que está presente na placa de ELISA (fase sólida). Essa ligação antígeno-anticorpo é revelada pela ação do conjugado enzimático específico, que gera coloração ao reagir com o substrato cromogênico (moléculas em que a enzima se liga resultando em formação de cor). É um ensaio que inspira cuidados, uma vez que a medida de anticorpos IgM, aplicada a doenças infecciosas, tem como interferente a presença de grandes quantidades do fator reumatoide na amostra, gerando resultados falso-positivos, o que prejudica sua especificidade. • ELISA competitivo: a placa contém o antígeno ou anticorpo de interesse, e o an tígeno ou anticorpo presente na amostra compete com aqueles presentes na placa pelo local ligação. Em consequência, a leitura da concentração desse teste é inver samente proporcional, uma vez que, quanto menor a concentração da substância
• Adição de amostra: as amostras dos pacientes são pipetadas na placa e incubadas. A incubação é a manutenção da placa sob uma temperatura uniforme durante um mesmo período estabelecido pelo kit reagente utilizado. Caso as amostras contenham anticorpos específicos para os antígenos fixados na placa, ocorrerá a formação de complexo antígeno-anticorpo. • Lavagem da placa: nova lavagem ocorre para retirada de anticorpos presentes na amostra que não se ligaram aos antígenos presentes na placa. • Adição do conjugado: o conjugado corresponde a um anticorpo anti-IgG (anticorpos secundários) ligado a uma enzima peroxidase (enzima mais comumente utilizada para técnica de ELISA). Esse anticorpo secundário tem como função ligarse ao anticorpo primário, quando este estiver presente na amostra (Figura 15). A placa passa por nova incubação e novos ciclos de lavagens (remoção de anticorpos soltos), antes da adição do substrato. FIGURA 15 – REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DAS LIGAÇÕES PRESENTES NO ELISA INDIRETO FONTE: http://biomedicinabrasil.com.br/metodologia/teste-de-elisa/. Acesso em: 18 mar. 2021. • Adição do substrato: o substrato consiste em uma substância (no caso da peroxidase, o substrato é o H2O2) que forma um complexo com a enzima e, com isso, gera novos produtos. Nessa técnica, o substrato está ligado a um cromógeno (substância que gera reação de cor). Caso ocorra reação enzimática, devido à presença de anticorpos na amostra, o substrato é oxidado e, com essa reação, o cromógeno gera cor (Figura 16). • Leitura: por fim, a formação de cor presente na placa é mensurada por espectrofo tometria com filtro ajustado para leitura do marcador de interesse (Figura 17).
4 ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO DE MICROPARTÍCULAS
Assim como o ELISA, trata-se de uma técnica imunoenzimática, porém a diferença é que a porção sólida são micropartículas em suspensão líquida e não uma placa (VOLTARELLI, 2009). Nessa técnica, a fase sólida são micropartículas de látex contendo os antígenos que se ligam aos anticorpos presentes na amostra estudada. Essas micropartículas se ligarão a uma matriz de fibra de vidro de maneira irreversível. O conjugado contendo antígenos e fosfatase alcalina é adicionado a seguir, ligando-se aos anticorpos, formando um complexo antígeno-anticorpo-antígeno. A reação é revelada pela adição de um substrato, que gera um produto fluorescente pela sua ligação com a enzima. A intensidade da fluorescência é medida, sendo considerada reagente quando supera o ponto de corte da técnica (Figura 18).
5 HEMAGLUTINAÇÃO
Nessa metodologia, são utilizados fragmentos de antígenos recobrindo glóbulos vermelhos. Essa solução contendo hemácias e antígenos específicos para o marcador investigado é distribuída em poços de microplaca. A presença de anticorpos específicos interage com o antígeno presente na solução dispensada na placa, recobrindo o poço como uma espécie de “tapete” vermelho (amostras 1 a 3 na Figura 19); caso a amostra de soro não apresente os anticorpos investigados, as hemácias ficam depositadas no fundo do poço formando um botão vermelho (amostras 4 a 7 da Figura 19) (FERREIRA; MORAES, 2013). FIGURA 19 – REAÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO FONTE: http://twixar.me/wttm; http://twixar.me/9ttm. Acesso em: 16 mar. 2021.
LEITURA COMPLEMENTAR CUIDADOS COM A DOSAGEM DA GONADOTROFINA CORIÔNICA HUMANA NO SEGUIMENTO DE PACIENTES COM DOENÇA TROFOBLÁSTICA GESTACIONAL Elza Uberti José Mauro Madi Antonio Braga Bruno Grillo Maurício Viggiano A principal vigilância hormonal no seguimento pós-molar consiste na dosagem periódica e sistemática da gonadotrofina coriônica humana (hCG). Sendo um produto das células da placenta, em especial do sinciciotrofoblasto, o hCG também é secretado em menores quantidades pelas células citotrofoblásticas. O hCG pertence ao grupo dos hormônios glicoproteicos, que também compreende o luteinizante (LH), o folículoestimulante (FSH) e o tireoestimulante (TSH). Todos esses possuem duas subunidades diferentes, a e b, que são unidas por ligações não covalentes e que precisam estar combinadas para formar o hormônio biologicamente ativo. A subunidade α é produzida tanto na hipófise como na placenta e tem a mesma sequência peptídica das subunidades a de outros hormônios (LH, FSH, TSH). A subunidade β é peculiar a cada hormônio e determina sua especificidade. O hCG é produzido pela placenta na gestação normal, pela doença trofoblástica gestacional (DTG), em mulheres que estão ou estiveram grávidas, nas neoplasias de origem germinativa, por tumores não trofoblásticos e também em tecidos normais, incluindo testículo e hipófise humana. A principal função do hCG é promover a produção de progesterona pelo corpo lúteo do ovário. No início da gestação normal, o trofoblasto se diferencia em células predominantemente citotrofoblásticas, enquanto as células sinciciotrofoblásticas são dominantes ao término da gravidez. O sinciciotrofoblasto é a maior fonte secretora de hCG intacto na circulação materna e as células menos diferenciadas do citotrofoblasto secretam além do hormônio na sua forma intacta, as subunidades α e β. À semelhança da placenta normal, as células anormais do trofoblasto na doença trofoblástica gestacional (DTG) sintetizam e secretam tanto o hCG intacto como as formas livres das subunidades α e β.
A dosagem de hCG também é essencial no rastreamento de causas de sangramento uterino disfuncional ou em mulheres que, no menacme, mesmo sem sangramento anormal, apresentem sintomas atípicos como hemoptise, dores abdominais, convulsões etc.; nesses casos, na ausência de gestação documentada há mais de 30 dias, um hCG positivo levanta a hipótese de DTG e indica avaliação diagnóstica. Para diagnóstico de gestação molar basta um resultado positivo na dosagem de hCG (≥ 200 mUI/mL) associado à imagem típica ao US. A quantificação do hCG nessa etapa diagnóstica será relevante, entretanto, para identificação da MH de alto-risco para desenvolvimento de NTG; em tais pacientes uma dosagem de hCG ≥ 100.000 mUI/mL é sinal de alerta para rastreio das complicações médicas associadas ao hCG elevado, tais como tamanho uterino maior do que o esperado para a idade gestacional, presença de cistos ovarianos teca-luteínicos volumosos, pré-eclampsia, hipertireoidismo e embolização trofoblástica. Na quantificação do hCG, é importante também destacar a possibilidade de um resultado falsamente mais baixo devido ao efeito “hook”, que pode estar presente quando os níveis da gonadotrofina são extremamente elevados. O excesso de hCG progressivamente satura a fase sólida e a detecção de anticorpos, impedindo que haja formação do “sanduíche” que quantifica o hCG, quando se utilizam os novos ensaios com anticorpos monoclonais. Esse efeito pode ser prevenido pela diluição da amostra a 1/100 e 1/10.000. Diante da paciente com gestação molar e úteros volumosos, um contato da equipe médica com o laboratório torna-se essencial, antes de ser iniciado o processo de quantificação do hCG, para evitar os resultados incorretos. O valor do BhCG obtido antes ou logo após esvaziamento da MH representa o ponto inicial de uma curva onde serão colocadas sucessivamente a cada 7 dias os outros valores numéricos, configurando a curva individual de regressão do BhCG, que possibilita identificar precocemente a evolução da DTG para remissão espontânea ou para evolução neoplásica. hCG no acompanhamento pós-molar
Feito um diagnóstico clínico de MH, o próximo passo é o esvaziamento da cavidade uterina, preferencialmente com o método de vácuo-aspiração elétrica ou manual, através do qual se consegue o material para ser enviado para exame histopatológico. Segue tal procedimento cirúrgico, um acompanhamento com consultas médicas e dosagens quantitativas de hCG, que duram em média 6 a 8 meses, conhecido como acompanhamento pós-molar. Esse acompanhamento que deve ser realizado preferencialmente em Centros de Referência (CR), onde uma equipe multidisciplinar treinada proporcione o atendimento adequado em todas as fases do tratamento. Nessa etapa, o BhCG, que precisa sempre ser precisamente quantificado, tem papel relevante como marcador tumoral.
Recomenda-se que as pacientes façam consultas médicas acompanhadas da dosagem de BhCG até serem obtidos três resultados semanais consecutivos com níveis inferiores a 5 mUI/mL quando, por definição clínica, é caracterizada a remissão da doença. Após a remissão, o controle passa a ser mensal, durante mais cerca de 6 meses. Durante todo o seguimento pós-molar, as pacientes devem fazer anticoncepção rigorosa, de preferência mediante o uso de anticoncepcional oral, uma vez que não podem engravidar durante o período de acompanhamento. A anticoncepção eficaz é um dos pilares do controle pós-molar e, como tal, o uso é recomendado e garantido. A maioria das pacientes portadoras de MH (80%) permanece assintomática até a cura completa da doença. A curva de regressão do BhCG de cada paciente realizada durante o acompanhamento pós-molar pode ser comparada com a curva semilogarítmica e exponencial de regressão normal do hCG, conforme proposto por Schlaerth et al. (Figura 2) ou com outra proposta em nosso meio por Maestá. Se os valores forem progressivamente descendentes e paralelos à curva padrão de regressão, significa que a paciente está evoluindo para remissão espontânea da doença, dispensando qualquer tratamento adicional. Figura 2 – Curva semilogarítmica de regressão do hCG proposta por Schlaerth et al. (média ± 2 desvios padrões), adaptada para mostrar o valor considerado normal (inferior a 5 mUI/mL)
FONTE: Adaptado de https://www.febrasgo.org.br/pt/noticias/item/414-cuidados-com-a-dosagem-dagonadotrofina-corionica-humana-no-seguimento-de-pacientes-com-doenca-trofoblastica-gestacional. Acesso em: 2 fev. 2021.
1 A imunocromatografia é uma metodologia qualitativa, utilizada em laboratório como
triagem para identificar os mais diferentes tipos de substâncias, como o próprio hormônio hCG, e para detecção de agentes patogênicos, como vírus e bactérias. A respeito do método imunocromatográfico, observe a figura a seguir: FONTE: http://www.nano-macro.com/2015/09/a-magica-do-diagnostico-post-2.html. Acesso em: 16 mar. 2021. Assinale a alternativa CORRETA: a) ( ) Trata-se de um teste com resultado reagente. b) ( ) Trata-se de um teste inválido, uma vez que a área de controle não apresentou marcação. c) ( ) Trata-se de um teste válido, uma vez que a área de controle não apresentou marcação. d) ( ) Trata-se de um resultado não reagente, uma vez que a área C não apresentou marcação.
2 ELISA é uma metodologia utilizada para diferentes finalidades, como a detecção viral,
a medida de antígenos ou anticorpos e a dosagem hormonal. Explique por que o ELISA indireto não é a melhor opção para detecção de IgM.
3 Existem tipos diferentes de ELISA: direto, indireto e competitivo. Explique o
funcionamento da técnica de ELISA competitivo.
precedem a geração de resultados que indicarão ou não a presença do marcador investigado. Com relação ao teste de ELISA indireto, analise a ordem dos compostos utilizados: I- Antígeno de interesse. II- Substrato. III- Soro de paciente. IV- Anticorpo secundário.
5 Sobre a hemaglutinação passiva, assinale a alternativa CORRETA:
a) ( ) Resultados reagentes são identificados pela presença de um botão vermelho no fundo do poço. b) ( ) São utilizados glóbulos brancos sensibilizados com fragmentos do antígeno de interesse. c) ( ) Resultados reagentes são identificados pela presença de um tapete vermelho no fundo do poço. d) ( ) São utilizados glóbulos brancos sensibilizados com fragmentos de cromógeno associado ao antígeno de interesse.
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DOENÇAS INFECTOCONTAGIOSAS E AUTOIMUNES
A partir do estudo desta unidade, você deverá ser capaz de: • entender as principais doenças infecciosas e autoimunes; • compreender as principais características e os testes imunológicos mais utilizados no diagnóstico e no acompanhamento de sífilis, síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA ou AIDS), hepatites virais, coronavírus e lúpus eritematoso sistêmico.
Esta unidade está dividida em cinco tópicos. No decorrer dela, você encontrará
TÓPICO 1 – SÍFILIS
TÓPICO 2 – SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA (SIDA OU AIDS)
TÓPICO 3 – HEPATITES VIRAIS
TÓPICO 4 – CORONAVÍRUS
TÓPICO 5 – LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO
um ambiente que facilite a concentração, assim absorverá melhor as informações.
CONFIRA A TRILHA DA
TÓPICO 1 —
SÍFILIS
1 INTRODUÇÃO
2 SÍFILIS
É sempre importante rever alguns conceitos para absorver o conteúdo com maior clareza: • Doença sistêmica: afetam diversos órgãos, não se restringindo ao prejuízo de um único determinado órgão ou sistema. • Bactéria Gram-negativa: são bactérias constituídas de uma parede de peptidoglicano mais delgada, o que faz com que não retenham o cristal violeta ao longo da etapa de descoloração, o que resulta na cor vermelha ao final da coloração de Gram. • Microaeróbia: microrganismos que se desenvolvem em baixas tensões de oxigênio. IMPORTANTE FIGURA 1 – COMPOSIÇÃO ESTRUTURAL DO TREPONEMA PALLIDUM FONTE: https://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/09/espiroquetas.html. Acesso em: 8 fev. 2021. O T. pallidum é um patógeno que tem como hospedeiro apenas os seres humanos e a via de transmissão ocorre principalmente por contato sexual, porém também pode ser causado por transmissão vertical, ou seja, da gestante para o feto (quando não houver tratamento da gestante) (AVELLEIRA; BOTTINO, 2006). Ao ser transmitido, o T. pallidum penetra no organismo e atinge a corrente sanguínea, sendo distribuído por diversos tecidos. Com essa dispersão, uma resposta inflamatória e imunológica por parte do sistema imune é desencadeada culminando nas manifestações clínicas que podem ser divididas em 3 estágio:
3 LABORATÓRIO CLÍNICO NO DIAGNÓSTICO E
3.1 TESTES NÃO TREPONÊMICOS
Como o próprio nome indica, nos ensaios não treponêmicos, os anticorpos detectados não são específicos para o T. pallidum. É possível encontrar na literatura esses testes classificados como anticardiolipínicos, ou seja, anticorpos produzidos sentam carga negativa e, em mamíferos, estão presentes na membrana mitocondrial. Em condições patológicas, essas moléculas estão presentes em células apoptóticas, na ativação plaquetária e em complicações durante a gestação. Contudo, também são encontrados na sífilis (RAND; WOLGAST, 2018). Os testes não treponêmicos estão amplamente disponíveis nos laboratórios, são de baixo custo e possibilitam o monitoramento da resposta ao tratamento. Como desvantagens, possuem baixa sensibilidade na sífilis primária e também na sífilis latente e tardia, além de produzirem resultados falso-positivos, devido à ocorrência de outras enfermidades que causam degeneração celular (BRASIL, 2016, p. 23). Assista ao seguinte vídeo, desenvolvido pelo Telelab, sobre testes não treponêmicos: https://www.youtube.com/watch?v=nAWWmxLM9vg. Tratase de um material importante que visa a facilitar a compreensão desses novos conhecimentos e revisa o conceito de efeito prozona, conhecimento essencial para evitar a obtenção de resultados falso-negativos. IMPORTANTE
3.1.1 Floculação: VDRL
Questoes de Fixacao e Aplicacao Pratica
- Descreva os principais conceitos e fundamentos fisiopatologicos e laboratoriais abordados nesta Unidade de Imunopatologia das Doencas Autoimunes e Hipersensibilidades.
- Explique os mecanismos de regulacao biologica e metodologias analiticas discutidas no texto.
- Qual a relevancia clinica e diagnostica das determinacoes bioquimicas e biomedicas descritas neste modulo?
- Diferencie os principais parametros laboratoriais e suas correlacoes com as manifestacoes patologicas.
- Como o conhecimento desta unidade se aplica na rotina diagnostica e conduta profissional em Imunologia Clinica e Diagnostico Sorologico?