pmid: "19439210"
title: "Achados serendipitosos enquanto pesquisava radicais livres de oxigênio."
authors: "Floyd RA"
journal: "Free radical biology & medicine"
pubdate: "2009 Apr 15"
doi: "10.1016/j.freeradbiomed.2009.02.003"
source: "PMC Full Text"

Achados serendipitosos enquanto pesquisava radicais livres de oxigênio.

Autores

Floyd RA

Periodico

Free radical biology & medicine (2009 Apr 15)

Conteudo

Descobertas Serendipitosas ao Pesquisar Radicais Livres de Oxigênio
Esta revisão é baseada na honra de receber o Prêmio Discovery da Sociedade de Biologia e Medicina de Radicais Livres. A revisão é reflexiva e apresenta nosso pensamento que levou a experimentos que produziram observações inovadoras. O questionamento crítico de nossa compreensão dos radicais livres de oxigênio em problemas biomédicos nos levou a usar e desenvolver métodos mais diretos e extremamente sensíveis. Isso incluiu a captura de radicais livres com nitronas por spin-trapping e detecção eletroquímica por HPLC. Essa tecnologia levou ao uso pioneiro do salicilato para capturar radicais livres hidroxila e mostrar fluxo aumentado em regiões cerebrais submetidas a isquemia/reperfusão, e também a detectar pela primeira vez de forma sensível a 8-hidroxi-droxiguanosina (8-OHdG) no DNA danificado por oxidação, ajudando a avaliar seu papel no desenvolvimento do câncer. Demonstramos que o Azul de Metileno (MB) fotoinduz a formação de 8-hidroxi-guanina em DNA e RNA e descobrimos que o MB fotoinativava de forma sensível vírus de RNA, incluindo HIV e o Vírus do Nilo Ocidental. Estudos em acidente vascular cerebral experimental nos levaram a descobrir serendipitosamente que a α-fenil-terc-butilnitrona (PBN) era neuroprotetora se administrada após o acidente vascular cerebral. Isso levou a um amplo desenvolvimento comercial do NXY-059, um derivado da PBN, para o tratamento do AVC. Mais recentemente, descobrimos que as nitronas PBN têm potente atividade anticâncer e são ativas na prevenção da perda auditiva causada por trauma acústico agudo.
Adentrar o desconhecido científico não é para os fracos de coração, mas é assim que se fazem descobertas que levam a uma compreensão mais profunda. Os primeiros pioneiros da biologia dos radicais livres, tanto pensadores quanto experimentalistas, como Chance, Michaelis, Harman, Commoner e a equipe de Gerschman e Gilbert, fizeram observações críticas e postulados ousados no início dos anos 1950 de que processos envolvendo radicais livres estavam implicados em processos biológicos. Os fatos fundamentais disponíveis eram limitados, mas mesmo assim era claro para Gerschman e Gilbert que os efeitos colaterais tóxicos do oxigênio eram semelhantes aos danos causados pelos raios X. Harman, logo no início, postulou que os radicais livres tinham consequências importantes para processos biológicos fundamentais, incluindo o envelhecimento e o câncer. Décadas mais tarde, ainda estamos tentando compreender toda a extensão de suas primeiras teorias prescientes. Assim, esse era o estado de coisas em um campo de pesquisa incipiente que estava destinado a se tornar um polo de atividade de pesquisa que ganhou impulso a partir do final dos anos 1960, após a descoberta da superóxido dismutase por McCord e Fridovich {9433, 9451}, até os dias atuais. Foi durante esse período inicial (1969) que comecei a trabalhar com oxigênio e processos biológicos no laboratório de Britton Chance, o que levou a observações pioneiras sobre os processos fundamentais da formação de oxigênio a partir da água na fotossíntese de plantas verdes. Pouco tempo depois, passei outro período importante (1971-1974) fazendo pesquisa no laboratório de Barry Commoner, que em 1954 havia feito a primeira observação de radicais livres em sistemas biológicos usando métodos de ressonância paramagnética eletrônica. A experiência no laboratório de Commoner, onde mostramos que radicais livres de ascorbato eram observados usando ressonância paramagnética eletrônica em tecidos que estavam simultaneamente sendo submetidos à irradiação por raios X, alimentou meu crescente interesse no campo dos processos de radicais livres em problemas biomédicos. Depois de montar meu próprio laboratório na Oklahoma Medical Research Foundation em 1974, nossa pesquisa inicialmente se concentrou na fase de iniciação do câncer, o que levou a várias observações pertinentes aos radicais livres no metabolismo de carcinógenos.
O papel dos radicais livres no desenvolvimento do câncer e outras doenças relacionadas à idade tornou-se uma parte importante do nosso esforço de pesquisa pelos próximos 34 anos, período durante o qual os avanços no campo da biologia dos radicais livres e os resultados surpreendentes de nossos experimentos geraram um interesse cada vez maior no papel das espécies reativas de oxigênio e óxido nítrico em problemas biomédicos. Descobertas fortuitas que surgiram ao tentar entender o dano oxidativo na isquemia-reperfusão cerebral experimental nos levaram a um foco maior em levar nossas descobertas da ciência básica para aplicações práticas no desenvolvimento comercial do tratamento terapêutico do acidente vascular cerebral. Esse esforço levou a um foco maior em vários problemas biomédicos, incluindo o desenvolvimento do câncer e a proteção contra a perda auditiva induzida por trauma acústico agudo, e ao desenvolvimento e utilização de diferentes talentos para alcançar nossos objetivos. Recentemente, revisamos alguns aspectos desse esforço {35437}.
Na minha carreira, tive a feliz oportunidade de realizar pesquisas em diversas áreas, às vezes aparentemente não relacionadas. No entanto, em retrospecto, o oxigênio tem sido um tema central ao longo de tudo. A Figura 1 apresenta uma lista em ordem cronológica de algumas das várias áreas onde nosso esforço de pesquisa contribuiu para o campo e ajudou a abrir um grau mais profundo de compreensão. Nesta revisão, apenas as áreas de pesquisa que considero terem sido as mais originais e/ou úteis para o campo de pesquisa em geral ou que representam um conceito importante na abordagem de pesquisa serão discutidas. Algumas áreas serão discutidas para homenagear os excelentes cientistas criativos com quem tive a sorte de trabalhar e com quem aprendi lições valiosas tanto em abordagens criativas quanto na coragem de fazer perguntas difíceis. O objetivo desta revisão de perspectiva do nosso esforço de pesquisa é fornecer um relatório baseado em conceitos que será útil, especialmente para cientistas mais jovens, a fim de alimentar a confiança na importância da criatividade e no valor de buscar uma compreensão mais profunda questionando as explicações existentes. Essa abordagem leva a descobertas que abrem oportunidades criativas tanto na ciência básica quanto na ciência translacional.

P680- Formação de Oxigênio na Fotossíntese

A importância da formação de oxigênio durante a fotossíntese é um dos processos mais fundamentais em toda a biologia. Essa área atraiu minha atenção durante os estudos de pós-graduação na Purdue University e foi um privilégio realizar pesquisa de pós-doutorado nessa área com Don Devault e Britton Chance na University of Pennsylvania. Devault e Chance descobriram que a transferência de elétrons impulsionada pela luz ocorria por mecanismos de tunelamento em temperaturas de hélio líquido em bactérias fotossintéticas em 1966. Eles demonstraram que os elétrons eram transferidos em temperaturas muito baixas (de 120 K a pelo menos 4 K) de maneira independente da temperatura, do citocromo para o centro de reação fotossintética que havia sido tornado deficiente em elétrons pela captura de fótons. O fato de o fluxo de elétrons em temperaturas muito baixas ser independente da temperatura significa que os elétrons “tunelam” através das barreiras de energia de ativação. Esta foi uma descoberta revolucionária em sistemas biológicos e foi revisada em uma estrutura formal por Devault.
No contexto dessas descobertas fundamentais em bactérias fotossintéticas, fui levado ao problema de estudar o fluxo de elétrons ativado pela luz em baixas temperaturas em plantas verdes, tentando entender anormalidades previamente observadas na oxidação do citocromo f em plantas verdes pelo laboratório de Chance. Para estudar isso adequadamente, utilizamos o aparelho óptico projetado, construído e montado por Don Devault, que envolvia um sistema de laser de rubi com Q-switched de 20 ns como pulso de ativação luminosa. O aparelho óptico que Devault construiu exigiu o desenvolvimento de componentes de circuitos eletrônicos que não estavam disponíveis comercialmente na época. Sua abordagem criativa e design são descritos em detalhes por Parson e Seibert por ocasião da homenagem à sua vida.
Os estudos que realizei com Devault exigiam um dewar de baixa temperatura revestido de prata em um padrão específico para acomodar os pulsos de luz de ativação, bem como o caminho para o feixe de luz de análise. A construção desse dewar a partir de um blank, incluindo o revestimento de prata com o padrão adequado, era minha tarefa a ser dominada como um rito que deve ser cumprido para ser iniciado na abordagem de Devault de “criação de toda tecnologia existente a partir de princípios básicos” para a ciência básica fundamental realizada em seu laboratório. Outro obstáculo a ser superado era a disponibilidade de pulsos de laser de ativação com o comprimento de onda adequado. Como o laser de rubi emitia um pulso de luz de 694 nm, era necessário obter um pulso de luz fora da faixa de 650-700 nm, porque estudos piloto e trabalhos anteriores haviam mostrado que alterações ópticas de pelo menos um centro de reação (P700) dos dois centros de reação fotossintéticos de plantas verdes absorviam nessa faixa, e pensava-se, mas não se sabia realmente, que o segundo centro de reação também poderia absorver nessa faixa. Adquirir um sistema de laser que emitisse luz fora da faixa de 670-700 nm estava fora de questão. Portanto, uma abordagem completamente nova foi concebida e projetada. Esta consistia em disparar os pulsos de laser de rubi de 20 ns em uma célula óptica de quartzo contendo gás hidrogênio sob alta pressão (60 atm). A célula óptica emitia um pulso de laser verde de 539 nm gerado como resultado do pulso de laser de rubi causando estimulação Raman das moléculas de hidrogênio para produzir a primeira linha anti-Stokes em 539 nm. Portanto, após a filtragem adequada dos pulsos de luz de rubi que passavam e permitindo seletivamente a passagem dos pulsos de luz verde do laser, obtivemos pulsos de luz de ativação fora da faixa de 650-700 nm. Isso então tornou possível medir a cinética das alterações de absorbância na faixa de 650-700 nm.
A preparação das amostras (cloroplastos isolados ou porções de folhas inteiras) e o posicionamento da cubeta de amostra para análise foram feitos em completa escuridão para excluir rigorosamente fótons dispersos. Isso porque as amostras, após serem carregadas na cubeta, foram imersas em nitrogênio líquido antes do posicionamento no suporte para análise e, portanto, cada fóton disperso que atingia a amostra congelada era capturado e, consequentemente, os centros de reação eram irreversivelmente oxidados. Isso também significava que, após um pulso de laser de ativação, a amostra era irreversivelmente alterada e não podia ser usada novamente. Portanto, amostras frescas eram necessárias para cada ponto de dado coletado, o que se tornou muito trabalhoso, especialmente ao definir o espectro de ativação em uma ampla faixa de comprimentos de onda. Os traços do fotomultiplicador para cada amostra foram capturados em um osciloscópio e os traços fotografados em filme Polaroid e depois analisados manualmente.

Os resultados que obtivemos durante este esforço de pesquisa provaram ser importantes para a compreensão da fotossíntese de plantas verdes. A pesquisa foi importante para estabelecer que o P680 era o centro de reação do chamado segundo fotoato da fotossíntese, ou seja, o centro de reação onde o oxigênio é formado a partir da água. Além disso, nossa pesquisa estabeleceu que o fluxo de elétrons do citocromo b559 para o P680 era cineticamente independente da temperatura de 80 a 220 K. Como acontece com muitos resultados inovadores, nossos estudos foram repetidos por vários laboratórios e desafiados independentemente usando outras abordagens. Com o tempo, nossos resultados foram comprovados como corretos e ainda são considerados importantes neste campo.

Os Radicais de Oxigênio Existem? Novas Abordagens e Novos Métodos Necessários

Questão Importante

Um momento decisivo na carreira de um cientista parece surgir quando se começa a realmente examinar profundamente e questionar a validade dos princípios básicos do campo de pesquisa escolhido. Isso aconteceu comigo no final dos anos 1970 e início dos anos 1980, depois que eu já havia recebido e concluído várias bolsas do NIH. As perguntas que começaram a me atormentar podem ser melhor formuladas como: A) Os radicais livres de oxigênio realmente existem e são realmente importantes em processos biológicos e biomédicos? B) Se eles são importantes, então o cérebro deveria ser o órgão mais suscetível e, portanto, por que não focar nele? Essas perguntas surgiram principalmente porque me tornei agudamente consciente da falta de métodos diretos e rigorosos então em prática para identificar e medir radicais livres de oxigênio em sistemas biológicos. Lutar com essas perguntas me atormentou até que comecei a adotar abordagens criativas concretas para abordá-las. Isso acabou sendo um dos pontos de virada mais importantes na minha carreira de pesquisa.

Aprisionamento de Spin
Para abordar essas questões fundamentais, foi importante utilizar novas abordagens e novos métodos que levaram vários anos para serem desenvolvidos e gerarem resultados pertinentes às questões originais. A meia-vida muito curta da maioria dos radicais livres de oxigênio sempre destacou as severas limitações das abordagens metodológicas disponíveis para estudá-los. O método de aprisionamento de spin, que começamos a usar no início de 1975, foi muito útil para nós em muitos problemas de pesquisa bioquímica. No entanto, apesar de sua utilidade em problemas de pesquisa bioquímica e química, ele apresentava limitações severas para abordar seriamente a questão real de se os radicais livres existiam e eram importantes em sistemas vivos. A limitação mais séria da abordagem de aprisionamento de spin é o fato de que o produto de radical livre aprisionado por spin (aduto de spin) é facilmente reduzido por sistemas biológicos (Fig 2) e, portanto, torna-se não observável por métodos de ressonância paramagnética eletrônica (RPE). Usando RPE, demonstramos que o espectro de RPE do aduto de radical hidroxila aprisionado do 5,5-dimetil-1-pirrolina-1-óxido (DMPO) era rapidamente tornado silencioso em RPE por sinaptossomos. Mostramos que o aduto DMPO-OH era rapidamente reduzido quimicamente pelas mitocôndrias nos sinaptossomos. Isso significava que deveria ser possível usar métodos de oxidação para reverter esse processo e, assim, revelar os adutos de spin nitroxila originais para medição por RPE. Muitas tentativas de conseguir isso usando várias abordagens mostraram-se infrutíferas.
Aprisionamento de Spin e HPLC com Detecção Eletroquímica
Uma abordagem que investigamos foi utilizar uma metodologia de HPLC com Detecção Eletroquímica (HPLC-ED), pela qual poderíamos, em princípio, detectar não apenas o aduto de spin do radical livre no estado nitróxido “visível por RPE”, mas também o aduto de spin reduzido “silencioso em RPE”. Testamos essa abordagem usando um sistema químico simples, onde luz UV foi usada para produzir radicais livres hidroxila a partir de H2O2 que foram aprisionados usando DMPO. A metodologia de HPLC-ED demonstrou que não apenas o aduto de spin do radical hidroxila aprisionado por DMPO podia ser observado como um pico separado no HPLC, também visível por RPE, mas que ele era completamente separado da espécie de radical hidroxila aprisionada por DMPO reduzida por ascorbato, que era silenciosa em RPE. Portanto, a metodologia de detecção eletroquímica por HPLC tornou possível, em princípio, determinar os radicais livres aprisionados por spin formados in vivo, mesmo que fossem reduzidos e se tornassem silenciosos em RPE. Por mais promissora que essa tecnologia e abordagem fossem em um sistema puramente químico, em sistemas biológicos optamos por seguir outras abordagens simplesmente porque não conseguimos encontrar um sistema de solvente que removesse de forma limpa os adutos de spin de radical livre do DMPO do meio biológico.
HPLC com Detecção Eletroquímica e Aprisionamento de Radical Hidroxila por Salicilato
A reatividade muito rápida dos radicais livres hidroxila contribui grandemente para sua concentração extremamente baixa in vivo. Como a tecnologia HPLC-ED possui sensibilidade extrema inerente, essa metodologia foi vital para ajudar a esclarecer o papel dos radicais livres em problemas biomédicos. A literatura química sobre a reatividade dos radicais livres hidroxila nos orientou a determinar se o fenol poderia ser usado como um captador. O fato de que os produtos de reação específicos dos radicais livres hidroxila com o fenol poderiam ser detectados por métodos de detecção eletroquímica nos levou a usar o fenol como uma primeira abordagem. Essa abordagem foi bem-sucedida. No entanto, percebemos que o fenol era extremamente tóxico para os sistemas biológicos, então começamos a considerar uma substância química com reatividade um pouco semelhante à do fenol, mas bem tolerada pelos sistemas biológicos. Felizmente, utilizamos o salicilato e descobrimos que os produtos da reação dos radicais livres hidroxila, 2,3- e 2,5-di-hidroxibenzoato (2,3- e 2,5-DHBA), eram facilmente extraídos do meio biológico e eluíam separadamente do salicilato por HPLC, sendo detectados de forma rápida e sensível por métodos eletroquímicos. Nossa primeira tentativa de utilizar o salicilato como captador de radicais livres hidroxila in vivo foi no modelo de ratos tratados com adriamicina. A adriamicina era conhecida por ser muito tóxica para o coração devido a processos oxidativos, o que limitava seu uso como agente terapêutico eficaz contra o câncer. Os ratos receberam um bolus de 100 mg/kg de salicilato durante um regime de tratamento com adriamicina conhecido por causar danos ao coração. Extratos de tecidos analisados por HPLC-ED mostraram que os tecidos do coração, músculo, pulmão, cérebro e sangue apresentaram níveis de 2,5-DHBA de 100 a 3 vezes maiores, respectivamente, quando comparados aos tecidos de ratos normais não tratados com adriamicina. Este estudo demonstrou claramente que o salicilato era útil como captador de radicais livres hidroxila in vivo. Como se verificou mais tarde, o método de captação com salicilato foi muito importante em nossos estudos sobre acidente vascular cerebral.
Oxidação do DNA – Medição de 8-OHdG por HPLC-ED
A medição direta de produtos de oxidação únicos formados pela reação de radicais livres de oxigênio com alvos moleculares in vivo é outra abordagem importante para investigar seu papel em sistemas biológicos. Desde cedo, começamos a explorar a reação de radicais livres hidroxila com o DNA usando um complexo de DNA-ferro ferroso-peróxido de hidrogênio. Evidências do ataque de radicais livres hidroxila às porções de açúcar do DNA foram demonstradas. Utilizando vários nucleotídeos na presença de ferro ferroso quando reagiram com peróxido de hidrogênio, demonstramos que radicais livres hidroxila foram formados e que os nucleotídeos di- e trifosfato complexados com Fe2+ efetivamente retardaram a oxidação do ferro ferroso para o complexo de ferro férrico ineficaz. O fato de que di- e trinucleotídeos complexados com ferro ferroso de tal maneira que Fe2+ reagiu com H2O2 para formar radicais livres hidroxila nos sugeriu que esses radicais livres também poderiam possivelmente reagir com as bases nucleotídicas para formar produtos de oxidação únicos. Simultaneamente, tomamos conhecimento de que Kasai e Nishimura haviam acabado de descobrir um novo aduto de oxidação da guanina no DNA, a saber, 8-hidroxil-2-desoxiguanosina (8-OHdG), e haviam demonstrado sua formação em DNA que havia sido tratado com Fe e agentes redutores para formar radicais livres de oxigênio. Pensamos que poderia ser possível detectar 8-OHdG usando métodos de HPLC-ED. Kasai e Nishimura gentilmente nos forneceram uma pequena amostra de 8-OGdG. Usando essa amostra, fomos os primeiros a mostrar que 8-OHdG era detectado com muita sensibilidade usando HPLC-ED. Na época, mostramos pela primeira vez que 8-OHdG podia ser detectado com tanta sensibilidade que ninguém sabia se 8-OHdG era formado in vivo. No entanto, logo nós, assim como outros, conseguimos demonstrar claramente que baixos níveis de 8-OHdG estavam presentes no DNA de sistemas vivos e que aumentavam após submeter o sistema biológico a uma quantidade aumentada de estresse oxidativo. Mostramos que a exposição de DNA isolado a radicais livres hidroxila formados pela exposição de H2O2 à luz UV causou a formação de níveis significativos de 8-OHdG no DNA.
HPLC methodology made it possible to detect sub-nanomole levels of 8-OHdG. We recognized early that the methods utilized in the isolation and treatment of DNA influenced the yield of 8-OHdG. The HPLC-ED methodology was to become a very important tool to help elucidate the role of 8-OHdG in biomedical problems, especially its role in cancer initiation and development. Early on we studied conditions known to influence cancer and noted that there was a strong direct relationship of enhanced 8-OHdG levels in DNA and the development of cancer in experimental models of carcinogenesis where oxygen free radicals were strongly implicated. The role of 8-OHdG in cancer development became a very important area of experimental research that is much too extensive to review here. Summarizing, it was soon demonstrated that the presence of 8-OHdG in DNA caused mutations. With time, it was also demonstrated that three classes of DNA repair enzymes were present in biological systems: two specifically engaged in removing 8-OHdG from DNA and another which mediates the degradation of the 8-OH-guanine triphosphate nucleotides thus preventing this oxidized base from being inserted into newly forming DNA. The presence of these three enzyme systems is prima facia evidence that nature considers it important to assure that 8-OHdG is removed from DNA or is prevented from being formed de novo from the oxidized purine base nucleotide.
Methylene Blue Photo-inactivation of RNA Viruses
In June 1986, we began a series of experiments that rather rapidly lead to two original findings, namely: A) that methylene blue (MB) in the presence of light mediates the formation of 8-hydroxyguanine in DNA and RNA; and B) that MB photo-inactivates RNA viruses very effectively. Having in hand the HPLC-ED technology to sensitively measure 8-OHdG in DNA, it was straightforward to demonstrate that MB in the presence of light caused the formation of large levels of 8-OHdG in DNA. During this time (mid-1980s) the possibility of an AIDS pandemic was center stage. Spurred by this concern, we speculated that MB could photo-inactivate the HIV virus. We tested this notion using R17, a model RNA virus, and demonstrated that R17 was very sensitively photo-inactivated by MB. For example, we noted R17 was inactivated by over 8 logs in the presence of 2 μM MB illuminated for 5 min by white light. These observations are summarized in my patent entitled “Phototherapy Using Methylene Blue”. With the expertise of Dr. Raymond Schinazi, we then demonstrated that this approach was also valid in the MB-mediated photo-inactivation of HIV in biological fluids. We also patented these discoveries. More recently, we demonstrated that the West Nile Virus (WNV) is photo-inactivated by MB and that MB photo-inactivation abolishes WNV infectivity in a mouse model.
Estudos foram realizados para compreender os mecanismos envolvidos na fotomediação pelo MB de: A) formação de 8-OHdG no DNA; e B) a base da inativação de vírus de RNA. No caso da fotomediação pelo MB da formação de 8-OHdG em DNA isolado, demonstramos que o oxigênio era necessário para que isso ocorresse. Descartamos um papel para superóxido, peróxido de hidrogênio e radicais livres hidroxila com base no fato de que sequestradores desses intermediários não tiveram efeito sobre o rendimento de 8-OHdG. Com base nos níveis aumentados de 8-OHdG obtidos na presença de D2O em comparação com H2O, concluímos que o oxigênio singlete era um intermediário importante. Isso é consistente com o fato de que é bem conhecido que o oxigênio singlete é produzido na fotólise do MB na presença de oxigênio (Fig 3). Como o MB é um dos vários membros dos corantes tiazínicos, realizamos estudos para determinar as potências relativas de cada um desses corantes na fotomediação da formação de 8-OHdG em DNA isolado. Descobrimos que a potência relativa era a seguinte: Azul de Metileno > Azul B > Azul A > Azul de Toluidina > Tionina.
Em estudos utilizando plasmídeos de DNA superenovelados de fita dupla, demonstramos que MB mais luz causou a formação de grandes níveis de 8-OHdG, bem como quebras de fita simples. As quebras de fita simples ocorreram aproximadamente 17 vezes menos frequentemente do que a formação de 8-OHdG e foram reduzidas por íons magnésio. O papel dos radicais livres hidroxila foi descartado como responsável pelas quebras de fita. Pensou-se que as quebras de fita simples dependiam da presença de 8-OHdG nos plasmídeos de DNA superenovelados, mas a base mecanística exata não foi estabelecida. Utilizando o sistema de bacteriófago M13mp2 de fita simples, as mutações induzidas por MB mais luz foram estudadas. Grandes níveis de 8-OHdG foram gerados por MB mais luz nesses plasmídeos, no entanto os resultados mostraram que a mutagênese era altamente específica e dependente da resposta SOS nas bactérias nas quais os plasmídeos de DNA lesionados foram inseridos. Os resultados mostraram que as mutações eram devidas a transversões G→C e não a transversões G→T esperadas da presença de 8-OHdG. Concluiu-se que as mutações não eram devidas à presença de 8-OHdG per se, mas sim a lesões não identificadas geradas por espécies reativas de oxigênio.
Além de estudar plasmídeos de DNA conforme mencionado acima, realizamos estudos aprofundados dos mecanismos envolvidos nas lesões fotoinduzidas por AM mais luz em bacteriófagos e vírus de RNA. Em um estudo no qual utilizamos AM e Rosa Bengala, um corante também conhecido por gerar eficientemente oxigênio singlete sob luz, examinamos o papel do oxigênio singlete, dos radicais livres hidroxila, da temperatura de reação e da formação de 8-hidroxiguanosina (8-OHG) no RNA do fago na fotoinativação dos bacteriófagos R17 e Qβ. Foi demonstrado que a adição de agentes para sequestrar radicais livres hidroxila teve pouco efeito sobre a quantidade de inativação dos fagos por AM mais luz. O papel da inativação dos fagos por AM mais luz, bem como a formação de 8-OHG, analisada no RNA do fago por métodos de CLAE-DE, foi independente da temperatura na faixa de 13° a 37° C. Descobrimos que o AM foi muito mais eficaz que a Rosa Bengala na fotoinativação dos fagos, mas que a taxa de inativação dos fagos aumentou significativamente tanto para o AM quanto para a Rosa Bengala quando as reações foram realizadas em D2O em comparação com H2O. Todas essas observações implicam fortemente o envolvimento do oxigênio singlete.
Realizamos estudos focados dedicados a determinar a natureza das lesões letais na fotoinativação do bacteriófago Qβ com AM. Os danos letais foram avaliados pela perda da capacidade do fago tratado de mediar a morte quando reinfectado em bactérias. O Qβ é um vírus de RNA muito simples, que consiste em um capsídeo proteico poroso que envolve o genoma de RNA. Utilizando AM mais luz, demonstramos que os danos letais ao Qβ dependiam da presença de oxigênio e que os danos letais não podiam ser explicados pelo número de 8-OHG formadas por vírion. Descobrimos que o AM mais luz mediava a formação de ligações cruzadas RNA-proteína. As ligações cruzadas presumivelmente envolviam a proteína do capsídeo. Essa descoberta ocorreu ao omitir a etapa de digestão com proteinase K antes da extração do RNA do fago com fenol. A recuperação de RNA foi significativamente reduzida; no entanto, logo se notou que o RNA ausente estava na interface fenol-água como ligações cruzadas RNA-proteína. Estudos adicionais utilizando ensaios de RNA infeccioso demonstraram que as lesões letais no fago Qβ após o tratamento com AM mais luz podiam ser explicadas e residiam no componente RNA, mas que o componente proteico do vírion contribuía para a inativação. Tentamos estender esses achados no Qβ para a fotoinativação de vírus HIV mediada por AM mais luz. Tivemos apenas sucesso limitado nesse esforço. No entanto, nossos estudos nessa área indicaram claramente que a morte do HIV por AM mais luz não podia ser explicada pela fotoinativação da transcriptase reversa viral per se.
Potencial Terapêutico das Nitronas
Começamos a trabalhar com as nitronas como compostos de captura de spin a partir de 1975. Foi na segunda metade da década de 1980 que descobrimos seu potencial como terapêuticos no AVC experimental. Cerca de 10 anos atrás, descobrimos que as nitronas PBN eram agentes anticancerígenos eficazes e, mais recentemente, descobrimos que são agentes eficazes para proteger contra a perda auditiva induzida por trauma acústico agudo. O uso de nitronas como terapêuticos foi recentemente revisado, onde essas áreas de pesquisa são abordadas em profundidade {35437}. Nosso objetivo nesta revisão é discutir o esforço de pesquisa de base e a justificativa que levaram às primeiras descobertas e, em seguida, resumir brevemente o esforço passado nessa área e o estado atual da pesquisa em andamento.
Dano Oxidativo ao Cérebro
Para entender completamente por que descobrimos por acaso que as nitronas eram eficazes na proteção contra o AVC experimental, é necessário compreender nosso esforço de pesquisa de base sobre dano oxidativo ao cérebro, que se enraizou no final da década de 1970 e início da década de 1980. Fomos um dos primeiros laboratórios a focar nos mecanismos de dano oxidativo no cérebro. Nossos primeiros experimentos, que utilizaram homogeneizado cerebral, mostraram claramente que o cérebro era muito facilmente oxidado e que a presença de quantidades traço de Fe era muito importante para causar a peroxidação cerebral. Os resultados dos primeiros experimentos, combinados com uma análise da literatura, nos permitiram racionalizar que o cérebro seria extremamente sensível ao dano oxidativo principalmente porque: A) o cérebro consome cerca de 20% da demanda total de oxigênio de todo o corpo, o que é uma quantidade desproporcional com base em seu peso; B) o cérebro é significativamente enriquecido em ácidos graxos altamente insaturados (22:6 e 20:4) em comparação com outros tecidos e, como tal, esses ácidos graxos são potencialmente extremamente sensíveis à peroxidação; e C) o cérebro possui áreas que são enriquecidas em Fe, bem como em ascorbato, e é pobre na enzima antioxidante catalase. Utilizando sinaptossomas isolados do tecido estriatal, mostramos que a síntese de dopamina a partir da tirosina era perdida em proporção direta à quantidade de peroxidação lipídica que ocorria quando essas organelas subcelulares eram induzidas a peroxidar pelo aumento das quantidades de Fe quelado com ADP e ascorbato. Também demonstramos que, com uma atmosfera de oxigênio crescente, a peroxidação lipídica aumentava no homogeneizado de regiões cerebrais isoladas que apresentavam os níveis mais altos de ferro total. Todas essas observações reafirmaram nossas previsões originais de que o cérebro é um órgão propenso a danos oxidativos excessivos. Isso significa que qualquer anormalidade que cause um desequilíbrio no controle normal do dano oxidativo pode desencadear uma série de eventos que podem levar a danos oxidativos excessivos.
Convergência de Desenvolvimentos Científicos Importantes
Durante esse intervalo de tempo (meados da década de 1980), houve uma convergência de desenvolvimentos científicos que tornou o momento propício para começarmos a testar nossas ideias sobre a suscetibilidade do cérebro ao dano oxidativo em um modelo animal. Os desenvolvimentos científicos importantes foram: A) nossas primeiras demonstrações de que o tecido cerebral era extremamente sensível ao dano oxidativo; B) tínhamos em mãos a tecnologia HPLC-ED que nos permitia detectar com sensibilidade o aumento do fluxo de radicais livres hidroxila usando salicilato como armadilha; C) iniciamos uma colaboração com o Dr. John Carney, que tinha experiência com um excelente modelo animal (gerbil da Mongólia) de acidente vascular cerebral experimental e estava no Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Oklahoma, portanto disponível localmente e ativamente desejoso de colaborar conosco; e D) uma nova teoria foi apresentada pelo Dr. Joe McCord, baseada em observações primárias no intestino delgado de gato, de que a reoxigenação do tecido isquêmico causava um grande aumento no fluxo de radicais livres de oxigênio. Eu estava bastante cético em relação à teoria apresentada por McCord e a convergência dos quatro desenvolvimentos mencionados acima tornou possível testar rigorosamente essas ideias no modelo de cérebro com AVC reperfundido. Utilizando o excelente modelo de AVC em gerbil da Mongólia com salicilato como armadilha em nossos primeiros experimentos, provamos de forma muito clara que um aumento do fluxo de radicais livres hidroxila era produzido apenas no tecido cerebral isquêmico/reperfundido e não nas áreas cerebrais que não haviam sofrido isquemia/reperfusão. Esta foi a primeira prova direta e rigorosa desse conceito em um modelo animal experimental de AVC e foi amplamente vista com grande interesse pela comunidade científica.
Após esses resultados empolgantes, nossos laboratórios começaram a colaborar com o laboratório do Dr. Earl Stadtman. O laboratório deles havia estudado extensivamente os danos oxidativos a proteínas e o envelhecimento. Portanto, as medições de danos oxidativos a proteínas, bem como a atividade da glutamina sintase e da protease neutra, foram parâmetros medidos em cérebros de gerbils jovens e velhos antes e após o acidente vascular cerebral experimental. Além disso, a administração aguda e crônica de PBN também foi utilizada como outro parâmetro. Esses esforços colaborativos levaram rapidamente a vários relatórios publicados que produziram várias descobertas novas importantes. Um resumo das novas observações que fizemos é apresentado na Figura 4. Descobrimos que os gerbils mais velhos eram mais suscetíveis a AVC do que os gerbils mais jovens e que a quantidade de proteína oxidada no cérebro dos gerbils mais velhos estava aumentada em comparação com os mais jovens. Os cérebros mais velhos tinham menor atividade da glutamina sintase, bem como da protease neutra, um sistema enzimático que cataboliza proteínas, que foi descoberto no laboratório de Stadtman e agora é uma área de pesquisa extremamente ativa sob a área geral dos proteassomas. A administração crônica de PBN (30 mg/kg diariamente) por 14 dias reverteu muitos dos parâmetros dos gerbils mais velhos de volta aos níveis observados nos gerbils mais jovens, conforme observado na Figura 4. Esses são resultados notáveis que realmente nos entusiasmaram, bem como o campo de pesquisa em geral. Outra observação marcante e importante que fizemos foi a demonstração de que a administração de um bolus de PBN antes de submeter os gerbils a um AVC causou proteção significativa contra danos cerebrais induzidos pelo AVC. Essa observação nos levou a testar se o PBN administrado logo após (até 1 hora) um AVC ofereceria proteção. Fizemos a observação impressionante de que o PBN protegeu se administrado até 1 hora após um AVC. Esses resultados foram logo reproduzidos e ampliados pelo laboratório de Phillis.
PBN-Nitronas como Terapêutica no AVC
A descoberta que fizemos em 1988 de que um bolus de PBN administrado até uma hora após o início da reperfusão cerebral no AVC experimental era eficaz na redução do dano cerebral foi patenteada. Era óbvio para o Dr. Carney e para mim que as PBN-nitronas poderiam se tornar um tratamento eficaz após um AVC e, como tal, também ter potencial comercial. Ao longo de um período de quatro anos, nossos esforços contínuos de pesquisa agregaram potencial significativo à tecnologia das PBN-nitronas, conforme detalhado na Figura 4. Também durante esse intervalo de tempo, tivemos muitas visitas infrutíferas a várias empresas farmacêuticas pequenas e grandes na tentativa de licenciar a tecnologia para elas. Como o Dr. Huber Warner, do National Institutes of Aging, tinha grande interesse em nossa tecnologia, fomos apresentados a Paul Glenn, que havia formado uma fundação privada (Paul F. Glenn Foundation for Aging Research) para ajudar a financiar pesquisas sobre envelhecimento. Ele e seu conselho de consultores viram em nossa pesquisa um valor significativo para a compreensão do envelhecimento cerebral e, em fevereiro de 1992, nos concederam uma bolsa de US$ 50.000 (não solicitada) para realizar mais pesquisas nessa área. Por meio dessa pequena bolsa, vários derivados de PBN foram sintetizados e testados no modelo de AVC e em outros modelos neurodegenerativos. Esse dinheiro foi a alavanca catalítica que levou à síntese inicial e, posteriormente, ao desenvolvimento de um composto (2,4-dissulfofenil-N-terc-butilnitrona) que mais tarde seria chamado de NXY-059 como o fármaco candidato para o tratamento terapêutico do AVC em humanos. Além disso, como resultado de nossa interação com a Glenn Foundation e consultores, em 1992 formamos a Centaur Pharmaceuticals, Inc., como uma empresa para explorar o potencial comercial das PBN-nitronas para doenças neurodegenerativas. Como resultado da extensa pesquisa e desenvolvimento conduzidos na Centaur e da parceria formada com a AstraZeneca, o fármaco experimental NXY-059 foi desenvolvido para o tratamento do AVC. Resumimos esse esforço em grande detalhe em uma revisão recente {35437} e, portanto, apenas os aspectos principais mais importantes são apresentados na Figura 5 e discutidos brevemente aqui.
Vários anos de estudos foram dedicados à exploração de derivados de PBN em experimentos pré-clínicos com roedores. O derivado de PBN 2,4-dissulfofenil-N-terc-butilnitrona (NXY-059) foi escolhido com base em sua potência aprimorada de neuroproteção no AVC e seu excelente perfil de segurança em animais experimentais e em ensaios clínicos de fase 1 e 2 em humanos. Um estudo fundamental foi a demonstração de que o NXY-059 proporcionou neuroproteção significativa se administrado 4 horas após um AVC em um modelo de sagui. Com base em todas as informações disponíveis, os ensaios clínicos de eficácia de fase 3 em todo o mundo, patrocinados pela AstraZeneca, começaram em 2003 com um estudo inicial menor com 1700 pacientes com AVC (SAINT I). Este estudo mostrou proteção significativa com base na escala de Rankin modificada se o NXY-059 fosse administrado dentro de 6 horas após o AVC. Este estudo foi seguido por um ensaio muito maior com 3200 pacientes com AVC (SAINT II) que utilizou muitos mais centros clínicos em todo o mundo. Para surpresa de muitos, o ensaio SAINT II não conseguiu mostrar significância. Isso fez com que a AstraZeneca interrompesse o desenvolvimento do NXY-059. Em nossa revisão recente {35437}, discutimos as várias críticas que foram escritas sobre esses estudos.
PBN-Nitronas como Agentes Anticâncer
Em 1997, iniciamos uma série de experimentos que levaram à demonstração de que o PBN possuía atividade anticancerígena. Resumimos isso em uma revisão recente {35437}. A maior parte da minha carreira científica foi dedicada ao estudo dos radicais livres e do desenvolvimento do câncer. Um dos objetivos mais desejáveis nessa área de pesquisa é poder trabalhar em um modelo de carcinogênese em que o câncer se desenvolve e o único agente conhecido responsável são os radicais livres. Na minha opinião, o carcinoma hepatocelular induzido por deficiência de colina é o melhor modelo que se encaixa nesse critério. Eu não tive a oportunidade de realmente trabalhar nesse modelo até 1997. Foi então que o Dr. Dai Nakae, do laboratório do Dr. Yoichi Konishi em Nara, Japão, visitou nosso laboratório. Eles já haviam demonstrado que certos antioxidantes suprimiam os estágios iniciais do desenvolvimento do câncer no modelo de deficiência de colina. Eu os convenci a testar o PBN em um estudo piloto. Portanto, os experimentos começaram com um estudo piloto de curto prazo conduzido em colaboração com o Dr. Dai Nakae na Nara Medical School em Nara, Japão, usando a dieta definida em aminoácidos com deficiência de colina (CDAA). Essa dieta, quando fornecida a ratos machos, causa a indução de carcinoma hepatocelular em cerca de um ano. O desenvolvimento do câncer nesse modelo está intimamente acoplado a níveis elevados de processos de radicais livres de oxigênio. A administração de PBN em 3 níveis diferentes na água de beber por 12 semanas demonstrou claramente que essa nitrona tinha atividade potente para inibir os estágios iniciais da carcinogênese. Os achados mais notáveis foram que a administração de PBN: A) fez com que as lesões pré-neoplásicas fossem significativamente menores; B) diminuiu o dano oxidativo ao DNA, conforme avaliado pelo conteúdo de 8-OHdG e; C) diminuiu a peroxidação lipídica no tecido-alvo. Estudos de acompanhamento demonstraram que a administração de PBN a longo prazo diminuiu significativamente a quantidade de carcinomas hepatocelulares francos e, como tal, atua como um agente anticancerígeno. Nesses estudos, também demonstramos que o PBN, quando administrado em um estudo de longo prazo, não era carcinogênico por si só. Isso também foi demonstrado em modelos de camundongos.
Mecanisticamente, não entendemos por que o PBN é um agente anticancerígeno, no entanto, acreditamos que pistas importantes foram obtidas nesses estudos. Observamos que a administração de PBN causou morte aumentada das células dentro dos nódulos pré-neoplásicos, mas não teve efeito, ou talvez até um efeito paliativo, sobre as células normais circundantes. A influência diferencial do PBN em matar as células que são pré-neoplásicas, que podem eventualmente se desenvolver em tumores francos, versus não mostrar efeito, ou até mesmo um efeito protetor, sobre as células normais circundantes, é notável e importante. A causa raiz disso ainda não é compreendida. Nós mostramos que a óxido nítrico sintase induzível (iNOS) pode estar envolvida e que o PBN suprime a indução dessa enzima no fígado em processo de desenvolvimento de câncer.
Está claro que o PBN tem um efeito anticâncer de amplo espectro em outros modelos experimentais de câncer. O Dr. Rheal Towner e eu demonstramos que o PBN possui atividade anticâncer em um modelo experimental de glioblastoma. Derivados do PBN estão sendo extensivamente investigados nesse modelo com o objetivo de longo prazo de desenvolver um derivado para estudos em humanos. Em estudos preliminares, também demonstramos que o PBN tem atividade anticâncer no modelo APCmin de câncer de cólon.
PBN-Nitronas e Proteção contra Perda Auditiva
Ampla pesquisa de base demonstrou que processos de radicais livres estão envolvidos no dano à cóclea causado pela exposição a ruído intenso por si só ou ainda mais em combinação com toxinas ambientais. Com base nisso, ajudamos e incentivamos o Dr. Lawrence Fechter a utilizar o PBN para determinar se ele tinha efeitos preventivos. Sua pesquisa mostrou que o PBN teve um pequeno efeito protetor em modelos de ratos usando ruído intenso em combinação com certas toxinas ambientais. Pude me envolver mais diretamente nessa área trabalhando com o Dr. Richard Kopke e seus colegas no Hough Ear Institute a partir de 2003. Essa associação frutífera produziu resultados empolgantes com chinchilas, onde o trauma acústico agudo (TAA) é induzido usando ruído de banda larga. Nossa pesquisa nessa área foi recentemente revisada {35437}. Descobrimos que a perda auditiva pode ser amplamente prevenida pela administração de 4-hidroxi-PBN (4-OHPBN) em combinação com N-Acetilcisteína (NAC) 4 horas, ou até mais, após o TAA. A combinação de 4-OHPBN mais NAC é muito mais eficaz do que qualquer um isoladamente; na verdade, o efeito protetor é sinérgico, de modo que é necessária muito menos quantidade de cada fármaco. Essas são observações muito importantes que estamos buscando ativamente como potenciais abordagens terapêuticas para proteger o pessoal militar.
Tive a grande sorte de ter a honra e o prazer de ser um peregrino no caminho da aventura e descoberta científica. Esta tem sido verdadeiramente uma era de conquistas espetaculares nas ciências biomédicas. O campo da biologia e medicina dos radicais livres passou de uma base de conhecimento tão rudimentar nos últimos 40 anos para a sofisticação atual, onde questões científicas podem ser formuladas que antes nem sequer poderiam ter sido concebidas. No entanto, muito ainda resta a ser descoberto e traduzido em aplicações práticas. Os cientistas de hoje, inclusive eu, devem continuar a fazer perguntas e desenvolver novas tecnologias inovadoras que produzirão resultados que podem minar os modelos atuais e criar novos modelos que incorporem plenamente as observações passadas. É surpreendente que a ciência quase nunca seja conduzida com esse objetivo elevado em mente. É no curso da investigação científica, quando os experimentos produzem resultados que não são os previstos e os erros metodológicos e de protocolo foram eliminados, que a Natureza pode ter apresentado uma oportunidade única para o que poderia levar a uma compreensão mais profunda e a descobertas. É verdade que tentativas prolongadas de entender por que os experimentos produziram resultados intrigantes podem levar a becos sem saída. Tive a sorte de que muitos dos achados fortuitos que fizemos vieram de experimentos de acompanhamento desencadeados por resultados intrigantes. Isso não minimiza o fato de que muitas vezes os experimentos mais bem planejados produzem os resultados mais surpreendentes e fortuitos, o que é um tributo à abordagem científica.
Figuras
Lista de áreas de pesquisa onde nossa pesquisa contribuiu com descobertas inovadoras.
Equações ilustrando o uso do captador de spin α-fenil-terc-butilnitrona (PBN) para capturar um radical livre e a subsequente redução metabólica do aduto de spin a uma espécie que não é observável por ressonância paramagnética eletrônica. A captura de radicais livres hidroxila pelo salicilato produz os compostos ácido 2,3 e 2,5-di-hidroxibenzoico, indicados como 2,3 e 2,5-DHBA.
Equações observando a formação fotoinduzida da espécie singlete excitada do azul de metileno (MB) que pode decair de volta ao estado fundamental do MB ou formar o estado triplete excitado do MB que reagirá com o oxigênio no estado fundamental para formar oxigênio singlete.
Lista de observações que fizemos no estudo do modelo de acidente vascular cerebral no gerbil da Mongólia.
Linha do tempo da descoberta e principais estágios de pesquisa e desenvolvimento das PBN-nitronas para o tratamento do acidente vascular cerebral.
Lista de Referências
Espécies reativas de oxigênio e oxidação de proteínas no envelhecimento: um olhar para trás, um olhar para frente
Intoxicação por oxigênio e irradiação por raios X: um mecanismo em comum
Envelhecimento: Uma teoria baseada na química dos radicais livres e da radiação
Mutação, Câncer e Envelhecimento
Superóxido dismutase: Uma função enzimática para a eritrocupreína (Hemocupreína)
Superóxido e superóxido dismutase
Reações fotoinduzidas a baixa temperatura em folhas verdes e cloroplastos
Radicais livres em materiais biológicos
Sinais de ESR durante a irradiação por raios X de tecidos: Suas características e relação com o estado canceroso
Radicais livres e carcinogênese. Algumas propriedades dos radicais livres nitroxila produzidos pela ligação covalente do 2-nitrosofluoreno a lipídios insaturados de membranas
Radicais livres na carcinogênese por arilaminas
Radicais livres na carcinogênese por arilaminas
Radicais livres produzidos em uma reação de nitrosofluoreno com lipídio insaturado
Oxidação catalisada por peroxidase de raiz-forte/peróxido de hidrogênio do carcinógeno N-hidroxi-N-acetil-2-aminofluoreno afetada por cianeto e ascorbato
Nitronas como terapêuticos
Estudos de fotossíntese usando um laser pulsado
Tunelamento quântico em sistemas biológicos
Don DeVault: Uma homenagem por ocasião de sua aposentadoria
Obituário
Aprisionamento de spin do radical triclorometila produzido durante a oxidação enzimática do NADPH na presença de tetracloreto de carbono ou bromotriclorometano
Aprisionamento de spin em sistemas biológicos. Oxidação do captador de spin 5,5-dimetil-1-pirrolina-1-óxido por um sistema hidroperóxido-hematina
Formação de radical livre hidroxila catalisada por DNA-ferro ferroso a partir de peróxido de hidrogênio
Demonstração direta de que complexos de íons ferrosos de nucleotídeos di- e trifosfato catalisam a formação de radical livre hidroxila a partir de peróxido de hidrogênio
Formação de radical livre hidroxila a partir de peróxido de hidrogênio por complexos de ferro ferroso-nucleotídeo
Aduto de spin de radical livre hidroxila em sinaptossomas de cérebro de rato. Observações sobre a redução do nitróxido
Detecção eletroquímica de radicais livres de oxigênio por cromatografia líquida de alta pressão
Ensaio sensível da formação de radical livre hidroxila utilizando cromatografia líquida de alta pressão com detecção eletroquímica de produtos de hidroxilação de fenol e salicilato
Uso de salicilato com cromatografia líquida de alta pressão e detecção eletroquímica (LCED) como uma medida sensível de radicais livres hidroxila em ratos tratados com adriamicina
Hidroxilação da desoxiguanosina na posição C-8 por ácido ascórbico e outros agentes redutores
Aduto de radical livre hidroxila da desoxiguanosina: Detecção sensível e mecanismos de formação
Formação de 8-hidroxidesoxiguanosina, aduto de radical livre hidroxila do DNA em granulócitos expostos ao promotor tumoral, tetradecanoilforbolacetato
Formação de 8-hidroxiguanina mediada por radical livre hidroxila em DNA isolado
Condições que influenciam o rendimento e a análise de 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina em DNA danificado oxidativamente
Aumento do conteúdo de 8-hidroxiguanina no DNA de cloroplastos de plantas tratadas com ozônio
Níveis elevados de 8-hidroxidesoxiguanosina no DNA de hamsters sírios tratados com dietilestilbestrol: Dano covalente ao DNA por radicais livres gerados pelo ciclo redox do dietilestilbestrol
Reação do cromo(VI) com glutationa ou com peróxido de hidrogênio: Identificação de intermediários reativos e seu papel no dano ao DNA induzido por cromo(VI)
O papel da 8-hidroxiguanina na carcinogênese
8-Hidroxiguanina, uma forma abundante de dano oxidativo ao DNA, causa substituições G T e A C
Azul de metileno mais luz medeia a formação de 8-hidroxiguanina no DNA
Mediação da formação de 8-hidroxiguanina no DNA por corantes tiazínicos mais luz
Fototerapia usando azul de metileno
Corantes tiazínicos usados para inativar o HIV em fluidos biológicos
Fotoinativação de vírus de RNA por azul de metileno
A fotoinativação por azul de metileno abole a infectividade do vírus do Nilo Ocidental in vivo
Azul de metileno mais luz medeia a formação de 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina no DNA preferencialmente sobre a quebra de fita
Mutações induzidas por azul de metileno mais luz em M13mp2 de fita simples
Fotoinativação de bacteriófagos de RNA por azul de metileno e rosa bengala: Estudos comparativos da formação de 8-oxoguanina em RNA isolado
Mecanismos potenciais de inativação fotodinâmica de vírus por azul de metileno
Bacteriófago Qβ fotoinativado por azul de metileno mais luz envolve a inativação de seu RNA genômico
Síntese fotoquímica de nucleosídeos de 8-hidroxiguanina
Possível envolvimento de ferro e radicais livres de oxigênio em aspectos do envelhecimento no cérebro
Envolvimento de espécies ativadas de oxigênio na peroxidação de membranas: Possíveis mecanismos e consequências bioquímicas
Peroxidação lipídica regional no cérebro de rato in vitro: possível papel do ferro endógeno
Dano mediado por radicais de oxigênio ao tecido cerebral
Peroxidação lipídica induzida por ferro e inibição da síntese de dopamina em sinaptossomas do estriado
Radicais livres derivados do oxigênio na lesão tecidual pós-isquêmica
Inibidores da xantina oxidase atenuam as alterações da permeabilidade vascular induzidas por isquemia no intestino de gato
Envolvimento de radicais livres de oxigênio na lesão de isquemia e reperfusão no cérebro
Proteção contra dano oxidativo ao SNC por α-fenil-terc-butil nitrona e outros agentes de captura de spin: Uma nova série de sequestradores de radicais livres não lipídicos
Dano oxidativo ao comportamento durante o envelhecimento
Modificação de proteínas no envelhecimento
Papel dos radicais livres de oxigênio na carcinogênese e isquemia cerebral
Reversão do aumento relacionado à idade na oxidação de proteínas cerebrais, diminuição da atividade enzimática e perda de memória temporal e espacial pela administração crônica do composto de captura de spin N-terc-butil-α-fenilnitrona
Composições de fenil butil nitrona e métodos para tratamento de dano tecidual oxidativo
O agente de captura de radicais livres N-terc-butil-α-fenilnitrona (PBN) atenua a lesão isquêmica cerebral em gerbils
α-fenil-terc-butil-nitrona reduz o infarto cortical e edema em ratos submetidos à isquemia focal
Inibição por fenil N-terc-butil nitrona na fase inicial da carcinogênese nos fígados de ratos alimentados com uma dieta deficiente em colina e definida em L-aminoácidos
Espécies reativas de oxigênio na carcinogênese induzida por deficiência de colina e inibição por nitrona
Inibição do desenvolvimento de carcinomas hepatocelulares por fenil N-terc-butil nitrona em ratos alimentados com uma dieta deficiente em colina e definida em L-aminoácidos
Inibição do desenvolvimento de câncer por nitrona
Efeitos da fenil N-terc-butil nitrona e seus derivados na fase inicial da hepatocarcinogênese em ratos alimentados com uma dieta deficiente em colina e definida em L-aminoácidos
Óxido Nítrico e Desenvolvimento do Câncer
Visualização da capacidade protetora de um composto sequestrador de radicais livres contra gliomas C6 e F98 em ratos por tractografia de fibras por tensor de difusão
Fenil-terc-butil-nitrona induz regressão tumoral e diminui a angiogênese em um modelo de glioma C6 em ratos
Proteção coclear contra exposição ao monóxido de carbono por bloqueadores de radicais livres em cobaias
Efeitos protetores da fenil-N-terc-butilnitrona na potenciação da perda auditiva induzida por ruído pelo monóxido de carbono
Acrilonitrila potencializa a perda auditiva induzida por ruído em ratos
Eficácia da 4-hidroxi fenil N-terc-butilnitrona (4-OHPBN) isoladamente e em combinação com outros fármacos antioxidantes no tratamento do trauma acústico agudo em chinchilas
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