# Unidade 2 - Cocos e Bacilos Gram-Positivos e Gram-Negativos de Importancia Medica
Modulo de Formacao Tecnica e Fundamentacao Cientifica - Acervo Integrativia.
Introducao Geral a Unidade
O estudo de Cocos e Bacilos Gram-Positivos e Gram-Negativos de Importancia Medica na disciplina de Microbiologia Clinica e Bacteriologia Medica estabelece as bases conceituais, metodologicas e praticas indispensaveis para a formacao e atuacao tecnica do profissional biomedico e de saude, integrando a fundamentacao cientifica aos protocolos laboratoriais, interpretacao analitica e conduta clinica integrada.
1 INTRODUÇÃO
Caro acadêmico, antes de nos aprofundarmos nas técnicas empregadas no laboratório de microbiologia, precisamos compreender quais são suas defini ções, características e estrutura. Será que todo laboratório de microbiologia tem os mesmos requisitos de segurança, ou há, dependendo do material utilizado, uma estrutura especializada e direcionada para cada caso? O gestor de um laboratório/setor de microbiologia clínica deve ter o conheci mento da necessidade do cumprimento das leis e normas para o seu funcionamento. Portanto, o plano de gestão deverá estabelecer a implantação dos serviços e processos de acordo com resoluções, portarias e normas que regem os serviços de saúde, que podem ser conferidas a nível nacional, estadual ou municipal (BRASIL, 2004).
TÓPICO 1 —
ESTRUTURA E BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA CLÍNICA A RDC 302 publicada no Diário Oficial da União, no dia 14 de outubro de 2005, dispõe sobre regulamento técnico para funcionamento de laboratórios clínicos e define os re quisitos para o funcionamento dos laboratórios clínicos e postos de coleta laboratorial públicos ou privados que realizam atividades na área de análises clínicas, patologia clínica e citologia. Que tal verificar quais os principais pontos que estão relacionados ao laboratório de microbiologia? ESTUDOS FUTUROS
2 ESTRUTURA BÁSICA E CLASSIFICAÇÃO DE RISCO NA
MICROBIOLOGIA CLÍNICA Segundo a Agência de Vigilância Sanitária (ANVISA), a estrutura física do laboratório deve atender aos requisitos da RDC/ANVISA, nº 50, publicada em 21 de fevereiro de 2002. O laboratório de microbiologia é responsável por caracterizar e tam bém identificar os microrganismos presentes em vários tipos de amostras. Esta área pode ter diversos segmentos, tais como: saúde, indústria alimentícia e cosméticos.
TÓPICO 1 — ESTRUTURA E BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA CLÍNICA
QUADRO 3 – NÍVEIS DE BIOSSEGURANÇA A SEREM ADOTADOS PELOS LABORATÓRIOS DE MICROBIOLOGIA CLÍNICA Nível 1 de Biossegurança (NB-1) ou proteção básica (P1) Agentes Práticas Equipamentos de Segurança Instalações Apenas organis mos de classe 1 poderão ser manipulados Aplicação das Boas Práticas Microbio lógicas (BPLs) Não são exigidos equipamentos especiais de con tenção; Utilização de EPIs. Salas separadas das áreas públicas de passagens; Bancadas abertas com pias próximas. 1. Acesso controlado. 2. Pia para lavar as mãos. 3. Política de alerta de perigos acentuados. 4. Equipamento de proteção individual. 5. Bancada de laboratório. 6. Autoclave. Nível 2 de Biossegurança (NB-2) ou (P2) Agentes Práticas Equipamentos de Segurança Instalações Manipulação de microrganismos de Classe de ris co 2. Práticas de NB-1 acres cidas de: 1. Acesso limitado. 2. Avaliação de Risco Biológico. 3. Precauções com obje tos perfurocortantes. 4. Manual de Biosse gurança que defina a descontaminação de dejetos ou normas de vigilância médica. 5. Sinalização de risco. Barreiras primá rias = Cabines de Classe I ou II ou outros dispositi vos de contenção física usados para todas as manipu lações de agentes que provoquem aerossóis ou vaza mento de mate riais infecciosos; Uso de EPIs: aven tais, luvas, prote tor facial. NB-1 acrescido de: 1. Autoclave. 2. Instalação de um sistema mecânico de ventilação. 3. Pias com acionamento automático.
TÓPICO 1 — ESTRUTURA E BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA CLÍNICA
Acesso controlado 2. Pia para lavar as mãos 3. Política de alerta de perigos acentuados 4. Dispositivo de contenção física 5. Equipamento de proteção pessoal 6. Bancada de laboratório Nível 3 de Biossegurança (NB-3) ou (P3) Agentes Práticas Equipamentos de Segurança Instalações Agentes exóticos com potencial para transmissão via aerossol; a doença pode ter consequências sé rias ou até fatais. Microrganismos de Classe de risco 3. Práticas de NB-2 acres cidas de: 1. Acesso controlado. 2. Descontaminação de todo lixo. 3. Descontaminação da roupa usada no laboratório an tes de ser lavada. 4. Controle soroló gico dos funcio nários. Barreiras primárias = Cabines de classe II ou III ou outros dis positivos de conten ção usados para to das as manipulações. É obrigatório o uso de roupas de proteção específica – macacões, gorros, luvas, pró-pés e respiradores. NB-2 acrescidas de: 1. Separação física dos corredores de acesso. 2. Portas e acesso du plos e com fecha mento automático. 3. Ar de exaustão não recirculante. 4. Fluxo de ar ne gativo dentro do laboratório. 5. Piso antiderra pante e de fácil limpeza.Vedação ao desinfetar. 2. Fechamento automático, acesso de porta dupla e acesso controlado. 3. Chuveiro pessoal fora do laboratório (melhoria baseada em risco). 4. Política de alerta de perigos acentuados. 5. Pia para lavar as mãos. 6. Penetrações seladas. 7. Dispositivo de contenção física. 8. Respirador purificador de ar alimentado (aumento baseado em risco). 9. Bancada de laboratório. 10. Autoclave. 11. Filtro HEPA de exaustão (aprimoramento baseado em risco). 12. Sistema de descontaminação de efluentes (melhoria baseada em risco). Nível 4 de Biossegurança (NB-4) ou (P4) Agentes Práticas Equipamentos de Segurança Instalações Agentes exóticos ou perigosos que exponham o indi víduo a um alto ris co de doenças que ameaçam a vida. Infecções labora toriais transmiti das via aerossol ou relacionadas a agentes com risco desconhecido de transmissão. Microrganismos de classe de risco 4. Práticas de NB-3 acrescidas de: 1. Mudança de roupa antes de entrar. 2. Banhar na saída. 3. Todo o mate rial deve ser descontamina do na saída das instalações. Barreiras primárias = Todos os procedi mentos conduzidos em cabines de Classe III ou II juntamen te com macacão de pressão positiva com suprimento de ar. O trabalho é feito em dupla. NB-3 acrescidas de: 1. Edifício sepa rado o u área isolada. 2. Descontamina ção do material é feita em um sistema de au toclave de du pla porta. 3. Sistemas de abastecimento e escape, a vá cuo, e de des contaminação. 4. Circuito inter no de TV. 5. Intercomunica dores.
TÓPICO 1 — ESTRUTURA E BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA CLÍNICA
Vedação ao ar. 2. Fechamento automático, acesso de porta dupla e acesso controlado. 3. Política de alerta de perigos acentuados. 4. Pia para lavar as mãos. 5. Penetrações seladas. 6. Dispositivo de contenção física. 7. Roupa de proteção de pressão positiva. 8. Bancada de laboratório. 9. Autoclave. 10. Chuveiro químico para fora. 11. Chuveiro pessoal para fora. 12. Filtro HEPA de alimentação e exaustão. 13. Sistema de descontaminação de efluentes. FONTE: Adaptado de Center for Preparedness and Response - CDC (2020) e ANVISA (2013)
2.1 CABINES DE SEGURANÇA BIOLÓGICA
Como você percebeu, há um equipamento dentro dos laboratórios de mi crobiologia bastante peculiar: as cabines de segurança biológica (CSB), também conhecidas como capelas de fluxo laminar. As CSB são geralmente usadas como contenção primária no trabalho com agentes de risco biológico, minimizando a exposição do operador, do pro duto e do ambiente. Muitos agentes de risco biológico requerem o uso de subs tâncias químicas e radioisótopos em suas análises. Dependendo do volume de substâncias químicas e radioisótopo utilizado, é exigido modificações na es trutura da CSB ou na construção do sistema de exaustão da cabine, que pode incluir filtro de carvão, visto que os filtros absolutos ou filtros HEPA não retêm substâncias químicas vaporizadas ou sublimadas.
TÓPICO 1 — ESTRUTURA E BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA CLÍNICA
QUADRO 4 – COMPARAÇÃO DAS CABINES DE SEGURANÇA BIOLÓGICA FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 4 mar. 2021. É importante lembrarmos que um laboratório de microbiologia clínica exige boas práticas, assim como em um laboratório clínico. Vamos relembrar aqui quais são elas: • É expressamente proibido o consumo de bebidas e alimentos, a aplicação de cosméticos e o fumo na área técnica. • Em todos os procedimentos, é recomendado prender os cabelos e evitar o uso de bijuterias e maquiagens. • É proibido o uso de calçados abertos (chinelos e sandálias). • Toda amostra biológica deve ser considerada potencialmente contaminada. • É obrigatório o uso de EPI dentro na unidade técnica. • É proibido pipetar com a boca. • Antes de iniciar a rotina, é obrigatória a descontaminação das bancadas de trabalho antes e após o desenvolvimento das atividades. • É proibido reencapar e entortar agulhas após o uso.
• Nunca processar materiais não identificados. • Depositar todo material contaminado em recipientes apropriados para auto clavagem. • Higienizar sempre as mãos antes e após os procedimentos. Leia o texto: Afinal você sabe qual a importância da biossegurança? Disponível em: https://bit.ly/3nKEAY4 DICAS
Neste tópico, você aprendeu que: RESUMO DO TÓPICO 1 • O laboratório de microbiologia clínica é responsável por caracterizar e tam bém identificar os microrganismos presentes em vários tipos de amostras bio lógicas. • A utilização de equipamentos de Biossegurança como luvas, máscaras, óculos de proteção e jaleco são essenciais para a segurança do biomédico. • Listamos os equipamentos mínimos para funcionamento de um laboratório de microbiologia. • Diferentes tipos de microrganismos exigem diferentes abordagens em bios segurança, uma vez que possuem variados graus de patogenicidade, logo, os tipos de equipamentos e estrutura utilizados devem ser diferentes. • O nível de Biossegurança adotado em um laboratório de Microbiologia deve rá levar em consideração o agente biológico de maior classe de risco envolvi do nas atividades realizadas por ele. • As CSB são geralmente usadas como contenção primária no trabalho com agentes de risco biológico, minimizando a exposição do operador, do produto e do ambiente. • Existem três tipos de CSB e cada uma é proporcional ao nível de risco bioló gico manipulado.
1 (FUNIVERSA-SECTEC-GO, 2010) Biossegurança é o conjunto de ações vol tadas para prevenção e: a) ( ) minimização ou eliminação de riscos inerentes às atividades de trabalho, que possam comprometer a saúde do homem, dos animais e do meio ambiente. b) ( ) minimização ou também no aumento de riscos inerentes às atividades de trabalho, que devem comprometer a saúde do homem, dos animais e do meio ambiente. c) ( ) maximização e não eliminação de riscos inerentes às atividades de tra balho, que possam comprometer a saúde do homem, dos animais e do meio ambiente. d) ( ) minimização ou eliminação de riscos não inerentes às atividades de tra balho. É uma sistemática para comprometer a saúde do homem, dos animais e do meio ambiente. e) ( ) conservação ou não eliminação de riscos inerentes às atividades de tra balho, primando para comprometer a saúde do homem, dos animais e do meio ambiente. 2 (FUNIVERSA - Governo do Estado do Amapá, Biomédico, 2014) Os riscos biológicos são decorrentes da exposição a agentes do reino animal, vegetal e de micro-organismos ou de seus subprodutos. Tais agentes podem estar pre sentes, veiculados sob diversas formas que oferecem risco biológico, como ae rossóis, poeira, alimentos, instrumentos de laboratório, água, cultura, amos tras biológicas, entre outros. Os germes patogênicos que costumam provocar doença grave em seres humanos ou animais, propagada de um hospedeiro infectado ao outro. Porém, existem medidas profiláticas e de tratamento bem esclarecidas. Considerado de alto risco individual e de baixo risco para a co munidade. Esse tipo de agente é incluído no grupo de risco: a) ( ) 0 b) ( ) 1 c) ( ) 2 d) ( ) 3 e) ( ) 4 3 (COTEC-UNIMONTES, Farmacêutico, 2014) A biossegurança é um conjunto de ações voltadas para prevenção, minimização e eliminação de riscos para a saúde, ajuda na proteção do meio ambiente contra resíduos e na conscien tização do profissional da saúde. Considere a informação abaixo: Aplica-se a
agentes biológicos que provocam infecções no homem ou nos animais, cujo risco de propagação na comunidade e de disseminação no meio ambiente é limitado, não constituindo em sério risco a quem os manipula em condi ções de contenção, pois existem medidas terapêuticas e profiláticas eficientes. Exemplo: Toxoplasma spp. Qual a classe de risco biológico descrita acima? a) ( ) Risco 2. b) ( ) Risco 1. c) ( ) Risco 4. d) ( ) Risco 3.
1 INTRODUÇÃO
Na rotina de um laboratório são utilizados Procedimento Operacional Pa drão (POPs), para que se mantenha o controle de qualidade nas técnicas realiza das. Todo laboratório de microbiologia depende, antes de mais nada, de uma boa qualidade da amostra e do controle de qualidade das análises. Para isso, o mate rial coletado deve ser representativo do processo infeccioso investigado, devendo ser eleito o melhor sítio da lesão, evitando contaminação com as áreas adjacentes. Além disso, muitos materiais não são coletados próximos aos locais de análise, nem analisados imediatamente, logo, é necessário que ocorra um bom transporte e condicionamento da amostra, até que chegue ao laboratório (BRASIL, 2004). O que mencionamos no parágrafo acima se enquadra na classificação de fases em que uma amostra deve passar estas fases são (BRASIL, 2004): Pré analítica: que envolve preparo do paciente e coleta do material; Analítica: período em que a amostra será processada no laboratório; Pós analítica: validação e liberação dos resultados.
TÓPICO 2 —
COLETA, TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO DE AMOSTRAS EM MICROBIOLOGIA CLÍNICA
2 COLETA E TRANSPORTE DE MATERIAIS BIOLÓGICOS
Nunca devemos esquecer que o procedimento da coleta deve ser muito cui dadoso. Seja pela segurança do paciente ou pela segurança do coletador. Todo cuidado é pouco, portanto, siga os protocolos preestabelecidos. IMPORTANTE QUADRO 5 – COLETA DE MATERIAL PARA O LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA: CONSIDE RAÇÕES GERAIS E DE SEGURANÇA CONSIDERAÇÕES GERAIS DA COLETA MICROBIOLÓGICA • Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível. • Instruir claramente o paciente sobre o procedimento. • Observar a antissepsia na coleta de todos os materiais clínicos. • Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado. • Considerar o estágio da doença na escolha do material. A fase da doença irá determinar o melhor local da coleta. Exemplo: patógenos entéricos causado res de diarreia, estão presentes em maior quantidade e são mais facilmente isolados durante a fase aguda ou diarreica do processo infeccioso intestinal, logo, a melhor espécime seria as fezes do paciente. • Coletar uma quantidade satisfatória de material, permitindo uma completa análise microbiológica. Caso a quantidade seja inferior, priorizar os exames. • O pedido do exame deve conter as informações básicas do paciente (nome, idade), informações clínicas (sinais e sintomas, características do sítio de infecção, portador de doenças crônicas), data/hora da coleta e natureza do exame solicitado. CONSIDERAÇÕES DE SEGURANÇA • Utilizar as barreiras de proteção necessárias a cada procedimento. • Toda amostra deve ser tratada como potencialmente patogênica. • Usar frascos e meios de transporte apropriados. • Não manusear a amostra em trânsito: paciente e laboratório. • Não contaminar a superfície externa do frasco de coleta e verificar se ele está firmemente vedado (caso ocorram respingos ou contaminação na parte externa do frasco, fazer descontaminação com álcool 70% ou outra solução descontaminante disponível). • Não contaminar a requisição médica que acompanha o material. • As amostras deverão ser transportadas em sacos plásticos fechados. • Identificar claramente a amostra coletada, com todos os dados necessários. • Colocar a identificação no frasco de coleta e nunca na tampa ou sobre rótulos. • Encaminhar os materiais imediatamente ao laboratório. FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 10 mar. 2021.
TÓPICO 2 — COLETA, TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO DE AMOSTRAS EM MICROBIOLOGIA CLÍNICA
Amostras inadequadas devem ser devidamente rejeitadas, uma vez que o critério de recebimento implica diretamente na correlação clínico/laboratorial. O microbiologista ou responsável pela rotina deverá verificar se a amostra está apropriadamente identificada, se a quantidade de material é suficiente e observar o aspecto da amostra – purulento, límpido, hemorrágico etc. (BRASIL, 2004; PROCOP et al., 2018). O Quadro 6 detalha quais os tempos críticos para a amostra dar entrada no laboratório e os meios de transportes recomendados. QUADRO 6 – TEMPO CRÍTICO PARA ENTREGA DA AMOSTRA AO LABORATÓRIO E MEIOS DE TRANSPORTE Amostra Tempo Crítico Frascos e Meios de Transporte Líquor Imediatamente (não refrigerar) Tubo seco estéril. Líquido pleural Imediatamente (não refrigerar) Tubo seco estéril. Swab Imediatamente (não refrigerar) Tubo seco estéril ou meio semissólido (Stu art, Amies). Suspeita de anaeró bios 30 minutos Meio de transporte apropriado e evitar o transporte em seringa com agulha. Feridas e tecidos 30 minutos de ou até 12 horas (meio de transporte) Meio de transporte apropriado. Hemocultura 30 minutos (não refrigerar) Frascos com meios de cultura para rotina ma nual ou automatizada. Trato respiratório 30 minutos Tubo seco estéril. Trato gastrointestinal 1 hora Tubo seco estéril. Urina 1 hora ou refrigerada até 24 horas Pote seco estéril. Fezes 12 horas se em meio de transporte Cary Blair meio modi ficado para transporte de fezes, com pH 8,4. Boa recuperação tam bém fezes, com pH 8,4. Boa recuperação também para Vibriosp e Campylobacter. FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021.
Não é o objetivo deste livro se tornar um manual de coleta, porém, é importante destacar como é realizado tal procedimento das principias amostras trabalhadas em um laboratório de microbiologia. São elas: Lesões, Abscessos e Exsudatos Material Genital Fezes Urina Escarro Hemocultura
Todas as instruções descritas abaixo estão em conformidade com Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde descrito pela ANVISA (BRASIL, 2004). Não serão abordados todos os tipos de coleta, logo, para maiores detalhes recomendados uma leitura aprofundada do documento.
3 INSTRUÇÕES PARA COLETA: LESÕES, ABSCESSOS E
EXSUDATOS
A origem do material precisa ser especificado, por isso, “secreção de ferida” é um termo que não deve ser utilizado, pois o local da coleta deve ser descrito quanto ao sítio anatômico, estas informações são extremamente importantes para o laboratório uma vez que auxilia na interpretação dos resultados. QUADRO 7 – INSTRUÇÕES PARA COLETA DE FERIDAS, ABSCESSOS E EXSUDATOS FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021. Procedimento: • As margens e superfície da lesão devem ser descontaminadas com solução de povidine iodine (PVPI) e soro fisiológico (metade/metade). • Proceder à limpeza com solução fisiológica. • Coletar o material purulento localizado na parte mais profunda da ferida, utili zando-se, de preferência, aspirado com seringa e agulha. Quando a punção com agulha não for possível, aspirar o material somente com seringa tipo insulina. • Os Swabs são menos recomendados e serão utilizados apenas quando os pro cedimentos acima citados não forem possíveis. A escarificação das bordas após antissepsia pode produzir material seroso que é adequado para cultura. Observações: • A descontaminação da superfície das lesões ou abscessos abertos, antes da coleta do material, é crítica para interpretação do resultado. • Não coletar o pus emergente. O material das margens da lesão e a parte mais profunda do sítio escolhido são mais representativos e possuem maior viabilidade de microrganismos. • A cultura de lesões secas e crostas não é recomendada, a menos que a obten ção de exsudato não seja possível. • A coleta de ferida de queimadura deve ser realizada após extensa limpeza e debridamento da lesão. Biópsia da pele é a técnica mais recomendada.
TÓPICO 2 — COLETA, TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO DE AMOSTRAS EM MICROBIOLOGIA CLÍNICA
4 INSTRUÇÕES PARA COLETA: MATERIAL GENITAL
As amostras genitais são variadas, seja para o trato masculino ou feminino. No Quadro 8 estão destacados os principais sítios genitais, bem como em quais estão indicados o cultivo de anaeróbios ou não. QUADRO 8 – AMOSTRA E SÍTIOS GENITAIS PARA CULTURA FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021. QUADRO 9 – PROCEDIMENTOS PARA COLETA DE SECREÇÃO VAGINAL FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021. Serão apontados os procedimentos de coleta de secreção vaginal (Quadro 9) e de secreção uretral (Quadro 10), que são as amostras genitais em que mais comumente são realizadas as análises microbiológicas. Preparo da paciente Recomenda-se: • Não estar em período menstrual. • Não se deve utilizar ducha e cremes vaginais na véspera da coleta. • Faz-se necessário abstinência sexual por três dias. Procedimento • O especulo deve ser inserido (sem lubrificante; usar água morna) na vagina. • Remover o excesso de muco cervical com swab de algodão. • Os swabs indicados devem ser inseridos, rodar por alguns segundos sobre o fundo do saco, retirar e voltar aos meios indicados no kit: - Com o swab seco: realizar as lâminas para bacterioscopia da secreção fresca. - Com o swab do meio de transporte para cultura aeróbia/fungos.
Uma boa coleta e agilidade na entrega da amostra ao laboratório define o sucesso da cultura, pois algumas bactérias podem se tornar inviáveis pela de mora em sua semeadura. Considerando amostras de secreção uretral, a Neisseria gonorrhoeae é a suspeita clínica na maioria dos casos. Essa bactéria será melhor discutida adiante, porém, vale lembrar que a ela é muito sensível e pode morrer rapidamente se não for semeada imediatamente após a coleta. QUADRO 10 – PROCEDIMENTOS PARA COLETA DE SECREÇÃO URETRAL FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021. QUADRO 11 – PROCEDIMENTO PARA COLETA DE FEZES EM MICROBIOLOGIA CLÍNICA FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021. Procedimento • As primeiras gotas da secreção devem ser desprezadas. • Deve-se coletar a secreção purulenta, de preferência pela manhã, antes da primeira micção ou há pelo menos duas horas ou mais, sem ter urinado. • Utilizar a alça bacteriológica descartável ou swab estéril fino. • A amostra deve ser acondicionada em meio de transporte e realizar as lâminas para bacterioscopia da secreção fresca. • Enviar imediatamente para o laboratório. Em pacientes assintomáticos, deve-se coletar a amostra através de massagem prostática ou com pequeno swab inserido alguns centímetros na uretra.
5 INSTRUÇÕES PARA COLETA: FEZES
As amostras devem ser coletadas no início ou na fase aguda, pois, nesta fase o patógeno está presente em maior número. É importante que a coleta seja realizada antes da antibioticoterapia. • As fezes devem ser coletadas e acondicionadas em um frasco contendo o meio para transporte (Cary Blair ou salina glicerinada tamponada), forneci do pelo laboratório, em quantidade equivalente a uma colher de sobremesa. Preferir sempre as porções mucosas e sanguinolentas. • O frasco deve ser bem fechado. • A amostra deve ser entregue no laboratório em uma hora, caso isso não ocorra conservar em geladeira a 4 ºC, no máximo por um período de 12 ho ras. Marcar o horário da coleta.
6 INSTRUÇÕES PARA COLETA: URINA
A amostra deve ser, preferencialmente, a primeira micção do dia. Caso não seja possível, deve-se orientar o paciente a fazer retenção vesical de duas a três horas e só então realizar a coleta.
TÓPICO 2 — COLETA, TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO DE AMOSTRAS EM MICROBIOLOGIA CLÍNICA
QUADRO 12 – PROCEDIMENTO PARA COLETA DE URINA EM MICROBIOLOGIA CLÍNICA FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021. Crianças Deve-se realizar assepsia rigorosa prévia dos genitais com água e sabão neutro, e posterior secagem com gaze estéril. Modo de coleta O jato intermediário (jato médio) espontâneo é o ideal. Bem indicado em crian ças que urinam sob comando, usado também em lactentes. Em lactentes pode-se usar o saco coletor de urina, porém a troca deve ser realizada de 30 em 30 mi nutos e, ao trocar o coletor, refazer a assepsia. Em casos especiais (RN, lactentes de baixo peso, resultados repetidamente duvidosos) o indicado é punção vesical suprapúbica (este procedimento deve ser realizado por um médico). Adultos Sexo Feminino • O processamento laboratorial deve ser feito dentro de duas horas. Caso não seja possível, as amostras devem ser refrigeradas a 4 ºC até o momento da semeadura (no máximo de 24 horas). • É necessário afastar os grandes lábios com uma das mãos e continuar assim enquanto fizer a higiene e coleta do material. • A higienização do local pode ser realizada com gaze umedecida ou reco menda-se que a paciente tome banho. • No momento da coleta, afastar os grandes lábios para urinar. Colher o jato médio urinário no frasco fornecido pela enfermagem (um pouco mais da metade do frasco). • Deve-se evitar encher o frasco. • Fechar bem o frasco e caso haja algum respingo na parte externa do frasco, lave-o e enxugue-o. Adultos Sexo Masculino • Primeiramente, é necessário que seja realizada a higienização. • Coletar jato intermediário. • Pacientes cateterizados com sistema de drenagem fechada: O Colher a urina puncionando-se o cateter na proximidade da junção com o tubo de drenagem. O Não colher a urina da bolsa coletora. O Adicionar uma observação caso o paciente esteja cateterizado. Observação: Não aceitar, sem exceção, as coletas de 24 horas dos materiais clínicos para cul tura, particularmente de urina para o isolamento de micobactérias, devido a possível contaminação do material.
7 INSTRUÇÕES PARA COLETA: ESCARRO
TÓPICO 2 — COLETA, TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO DE AMOSTRAS EM MICROBIOLOGIA CLÍNICA
8 INSTRUÇÕES PARA COLETA: HEMOCULTURAS
A coleta de hemocultura é bastante utilizada em laboratórios que aten dem em ambiente hospitalar, sendo rotineira a coleta de várias amostras no dia. Toda a coleta deve ser minuciosa, uma vez que o procedimento é muito passível a contaminações que por consequência podem gerar falsos positivos e compro meter a confiabilidade do exame. O volume de sangue coletado influencia diretamente nos resultados da hemo cultura. O ideal é que seu volume corresponda a 10% do volume total do frasco de coleta. Quanto maior o volume de sangue inoculado no meio de cultura, por amostra, melhor recuperação do microrganismo, respeitando-se a proporção sangue/meio citada. Quando há desproporção entre sangue e meio de cultura, pode haver inibição do cres cimento de microrganismos. Os frascos de coleta de 10 ml são os mais indicados. O SPS (Polianetolsulfonato sódico) é o anticoagulante mais apropriado. IMPORTANTE QUADRO 14 – PROCEDIMENTOS PARA COLETA DE HEMOCULTURA Procedimento • A coleta deve ocorrer antes do uso de antibióticos. • Deve-se lavar as mãos e secá-las. • Primeiramente deve-se remover os selos da tampa dos frascos de hemocul tura e realizar assepsia prévia nas tampas com álcool 70%. • Em seguida garrotear o braço do paciente e selecionar uma veia adequada. Fazer a antissepsia com álcool 70% de forma circular e de dentro para fora. Aplicar solução de iodo (tintura de iodo 1% a 2% ou PVPI 10%) também com movimentos circulares e de dentro para fora. Após a aplicação deixar secar por um a dois minutos antes de efetuar a coleta. • Coletar a quantidade de sangue e o número de amostras recomendados no pedido médico. • Posteriormente remover o iodo do braço do paciente com álcool 70% para evitar reação alérgica. • Realizar a identificação dos frascos com todas as informações padronizadas. • Enviar ao laboratório juntamente com a solicitação médica devidamente preenchida. Observações: • Não é recomendada a técnica de coleta através de cateteres ou cânulas. • Deve-se dar preferência a punção venosa. • Não trocar de agulhas entre a punção de coleta e distribuição do sangue no frasco de hemocultura.
RESUMO DO TÓPICO 2 Neste tópico, você aprendeu que: • Os POPs são utilizados para que se mantenha o controle de qualidade nas técnicas realizadas. • As fases de processamento de amostras são: O Pré-analítica: que envolve preparo do paciente e coleta do material. O Analítica: período em que a amostra será processada no laboratório. O Pós-analítica: validação e liberação dos resultados. • A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiológico e favorecer o crescimento de outros microrganismos da microbiota induzindo a um tratamento inapropriado. • Foram especificados os tipos de coleta de acordo com cada material, descren do o passo a passo de cada protocolo. • Importante ressaltar a importância de o profissional ter o conhecimento do protocolo para que possa instruir o paciente ou mesmo explicar como serão realizados cada procedimento.
1 A urina é um material de coleta simples, não invasiva e indolor, e seu exame for
nece importantes informações, tanto do sistema urinário quanto do metabolismo e de outras partes do corpo. É correto afirmar que para este exame deve-se: a) ( ) Higienizar o local, coletar a primeira urina da manhã sendo o jato inter mediário. b) ( ) Higienizar o local, coletar a primeira urina da manhã sendo primeiro jato. c) ( ) Não é necessário higienizar o local, coletar a primeira urina da manhã sendo o jato intermediário. d) ( ) Não é necessário higienizar o local, coletar a primeira urina da manhã, sendo o primeiro jato. 2 (IBFC-EBSERH - Técnico em Análises Clínicas, 2016) Para o procedimento da co leta de hemocultura, cada instituição deverá ter suas normas de coleta particula rizadas de acordo com o tipo de sistema utilizado (manual x automatizado) e do tipo de paciente. Assinale a alternativa incorreta quanto à coleta de hemocultura: a) ( ) Não é recomendada a técnica de coleta através de cateteres ou cânulas quando se podem utilizar punções venosas. b) ( ) Punções arteriais não trazem benefícios na recuperação dos microrga nismos quando comparadas com punções venosas. c) ( ) Recomenda-se a troca de agulhas entre a punção de coleta e distribui ção do sangue no frasco de hemocultura. d) ( ) Método de coleta do sangue e o volume coletado influenciam direta mente no sucesso de recuperação de microrganismos e uma interpreta ção adequada dos resultados. e) ( ) O anticoagulante recomendado é o SPS (Polianetolsulfonato sódico). 3 (UFRJ, 2016) O diagnóstico laboratorial da tuberculose (TB) pulmonar e la ríngea se dá, na grande maioria dos casos, por meio de exames de escarro. A adequada coleta de escarro para realização de baciloscopias é importante no acompanhamento e avaliação da eficácia do tratamento adotado. Conside rando a participação do Técnico de Enfermagem para elucidação diagnóstica e tratamento, na coleta de escarro para baciloscopia deverá ser realizada: a) ( ) a coleta de uma amostra de escarro para diagnóstico de casos novos, durante a primeira consulta e da segunda amostra na manhã do dia seguinte, no consultório de enfermagem. b) ( ) a coleta entre 10 e 15ml de escarro para baciloscopia, com aspecto mu copurulento, realizada no consultório de enfermagem para preservar a privacidade do paciente. c) ( ) a coleta entre 5 a 10ml de escarro para baciloscopia, obtido da árvore brônquica após esforço de tosse, com aspecto mucopurulento, mensal mente para acompanhamento dos casos.
d) ( ) a coleta entre 5 a 10ml de escarro para baciloscopia, com aspecto muco purulento; acondicionado em pote descartável de plástico não transpa rente com capacidade de 35-50 ml. e) ( ) a coleta entre 5 a 10ml de escarro, com aspecto mucopurulento para ba ciloscopia, após orientação ao paciente para higienizar a cavidade oral com soluções antissépticas.
1 INTRODUÇÃO
Uma vez que a coleta foi realizada corretamente e o material chega ao laboratório de microbiologia, você irá se perguntar: O que fazer? Por onde co meçar? Quais as técnicas iniciais que devem ser empregadas ao material clínico? Neste tópico, iremos abordar os aspectos iniciais da análise microbiológica, detalhando-os para cada tipo bacteriano que será discutido no Tópico 4. A Figura 3 mostra de forma resumida as etapas de processamento das amostras microbiológicas.
TÓPICO 3 —
PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS NA MICROBIOLOGIA CLÍNICA FIGURA 3 – FLUXOGRAMA INICIAL DA ANÁLISE LABORATORIAL APÓS A CHEGADA DA AMOSTRA FONTE: O autor (2021)
2 IDENTIFICAÇÃO E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
TÓPICO 3 — PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS NA MICROBIOLOGIA CLÍNICA
QUADRO 17 – TÉCNICA DE OBSERVAÇÃO DIRETA (SALINA) FONTE: O autor (2021) Material utilizado • Solução Salina (0,85%) • Lâmina • Lamínula Técnica • Primeiramente deve-se adicionar uma gota de solução salina no centro de uma lâmina, em seguida, suspender uma colônia ou uma alçada do material a ser investigado. • Adicionar uma lamínula e examiná-la no microscópio, com objetiva de 40X ou 100X com a adição de óleo de imersão. A Técnica de coloração de Gram é usada para classificar bactérias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes (Gram-positivas ou Gram-negativas). No laboratório de microbiologia clínica acontece teste adicional rápido para o diagnóstico de agentes infecciosos, mas que acaba exigindo a atuação de profissionais capacitados e experientes para sua correta realização e interpretação. Também pode ser utilizado para avaliar a qua lidade da amostra clínica analisada (BRASIL, 2004; PROCOP et al., 2018). As interpretações dos esfregaços corados pelo Gram levam em conside ração características relacionadas à coloração, ao tamanho, à forma e ao agrupa mento das células, sendo as mesmas influenciadas por diversos fatores, como: a idade da cultura, o meio de cultivo utilizado, a atmosfera de incubação e a pre sença de substâncias inibidoras (BRASIL, 2004; PROCOP et al., 2018). Conforme o Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde, publicado pela ANVISA (BRASIL, 2004), sua utilização é bastante ampla, porém, podemos destacar algumas das situações mais pertinen tes para o emprego da técnica: • Bacterioscopia da maioria dos materiais biológicos ou culturas de microrga nismos em meios sólidos ou líquidos. • Análise de amostras de culturas jovens de meio de cultura sem inibidores e amostras clínicas recém-coletadas – por fornecerem os melhores resultados. • Verificação da morfologia bacteriana a partir de esfregaços de cultura em caldo. Observe que o que precede a técnica do gram é a confecção do esfregaço. Os esfregaços devem ser preparados com um gradiente de espessura suficientemente denso para facilitar a visualização, mas, também, bastante esparso para indicar as características do agrupamento. Lâminas limpas e novas deverão ser utilizadas de preferência. Os me lhores resultados serão obtidos se as mesmas permanecerem no álcool até o momento do uso (BRASIL, 2004). A técnica adequada para o preparo de esfregaço estão destacadas no Quadro 18 e as particularidades para cada material clínico estão destacadas no Quadro 19. O Quadro 20 detalha a confecção de esfregaços a partir de meios de cultura.
QUADRO 18 – TÉCNICA PARA PREPARO DE ESFREGAÇO BACTERIOLÓGICO FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021. Material: • Lâminas de vidro limpas e desengorduradas 7,5 cm x 2,5 cm • Alça bacteriológica • Salina estéril • Bico de Bunsen • Material Clínico • Swab estéril (quando necessário) Procedimento: • Primeiramente deve-se identificar a lâmina de maneira segura. • O swab deve ser passado em movimentos suaves para a não destruição das células. • Utilizar chama para a fixação. • Caso o material seja escasso, demarcar a área do esfregaço. • Para finalizar aplicar a coloração apropriada.
TÓPICO 3 — PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS NA MICROBIOLOGIA CLÍNICA
QUADRO 19 – PARTICULARIDADES PARA O PREPARO DE ESFREGAÇO A PARTIR DO MATERIAL CLÍNICO FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021.
TÓPICO 3 — PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS NA MICROBIOLOGIA CLÍNICA
QUADRO 22 – PRINCIPAIS BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS, GRAM-NEGATIVAS E MICOBACTÉRIAS FONTE:https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021. GramPositivos Cocos Cadeias longas - estreptococos aeróbios e anaeróbios. Cachos – estafilococos e peptococos (anaeróbio). Cachos e tétrades – Micrococcus, Stomatococcus, Ae rococcusspp. Aos pares – Enterococcus e S. pneumoniae (Em chama de vela). Cocobacilos Gram variável – Gardnerella. Retos e curtos – Lactobacillus, Erisipelotrix, Listeria, Rhodococcus. Bacilos Ramificados – Nocardia, Streptomyces, Actinomyces, Propionibacterium (anaeróbico). Difteróides – Corynebacterium. Esporulados – Bacillus, Clostridium. GramNegativos Cocos (aos pares) Neisseria, Moraxella, Branhamella, Acinetobacter, Veillonella (anaeróbio). Cocobacilos Haemophillus (pleomórfico, ora coco-bacilo, ora ba cilo), Brucella, Bordetella, Pasteurella, Actinobacillus, Bacteróidesa (anaeróbicos), Enterobactérias. Bacilos Curvos – Campylobacter, Helicobacter, Vibrio. Helicoidais – Arcobacter e Borrelia. Leptospira e Treponema (não visíveis ao Gram). Retos – Enterobactérias não fermentadores. Extremidades afiladas – Fusobacterium (anaeróbio). Extremidade bifurcada – Bifidobacterium (anaeróbio). Micobactérias Bacilos Mycobacteriumspp. As técnicas morfológicas e de coloração são limitadas e, em muitos casos, não é possível identificar a espécie em questão. A principal forma de contornar essa situação é utilizando técnicas de cultura, que permitem uma avaliação mor fológica de colônias e possibilita a realização de provas bioquímicas. Tais mé todos ampliam a possibilidade de avaliação e, por conseguinte, permitem uma identificação precisa do microrganismo relacionado. Meios de cultura, ou cultura microbiológica, é um método que permite o crescimento e isolamento de microrganismos através da sua inoculação em pre parados especiais, em condições de laboratório. Em geral, os microrganismos são cultivados em recipientes como placas, tubos, frascos (PROCOP et al., 2018). Os meios de cultivo contêm substâncias exigidas pelas bactérias e que são úteis ao seu crescimento e sua multiplicação. Quimicamente, devem conter substâncias que favoreçam a síntese de sua própria matéria nutritiva e devem
TÓPICO 3 — PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS NA MICROBIOLOGIA CLÍNICA
QUADRO 24 – MEIOS DE CULTURA QUANTO A SUA FUNÇÃO FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021. • Meios simples: São aqueles que possuem os componentes essenciais para o crescimento de microrganismos pouco exigentes. Podem ser usados como base no preparo de outros meios. Por exemplo, caldo simples. • Meios de enriquecimento: São meios que foram suplementados com mate riais altamente nutritivos. As substâncias enriquecedoras comumente utili zadas para produção desses meios são o sangue, o soro, o ovo, o extrato de leveduras etc. Com um grande aporte de nutrientes, esses meios de cultura permitem o crescimento de microrganismos fastidiosos (exigentes). Exem plo: Ágar sangue e o Ágar chocolate. • Meios seletivos: Favorecem o desenvolvimento de determinados micror ganismos em detrimento de outros, geralmente pela adição de substâncias inibidoras(antibióticos), que selecionam o crescimento de um determinado grupo. Exemplo: Ágar Salmonella-Shigella e o Ágar manitol; • Meios diferenciais: São adicionados alguns reagentes ou substâncias que resultam em um tipo de crescimento relativamente definido, permitindo ao observador diferenciar um grupo ou uma espécie de microrganismo. Exem plo: Ágar MacConkey e o ágar CPS. • Meios de manutenção: São destinados a manter a viabilidade e as caracte rísticas fisiológicas de uma cultura bacteriana. Exemplo: Ágar nutriente e meio Stuart (conservantes de cepas bacterianas). • Meios de transporte: São meios isentos de nutrientes e que possuem um agen te redutor (tioglicolato ou cisteína) que impede que as bactérias se reprodu zam ou acidifiquem o meio. Exemplos: Ágar Cary-Blair e Caldo Tioglicolato. Existem variadas técnicas de semeadura (semear o microrganismo em meio de cultura), definidas para diferentes abordagens. Versaremos sobre quatro principais técni cas empregadas no laboratório de microbiologia. No Quadro 27 detalhamos tais técnicas. QUADRO 25 – PRINCIPAIS TÉCNICAS DE SEMEADURA EMPREGADAS EM UM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA Técnica de Semeadura em Estrias
TÓPICO 3 — PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS NA MICROBIOLOGIA CLÍNICA
Técnica em Semeadura Quantitativa Objetivo • Realizar da contagem de Unidade Formadora de Colônias (UFC). • Para este teste é necessário utilizar alças calibradas com volumes que em geral são de 1, 10 ou 100 μL. • O número de UFC obtido deverá ser multiplicado pelo fator de correção para 1 ml, relativo ao volume inoculado; 1.000, 100 ou 10, respectivamente. Procedimento • Homogeneizar o material. • Com o auxilio da alça calibrada obter o volume definido. • Sem flambar a alça, distribuir o material em linha reta até a outra extremidade. Perpendicularmente, distribuir o material por toda a superfície de maneira uni forme. Repetir o mesmo procedimento por 3 vezes, ou até que a superfície da pla ca esteja seca, alterando a direção da estria, como demonstrado na imagem acima. FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021. Uma vez que a cultura foi realizada, o crescimento, bem como as colônias, precisa ser avaliado. Uma das primeiras avaliações se dá quanto à morfologia co lonial. O Quadro 26 descreve esses aspectos. As características bioquímicas serão discutidas nos tópicos seguintes para cada subtipo bacteriano.
TÓPICO 3 — PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS NA MICROBIOLOGIA CLÍNICA
QUADRO 26 – DESCRIÇÃO DA MORFOLOGIA COLONIAL FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021. Leitura do material: Manual de Microbiologia Disponível em: http://www.csvlab.com.br/download/Manual-de-Microbiologia.pdf DICAS
RESUMO DO TÓPICO 3 Neste tópico, você aprendeu que: • Os aspectos iniciais da análise microbiológica, sendo os detalhes para cada tipo bacteriano. • Verificação da qualidade da amostra. • As técnicas iniciais, como compreender o meio de cultura adequado para po der realizar a microscopia e coloração da bactéria. • Existem meios de culturas sólidos e líquidos. Os principais objetivos na utili zação de meios de cultura são: O crescimento bacteriano; O isolamento bacteriano; O estudo da morfologia colonial; O pesquisa de patogenicidade; O pesquisa das características bioquímicas. • Uma vez que a cultura foi realizada, o crescimento, bem como as colônias, precisa ser avaliado. Uma das primeiras avaliações se dá quanto à morfologia colonial. • Pode-se realizar a coloração para a diferenciação entre Gram positivas, Gram negativas e BAAR. • Também destacamos a importância de ter o conhecimento das técnicas de acordo o microrganismo que está sendo identificado. • Todo o processo desde a coleta realizada de forma adequada a isolamento correto, auxiliam na identificação e diagnóstico corretos para posterior libe ração dos laudos.
1 (UFC, 2017) O desenvolvimento de microrganismos em laboratório é re alizado através do fornecimento de nutrientes essenciais que compõem o meio de cultivo. Relacione os tipos de meios abaixo com sua respectiva fun ção e marque a opção que representa a sequência correta. I- Meio Diferencial II- Meio de enriquecimento III- Meio Seletivo IV- Meio para contagem ( ) Enumeração de microrganismos presen tes na água, nos alimentos, no solo etc. ( ) Facilita a identificação de um microrga nismo de interesse. ( ) Favorece o crescimento de microrganis mos que estão em pequenas quantidades. ( ) Permite o crescimento de um microrga nismo em particular e/ou inibem o cres cimento de outros microrganismos. a) ( ) II - I - III - IV b) ( ) II - I - IV - III c) ( ) IV - I - II - III d) ( ) IV - I - III - II e) ( ) IV - III - II - I 2 (UFC, 2017) A semeadura primária adequada, a seleção correta dos meios de cultura e as metodologias a serem utilizadas são etapas fundamentais na rotina de um laboratório de Microbiologia. Analise as afirmativas abaixo as classificando com (V) para verdadeiro e (F) para falso. Depois marque a alternativa correspondente a sequência correta. ( ) Os meios de cultura podem ser sólidos, semissólidos, mas nunca líqui dos, com composição química simples ou complexa. ( ) Para o cultivo de um microrganismo é necessário selecionar o meio de cultura, a atmosfera e o tempo de incubação apropriados. ( ) A Semeadura em meio sólido, por esgotamento, objetiva o isolamento de microrganismos. ( ) O Ágar MacConkey pode ser considerado seletivo e diferencial. Pois di ferencia bactérias Gram-positivas das Gram-negativas e seleciona as bac térias fermentadoras de lactose das não-fermentadoras. ( ) O Ágar sangue é um meio de cultura utilizado no isolamento primário dos microrganismos e uma das suas características é diferenciar as bacté rias quanto ao tipo de hemólise. a) ( ) F, V, V, F, V. b) ( ) V, F, F, V, F. c) ( ) F, V, F, F, V. d) ( ) V, V, F, F, V. e) ( ) F, V, F, V, F.
1 INTRODUÇÃO
Com exceção das enterobactérias, as bactérias gram-positivas (particular mente os cocos) constituem os microrganismos isolados com mais frequência em amostras clínicas. Essas bactérias estão disseminadas na natureza e podem ser isoladas do ambiente ou como habitantes comensais da pele, das mucosas e de outras partes do corpo dos seres humanos e animais (PROCOP et al., 2018). A ampla presença das bactérias gram-positivas na natureza dificulta, em certas ocasiões, a interpretação de seu isolamento de amostras obtidas de pacien tes, a não ser que existam manifestações clínicas evidentes de um processo pato lógico infeccioso (PROCOP et al., 2018). O isolamento desses microrganismos a partir de amostras deve ser sem pre correlacionado com a condição clínica do indivíduo antes que se possa esta belecer o seu papel no processo infeccioso (PROCOP et al., 2018). Neste tópico, iremos abordar a importância do isolamento e identificação corretas das bactérias envolvidas em processos patológicos.
TÓPICO 4 —
PRINCIPAIS BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS E GRAM-NEGATIVAS DE IMPORTÂNCIA MÉDICA: ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO
2 COCOS GRAM-POSITIVOS
Considerando os cocos gram-positivos (CGP), três gêneros têm importância clínica, uma vez que são encontrados na ampla maioria dos casos. No Quadro 27 estão relacionados os principais gêneros e espécies de CGP. QUADRO 27 – PRINCIPAIS COCOS GRAM-POSITIVOS (GÊNEROS E ESPÉCIES) DE IMPORTÂNCIA MÉDICA Cocos gram-positivos (Gêneros) Principais espécies Staphylococcus sp. S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus S. lugdunensis
Streptococcus sp. S. pyogenes S. pneumoniae S. agalactiae Streptococcus do grupo viridans Enterococcus sp. E. faecalis E. faecium FONTE: Adaptado de Procop et al. (2018) Microscopicamente são distintos, variando em suas morfologias em estafilococo (“cacho de uva”), estreptococo (“em cadeia longa”) e diplococos (“em dupla”), sendo esse último característico da espécie S. pneumoniaie. Algumas morfologias estão descritas na Figura 5. FIGURA 5 – PRINCIPAIS COCOS GRAM-POSITIVOS (GÊNEROS E ESPÉCIES) DE IMPORTÂNCIA MÉDICA EM COLORAÇÃO DE GRAM A PARTIR DE HEMOCULTURAS FONTE: <www.microbe-canvas.com>. Acesso em: 25 mar. 2021. A: S. aureus (Morfologia típica de estafilococos em “cacho de uva”); B: S. pneumoniae (Morfologia em diplococos); C: E. faecalis (Morfologia típica de estreptococos “Em fileira”).
TÓPICO 4 — PRINCIPAIS BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS E GRAM-NEGATIVAS DE IMPORTÂNCIA MÉDICA: ISOLAMENTO E
IDENTIFICAÇÃO É muito comum relacionarmos o nome da espécie com sua morfologia, no entanto, repare que a espécie Streptococcus pneumoniae não é morfologicamente um estreptococo, mas um diplococo. IMPORTANTE
2.1 IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Os Staphylococcus spp. estão entre os agentes mais frequentes nas princi piais afecções humanas. De maneira geral, esse gênero é composto por 37 espé cies, sendo que 17 delas podem ser isoladas em amostras biológicas humanas. São anaeróbias facultativas e catalase positivas. No entanto, rotineiramente, boa parte dos laboratórios não faz a distinção de todos membros dos grupos, diferen ciando apenas estafilococos coagulase positiva (S. aureus) dos estafilococos coa gulase negativa (todos as demais espécies). O Staphylococcus aureus é um agente de variado poder patogênico, que causar desde simples infecções (furúnculos e espinhas) até infecções mais graves (endocardite, septicemia, síndrome do choque tóxico). Possui uma elevada im portância na saúde pública, principalmente por ser o responsável por inúmeras infecções relacionadas à Assistência à Saúde. Nas últimas décadas, houve um significativo aumento na prevalência de cepas multirresistentes a alguns anti bióticos, como os Staphylococcus aureus Meticilina-Resistentes (MRSA). Essa bactéria chama a atenção frente as outras do grupo pela alta capacidade virulenta (MOURA et al., 2011; BROOKS et al., 2014; ACOSTA et al., 2018). As patologias humanas mais comuns e que estão relacionadas as espécies deste gênero estão destacadas nos Quadros 28, 29 e 30. QUADRO 28 – PRINCIPAIS PROCESSOS INFECCIOSOS RELACIONADOS AO GÊNERO Staphylococcus spp Pneumonias. Bacteremias. Infecções de pele e tecidos moles. Infecções relacionadas ao uso de próteses e cateteres venosos. Infecções do trato urinário. Meningites. FONTE: Adaptado de Murray et al. (2018)
QUADRO 29 – BACTÉRIAS X DOENÇAS FONTE: Adaptado de Murray et al. (2018) Espécie Origem Histórica Doenças S. aureus Aureus, dourado ou amarelo; as colônias de S. aureus podem ficar amarelas com o tempo. Infecções pirogênicas em geral; infecções mediadas por toxinas. S. epidermi dis Epidermidis, epidermidis (pele). Infecções oportunistas (p.ex., infecções associadas ao uso de cateteres, infecção em um local onde foi introduzido um corpo estranho, como por exemplo uma válvula cardíaca artificial [endo cardite subaguda]). S. saprophyticus Saprophyticus: sapros, pútri do; phyton, planta (saprofítico ou que cresce em tecido morto). Infecções do trato urinário, parti cularmente em mulheres jovens e ativas sexualmente. S. lugdunen sis Lugdunensis: Lugdunun, nome de leão em latim, animal em que a bactéria foi inicialmen te isolada. Endocardite aguda em pacientes com válvulas cardíacas naturais. QUADRO 30 – PRINCIPAIS PROPRIEDADES DO S. AUREUS • Capacidade para crescer em condições aeróbias e anaeróbias, em um amplo intervalo de temperaturas e na presença de altas concentrações de sal; esta última característica é importante porque essas bactérias frequentemente causam intoxicação alimentar. • Cápsula: polissacarídica que protege as bactérias da fagocitose. • Proteínas de superfície celular (proteína A, proteínas que são fatores de aglutina ção bacteriana) responsáveis pela adesão das bactérias aos tecidos do hospedeiro. • Catalase: que protege os estafilococos dos peróxidos produzidos pelos neu trófilos e macrófagos • Coagulase: converte o fibrinogênio em fibrina insolúvel que forma coágulos e pode proteger o S. aureus da fagocitose. • Enzimas hidrolíticas e citotoxinas: O Lipases, nucleases e hialuronidase que causam destruição tecidual. O Citotoxinas (alfa, beta, delta, gama, leucocidina) que lisam hemácias, neutrófilos, macrófagos e outras células do hospedeiro. Toxinas: O Enterotoxinas (muitas antigenicamente distintas) são termoestáveis e ácido-resistentes, responsáveis por intoxicação alimentar. O Toxinas esfoliativas A e B, provocam descamação da pele (síndrome da pele escaldada). O Toxina da síndrome do choque tóxico, é resistente ao calor e a proteases, e é responsável por uma patologia envolvendo múltiplos órgãos. FONTE: Adaptado de Murray et al. (2018)
TÓPICO 4 — PRINCIPAIS BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS E GRAM-NEGATIVAS DE IMPORTÂNCIA MÉDICA: ISOLAMENTO E
IDENTIFICAÇÃO As doenças causadas pelo S. aureus são classificadas em dois grupos: (1) Piogênicas localizadas ou “produtoras de pus”, que são caracterizadas por des truição tecidual, provocada por enzimas hidrolíticas e citotoxinas; e (2) Causadas por toxinas, que funcionam como superantígenos que provocam manifestações sistêmicas. O quadro 31 descreve detalhadamente cada uma delas. QUADRO 31 – DOENÇAS CAUSADAS POR S. AUREUS: DESCRIÇÃO DOS PRINCIPAIS TIPOS FONTE: Adaptado de Murray et al. (2018) Doenças Piogênicas • Impetigo: infecção cutânea localizada, caracterizada por vesículas cheias de pus sobre uma base avermelhada ou eritematosa; observada principalmente na face e nos membros; acomete principalmente crianças. • Foliculite: impetigo envolvendo os folículos pilosos, como os da barba. • Furúnculos (abscessos) e carbúnculos: grandes nódulos cheios de pus; po dem avançar para camadas mais profundas da pele e se espalhar para o sangue e outras áreas do corpo. • Infecções de ferida: caracterizadas por eritema e pus em locais de trauma ou cirurgia; mais difícil de tratar se houver um corpo estranho (p.ex., tala, sutura cirúrgica); a maioria das infecções, tanto na comunidade quanto nos hospitais, é causada por MRSA; surtos recorrentes de infecções são comuns. • Pneumonia: formação de abscessos nos pulmões; observada principalmente em indivíduos muito jovens ou muito velhos, frequentemente após infec ções virais do trato respiratório. • Endocardite: infecção do endotélio cardíaco; pode progredir rapidamente e está associada a uma alta taxa de mortalidade. • Osteomielite: destruição óssea, particularmente nas áreas altamente vascu larizadas dos ossos longos, em crianças. • Artrite séptica: infecção das articulações, caracterizada por inchaço, vermelhi dão, com acúmulo de pus; é a causa mais comum de artrite séptica em crianças. Doenças provocadas por toxinas • Intoxicação alimentar: após o consumo de alimento contaminado com a enterotoxina termoestável, manifesta-se rapidamente (de 2 a 4 horas), por meio de vômito frequente, diarreia e dores abdominais, mas regride em 24 horas. A intoxicação é rápida porque a toxina já é pré-formada no alimento, diferentemente de uma infecção, em que as bactérias teriam que crescer e produzir toxina no intestino. • Síndrome da pele escaldada: bactérias em uma infecção localizada produ zem a toxina que se espalha pelo sangue, provocando a formação de bolhas e descamação da epiderme; manifestação quase que exclusivamente obser vada em crianças muito novas • Síndrome do choque tóxico: bactérias em uma infecção localizada produ zem a toxina que afeta vários órgãos; caracterizada inicialmente por febre, hipotensão e uma erupção eritematosa macular difusa. Altas taxas de morta lidade podem estar associadas a esta doença, a menos que antibióticos sejam administrados imediatamente e a infecção local seja controlada.
Um ponto importante relacionado ao S. aureus é em relação a sua capacidade de desenvolver resistência a antimicrobianos. Recentemente, cepas de S. aureus resistente a meticilina (MRSA) têm chamado a atenção, uma vez que indica que nenhum beta-lactâ mico será eficaz na terapia. Iremos discutir melhor esse assunto na Unidade 3. IMPORTANTE Os Streptococcus spp. podem ser classificados por meio de vários critérios – padrão sorológico, padrões hemolíticos e propriedades fisiológicas. No entanto, a mais amplamente utilizada na literatura e na prática clínica é em conformidade com o grau de hemólise em ágar sangue. Dessa forma, são então classificados em alfa-hemolíticos (α), beta-hemolíticos (β) e gama-hemolíticos (γ). O Quadro 32 des creve essas características e a Figura 6 demonstra a classificação em ágar sangue. QUADRO 32 – DESCRIÇÃO DOS PADRÕES DE HEMÓLISE CARACTERÍSTICOS PARA A DIFE RENCIAÇÃO DOS STREPTOCOOCCUS SPP. Alfa-hemólise (α): é caracterizada por uma hemólise parcial, associada com a perda parcial de hemoglobina pelas hemácias, ocorrendo uma zona cinza-esver deada no meio de cultura ao redor da colônia. Streptococcus pneumoniae caracte riza-se por produzir este tipo de hemólise. Beta-hemólise (ß): é caracterizada pela lise completa das hemácias que rodeiam a colônia, ocorrendo uma zona transparente (zona de lise total) ao redor da co lônia. Streptococcus pyogenes realizam esse tipo de hemólise. Gama-hemólise (γ): é caracterizada pela ausência de hemólise. Cepas desses microrganismos não hemolíticos, ou d-hemolíticos, não causam modificação no meio de ágar sangue de carneiro. Exemplo: Enterococos. FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021. FIGURA 6 – PADRÕES DE HEMÓLISE EM ÁGAR SANGUE DE CARNEIRO FONTE: <www.microbe-canvas.com>. Acesso em: 15 mar. 2021.
TÓPICO 4 — PRINCIPAIS BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS E GRAM-NEGATIVAS DE IMPORTÂNCIA MÉDICA: ISOLAMENTO E
IDENTIFICAÇÃO A: Todos conjuntamente. B: Beta-hemólise. C: Alfa-hemólise. D: Gama-hemólise. Outra forma de classificá-los foi descrita, segundo Procop et al. (2018), por Rebeca Lancefield, em 1918, e foi baseada na composição antigênica da parede celular dos Streptococcus spp. Conforme essa classificação, eles estão dispostos em 20 grupos sorológicos designados por letras maiúsculas do alfabeto (A, B, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U e V), como mostra o Quadro 33. QUADRO 33 – CLASSIFICAÇÃO DE LANCEFIELD DOS STREPTOCOCCUS SPP. Espécies Hemólise Habitat Doença Grupo A Β Faringe e pele Infecções primárias, faringites, septicemia, impetigo. Sequelas de infecções: febre reumática, endo cardite e glomerulonefrite. S. pyogenes Grupo B α, β, γ Faringe e vagina Endocardites, pneumonia, infec ções neonatais (meningite, septice mia e pneumonia). S. agalactiae Grupo C α, β Faringe, vagina e pele Endocardite, febre puerperal e in fecções de feridas. S. equi S. equisimilis S. dysgalactiae Grupo D - não enterococos α, β Intestino grosso Infecções urinárias, abscessos pel vianos, peritonites, endocardites e infecções de feridas. S. bovis S. equinus Grupo D – Enterococcos α, β, γ Intestino grosso Infecções urinárias, abscessos pel vianos, peritonites, endocardites e infecções de feridas. S. faecalis S. faecium S. durans Grupo F Β Boca, dente e faringe Sinusites, cárie dentária, abscessos cerebrais, pneumonia e meningite. S. aginosus Grupo G Β Faringe, vagina e pele Infecções de feridas e endocardites. Streptococcus Grupo H Α Boca, dente e faringe Septicemia, endocardites, cárie dentária, sinusite. S. sanguis Grupo K Α Faringe e boca Septicemia, endocardites, meningi te, sinusite. Streptococcus pneumoniae Α Faringe, boca e traquéia Otite, endocardites, septicemia, meningite e pneumonia. FONTE: https://bit.ly/3eemr1Q. Acesso em: 15 mar. 2021.
TÓPICO 4 — PRINCIPAIS BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS E GRAM-NEGATIVAS DE IMPORTÂNCIA MÉDICA: ISOLAMENTO E
IDENTIFICAÇÃO É importante destacar que o homem é o reservatório e o hospedeiro exclu sivo de S. pneumoniae, cujo habitat é o sistema respiratório. Praticamente, todas as pessoas já foram colonizadas por esta bactéria em algum estágio da vida. Uma vez que essa bactéria tem forte relação com a microbiota humana; todas as faixas etárias, gêneros e etnias são susceptíveis às doenças por pneumococo. Entretan to, são altamente vulneráveis os indivíduos com imaturidade ou alguma forma de comprometimento do sistema imunológico, como bebês, crianças e os idosos (BROOKS et al., 2014; PROCOP et al., 2018). A meningite é uma infecção grave que afeta as meninges com cefaleia, febre e sepse. Possui alta mortalidade e deficiências neurológicas graves nas pessoas que sobre vivem à doença. Existem vacinas para alguns tipos de meningite? Que tal pesquisar sobre. ESTUDOS FUTUROS Os Enterococcus são bactérias amplamente distribuídas na natureza, fazem parte da microbiota normal do ser humano, principalmente do trato gastrointes tinal. São cocos Gram-positivos agrupados em cadeia, anaeróbios facultativos e de catalase negativa. Existem 14 espécies, mas somente duas são clinicamente de maior importância: E. faecalis e E. faecium. A associação deste gênero com endocar dite bacteriana é classicamente conhecida. Por outro lado, denota-se atualmente o isolamento destas bactérias em diversos sítios, causando infecções relacionadas à assistência à saúde, como infecções do trato urinário, infecções da corrente san guínea e infecções de sítio cirúrgico e intra-abdominais. Infecções por esse gênero chamam bastante atenção devido à frequência de resistência à antimicrobianos. Esse assunto será melhor abordado na Unidade 3.
2.2 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO
uva ou agrupados. No entanto, a identificação baseada somente na morfologia é um tanto arriscada e em muitos casos pode ser duvidosa. Para contornar tal situação, provas bioquímicas são utilizadas a fim de confirmar as etapas de identificação. A principal prova para diferenciar os cocos gram-positivos é a prova da catalase. Com a alça bacteriológica ou com um palito, coleta-se o centro de uma colônia suspeita e esfrega-se em uma lâmina de vidro. Em seguida, coloca-se so bre este esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observa-se se há formação de bolhas. Para a família Microccocacea (estafilococos), a prova é geralmente posi tiva, enquanto que para a família Streptococcacea (estreptococos), é negativa. A Figura 7 detalha resumidamente o fluxograma de identificação de cocos e o quadro 34 detalha as principais provas bioquímicas. FIGURA 7 – FLUXOGRAMA PARA A IDENTIFICAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS FONTE: O autor (2021)
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IDENTIFICAÇÃO
3 BACILOS GRAM-NEGATIVOS FERMENTADORES -
ENTEROBACTERIACEAE Neste subitem, iremos abordar a maior família de bactérias clinicamente importantes. Este grupo heterogêneo compreende microrganismos responsáveis por praticamente todos os tipos de infecções que são observadas na prática clínica. As bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae são microrganis mos ubiquitários encontrados em diversos ambientes, como no solo, na água e na vegetação. Elas fazem parte da microbiota normal da maioria dos animais, incluindo o homem. Atualmente, essa família é composta por cerca de 51 gêneros e 279 espécies, sendo destes, 26 gêneros causadores de infecções humanas. No en tanto, menos de 20 espécies são responsáveis por 95% das infecções em humanos (BRASIL, 2004; BRASIL, 2013; PROCOP et al., 2018). Sua importância clínica está fundamentada na sua representatividade em mais de 80% de todos os bacilos Gram-negativos de importância médica isolados na rotina microbiológica, sendo seu isolamento possível em qualquer amostra clínica. São agentes causais de infecções hospitalares e na comunidade. Uma boa parte de suas espécies são patogênicas ao homem, causando diarreias, infecções geniturinárias, infecções respiratórias e em feridas e queimaduras. Cerca de 70% das infecções urinárias e de 50% das septicemias são causadas por suas espécies. Algumas são consideradas enteropatogênicas por causarem infecções no Trato Gastrointestinal (TGI), ocorrendo transmissão através de água e alimentos con taminados (Salmonella sp., Shigella sp., E. coli e Yersiniaenterocolitica) (BRASIL, 2013).
3.1 CARACTERÍSTICAS DA FAMÍLIA
nia, hemorragia capilar, hipotensão e colapso circulatório – sinais e sintomas que, em grande parte, são praticamente iguais aos observados nos seres humanos com sepse gram-negativa (PROCOP et al., 2018; MURRAY et al., 2018). O LPS também tem importância laboratorial uma vez que tem função an tigênica e varia entre as diferentes espécies no polissacarídeo O. Outros antígenos amplamente empregados são o antígeno capsular (K) e as proteínas flagelares (H) (MURRAY et al., 2018). Em cerca de 99% dos isolados relativos a enterobactérias de importância clínica, podemos encontrar em ordem de probabilidade a: Escherichia coli, Kleb siella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Providenciaspp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Serratia spp. Porém em casos atípicos podemos observar também a presença das espécies: Edwarsiella spp., Hafnia spp., Yersinia spp. (PROCOP et al., 2018; MURRAY et al., 2018). Essa família tem muita relevância clínica devido aos seus fatores de viru lência (Discutidos na unidade 1). Alguns deles são comuns em todos os membros clinicamente relevantes e estão destacados no Quadro 35. QUADRO 35 – FATORES DE VIRULÊNCIA COMUNS GERALMENTE ASSOCIADOS A ENTERO BACTERIAS Fatores de virulência Características Endotoxina ou LPS Induz processo inflamatório e pode causar Choque endotóxico. Cápsula Protege contra a fagocitose. Variação de fase antigênica Antígenos O, K e H variam entre as espécies. Sistemas secretórios tipo III Introduz fatores de virulência em células eu carióticas-alvo. Sequestro de fatores de crescimento Sequestra nutrientes como Ferro a partir de grupamentos heme. Resistência aos efeitos bacterici das do soro Impede a ligação do sistema complemento. Resistência aos antimicrobianos Podem criar rápida resistência contra antimi crobianos (plasmídeos). FONTE: Adaptado de Murray et al. (2018)
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IDENTIFICAÇÃO Você já ouviu falar da Peste Negra? Foi uma das pandemias mais mortais da história que ocorreu entre os anos de 1347 até 1351. Segundo os livros de história, levou à morte de 75 a 200 milhões de pessoas na Eu ropa e Ásia. O microrganismo responsável pela doença era uma enterobactéria conhecida como Yersiniapestis. Naquela época não havia conhecimento sobre bactérias, muito me nos sobre o uso de antibióticos, como atualmente. INTERESSANTE
3.2.1 Escherichia coli
E. coli (Figura 8) é o mais comum e importante membro das enterobacté rias, uma vez que está associada a maior parte das infecções por membros dessa família, incluindo gastroenterite e infecções extraintestinais, como infecções do trato urinário, meningites e sepses. Uma variedade de cepas pode causar doen ças, sendo alguns sorotipos associados à maior virulência (ex.: E. coli O157 é a causa mais comum de colite hemorrágica e síndrome hemolítico-urêmica) (PRO COP et al., 2018; MURRAY et al., 2018).
3.2 IMPORTÂNCIA CLÍNICA
QUADRO 36 – E. COLI E SUAS CARACTERÍSTICAS Propriedades • E. coli enterotoxigênica (ETEC) adere ao intestino delgado através de fatores de colonização e produz as toxinas termo labil e termoestável. • E. coli enteropatogênica (EPEC) adere ao intestino delgado através de adesinas (pili formadores de feixes, intimina), provocando danos à mucosa intestinal. • E. coli enteroagregativa (EAEC) adere ao intestino delgado através da fimbria de aderência agregativa (AAF), também provocando danos à mucosa intestinal. • E. coli produtora de toxina de Shiga (STEC) adere inicial mente ao intestino através de pili formadores de feixes e in timina e, em seguida, produz as toxinas de Shiga Sti e Stx2 que afetam a mucosa do colon. • EIEC invade e destrói a mucosa do colon. • Cepas uropatogênicas se ligam a células da bexiga e do trato urinário superior através de adesinas (fimbria P, AAF e outras) e produzem a hemolisina Hlya que lisa as células, levando a liberação de citocinas, no estímulo da resposta inflamatória. • A maioria das cepas que causa meningite neonatal expressa o antigeno capsular K1. Epidemiologia • Representam os bacilos aerobios Gram-negativos mais co muns do trato gastrintestinal. • Infecções do trato urinário, infecções intra-abdominais e septi cemias geralmente têm origem endógena (ou seja, são causadas por E.coli da própria flora do paciente); cepas causadoras de gas trenterites são geralmente adquiridas de fontes exógenas. • Meningites são principalmente restritas aos recém-nascidos. • Infecções intra-abdominais são relacionadas com a saída de bactérias do intestino durante trauma ou cirurgias; infec ções geralmente polimicrobianas.
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QUADRO 37 – K. PNEUMONIAE E SUAS CARACTERÍSTICAS FONTE: Murray et al. (2018, s.p.)
3.2.2 Klebisiella pneumoniae
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IDENTIFICAÇÃO Você já ouviu falar em KPC? Que tal pesquisar sobre? Iremos discutir os testes de sensibilidade a antimicrobianos na próxima unidade. DICAS