pmid: "31624290"
title: "Efeito fotodinâmico de nanobicamadas biocompatíveis de fosfato de zircônio contendo azul de metileno em células cancerosas e normais."
authors: "Hosseinzadeh R, Khorsandi K"
journal: "Scientific reports"
pubdate: "2019 Oct 17"
doi: "10.1038/s41598-019-51359-7"
source: "PMC Full Text"

Efeito fotodinâmico de nanobicamadas biocompatíveis de fosfato de zircônio contendo azul de metileno em células cancerosas e normais.

Autores

Hosseinzadeh R, Khorsandi K

Periodico

Scientific reports (2019 Oct 17)

Conteudo

Efeito fotodinâmico de nano-bicamadas biocompatíveis de fosfato de zircônio contendo azul de metileno em células cancerosas e normais
As aplicações farmacêuticas do azul de metileno, especialmente como fotossensibilizador, têm sido limitadas devido à sua rápida redução enzimática nos sistemas biológicos. Neste estudo, nano-plaquetas de fosfato de zircônio foram sintetizadas e sua biocompatibilidade foi avaliada. O material sintetizado foi considerado como veículo de liberação de fármaco para o azul de metileno, visando aumentar a eficácia da terapia fotodinâmica em células de câncer de mama humano. Os nano-híbridos de fosfato de zircônio-azul de metileno foram caracterizados por Difração de Raios X em Pó (DRX), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Análise Termogravimétrica (TGA). A biocompatibilidade dos nanomateriais sintetizados foi estudada em células normais de fibroblasto humano Hu02 e em células de câncer de mama humano MDA-MB-231. Os resultados esclareceram que as nanopartículas de ZrP-MB podem diminuir a toxicidade no escuro do azul de metileno livre. A terapia fotodinâmica utilizando fosfato de zircônio-azul de metileno em células de câncer de mama humano MDA-MB-231 foi avaliada por ensaio MTT, ensaio de capacidade de formação de colônias, coloração dupla AO/EB e detecção de apoptose por citometria de fluxo. Os resultados sugerem que os nano-híbridos de fosfato de zircônio-azul de metileno aumentam significativamente a eficácia da terapia fotodinâmica, provavelmente por meio de um mecanismo de morte celular por apoptose, contra células de câncer de mama humano. De acordo com os resultados, as nanopartículas de fosfato de zircônio podem ser sugeridas como um promissor nanotransportador para a entrega de fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica.
Introdução
O câncer ainda é uma das doenças mais desafiadoras e é a principal causa de morte depois das doenças cardiovasculares. O câncer de mama é uma das neoplasias malignas mais comuns em mulheres e o segundo câncer mais letal após o câncer de pulmão entre as mulheres. Com o desenvolvimento do conhecimento sobre as doenças cancerígenas, muitos avanços foram feitos para tratá-las. A quimioterapia é um dos principais métodos terapêuticos e permanece como uma ferramenta comum e importante no tratamento do câncer de mama metastático. Os efeitos tóxicos dos medicamentos anticâncer sobre as células normais ainda são uma questão importante, pois eles frequentemente agem de forma inespecífica. Nas últimas duas décadas, novos sistemas de liberação de fármacos foram desenvolvidos que podem superar os problemas da quimioterapia. Nos últimos anos, mais atenção tem sido dada à utilização de nanopartículas como transportadores para a liberação de fármacos. Os transportadores de nanopartículas melhoram a função dos fármacos e reduzem seus efeitos colaterais alterando as propriedades farmacocinéticas. Para a síntese de nanopartículas, vários materiais como polímeros, partículas metálicas, lipídios, etc. podem ser utilizados, os quais produzem diferentes formas e tamanhos de nanopartículas. Essas estruturas têm a capacidade de controlar a liberação do fármaco, proteger a molécula do fármaco, ter tamanho de partícula menor que as células, atravessar barreiras biológicas para atingir o local alvo, aumentar a meia-vida do fármaco na corrente sanguínea, realizar a entrega direcionada de fármacos e apresentar biocompatibilidade, podendo ser consideradas sistemas de liberação altamente eficazes para aumentar a eficácia terapêutica dos medicamentos. Recentemente, o uso de nanomateriais inorgânicos para aplicações biomédicas tem crescido em comparação com os sistemas tradicionais de liberação de fármacos poliméricos. Dentre a variedade de nanopartículas, os compostos inorgânicos lamelares têm um interesse especial nas pesquisas devido à sua alta capacidade de troca iônica, estrutura cristalina, tamanho de partícula ajustável, formas não esféricas e biocompatibilidade.
Nanomateriais inorgânicos não esféricos com estrutura em camadas (LSNs) são utilizados em diversas pesquisas. Existem muitos relatos científicos sobre as aplicações dos LSNs. Entre eles, os materiais de troca catiônica em camadas de fosfato de zircônio têm sido amplamente utilizados em aplicações biomédicas como veículos de fármacos devido à sua inocuidade para os seres humanos e por não interferirem na função metabólica do corpo. O tamanho dos materiais de ZrP sintetizados pode ser facilmente controlado por métodos de síntese e modificação. Eles devem apresentar melhores propriedades de ligação, adesão celular e marginação do que as nanopartículas esféricas devido ao formato semelhante a plaquetas das nanoestruturas de fosfato de zircônio. O ZrP pode intercalar uma ampla variedade de fármacos e, devido à sua capacidade de troca iônica, pode liberar os fármacos interagidos em condições ácidas, como no microambiente das células cancerígenas. Os lisossomos e os peroxissomos poderiam dissociar o fosfato de zircônio em íons fosfato e sais de zircônio inofensivos. Além disso, a boa biocompatibilidade, bioatividade, disponibilidade de baixo custo, método de síntese simples e alta estabilidade do fosfato de zircônio proporcionam o potencial para seu uso na área biomédica. Atualmente, esses materiais são nanocarreadores muito atrativos para a entrega de fármacos, proteínas e genes.
Terapia fotodinâmica (PDT) é uma terapia de radiação não invasiva utilizada para o tratamento de tipos de câncer, doenças cardiovasculares e oftálmicas. A PDT baseia-se na fotoativação de material sensível à luz (fotossensibilizador). Os fotossensibilizadores ativados transferem seu excesso de energia para o oxigênio circundante para formar as espécies reativas de oxigênio (ROS), particularmente o oxigênio singleto como materiais reativos citotóxicos, que causarão danos em células e tecidos cancerosos. Outra grande vantagem da PDT é seu potencial de superar a resistência a múltiplos fármacos (MDR) devido ao mecanismo citotóxico específico dos fotossensibilizadores sobre as células cancerosas, que é diferente dos mecanismos dos agentes quimioterápicos. Os efeitos colaterais significativos do fotossensibilizador são interações inespecíficas e danos a células e tecidos normais devido à baixa seletividade para células específicas, degradação ambiental do fotossensibilizador e insolubilidade em água ou hidrofobicidade molecular, que causam várias limitações na aplicação clínica da terapia fotodinâmica. A aplicação de nanopartículas na entrega de fotossensibilizadores para células tumorais na PDT tem sido aprimorada. Vantagens como dispersão aquosa estável de fotossensibilizadores hidrofóbicos, capacidade de modificação de superfície, terapia direcionada, proteção dos fotossensibilizadores contra degradação ambiental e supressão podem ser alcançadas usando sistemas de nanoentrega. De acordo com as propriedades químicas e redox do azul de metileno (MB), o uso clínico do MB tem sido dificultado devido à simples redução do MB para a forma reduzida fotodinamicamente inativa "leuco-azul de metileno" em sistemas biológicos. Os dois principais sistemas redutores associados à inativação do azul de metileno são a presença de uma redutase de corante tiazínico transmembrana na superfície celular e a redução intracelular pelas desidrogenases NADH/NADPH. Neste estudo, sintetizamos e caracterizamos nanofolhas lamelares de fosfato de zircônio e as utilizamos como nanocarreadores de azul de metileno para terapia fotodinâmica de células de câncer de mama humano. As quantidades carregadas de MB foram determinadas por métodos espectrofotométricos e térmicos e a liberação in vitro do fármaco a partir do sistema de nanoentrega foi avaliada. A citotoxicidade in vitro e o mecanismo de morte das nanopartículas ZrP-MB no tratamento fotodinâmico da linhagem celular de câncer de mama humano MDA-MB-231 foram determinados.
Cloreto de zirconila (ZrOCl2, 8H2O), ácido fosfórico e azul de metileno foram obtidos da Merck. O meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) foi adquirido da Invitrogen. O reagente de ensaio MTT, (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio), foi fornecido pela Sigma-Aldrich. A solução de azul de tripano (0,4% p/v) e dimetilsulfóxido (DMSO) foram obtidos da Merck Company. Soro fetal bovino (SFB) e antibióticos foram adquiridos da Gibco (Gibco BRL). Todos os produtos químicos eram de grau analítico. Água deionizada bidestilada foi utilizada em todos os experimentos e soluções. Todas as medições de pH foram realizadas a 25 °C utilizando um Bel PHS3-BW (BEL ENGINEERING, Itália). Os espectros de absorção UV-Vis foram registrados utilizando um espectrofotômetro UV/Vis Cary 60, equipado com cubetas de quartzo. Um LED emissor de luz vermelha (660 nm; densidade de potência: 30 mW cm−2) foi utilizado como fonte de luz para os experimentos fotodinâmicos.
Síntese de fosfato de zircônio
A síntese do fosfato de zircônio foi realizada com base em procedimentos relatados previamente na literatura. Resumidamente, uma certa quantidade de cloreto de zirconila octa-hidratado foi dissolvida em água deionizada (14 mM) e agitada vigorosamente até a dissolução completa. A solução homogênea resultante foi adicionada gota a gota a uma solução diluída de ácido fosfórico (28 mM) e agitada vigorosamente. Um precipitado pastoso foi produzido. A mistura resultante foi transferida para uma autoclave de aço inoxidável revestida de teflon selada. A autoclave foi mantida a 180–200 °C por 9 h e então resfriada até a temperatura ambiente sob condições ambientes. Os produtos sintetizados foram coletados por centrifugação. Para remover outros contaminantes do produto final, o precipitado coletado foi ressuspenso em água deionizada e coletado por centrifugação por três vezes.
Caracterização do fosfato de zircônio sintetizado
A caracterização dos materiais sintetizados foi realizada utilizando vários métodos analíticos. A estrutura cristalina do ZrP foi caracterizada por análise de difração de raios X em pó. Os padrões de XRD foram obtidos por um difratômetro de raios X Rigaku MiniFlex utilizando radiação CuKα (λ = 0,154 nm). As larguras das fendas de divergência, recepção e detecção foram de 2 mm; a largura da fenda de dispersão foi de 0,6 mm. Imagens de MEV foram obtidas utilizando um microscópio eletrônico de varredura para amostras em pó pelo instrumento MEV Zeiss (Zeiss EVO-18, Alemanha). O EVO 18 oferece Espectroscopia de Energia Dispersiva e de Comprimento de Onda Dispersivo (EDS e WDS) para análise elementar de superfície. A Área de Superfície Específica (ASE) obtida e calculada para as nanopartículas sintetizadas foi de 65,8 m²/g. Os espectros de fluorescência foram registrados por um espectrofotômetro de fluorescência Cary Eclipse equipado com um porta-cubetas termostatizado à temperatura ambiente. As fendas de excitação e emissão foram ajustadas em 5 nm. O espectrofotômetro UV-vis Cary 100, equipado com cubetas de quartzo, foi utilizado para registrar os espectros de absorção UV-Vis.
Intercalação de azul de metileno em fosfato de zircônio lamelar
O azul de metileno foi intercalado nas camadas de fosfato de zircônio de acordo com métodos anteriores. Uma determinada quantidade de fosfato de zircônio suspensa nas soluções contém concentrações constantes de azul de metileno. As suspensões experimentais são mantidas no escuro e agitadas continuamente. A absorbância do sobrenadante das amostras centrifugadas foi medida em intervalos de 30 minutos até atingir um valor constante, indicativo do fim da intercalação do azul de metileno. O tempo ótimo relacionado ao processo de intercalação foi obtido por medições contínuas da absorbância do azul de metileno nos sobrenadantes em vários momentos até obter o tempo de equilíbrio de intercalação. Após atingir o equilíbrio de intercalação, a suspensão foi centrifugada e o sobrenadante descartado. O precipitado obtido foi lavado três vezes para remover o excesso de MB livre (MB não intercalado) dos materiais de intercalação.
Análise termogravimétrica (TGA)
A análise termogravimétrica foi registrada usando STA 1500, da Rheometic Scientific Co. A porcentagem de azul de metileno carregado nas nanopartículas de ZrP foi calculada por análise termogravimétrica. As perdas de peso térmico foram registradas aumentando a temperatura até 600 °C com uma rampa de 5 °C/min.
Experimentos celulares
Células de fibroblastos humanos normais (HU02) e células de câncer de mama humano (MDA-MB-231) foram adquiridas do Instituto Pasteur, Teerã, Irã. O meio DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 UI/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina foi usado como meio de cultura celular. As células foram cultivadas no meio fornecido e então incubadas em uma incubadora umidificada contendo 5% de CO2 a 37 °C. As células foram removidas por tripsinização (tripsina 0,025%, EDTA 0,02%) e lavadas com solução tampão fosfato e então cultivadas para fins experimentais. Para os tratamentos, as soluções de MB e ZrP-MB foram preparadas frescas usando solução tampão PBS.
Ensaio MTT
O ensaio colorimétrico MTT (brometo de tiazolil azul tetrazólio) foi usado para avaliação da viabilidade celular. As células vivas convertem o MTT em um formazan insolúvel. O formazan resultante foi solubilizado usando dimetilsulfóxido (DMSO) e sua concentração medida usando um leitor de ELISA. Resumidamente, o meio de cultura foi removido e as células foram incubadas em meio contendo 0,5 mg/mL de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio por 4 h a 37 °C. Os cristais de formazan roxos resultantes foram dissolvidos em 100 µL de DMSO e agitados por 15 min. A absorbância das soluções foi medida a 570 nm por um leitor de ELISA (Hyperion, Inc., FL, EUA).
Experimentos fotodinâmicos
The MDA-MB-231 human breast cancer cells were grown in medium culture and after reaching 80∼90% confluence the cells were washed with PBS, afterwards detached from the flask by addition of 1.0 mL of 0.25% trypsin for 1–3 min at 37 °C. Cells (1 × 104 cells/well) were seeded into 96-well plates. The cells were treated with analyts at different conditions. After a further incubation 1 h, one plate was considered as dark (no irradiation/control plate) and the other plates illuminated by Laser light (PDT). The MTT assay was used to determine the cell viability.
Clonogenic cell survival assay
Clonogenic cell survival assay was used for evaluation of the long-term proliferative potential of MDA-MB-231 cancer cells following PDT treatment. For this purpose, the treated cells were seeded at a density of 200 cells per well in 6-well plates and cultured for 7 days. Then, the media was removed from each plate and stained by 0.5% crystal violet in methanol. The assay was done in triplicate.
Determination of apoptosis by fluorescence microscopy and flow cytometry
MDA-MB-231 cells were treated with 0, 10, and 50 µg/mL ZrP-MB for 1 h and then illuminated (PDT). the cells were washed with PBS and then were dissociated by trypsinization, collected by centrifugation at room temperature, and washed twice with PBS. Morphological changes due to apoptosis induction by photodynamic therapy mediated ZrP-MB were detected by Acridine Orange/Ethidium Bromide (AO/EB) double staining using fluorescence microscopy (BEL, Italy) according to previous procedures. All samples were stained and analyzed immediately at room temperature. For quantitative analysis of apoptosis induction by photodynamic treatment mediated ZrP-MB, the cells were collected as described above and then were suspended in 500 µL binding buffer containing 5 µL FITC Annexin-V and 5 µl PI reagents. Cells incubated for 15 min in dark condition and room temperature, and then were analyzed using flow cytometer (FACS Calibur, USA).
ROS detection
Quantitation of ROS generated by MB and ZrP-MB in cells was performed by 2′,7′-dichloro dihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA, Sigma-D6883). DCFH-DA passes easily through the cell membrane where it is deactylated to a non-fluorescent dihydrofluorescein, and an increase in fluorescence signal can be observed upon its oxidation. After PDT, the cells were trypsinized and, DCFH-DA was added to the medium at a final concentration of 2 mM. The plates were incubated for 45 minutes in the dark (37 °C, 5% CO2). Then medium containing DCFH-DA was removed and washed twice with PBS. The fluorescence emission of ROS can be detected by using excitation at 488 nm (blue) and emission at 530 nm (green) wavelengths. The generation of ROS was analyzed by Becton-Dickinson FACS Calibur Flow Cytometer (USA) using flowJo 7.6.1 software.
Statistical analysis
Todos os valores são expressos como média ± DP. Os resultados são expressos com n denotando o número de experimentos. P < 0,05 (*) foi considerado estatisticamente significativo.

Aprovação ética

Não realizamos testes em humanos ou animais. Portanto, nosso trabalho não necessita de aprovação ética para os experimentos.

Resultados e Discussão

Síntese, intercalação e caracterização de nanopartículas

Alteração da Abs do azul de metileno em massa (○) e ∆Abs relacionada (•) versus tempo (minuto).

A nanopartícula sintetizada foi utilizada para intercalar o azul de metileno com base no potencial de troca catiônica das nanoestruturas de bicamada de fosfato de zircônio. Como o azul de metileno é um pequeno corante catiônico de tiazina (cloreto de metiltionínio), na presença de material de troca catiônica como o ZrP, o corante catiônico troca com H+ interlamelar. Quando a concentração do cátion do corante é alta na solução, de acordo com as regras termodinâmicas, o potencial químico do corante na solução em massa (e sua energia livre de Gibbs relacionada) é maior do que o do corante intercalado. Devido à natureza das reações espontâneas, o corante se intercala nas bicamadas de ZrP para diminuir a energia livre de Gibbs da solução até que o equilíbrio de troca seja alcançado. A Figura 1 representa as variações da absorbância do corante (λmáx = 664 nm) em diferentes intervalos de tempo de incubação de ZrP-MB a 25 °C e pH = 7,4.

Padrões de difração de raios X das nanopartículas de ZrP (−) e ZrP-MB (−).

A absorbância diminuiu com o aumento do tempo de incubação até que o equilíbrio fosse alcançado. Após o equilíbrio, a absorbância não apresentou alterações significativas. As nanopartículas nuas e intercaladas foram caracterizadas usando várias técnicas. A Figura 2 mostra o padrão de DRX das nanopartículas sintetizadas.

De acordo com relatos anteriores, os picos que aparecem nos planos 002 em (2θ = 11–12 (/degree), 110 em (2θ = 19–20 (/degree) e 112 em (2θ = 24–26 (/degree) são os picos característicos da estrutura cristalina α-ZrP e nenhum outro pico de impureza foi detectado. O plano de difração (002) pode ser usado para determinar as distâncias interlamelares usando a Lei de Bragg para o padrão de difração do fosfato de zircônio, e o plano de difração (001) é útil para confirmar e determinar os produtos de intercalação e a distância interlamelar do compósito. Com base na equação de Bragg;

Imagem de MEV (A) e espectro de EDS relacionado (B) das nanopartículas de ZrP-MB.
A distância entre os planos (d) é igual à razão entre λ (comprimento de onda da fonte) e 2sen(θ; o ângulo de difração). Assim, usando esta equação, parâmetros relacionados para materiais sintetizados podem ser determinados. Conforme mencionado acima, o pico 002 (2θ≈12) pode ser usado para o cálculo da distância entre as camadas do ZrP (0.76 nm). O aparecimento de novos picos sem qualquer diferença significativa no padrão do ZrP confirmou a intercalação do azul de metileno entre as camadas do ZrP. Conforme mencionado anteriormente, o plano de difração (001) foi usado para a determinação dos produtos de intercalação e da distância interlamelar com base na Lei de Bragg (o valor obtido é ≈14–17 Å). Esta expansão entre as lâminas cristalinas do ZrP demonstrou que o azul de metileno é injetado na distância interlamelar. Considerando os parâmetros dimensionais aproximados do azul de metileno como comprimento de 1.25–1.60 nm, largura de 0.57–0.84 nm e espessura de cerca de 0.5 nm, parece que o MB é intercalado longitudinalmente de cima para baixo entre as duas lâminas de ZrP pela interação dos grupos amina do MB com os ânions fosfato nas lâminas (interações eletrostáticas). De acordo com o padrão de DRX do MB-ZrP intercalado, o padrão não mostrou nenhuma diferença significativa em comparação com os nanocristais de ZrP puro, indicando que o ZrP permaneceu inalterado durante a intercalação do azul de metileno na distância interlamelar. A distância interlamelar na estrutura cristalina do α-ZrP é de cerca de 7.6 Å, onde 1 Å é ocupado por moléculas de água intersticiais na galeria interlamelar. Um novo pico de difração (2θ≈4) é apresentado no fosfato de zircônio intercalado com azul de metileno, o que demonstrou a intercalação do azul de metileno na distância interlamelar do ZrP. O tamanho e a morfologia das nanoestruturas sintetizadas foram determinados usando microscopia eletrônica de varredura (SEM). Além disso, a análise por espectroscopia de energia dispersiva de raios X (EDS) foi realizada em um microscópio eletrônico de varredura. As imagens de SEM e os gráficos de EDS são mostrados na Fig. 3.
Análise termogravimétrica (TGA) do ZrP (−) e do ZrP-MB (−).
A Fig. 3A mostra morfologia hexagonal uniforme e estrutura em camadas com tamanhos de partícula variando de 50 a 100 nm. Os resultados da análise por espectroscopia de energia dispersiva de raios X (Fig. 3B) mostram que os elementos Zr, O, P e C foram incorporados ao sistema. Os elementos Zr, O, P e C estão distribuídos homogeneamente por todas as nanoestruturas preparadas. A Figura 4 representa os gráficos de termogravimetria (TG) relacionados ao ZrP vazio e ao ZrP intercalado com azul de metileno.
A análise termogravimétrica (TGA) mostrou que o azul de metileno foi intercalado nas nanocamadas de fosfato de zircônio e uma carga máxima de 30–35% foi alcançada. A carga de 30% nas nanopartículas sintetizadas foi considerada em experimentos posteriores. Esses resultados estão de acordo com os resultados obtidos nas medições espectrofotométricas e de EDS.
Biocompatibilidade das nanopartículas de ZrP e citotoxicidade in vitro do ZrP-MB
Toxicidade no escuro in vitro de diferentes concentrações de MB, com base no conteúdo de MB, em ZrP-MB, ZrP, MB livre e branco relacionado (PBS) em células MDA-MB-231 (A, incubação de 1 h), MDA-MB-231 (B, incubação de 4 h) e fibroblasto HuO2 (C, incubação de 1 h), sem irradiação a laser. Os resultados são expressos como média ± DP (n = 3), *P < 0,05 (comparado ao grupo tratado com MB).
O efeito dos nanomateriais de fosfato de zircônio na sobrevivência e proliferação celular foi determinado utilizando o ensaio MTT nas linhagens celulares de câncer de mama humano MDA-MB-231 e fibroblasto humano normal. Conforme relatado anteriormente, o tempo de incubação pode afetar a toxicidade no escuro do azul de metileno, Santos et al., relataram que a toxicidade no escuro do azul de metileno aumentou com o aumento do tempo de incubação (mais de 1 hora) em baixas concentrações de MB nas células MCF-10A, MCF-7 e MDA-MB-231, mas em concentrações mais altas de MB, a toxicidade no escuro do MB nas células MCF-10A e MCF-7 aumentou em tempos de incubação curtos, mas teve pouco efeito na viabilidade das células MDA-MB-231 em tempos de incubação semelhantes. Para obter a citotoxicidade no escuro do azul de metileno e dos nanomateriais híbridos, as células MDA-MB-231 foram tratadas com diferentes concentrações de MB, ZrP-NPs e ZrP-MB ((a concentração é mostrada na Fig. 5A,B) por tempos de incubação de 1 e 4 h, respectivamente. Como pode ser visto, as nanopartículas de ZrP vazias não alteraram a viabilidade celular com a mudança do tempo de incubação, o que demonstra a biocompatibilidade das nanopartículas de ZrP. De acordo com os resultados, a toxicidade no escuro do MB aumenta com o aumento da concentração de MB (mais de 10 µg/mL) e o tempo de incubação superior a 1 hora não mostrou nenhum efeito significativo na viabilidade celular. É claro que a toxicidade no escuro do MB é reduzida ao usar ZrP como sistema de liberação de fármaco e o tratamento das células com ZrP-MB diminuiu a toxicidade no escuro em comparação com o MB livre em condição de escuro. Para analisar o efeito do MB e do ZrP-MB em células normais, utilizamos o fibroblasto humano normal. Como pode ser visto na Fig. 5C, a viabilidade celular não mudou significativamente em baixas concentrações dos materiais de tratamento até 25 µg/mL e, ao aumentar a concentração (50 µg/mL e 100 µg/mL), a viabilidade celular diminuiu. De acordo com os resultados, a toxicidade no escuro do MB em células normais é reduzida ao usar ZrP-MB em vez de MB. Pode-se sugerir que este nanosistema pode reduzir a toxicidade no escuro do azul de metileno em comparação com o azul de metileno livre. Este efeito leva a uma PDT mediada por MB seletiva e localizada em sítios de câncer e tumor, iluminando com luz laser e induzindo morte celular controlável.
Efeito da irradiação a laser na citotoxicidade de nanomateriais híbridos (Ensaio fotodinâmico in vitro)
Fototoxicidade in vitro (irradiação a laser) de diferentes concentrações de ZrP-MB, ZrP, MB e branco relacionado (PBS) em células MDA-MB-231 (A) e Fibroblasto (B) após incubação de 1 h. Os resultados são expressos como média ± DP (n = 3), *P < 0,05 (comparado ao grupo tratado com MB).
O efeito da iluminação com luz laser de 660 nm (PDT) em células MDA-MB-231 tratadas com ZrP-MB (incubação de 1 hora) pode ser visto na Fig. 6A.
Os resultados mostram que, na presença de irradiação laser, a viabilidade celular no controle (apenas PBS) não apresentou alterações significativas, comprovando que a dosagem de luz utilizada não apresenta fototoxicidade na ausência de fotossensibilizadores. Além disso, as células tratadas com ZrP não apresentaram alterações significativas na viabilidade celular, o que comprovou a biocompatibilidade das nanoestruturas lamelares de ZrP sintetizadas. A viabilidade celular diminuiu com o aumento do fotossensibilizador (MB e ZrP-MB). Na presença de altas concentrações de ZrP-MB e MB (100 µg/ml), a viabilidade celular diminuiu mais nas células tratadas com MB do que com ZrP-MB. Curiosamente, em concentrações mais baixas de ZrP-MB e MB (inferiores a 100 µg/ml), a viabilidade celular diminuiu mais nas células tratadas com ZrP-MB do que com MB. Em outras palavras, os resultados demonstraram que a eficácia fotodinâmica do MB intercalado com ZrP é maior do que a do MB livre (Fig. 5).
(A) Atividade fotodinâmica dos materiais sob purga de gás inerte N2 para exame do efeito do O2. (B) Diferença na viabilidade celular (%) (VEscuro − VIrradiação) entre o experimento no escuro e com irradiação laser para os tratamentos com ZrP-MB, ZrP, MB e o respectivo branco (PBS) em células MDA-MB-231; os resultados são expressos como média ± DP (n = 3), *P < 0,05 (comparado ao grupo tratado com MB).
A Figura 6B representa o efeito de várias concentrações dos materiais sobre as células normais de fibroblastos sob iluminação com luz vermelha. Devido ao tempo de incubação após o tratamento, as células normais podem reparar o dano e normalizar o estresse oxidativo nas células. Conforme relatado anteriormente, devido à função das mitocôndrias nas células normais, os materiais de ROS induzidos podem ser eliminados por enzimas antioxidantes, como superóxido dismutase, enzimas removedoras de H2O2, catalase, peroxidases, proteínas de ligação a metais, no sistema mitocondrial das células normais devido à ativação da sinalização redox. No entanto, nas células cancerígenas, a disfunção do sistema mitocondrial causa o aumento de materiais de ROS nas células cancerígenas sem a eliminação das espécies reativas de oxigênio, devido à inativação da sinalização redox nas células cancerígenas em decorrência da disfunção mitocondrial. Assim, as células normais podem se reparar pela ativação do biossistema antioxidante de eliminação de ROS, mas as células cancerígenas não possuem essa capacidade. Também deve ser mencionado que a irradiação seletiva pode diminuir o dano às células normais. Ao considerar as partes cancerosas como pontos-alvo para a irradiação laser, os danos às células normais podem ser controlados e reduzidos. A Figura 7 mostra o efeito do oxigênio molecular na atividade de PDT dos materiais de tratamento (Fig. 7A) e o efeito fotodinâmico nas células cancerígenas, após subtrair a toxicidade no escuro para cada tratamento (Fig. 7B).
Ensaio de sobrevivência celular clonogênica
Um ensaio clonogênico de sobrevivência celular foi realizado para avaliar o potencial proliferativo de longo prazo das células MDA-MB-231 após o tratamento com PDT. Este ensaio é utilizado para determinar a capacidade das células de proliferar indefinidamente. As células com essa capacidade podem formar uma grande colônia ou um clone de células, conhecidas como células clonogênicas. Vários mecanismos estão envolvidos na morte celular, no entanto, a perda da capacidade de proliferação e propagação das células é conhecida como o fator mais comum. Assim, as células que mantêm a capacidade de síntese de proteínas e DNA podem passar por uma ou duas mitoses, mas são incapazes de se dividir e produzir uma grande população, sendo consideradas mortas. O ensaio foi considerado para examinar o potencial de proliferação das células tratadas com nanoestruturas de ZrP-MB sob iluminação a laser.
Imagens da capacidade clonogênica (10X) de células de câncer de mama a 0, 10 e 50 µg/mL de ZrP-MB no escuro (controle) e sob irradiação.
Como pode ser visto na Fig. 8, a capacidade de formação de colônias das células tratadas com várias concentrações de ZrP-MB diminuiu com o aumento da concentração de nanopartículas em comparação com o grupo controle (escuro). É claro que o tratamento com PDT pelas nanopartículas híbridas de ZrP-MB sintetizadas induziu morte celular e diminuiu a capacidade de proliferação das células de câncer de mama MDA-MB-231.
Detecção de apoptose: dupla coloração AO/EB e citometria de fluxo
Para obter a capacidade de indução de apoptose das nanopartículas de ZrP-MB nas células cancerosas MDA-MB-231, tratamos as células com (0, 10 e 50 µg/mL de nanopartícula de ZrP-MB) e, em seguida, PDT. As células foram coradas com Laranja de Acridina (AO) e Brometo de Etídio (EB) para microscopia de fluorescência. Além disso, as células foram coradas com Anexina V-FITC e PI, seguidas de análise por citometria de fluxo.
Indução de apoptose em células MDA-MB-231 a 0, 10 e 50 µg/mL de tratamento com ZrP-MB sob irradiação de luz laser, utilizando dupla coloração com Laranja de Acridina (AO) e Brometo de Etídio (EB) seguida de microscopia de fluorescência (40X) e coloração com anexina V-FITC e PI seguida de citometria de fluxo. As setas indicam células apoptóticas e necróticas.
Como pode ser visto na Fig. 9, sob um microscópio de fluorescência, as células normais (controle) são verdes e possuem núcleos intactos e de formato arredondado. Após o tratamento com nanopartículas de ZrP-MB e, em seguida, PDT, as células tornaram-se vermelhas (células apoptóticas iniciais ou tardias) com núcleos condensados ou fragmentados. As células apoptóticas tardias e necróticas aumentaram com o aumento da concentração de nanopartículas de ZrP-MB (10 a 50 µg/mL). A ligação da Anexina V e a captação de PI são um dos métodos mais comuns na medição da apoptose e necrose celular. A assimetria dos fosfolipídios de membrana é perturbada em células apoptóticas e a perda da assimetria conformacional da membrana causa a liberação de fosfatidilserina no lado externo da membrana plasmática. A ligação da Anexina V à fosfatidilserina externalizada pode ser usada na medição da apoptose celular. Além disso, as células apoptóticas são caracterizadas pela fragmentação do DNA e, consequentemente, isso pode ser determinado pela coloração com Iodeto de Propídio (PI) e subsequente ensaio de citometria de fluxo. De acordo com os histogramas de citometria de fluxo obtidos (Fig. 9) relacionados ao tratamento com ZrP-MB em várias concentrações e, em seguida, PDT, fica claro que as células apoptóticas e necróticas aumentaram com o aumento da concentração de ZrP-MB. Como mostrado nas Figs 5 e 6, o controle apresenta 4% de células apoptóticas (Q2 e Q3), enquanto após o tratamento com 10 e 50 µg/mL de ZrP-MB e, em seguida, PDT, as células apoptóticas iniciais representaram 10%, 13% (Q3) e as células apoptóticas tardias representaram 5% e 30% (Q2) do total de células, respectivamente. A 50 µg/mL de ZrP-MB, também é observado 7% de necrose (Q1). Pode-se concluir que, com o aumento da concentração de nanopartículas, as células apoptóticas aumentaram.
Geração de ROS após PDT com ZrP-MB
Efeitos do MB (50 µg/mL) e ZrP-MB (50 µg/mL) após PDT na geração intracelular de ROS em células MDA-MB-231. As células foram coradas com DCFH-DA (2 mM), seguido de citometria de fluxo. O DCFH-DA será convertido em DCFH+ na presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) e induzirá sinal de fluorescência no histograma.
Na PDT, o fotossensibilizador excitado transfere energia para o oxigênio molecular e gera espécies reativas de oxigênio (ROS) citotóxicas que podem induzir danos oxidativos ou morte celular. No entanto, não está claro se a geração de ROS está envolvida no mecanismo de morte celular da PDT com ZrP-MB. Para esclarecer isso, examinamos a geração intracelular de ROS por citometria de fluxo utilizando DCFH-DA. Como pode ser visto na Fig. 10, em condição de escuro, a geração de ROS nas células tratadas com MB é maior do que nas células tratadas com ZrP-MB. Enquanto após a PDT, as células tratadas com ZrP-MB apresentaram maior geração de ROS em comparação com as células tratadas com MB.
De acordo com os resultados obtidos e considerando diversos relatórios de pesquisa científica, pode-se concluir que os materiais nano-híbridos sintetizados podem ser utilizados para o tratamento fotodinâmico seletivo de células cancerígenas, na presença de células normais, devido à liberação seletiva do azul de metileno por causa da capacidade de troca catiônica do fosfato de zircônio no microambiente ácido das células cancerígenas. Ao trocar cátions de azul de metileno por íons de hidrogênio (H+), ocorreu a liberação do azul de metileno e a fotoativação do MB usando iluminação LED de luz vermelha causou, consequentemente, a morte celular fotodinâmica nas células cancerígenas.
Conclusão
Em conclusão, sintetizamos e caracterizamos NPs de ZrP e, em seguida, o azul de metileno foi carregado na parte interlamelar das nanoplacas. Os experimentos de citotoxicidade no escuro demonstraram que as nanoplacas sintetizadas eram biocompatíveis e não apresentaram citotoxicidade significativa. A boa eficácia de carregamento do fármaco, o intumescimento e a dispersibilidade em água foram as características das nanopartículas obtidas. As NPs de ZrP-MB foram eficazes na entrega do azul de metileno às células de câncer de mama MDA-MB-231. Experimentos no escuro esclareceram que a toxicidade celular do azul de metileno diminuiu ao ser intercalado nas camadas das nanopartículas de ZrP. A terapia fotodinâmica utilizando as nanopartículas sintetizadas demonstrou que a intercalação pode aumentar a eficácia da TFD com base na diminuição da toxicidade no escuro do azul de metileno e na prevenção das reações redox ambientais do azul de metileno. Em outras palavras, pode-se afirmar que a intercalação do azul de metileno em nanopartículas de ZrP aumentou a seletividade na toxicidade fotodinâmica local com base na iluminação seletiva a laser. De acordo com o microambiente extracelular ácido das células cancerígenas e considerando as características de capacidade de troca catiônica das nanopartículas de ZrP, a liberação seletiva do azul de metileno no microambiente das células cancerígenas pode aumentar a eficácia da terapia fotodinâmica. O ensaio clonogênico, a imagem de microscopia de fluorescência e os experimentos de citometria de fluxo das células tratadas confirmaram os resultados obtidos. A ausência de citotoxicidade das nanoplacas de fosfato de zircônio ofereceu um potencial promissor na aplicação de nanopartículas de ZrP como carreador de fotossensibilizadores catiônicos para uma terapia fotodinâmica eficaz. Por fim, são necessários estudos in vivo para avaliar a toxicidade, a viabilidade e a eficácia das nanopartículas de ZrP-MB em modelos animais de câncer de mama.
Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Contribuições dos Autores
R.H. projetou e realizou a síntese, os experimentos de caracterização das nanopartículas e redigiu o manuscrito. K.K. realizou os experimentos celulares, analisou os resultados e revisou o manuscrito.
Disponibilidade de Dados
Os conjuntos de dados gerados e analisados durante o presente estudo estão disponíveis com os autores correspondentes mediante solicitação razoável e com permissão do instituto e dos presidentes de departamento.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
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