pmid: "22284622"
title: "Efeitos protetores do acetato de incensol na lesão isquêmica cerebral."
authors: "Moussaieff A, Yu J, Zhu H, Gattoni-Celli S, Shohami E, Kindy MS"
journal: "Brain research"
pubdate: "2012 Mar 14"
doi: "10.1016/j.brainres.2012.01.001"
source: "PMC Full Text"
Efeitos protetores do acetato de incensol na lesão isquêmica cerebral.
Autores
Moussaieff A, Yu J, Zhu H, Gattoni-Celli S, Shohami E, Kindy MS
Periodico
Brain research (2012 Mar 14)
Conteudo
Efeitos protetores do acetato de incensol na lesão isquêmica cerebral
A resina de espécies de Boswellia é um importante agente anti-inflamatório que tem sido usado há séculos para tratar várias condições, incluindo lesões e condições inflamatórias. O acetato de incensol (IA), um constituinte principal dessa resina, demonstrou inibir a ativação do NF-κB e a inflamação concomitante. Aqui, mostramos que o IA protege contra danos neuronais isquêmicos e lesão de reperfusão em camundongos, atenuando a natureza inflamatória do dano isquêmico. O IA administrado após a isquemia reduziu os volumes de infarto e melhorou as atividades neurológicas no modelo de camundongo de lesão isquêmica de forma dependente da dose. A proteção contra o dano foi acompanhada pela inibição da expressão de TNF-α, IL-1β e TGF-β, bem como da ativação do NF-κB após a lesão. Além disso, o IA mostrou ter uma janela terapêutica de tratamento de até 6 horas após a lesão isquêmica. Finalmente, os efeitos protetores do IA foram parcialmente mediados pelos canais TRPV3, conforme determinado por camundongos deficientes em TRPV3 e estudos com bloqueadores de canais. Este estudo sugere que as atividades anti-inflamatórias e neuroprotetoras do IA podem servir como um novo tratamento terapêutico para lesão isquêmica e de reperfusão, e como uma ferramenta na pesquisa contínua de mecanismos de dano neurológico.
- Introdução
O acidente vascular cerebral (AVC) é uma das principais causas de incapacidade e morte nos Estados Unidos (http://www.americanheart.org/downloadable/heart/1136308648540Statupdate2006.pdf). O resultado e o tamanho do infarto após isquemia cerebral focal são determinados tanto pela morte celular "necrótica" quanto pela perda neuronal tardia na zona de borda da isquemia (morte celular programada ou apoptose). Terapias recentes surgiram para tratar o AVC isquêmico; no entanto, esses tratamentos não abordam a neuroproteção, a redução do déficit comportamental ou o volume do infarto cerebral uma vez que o ciclo de morte celular neuronal foi desencadeado, e lidam principalmente com a dissolução do coágulo sanguíneo. Estratégias neuroprotetoras passadas e atuais têm sido bem-sucedidas em modelos animais, mas falharam significativamente em ensaios clínicos. Compreender os mecanismos básicos que influenciam a perda celular ajuda a projetar drogas direcionadas a reduzir a morte celular associada à lesão isquêmica e melhorar o resultado funcional. As células na penumbra isquêmica estão sujeitas a vários processos patológicos que podem levar à sua própria morte e colocar em risco a sobrevivência de seus vizinhos. Esses mecanismos promotores de morte são compartilhados tanto pela lesão cerebral isquêmica quanto traumática e incluem estresse oxidativo, excitotoxicidade e inflamação.
O uso de remédios derivados de plantas para o tratamento de lesões continua desde o alvorecer da cultura humana até os dias atuais. A resina de espécies de Boswellia (Burseraceae), comumente conhecida como "Frankincense" ou "Olibano", é usada e exportada como incenso e para diversos fins medicinais. A resina de Boswellia spp. tem sido usada para o tratamento de inflamação crônica e para cicatrização de feridas na Europa, Ásia e África por muitos séculos. As propriedades anti-inflamatórias da resina de Boswellia e a atividade anti-inflamatória do acetato de incensol (IA) foram descritas anteriormente. Dado o uso da resina para tratar todos os tipos de lesões, bem como condições inflamatórias, os efeitos de seu principal constituinte anti-inflamatório, o IA, em camundongos após traumatismo craniano foram examinados. Seus efeitos anti-inflamatórios foram assim associados à melhora das funções neurocomportamentais e cognitivas em um modelo de lesão cerebral traumática em camundongos.
Muitas características semelhantes entre as vias prejudiciais que levam à morte celular secundária na zona de penumbra isquêmica e na área exposta à lesão pós-traumática secundária foram identificadas. Além disso, episódios isquêmicos precoces são relatados após lesão cerebral traumática, adicionando um componente de isquemia ao dano mecânico primário. Portanto, com base no trabalho anterior sobre os efeitos anti-inflamatórios e neuroprotetores do IA após lesão cerebral traumática, o presente estudo foi desenhado para examinar seu efeito no volume do infarto, atividades neurológicas, acúmulo de citocinas e efeitos nos canais de potencial receptor transitório vaniloide (TRPV) 3 no modelo de lesão isquêmica em camundongos.
- Resultados
Efeito da Dose de Acetato de Incensol na Lesão Isquêmica
Para determinar o efeito do IA na proteção contra lesão isquêmica, camundongos foram submetidos a 1 h de isquemia seguida por 24 h de reperfusão. O IA foi administrado i.p. nas doses de 1, 10 ou 50 mg/kg no início da reperfusão, para garantir proteção máxima. Comparado ao grupo injetado com veículo, o volume do infarto nos cérebros foi significativamente diminuído em todos os grupos tratados com IA. O IA (Fig. 2) mostrou uma redução dependente da dose na área da lesão. Os volumes do infarto vs. a dosagem de IA estão representados na Fig. 2A; as áreas de lesão foram de 70,78 ± 4,66 mm³ para o grupo veículo, 54,99 ± 3,57 mm³, 29,89 ± 4,22 mm³ e 21,50 ± 2,74 mm³ para os grupos tratados com IA nas doses de 1, 10 ou 50 mg/kg, respectivamente. Assim, a administração i.p. de IA após a isquemia nas doses de 1, 10 ou 50 mg/kg resultou em uma diminuição de 22%, 58% ou 71% no volume do infarto, respectivamente, em comparação ao veículo. A Fig. 2B mostra a área danificada presente nos animais submetidos ao veículo ou a 50 mg/kg de IA.
Para determinar o efeito do IA sobre os desfechos comportamentais em camundongos após lesão isquêmica, os animais foram examinados 22 h após a isquemia quanto a déficits neurológicos (Fig. 3). Os animais foram avaliados quanto a déficits neurológicos com base em uma escala de 0 a 4 (Ver MATERIAIS e MÉTODOS). Os animais tratados com IA apresentaram uma diminuição dose-dependente nos déficits neurológicos (Veículo, 3,3 ± 0,2; IA a 1 mg/kg, 2,7 ± 0,2; IA a 10 mg/kg, 1,6 ± 0,2; IA a 50 mg/kg, 0,7 ± 0,2). Não houve diferenças significativas nos parâmetros fisiológicos medidos (Tabela 1; pressão arterial média, pO2 sanguíneo, pCO2, fluxo sanguíneo cerebral e pH) entre os camundongos veículo e tratados no início, durante a isquemia ou após a reperfusão. Além disso, determinamos os níveis de IA no plasma e no cérebro dos camundongos (Tabela 2). Como visto na tabela, os níveis de IA atingiram ng a μg/ml no plasma e níveis de ng/grama no cérebro, o que foi suficiente para proporcionar os efeitos protetores observados no estudo.
Efeito do IA na Expressão de Mediadores Inflamatórios e na Atividade do NF-κB
Para determinar o mecanismo neuroprotetor de ação do IA no cérebro de camundongos após lesão isquêmica, os cérebros dos animais foram examinados quanto à expressão de mediadores inflamatórios. Determinamos os níveis das citocinas fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β) e fator de transformação do crescimento-β (TGF-β) 4 h após a lesão isquêmica (Fig. 4). Como visto na figura, o IA em todas as doses reduziu significativamente os níveis de TNF-α, IL-1β e TGF-β após a lesão isquêmica. A 50 mg/kg, o IA mostrou o maior efeito, reduzindo os níveis das citocinas acima em 88%, 77% e 80%, respectivamente. Uma vez que foi demonstrado que o IA atenua a ativação do NF-κB em células, examinamos o efeito do IA sobre a atividade do NF-κB no cérebro após 6 h de lesão. Como visto na Figura 5, a lesão de isquemia/reperfusão resultou na ativação do NF-κB, e o IA atenuou significativamente o aumento de forma dose-dependente. Nas doses de 1, 10 ou 50 mg/kg, a atividade do NF-κB foi significativamente reduzida em 23%, 71% ou 84%, respectivamente.
Também determinamos a expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) como um marcador de inflamação (Figuras 5B e 5C). Como visto nas figuras, na ausência de IA, a expressão de GFAP está significativamente aumentada após a lesão de isquemia e reperfusão, conforme demonstrado anteriormente. No entanto, o tratamento com 50 mg/kg de IA atenuou o aumento da GFAP, sugerindo que o IA pode influenciar a inflamação no cérebro durante a lesão de isquemia/reperfusão.
Curso Temporal da Administração de IA para Lesão Isquêmica
Para determinar o curso temporal da proteção conferida pela IA no modelo de camundongo de lesão por isquemia e reperfusão, 50 mg/kg de IA foram examinados após os estudos de resposta à dose. Os camundongos foram submetidos a 1 h de isquemia e 48 h de reperfusão para avaliação. Os animais foram tratados com IA em 0, 3, 6, 12 e 24 h após o término do período isquêmico e examinados quanto aos volumes de infarto e déficits comportamentais (Fig. 6A e B). A administração i.p. de IA pós-isquemia reduziu o volume de infarto nos cérebros dos animais (Fig. 6A): IA administrada em 0, 3 e 6 h após a isquemia mostrou redução de 77%, 67% e 37% na área da lesão, respectivamente. O volume de infarto dos animais tratados em 12 e 24 h após a isquemia, embora diminuído, não atingiu significância estatística em comparação aos animais tratados com veículo.
Os animais foram avaliados quanto a déficits neurológicos com base em uma escala de 0 a 4. Os déficits neurológicos para veículo, ou tratados com IA em 0, 3, 6, 12 e 24 h após a isquemia foram 3,2, 0,5, 1,1, 2,0, 2,8 e 3,1, respectivamente. Os animais tratados com IA mostraram uma diminuição dependente do tempo de tratamento nos déficits neurológicos (Fig. 6B), com p < 0,0001 para 0 e 3 h, p = 0,0006 para 6 h em comparação ao controle e para t = 12 h (p = 0,1744) e t = 24 h (p = 0,7486). Não houve diferenças significativas nos parâmetros fisiológicos medidos (pressão arterial média, pO2 sanguíneo, pCO2, fluxo sanguíneo cerebral e pH) entre os camundongos veículo e tratados no início, durante a isquemia ou após a reperfusão (dados não mostrados).
Finalmente, para avaliar os mecanismos potenciais associados à administração de IA, examinamos os efeitos da lesão por isquemia/reperfusão no volume de infarto e o impacto da IA nos canais de potencial receptor transitório vaniloide (TRPV3) (Figura 7). A Figura 7A mostra o efeito da isquemia/reperfusão nos camundongos deficientes em TRPV3. Os canais iônicos TRPV3 são ativados por múltiplos estímulos e são mediados pelo fluxo transmembrana de íons. Estudos anteriores sugerem que a IA regula a expressão e atividade do TRPV3. A exposição dos camundongos TRPV3−/− à lesão por isquemia/reperfusão resultou em um aumento modesto, mas significativo, no volume de infarto em comparação aos animais selvagens (76,87 ± 5,54 mm³ e 65,93 ± 5,15 mm³, respectivamente). O tratamento com 50 mg/kg de IA reduziu o volume de infarto nos camundongos selvagens, conforme mostrado na Figura 2 (22,18 ± 3,79 mm³) e também nos camundongos TRPV3−/− (48,83 ± 5,37 mm³), mas não na mesma extensão. Além disso, o tratamento com vermelho de rutênio (RR), um bloqueador do canal TRPV, atenuou o efeito da IA, mas não completamente, sugerindo um efeito parcial na proteção (23,64 ± 4,16 mm³ e 46,79 ± 8,92 mm³, respectivamente).
- Discussão
Trabalhos anteriores sobre as atividades farmacológicas do IA concentraram-se em seus efeitos anti-inflamatórios e consequentes neuroprotetores após lesão na cabeça. O presente estudo foi desenhado para examinar os potenciais efeitos neuroprotetores que o IA pode oferecer em um modelo de isquemia cerebral em camundongos, no qual o componente inflamatório do dano secundário está bem estabelecido. De fato, a administração de IA reduz, de maneira dose-dependente, os déficits neurológicos e o volume do infarto, típicos do dano neuronal pós-isquemia cerebral. Além disso, esses efeitos foram associados à inibição concomitante da expressão de mediadores inflamatórios e do NF-κB, um fator central no processo inflamatório. Os achados apresentados neste estudo reforçam ainda mais a noção dos efeitos neuroprotetores do IA em mais um modelo de dano neuronal que leva à cascata neurodegenerativa. O fato de que uma única dose de IA proporciona proteção contra lesão isquêmica pode ser atribuído ao efeito anti-inflamatório do composto, que já foi demonstrado em numerosos modelos in vitro e in vivo, e é mostrado neste estudo após lesão isquêmica. Esse efeito anti-inflamatório do IA, juntamente com seu efeito antiapoptótico específico para macrófagos na área do trauma, pode explicar a ampla proteção contra a neurodegeneração proporcionada pelo IA.
Como os processos neurodegenerativos desempenham papéis importantes nas patologias e nos resultados de lesões cerebrais e doenças degenerativas, tem havido uma busca intensiva por soluções farmacológicas nos últimos anos, sem sucesso até agora. Os robustos efeitos neuroprotetores oferecidos pelo IA em vários modelos sugerem que ele pode servir como uma ferramenta valiosa para o tratamento de lesões cerebrais, bem como outras condições neurodegenerativas. Após isquemia cerebral, o IA exerce um efeito neuroprotetor significativo na dose de 1 mg/kg. Um efeito altamente significativo é alcançado na faixa de 10–50 mg/kg e mostrou melhora tanto na neuroproteção quanto nos efeitos comportamentais. Essas doses de IA provavelmente podem ser ainda mais reduzidas consideravelmente ao se abordar sua baixa solubilidade em água. O cronograma para a administração do fármaco IA para neuroproteção é apresentado aqui pela primeira vez e está dentro da faixa de tratamento médico viável em humanos, se esses dados forem reproduzidos em humanos.
Um estudo anterior sugere que a atividade anti-inflamatória do IA é mediada através da inibição da ativação do NF-κB. Foi demonstrado que o IA inibe a fosforilação e ativação da quinase do IκB (IKK) in vivo, mas não in vitro, sugerindo que o efeito ocorre a montante da IKK, inibindo a fosforilação da IKK ao interferir nas interações TAK/TAB e na ligação com a IKK, bloqueando sua ativação. Isso sugere que o IA pode inibir a ativação do NF-κB em distúrbios neurológicos, atenuando assim a inflamação e retardando a deterioração, possivelmente melhorando condições degenerativas. A ausência de efeito do IA sobre medidas fisiológicas corrobora a noção de que a neuroproteção exibida pelo fármaco se deve à atenuação do processo inflamatório pós-isquêmico. Essa noção está de acordo com dados anteriores, que demonstram neuroproteção oferecida pelo composto após traumatismo craniano, concomitantemente à inibição da expressão de mediadores inflamatórios, sem efeito aparente sobre parâmetros físicos. Outro estudo de Moussaieff e colaboradores sugere que o IA é um potente modulador dos canais de potencial receptor transitório (TRP). Os canais TRP são ativados por uma miríade de estímulos e modulam o fluxo de cátions através de várias membranas. A família de canais TRP vanilóide (TRPV) é ativada por estímulos químicos e de temperatura, sendo denominada termo-TRPVs. O mRNA do TRPV3 é expresso em neurônios por todo o cérebro; no entanto, o papel dos canais TRPV3 no cérebro era desconhecido, e tal função foi sugerida pela primeira vez pelos efeitos psicoativos que o IA exerce no cérebro, aparentemente através desses canais. Nossos estudos mostraram que a ativação do canal TRPV3 pelo IA pode proporcionar um efeito protetor parcial, embora isso não seja a história completa. É possível que o IA atue induzindo o pós-condicionamento isquêmico e protegendo o cérebro de lesões. Assim, pode ser utilizado no estudo em andamento sobre a aparente ligação entre neurodegeneração e canais TRP.
Em conjunto, os dados apresentados no presente estudo indicam um efeito neuroprotetor robusto oferecido pelo IA após lesão isquêmica em doses significativamente menores do que as descritas anteriormente. Esses resultados estão em forte concordância com as conclusões de trabalhos anteriores sobre os efeitos neuroprotetores e anti-inflamatórios do IA, indicando que ele pode ser utilizado para tratamento e para pesquisas adicionais sobre lesão cerebral e processos neurodegenerativos.
4. Procedimentos Experimentais
Animais
Camundongos C57BL/6 (Harlan Laboratories, Indianápolis, IN), pesando 22–25 g cada, tiveram livre acesso a comida e água antes do experimento. Camundongos deficientes em TRPV3 foram adquiridos do Jackson Laboratory.
Isolamento do Acetato de Incensol
A purificação e identificação do acetato de incensol foi realizada conforme descrito anteriormente.
Administração do fármaco – dose-resposta
Os animais foram submetidos a 1,0 h de isquemia seguida de 6 h ou 24 h de reperfusão. Os animais foram aleatoriamente designados para um grupo veículo (n = 10) ou grupos (n = 10) tratados com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de IA em doses de 0 a 50 mg/kg. A IA foi reconstituída em isopropanol/Emulphor/salina (1:1:18), e a solução foi armazenada a 4 °C. O controle veículo recebeu solução de isopropanol/Emulphor/salina. As injeções i.p. em bolus foram administradas imediatamente após o início da reperfusão ou em vários momentos após a reperfusão.
Administração do fármaco – Curso Temporal
Os animais foram submetidos a 1,0 h de isquemia seguida de 48 h de reperfusão. Os animais foram aleatoriamente designados para um grupo veículo (n = 10) ou um dos cinco grupos de tratamento (n = 10 para cada grupo) que receberiam uma injeção i.p. inicial de IA na dose de 50 mg/kg em 0, 3, 6, 12 ou 24 h após a isquemia. A injeção i.p. em bolus de IA foi iniciada nos diferentes grupos de tratamento em 0, 3, 6, 12 ou 24 h após o início da reperfusão. Os investigadores estavam cegos para os grupos de tratamento.
Indução da isquemia
Os animais foram anestesiados com halotano (1% em 70%/30% de NO2/O2 por máscara). Monitoramento da pressão arterial média (PAM) por meio de aparelho de manguito caudal, e amostras de sangue foram coletadas para determinar os níveis de pH arterial e PaCO2 e PaO2. A PAM e a frequência cardíaca foram registradas usando um monitor de pressão arterial Visitech System. A temperatura cerebral foi monitorada usando um termômetro retal e uma sonda termistor inserida no músculo temporal. A temperatura corporal dos animais foi mantida a 37°C usando uma almofada de aquecimento com camisa d'água. A temperatura cerebral foi monitorada por 1 h antes da isquemia até 6 h após a isquemia e registrada em intervalos de 30 minutos. Cada camundongo foi anestesiado e a artéria carótida externa (ACE) e a artéria carótida comum (ACC) foram isoladas. A artéria carótida comum esquerda (ACC) foi exposta por meio de uma incisão na linha média do pescoço. As artérias tireoidea superior e occipital foram eletrocoaguladas e divididas. Um clipe microcirúrgico foi colocado ao redor da origem da artéria carótida externa (ACE). A extremidade distal da ACE foi ligada com seda 6-0 e seccionada. Uma seda 6-0 foi amarrada frouxamente ao redor do coto da ACE. O clipe foi removido e a ponta polida a fogo de uma sutura de náilon 5-0 (revestida de silicone) foi gentilmente inserida no coto da ACE. A alça da seda 6-0 foi apertada ao redor do coto e a sutura de náilon foi avançada aproximadamente 13 mm (ajustada conforme o peso corporal) para dentro e através da artéria carótida interna (ACI) até repousar na artéria cerebral anterior (ACA), ocluindo assim as artérias comunicante anterior e cerebral média. Após a sutura de náilon permanecer no lugar por 1 h, ela foi puxada de volta para a ACE e a incisão foi fechada.
Exame histológico
Para o exame histológico, os animais foram anestesiados com uma injeção i.p. de pentobarbital sódico (50 mg/kg) 24 horas após a indução da isquemia. Os cérebros dos camundongos foram perfundidos transcardialmente com solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4°C e 10%. Os cérebros foram então removidos e resfriados por 15 minutos a −20°C antes de serem colocados em uma Matriz de Cérebro de Roedor. Secções coronais (espessura de 1 mm) foram preparadas e submetidas à coloração com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) a 2% a 37°C. O TTC cora o tecido vivo (vermelho) em oposição ao tecido morto ou moribundo (branco). Sete secções coronais seriadas de 1 mm de espessura, abrangendo a extensão rostral a caudal do infarto, foram obtidas de cada cérebro, começando a 2 mm do polo frontal. As secções coradas com TTC foram colocadas em formalina tamponada neutra a 10% e mantidas no escuro a 4°C por pelo menos 24 horas. A área do infarto em cada secção foi determinada com um sistema de análise de imagem assistido por computador, composto por um computador Power Macintosh equipado com uma placa de captura de quadro Quick Capture, uma câmera CCD Hitachi montada em um microscópio Olympus e suporte para câmera. O Software de Análise de Imagem NIH, v. 1.55 foi utilizado. As imagens foram capturadas e a área total de dano determinada nas sete secções. Um único operador, cego para o status do tratamento, realizou todas as medições. O volume do infarto foi calculado somando os volumes de infarto das secções. O tamanho do infarto (%) foi calculado usando a seguinte fórmula: (volume contralateral − volume ipsilateral não danificado) × 100/volume contralateral para eliminar os efeitos do edema.
Análise de ELISA
Para a análise quantitativa de citocinas, um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) foi utilizado para medir os níveis de TNF-α, IL-1β ou TGF-β no tecido cerebral. As citocinas foram extraídas de cérebros de camundongos da seguinte forma: hemisférios cerebrais congelados foram colocados em Tampão de Homogeneização de Tecido contendo Coquetel Inibidor de Protease (PIC, Sigma) na diluição de 1:1000 imediatamente antes do uso, e homogeneizados usando politron. As suspensões de amostras de tecido foram distribuídas em alíquotas e congeladas rapidamente em nitrogênio líquido para medições posteriores. O kit de ELISA da Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) foi então utilizado, de acordo com as instruções do fabricante.
Medição do fluxo sanguíneo cerebral
Fluxo sanguíneo cerebral (FSC) foi monitorado utilizando um fluxômetro Doppler a laser. Os valores de FSC foram determinados como porcentagem, pois os valores exibidos pelo fluxômetro Doppler a laser não eram absolutos. Conforme descrito acima, os animais foram anestesiados com halotano (1% em 70%/30% de NO2/O2 por máscara) e montados em um quadro estereotáxico, e as sondas foram fixadas na cabeça. No hemisfério ipsilateral à oclusão da ACM, as coordenadas foram as seguintes: ponto A, 0,5 mm posterior ao bregma e 2 mm lateral à linha média; ponto B, 1 mm posterior ao bregma e 1,2 mm lateral à linha média; ponto D, 1 mm anterior ao bregma e 1,7 mm lateral à linha média; e ponto C no hemisfério contralateral, 1 mm posterior ao bregma e 2 mm da linha média. O FSC foi comparado 15 min antes do início da isquemia, durante a isquemia (15 min após o início da isquemia) antes da injeção dos artigos de teste e 30 min após a injeção (medições contínuas foram realizadas de 15 min antes da isquemia até 30 min após o término da injeção do composto). Os animais foram reanestesiados e o FSC foi medido 3 h após a reperfusão. Os valores médios antes da oclusão da ACM foram considerados como basal e os dados posteriores foram expressos como porcentagens do valor basal.
Avaliação comportamental
Testes comportamentais (déficit neurológico) foram realizados antes e após a lesão isquêmica. Os escores neurológicos foram os seguintes: 0, função motora normal; 1, flexão do tronco e do membro anterior contralateral quando o animal foi levantado pela cauda; 2, circulação para o lado contralateral quando segurado pela cauda em superfície plana, mas postura normal em repouso; 3, inclinação para o lado contralateral em repouso; 4, nenhuma atividade motora espontânea.
Análise da atividade de NF-κB
Seis horas após a lesão isquêmica, extratos de tecido cerebral foram examinados quanto à atividade de NF-κB usando um kit de detecção ELISA para NF-κB (Millipore, Billerica, MA).
Análise por Western blot
Western blots mediram a proteína glial fibrilar (GFAP) em cérebros de camundongos controle e isquêmicos, usando a mesma quantidade de proteína por canal do gel, realizada conforme descrito anteriormente. Os níveis de GFAP foram determinados nos extratos cerebrais (BioVision). As quantidades relativas de GFAP foram medidas por densitometria e os resultados foram expressos como porcentagem dos níveis médios de GFAP dos grupos controle. Western blots de controle para β-actina (Cell Signaling Technology) foram realizados para monitorar o carregamento igual das mesmas quantidades de amostras (20 μg de proteína) em cada canal do gel.
Análise dos níveis plasmáticos e cerebrais de IA
As amostras foram preparadas e submetidas à análise por CLAE/EM conforme descrito anteriormente. A análise foi realizada em um Espectrômetro de Massas com Armadilha de Íons acoplado a Cromatógrafo Líquido Finnigan LTQ (LC). A concentração do analito de IA foi determinada usando um padrão interno. As curvas padrão foram calculadas a partir das razões das áreas dos picos do analito/padrão interno.
Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). A significância estatística dos resultados no volume do infarto, déficit neurológico, dados fisiológicos e histológicos foi analisada usando uma análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Fisher.
Direcionando a lesão cerebral isquêmica com imunoglobulina intravenosa
TAK1 é recrutado para o complexo do receptor 1 do fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) de maneira dependente da proteína de interação com receptor (RIP) e coopera com MEKK3 levando à ativação do NF-kappaB
Composição química e atividade antimicrobiana de alguns óleos essenciais de resina oleogomosa de Boswellia spp
A estrutura do incensol
O receptor de estrogênio alfa, não beta, é um elo crítico na proteção mediada pelo estradiol contra lesão cerebral
Apoptose em distúrbios neurológicos agudos e crônicos
O fator de crescimento de fibroblastos-18 reduziu os volumes de infarto e déficits comportamentais após oclusão transitória da artéria cerebral média em ratos
Janela temporal da neuroproteção mediada pelo fator de crescimento de fibroblastos-18 após oclusão da artéria cerebral média em ratos
Estudos biocatalíticos e semissintéticos dos cembranoides anticancerígenos do tabaco
Etapas ausentes no caso STAIR: uma perspectiva da Medicina Translacional sobre o desenvolvimento de NXY-059 para tratamento do acidente vascular cerebral isquêmico agudo
Novas abordagens para o desenvolvimento de fármacos neuroprotetores
Abordagens farmacológicas para o acidente vascular cerebral isquêmico agudo: reperfusão com certeza, neuroproteção possivelmente
Farmacocinética translacional: desafios de uma abordagem emergente para o desenvolvimento de fármacos no acidente vascular cerebral
A lesão cerebral isquêmica e excitotóxica é aumentada em camundongos desprovidos do receptor p55 do fator de necrose tumoral
Determinação dos principais ácidos boswélicos no plasma por cromatografia líquida de alta pressão/espectrometria de massa
Acidente vascular cerebral isquêmico, dissecção aórtica e terapia trombolítica—a importância das habilidades clínicas básicas
Smad7 se liga aos adaptadores TAB2 e TAB3 para bloquear o recrutamento da quinase TAK1 para o adaptador TRAF2
Os canais iônicos TRPV3 e TRPV4 não são contribuintes principais para a sensação térmica em camundongos
Fosforilação encontra ubiquitinação: o controle da atividade do NF-[kappa]B
Indução isquêmica da expressão de proto-oncogenes no cérebro do gerbilo
Isquemia cerebral e trauma—etiologias diferentes, mas mecanismos semelhantes: oportunidades neuroprotetoras
Olíbano: farmacognosia festiva
A mutação da presenilina-1 aumenta a vulnerabilidade neuronal à isquemia focal in vivo e à hipóxia e privação de glicose em cultura de células: envolvimento da homeostase do cálcio perturbada
O Bálsamo de Jerusalém: do Mosteiro Franciscano na cidade velha de Jerusalém até Martindale 33
Resina de Boswellia: de cerimônias religiosas a usos médicos; uma revisão de estudos in vitro, in vivo e ensaios clínicos
O acetato de incensol, um componente do incenso, provoca psicoatividade ao ativar os canais TRPV3 no cérebro
Acetato de incensol: um novo agente neuroprotetor isolado de Boswellia carterii
Acetato de incensol, um novo composto anti-inflamatório isolado da resina de Boswellia, inibe a ativação do fator nuclear kappa B
Os receptores canabinoides CB1 estão envolvidos na neuroproteção via inibição do NF-kappa B
Isquemia cerebral focal no rato transgênico para TNFalfa
Os ácidos boswélicos estimulam a liberação de ácido araquidônico e a atividade da 12-lipoxigenase em plaquetas humanas independentemente de Ca2+ e interagem diferencialmente com a 12-lipoxigenase do tipo plaquetário
Uma introdução aos canais TRP
Modulação da resposta inflamatória mediada pela interleucina-1beta em astrócitos humanos por flavonoides: implicações na neuroproteção
Abordagens atuais para o tratamento farmacológico dos transtornos de ansiedade
TRPV3 é uma proteína semelhante ao receptor vaniloide sensível à temperatura
Neuroproteção na isquemia cerebral: fatos e fantasias – a necessidade de novas abordagens
O pós-condicionamento isquêmico protege contra lesão induzida por isquemia/reperfusão cerebral global em ratos
Neuroproteção e acidente vascular cerebral: hora de um compromisso
O análogo do fator motoneuronotrófico GM6 reduz o volume do infarto e os déficits comportamentais após isquemia transitória em camundongos
Camundongos com deficiência do potencial receptor transitório vaniloide tipo 4 apresentam relaxamento dependente do endotélio prejudicado induzido por acetilcolina in vitro e in vivo
O pós-condicionamento isquêmico como uma nova via para proteger contra lesão cerebral após acidente vascular cerebral
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A estrutura do acetato de incensol (IA)
A estrutura do acetato de incensol é apresentada.
O IA reduz os volumes do infarto em camundongos após isquemia transitória
Camundongos foram submetidos a 1 h de isquemia cerebral seguida por 24 h de reperfusão. A. Os animais foram injetados com veículo (controle) ou IA em doses de 1 a 50 mg/kg por via intraperitoneal (i.p.) ao final do período isquêmico. Os animais foram sacrificados no dia 2 e processados para determinar o volume do infarto. *p < 0,04 para IA (1 mg/kg) em comparação ao controle; **p < 0,0001 para IA (10 ou 50 mg/kg) em comparação ao controle. B. Imagens representativas de cérebros de camundongos submetidos a 1 h de isquemia e 24 h de reperfusão. Os animais foram injetados com IA (50 mg/kg) (painel direito) ou veículo (painel esquerdo) ao final da isquemia.
O tratamento com IA atenua os déficits neurológicos em camundongos após isquemia
Todos os camundongos foram submetidos a 1 h de isquemia cerebral seguida de 24 h de reperfusão. Os animais receberam injeção de veículo (controle) ou IA nas doses de 1, 10 ou 50 mg/kg i.p. ao final do período isquêmico. Os déficits neurológicos foram medidos ao final da reperfusão (22 h) conforme descrito nos Procedimentos Experimentais. *p < 0,04 para IA (1 mg/kg) em comparação ao controle; **p < 0,0001 para IA (10 ou 50 mg/kg) em comparação ao controle.
IA inibe a expressão de mediadores inflamatórios após isquemia
Camundongos foram submetidos a 1 h de isquemia seguida de 6 h de reperfusão. Animais tratados com IA nas doses indicadas foram examinados quanto aos níveis de: A. TNF-α; B. IL-1β e C. TGF-β. A análise quantitativa das citocinas no cérebro isquêmico foi determinada por ELISA. *p < 0,05; **p < 0,0001 em comparação aos controles.
IA reduz a ativação de NF-κB e a expressão de GFAP em cérebros de camundongos pós-isquêmicos
(A) Camundongos foram submetidos a 1 h de isquemia seguida de 6 h de reperfusão. Animais tratados com IA nas doses indicadas foram examinados quanto à ativação de NF-κB usando ELISA para p50. *p < 0,05; **p < 0,0001 em comparação aos controles. (B) Camundongos foram submetidos a 1 h de isquemia e 0, 2, 4, 8 e 24 horas de reperfusão. Animais foram tratados com veículo ou IA a 50 mg/kg e os cérebros examinados quanto à expressão de GFAP e β-actina por análise de Western blot. (C) Análise quantitativa da expressão de GFAP. *p < 0,05; **p < 0,001; ***p<0,0001 em comparação aos controles.
Efeitos da IA nos volumes de infarto e déficits neurológicos com diferentes tempos de tratamento
Camundongos foram submetidos a 1 h de isquemia cerebral seguida de 48 horas de reperfusão. Os animais receberam injeção de veículo (controle) ou IA a 50 mg/kg i.p. em diferentes momentos após o final do período isquêmico. A. Volumes de infarto em camundongos submetidos a um curso temporal de tratamento com IA. Os animais foram sacrificados após 48 horas e processados para determinar o volume de infarto. B. Déficits neurológicos em camundongos submetidos a um curso temporal de tratamento com IA. Os déficits neurológicos foram medidos ao final da reperfusão conforme descrito nos Procedimentos Experimentais. *p < 0,0001 para todos os grupos em comparação ao controle, exceto para t = 12 ou 24 h, p ≥ 0,05.
Impacto de camundongos deficientes no canal TRPV3 e do vermelho de rutênio nos volumes de infarto em camundongos após isquemia transitória
(A) Camundongos (selvagens ou deficientes em TRPV3) foram submetidos a 1 h de isquemia cerebral seguida de 24 h de reperfusão. Os animais receberam injeção de veículo ou IA a 50 mg/kg intraperitoneal (i.p.) ao final do período isquêmico. Os animais foram sacrificados no dia 2 e processados para determinar o volume de infarto. *p < 0,0001; **p<0,001. B. Camundongos C57BL/6 foram submetidos a 1 h de isquemia cerebral seguida de 24 h de reperfusão. Os animais receberam injeção de veículo, IA (50 mg/kg) ou IA (50 mg/kg) mais vermelho de rutênio a 3 mg/kg intraperitoneal (i.p.) ao final do período isquêmico. Os animais foram sacrificados no dia 2 e processados para determinar o volume de infarto. *p < 0,0001 em comparação ao veículo; **p<0,001 em comparação ao veículo e à IA;
Medidas Fisiológicas
Basal Durante Isquemia Após Reperfusão Pressão arterial média (mm Hg) Veículo 89,1 ± 8,7 91,2 ± 9,1 87,2 ± 8,4 1 mg/kg 87,5 ± 6,9 85,7 ± 8,9 90,1 ± 9,3 10 mg/kg 92,3 ± 7,5 88,6 ± 8,4 85,8 ± 8,1 50 mg/kg 86,6 ± 8,2 89,2 ± 8,6 88,4 ± 8,8 pO2 sanguínea (mm Hg) Veículo 94,3 ± 4,7 93,7 ± 5,1 91,9 ± 4,2 1 mg/kg 90,1 ± 5,2 91,4 ± 4,6 94,6 ± 4,1 10 mg/kg 92,7 ± 4,3 90,8 ± 4,7 95,1 ± 5,2 50 mg/kg 91,8 ± 4,5 94,5 ± 5,3 92,7 ± 4,4 pCO2 sanguínea (mm Hg) Veículo 46,5 ± 3,7 48,8 ± 4,2 49,7 ± 3,9 1 mg/kg 49,3 ± 4,3 46,9 ± 3,8 51,1 ± 4,5 10 mg/kg 51,2 ± 5,2 49,5 ± 5,1 48,8 ± 5,0 50 mg/kg 47,1 ± 4,9 50,3 ± 4,6 46,7 ± 4,7 Fluxo sanguíneo cerebral (% basal) Veículo 100 ± 5 21 ± 6 92 ± 4 1 mg/kg 102 ± 6 19 ± 4 89 ± 6 10 mg/kg 98 ± 4 23 ± 3 95 ± 7 50 mg/kg 101 ± 7 17 ± 6 97 ± 5 pH Veículo 7,35 ± 0,05 7,33 ± 0,04 7,32 ± 0,06 1 mg/kg 7,34 ± 0,04 7,36 ± 0,06 7,36 ± 0,05 10 mg/kg 7,32 ± 0,06 7,34 ± 0,07 7,34 ± 0,03 50 mg/kg 7,33 ± 0,03 7,37 ± 0,04 7,35 ± 0,05
Concentração de Acetato de Incensol no Plasma e Cérebro
Concentração Plasma (μg/ml) Cérebro (μg/g) Veículo — — 1 mg/kg 0,127 ± 0,051 0,003 ± 0,001 10 mg/kg 1,89 ± 0,32 0,028 ± 0,006 50 mg/kg 10,2 ± 1,3 0,13 ± 0,07
Destaques
O incensol (olíbano) protege camundongos da oclusão da artéria cerebral média.
O incensol atua através da inibição do NF-kB.
O incensol mostra uma proteção dependente da dose e do tempo contra o acidente vascular cerebral.
Uma potencial nova terapia para tratar isquemia cerebral.