pmid: "41298550"
title: "Azul de metileno reduz o delírio pós-operatório em camundongos por meio da supressão da neuroinflamação e reparo da barreira hematoencefálica."
authors: "Deng Y, Hua J, Pan H, Zhang J"
journal: "Scientific reports"
pubdate: "2025 Nov 26"
doi: "10.1038/s41598-025-26108-8"
source: "PMC Full Text"

Azul de metileno reduz o delírio pós-operatório em camundongos por meio da supressão da neuroinflamação e reparo da barreira hematoencefálica.

Autores

Deng Y, Hua J, Pan H, Zhang J

Periodico

Scientific reports (2025 Nov 26)

Conteudo

O azul de metileno reduz o delirium pós-operatório em camundongos por supressão da neuroinflamação e reparo da barreira hematoencefálica
O delirium pós-operatório (POD) é uma complicação grave após anestesia e cirurgia, com patogênese atualmente incerta e sem tratamentos eficazes. Nos últimos anos, evidências emergentes sugerem que a neuroinflamação e a disfunção da barreira hematoencefálica (BHE) desempenham um papel importante na patogênese do POD. O azul de metileno (MB), um medicamento aprovado pela FDA, tem sido relatado por possuir propriedades anti-inflamatórias e neuroprotetoras. Aplicamos um modelo de POD com uma laparotomia simples para avaliar o comportamento semelhante ao POD em camundongos adultos. Testes comportamentais foram realizados 24 horas antes da cirurgia, 6 horas e 24 horas após a cirurgia. Avaliamos a neuroinflamação e os estados reativos da microglia no hipocampo e no córtex pré-frontal. Também avaliamos a permeabilidade da BHE através da detecção de proteínas de junção oclusiva, transcitose e extravasamento de IgG e dextrana. Nossos resultados constataram que o comportamento semelhante ao POD em camundongos adultos ocorreu principalmente 6 horas após a cirurgia e diminuiu gradualmente 24 horas após a cirurgia. Descobrimos que o MB (5 mg/kg) atenuou a neuroinflamação e a ativação da microglia tanto no hipocampo quanto no córtex pré-frontal após anestesia/cirurgia. Ao reduzir os níveis proteicos do fator indutor de metaloproteinase de matriz EMMPRIN e da metaloproteinase de matriz 9 (MMP9), aumentar a expressão das proteínas de junção oclusiva da BHE e diminuir a transcitose, o MB pôde melhorar a função da BHE e atenuar o comportamento semelhante ao delirium em camundongos após anestesia/cirurgia. Nossos achados confirmam os efeitos anti-inflamatórios e protetores da BHE do MB em um ambiente inflamatório in vivo e fornecem melhores percepções sobre a fisiopatologia e o potencial tratamento do POD.
Informações Suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41598-025-26108-8.

Introdução
O delirium pós-operatório (POD) é uma síndrome de disfunção cerebral aguda potencialmente associada a cirurgia, anestesia, dor, comorbidades ou medicação, manifestando-se com perturbações flutuantes e concomitantes na cognição, atenção, ritmo sono-vigília e nível de consciência. O POD está associado a hospitalizações prolongadas, aumento dos custos de saúde, comprometimento funcional e até maior morbidade e mortalidade. Ocorre principalmente na primeira semana pós-operatória em todas as faixas etárias, sendo que a população idosa demonstra maior suscetibilidade. O aumento anual das populações cirúrgicas gerou maior demanda cirúrgica e maior incidência de POD. Infelizmente, nenhum tratamento eficaz para o POD foi identificado devido à fisiopatologia subjacente indefinida.
Anestesia e cirurgia foram relatadas como indutoras de comportamento semelhante ao delirium pós-operatório (DPO) em roedores, nos quais a neuroinflamação e a ruptura da barreira hematoencefálica (BHE) desempenham papéis fundamentais.O influxo de células e mediadores inflamatórios para o sistema nervoso central através da BHE comprometida leva a um comportamento semelhante ao delirium em camundongos. A BHE é composta por células endoteliais vasculares cerebrais (CEVC), membrana basal, pericitos e pés astrocíticos. Esses componentes formam junções oclusivas (Tjs) e junções de adesão (Ajs) que regulam o trânsito molecular no tecido cerebral, estabelecendo uma interface crítica entre a circulação periférica e o sistema nervoso central. Yang et al. demonstraram que a laparotomia sob anestesia com 1,4% de isoflurano (anestesia/cirurgia) diminuiu a expressão proteica das Tjs (claudina-5, ocludina e ZO-1), sem afetar as proteínas das Ajs (VE-caderina, E-caderina e p120-catenina). Hu et al. mostraram ainda que a inflamação periférica induzida pela anestesia/cirurgia ativou a metaloproteinase 9 da matriz (MMP9), que danificou a integridade da BHE por meio de dano aos pericitos, degradação das Tjs e aumento da transcitose. Coletivamente, esses achados indicam que a patogênese do DPO envolve disfunção da BHE impulsionada por cascatas inflamatórias induzidas pela anestesia/cirurgia.
O azul de metileno (AM), um medicamento aprovado pela FDA, tem sido usado com segurança na clínica para muitas doenças. O AM é um fármaco seguro em doses baixas (< 10 mg/kg), estável à temperatura ambiente, atravessa rapidamente a BHE e é barato. Também exerce efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes, restauradores da função mitocondrial e neuroprotetores, posicionando o AM como um candidato promissor para o tratamento de distúrbios do sistema nervoso central. Evidências pré-clínicas indicaram que uma dose baixa de AM (2 mg/kg) atenuou a neuroinflamação e o comportamento do tipo depressivo agudo após lesão cerebral difusa em camundongos. Uma única dose de AM a 5 mg/kg poderia proteger contra a disfunção cognitiva induzida por sevoflurano em camundongos idosos. Outra pesquisa descobriu que a administração de 10 mg/kg de AM reduziu os níveis séricos de IL-6 e atenuou a ativação microglial no cérebro de camundongos que receberam lipopolissacarídeo (LPS). E também descobrimos que 5 mg/kg de AM inibiu a neuroinflamação dependente de PHD3 ao inibir a via Siah2/Morg1/PHD3 e poderia melhorar os déficits neurocognitivos em déficits neurocomportamentais induzidos por LPS. Todos esses resultados indicaram que o AM pode reduzir a incidência de DPO ao ter como alvo a neuroinflamação e o comprometimento cognitivo.
O objetivo do nosso trabalho foi investigar o efeito protetor do AM em um modelo de DPO em camundongos. Descobrimos que o AM aliviou a neuroinflamação, atenuou a ativação microglial, restaurou a ruptura da BHE e melhorou o comportamento do tipo DPO induzido pela anestesia/cirurgia.
Resultados
O AM atenua o comportamento do tipo delirium pós-operatório induzido pela anestesia/cirurgia em camundongos.
Para avaliar se a anestesia/cirurgia (A/S) induz comportamento semelhante ao delirium em camundongos, realizamos uma bateria de testes comportamentais com o teste de enterrar comida, teste de campo aberto e teste do labirinto em Y 24 h antes do procedimento, 6 h e 24 h após a cirurgia. Os escores Z compostos para cada camundongo nos quatro grupos foram calculados 6 h e 24 h após a cirurgia (Figs. 1A, B). Descobrimos que os escores Z compostos no grupo A/S foram significativamente maiores do que os do grupo controle e do grupo MB, enquanto a administração de MB diminuiu os escores Z 6 h após a cirurgia. Não foi encontrada diferença estatística nos escores Z compostos entre os quatro grupos 24 h após o procedimento. Isso sugeriu que o comportamento semelhante ao delirium pós-operatório em camundongos adultos ocorreu principalmente 6 h após a cirurgia e diminuiu gradualmente 24 h após a cirurgia.
O teste de enterrar comida foi realizado para explorar se a anestesia/cirurgia afetou a capacidade dos camundongos de procurar e comer alimentos, dependendo do pensamento organizado, atenção completa e nível normal de consciência. Esses distúrbios comportamentais foram associados ao delirium. A latência para encontrar a comida escondida foi marcadamente maior no grupo A/S em comparação com o grupo controle 6 h após a cirurgia, enquanto a administração de MB melhorou a capacidade prejudicada induzida pela A/S (p < 0,01, Fig. 1C). Não foram observadas alterações significativas entre o grupo controle e o grupo MB.
O campo aberto foi usado para analisar a capacidade locomotora e o comportamento semelhante à ansiedade em camundongos. Durante a sessão de teste de 5 min, não houve diferenças significativas na distância total e no tempo de congelamento entre os quatro grupos nos dois momentos após o procedimento, o que indicou que a A/S não afetou a função motora dos camundongos adultos (Figs. 1D, G). No entanto, o tempo gasto no centro foi significativamente menor no grupo A/S do que nos grupos controle e MB 6 h após a cirurgia (p < 0,001, Fig. 1E), e a administração de MB atenuou esse fenômeno 6 h após a cirurgia (p < 0,05, Fig. 1E). Não houve alterações significativas na latência para o centro entre os quatro grupos 6 h após a cirurgia, enquanto a latência para a área central foi significativamente maior no grupo A/S do que no grupo controle 24 h após a cirurgia (p < 0,05, Fig. 1F). Quando comparados com o grupo controle, esses parâmetros no grupo MB não foram afetados (Figs. 1D-G). Esses achados sugeriram que a A/S afetou o comportamento de ansiedade (tempo gasto no centro) dos camundongos.
O teste do labirinto em Y foi conduzido para avaliar a capacidade de aprendizado espacial e memória em camundongos, conforme validado anteriormente. A A/S reduziu significativamente o número de entradas no braço novo 6 h após a cirurgia (p < 0,01, Fig. 1H) em comparação com o grupo MB. Além disso, a A/S também diminuiu o tempo de permanência no braço novo 6 h após a cirurgia quando comparada ao grupo controle (p < 0,01, Fig. 1I). No entanto, a administração de MB não alterou o desempenho dos camundongos adultos no teste do labirinto em Y nos dois momentos após a cirurgia (Figs. 1H, I).
Em resumo, não foram observadas diferenças significativas entre o grupo MB e o grupo controle, mas o tratamento com MB atenuou o comprometimento do comportamento de POD em camundongos adultos causado por A/S de forma flutuante.
MB alivia o comportamento semelhante ao delirium pós-operatório induzido por anestesia/cirurgia. (A, B) Alterações nos escores Z compostos após tratamento com MB ou NS por injeção intraperitoneal às 6 h e 24 h do pós-operatório. (C) Testes de comida enterrada, (D-G) testes de campo aberto e (H, I) testes do labirinto em Y foram monitorados às 6 h e 24 h após anestesia/cirurgia. Os dados são expressos como média ± EPM. N = 12 por grupo. A/S, anestesia/cirurgia; MB, azul de metileno. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.
MB atenua a neuroinflamação e a ativação da microglia no hipocampo e no córtex pré-frontal
Para avaliar os efeitos do MB na inflamação sistêmica, as citocinas inflamatórias (TNF-α, IL-6 e IL-1β), marcadores do sistema complemento (C1q, C3 e C5a) e marcadores do inflamassoma (NLRP3 e ASC) foram medidos para avaliar o nível de neuroinflamação no hipocampo e córtex pré-frontal de camundongos 6 h após a cirurgia. Como mostrado nas Figs. 2, os níveis de mRNA das citocinas inflamatórias (TNF-α, IL-6 e IL-1β), marcadores do sistema complemento (C1q e C3) e marcadores do inflamassoma (NLRP3) no hipocampo e córtex pré-frontal estavam aumentados no grupo A/S em comparação com o grupo controle, enquanto o MB atenuou o nível de mRNA dessas citocinas inflamatórias após A/S. Além disso, não houve diferença significativa no nível de mRNA das citocinas inflamatórias entre o grupo MB e o grupo controle. Os níveis de mRNA do marcador C5a não apresentaram diferenças entre os quatro grupos no hipocampo e córtex pré-frontal (Figs. 2F, N). E os níveis de mRNA do marcador ASC também não apresentaram diferenças significativas entre os quatro grupos no córtex pré-frontal (Figs. 2P). A ativação da micróglia foi uma alteração essencial na fase inicial da neuroinflamação, e a mudança na imunorreatividade de Iba-1 pôde ser usada para expressar os estados reativos da micróglia. Descobrimos que o immunoblotting para Iba1 revelou uma diminuição visível na expressão de Iba1 no hipocampo e córtex pré-frontal no grupo A/S + MB, em comparação com o grupo A/S (p < 0,05, Figs. 3 A, B; Figs. 4 A, B). Correspondentemente, o MB atenuou a ativação microglial transformando os estados de Iba1. Quando comparada com o grupo controle, a micróglia no grupo A/S apresentou morfologia semelhante a ameba e a área de imunorreatividade de Iba1 no grupo A/S também estava aumentada no hipocampo e córtex pré-frontal, enquanto a administração de MB restaurou a forma ramificada da micróglia e diminuiu a área celular (p < 0,05, Fig. 3C; Figs. 4C, D). Não houve alterações significativas em Iba1 no grupo MB. Para confirmar ainda mais a neuroinflamação após A/S, quantificamos as espécies reativas de oxigênio (ROS) no córtex pré-frontal usando coloração com Diidroetídio (DHE). Em comparação com o grupo controle e o grupo MB, a intensidade de fluorescência das ROS estava significativamente aumentada no grupo A/S, enquanto a administração de MB atenuou essa elevação de ROS induzida por anestesia/cirurgia (Figs. 4E, F).
MB alivia a neuroinflamação no hipocampo e córtex pré-frontal em camundongos cirúrgicos. (A-H) Níveis relativos de expressão de mRNA de TNF-α, IL-6, IL-1β, C1q, C3, C5a, NLRP3 e ASC no hipocampo 6 h após A/S (normalizados em relação ao grupo controle). (I-P) Níveis relativos de expressão de mRNA de TNF-α, IL-6, IL-1β, C1q, C3, C5a, NLRP3 e ASC no córtex pré-frontal 6 h após A/S (normalizados em relação ao grupo controle). Os dados são expressos como média ± EPM. N = 3 por coorte. A/S, anestesia/cirurgia; MB, azul de metileno. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.
MB atenua a ativação da microglia no hipocampo em camundongos cirúrgicos. (A, B) Nível relativo da proteína Iba1 6 h após A/S (normalizado em relação ao grupo controle) (os blots/géis originais são apresentados na Figura Suplementar S1). (C) Ativação da microglia no hipocampo 6 h após a cirurgia. Os dados são expressos como média ± EPM. N = 3 por coorte. A/S, anestesia/cirurgia; MB, azul de metileno. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.
MB atenua a ativação da microglia no córtex pré-frontal em camundongos cirúrgicos. (A, B) Nível relativo da proteína Iba1 6 h após A/S (normalizado em relação ao grupo controle) (os blots/géis originais são apresentados na Figura Suplementar S2). (C, D) Ativação da microglia no córtex pré-frontal 6 h após a cirurgia. Quatro campos aleatórios de cada secção foram selecionados para análise de intensidade de imunofluorescência. (E, F) O nível de espécies reativas de oxigênio (ROS) no córtex pré-frontal foi avaliado por coloração com Diidroetídio (DHE). Quatro campos aleatórios de cada secção foram selecionados para análise de intensidade de imunofluorescência. Os dados são expressos como média ± EPM. N = 3–4 por coorte. A/S, anestesia/cirurgia; MB, azul de metileno. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.
MB atenua a ruptura da barreira hematoencefálica induzida por anestesia/cirurgia
Pesquisas anteriores relataram que a anestesia e a cirurgia causaram aumento da permeabilidade da BHE e comprometimento da função cognitiva em camundongos. A IgG, juntamente com outros componentes plasmáticos, poderia escapar dos vasos sanguíneos e entrar no cérebro sob a ruptura da BHE. Portanto, a coloração por imunofluorescência para IgG, um indicador visual de extravasamento vascular e ruptura da BHE, foi realizada para avaliar a presença de IgG intersticial. Em nosso estudo, descobrimos que, em comparação com o grupo controle, a intensidade de fluorescência da IgG no grupo A/S aumentou significativamente tanto no hipocampo quanto no córtex pré-frontal dos camundongos 6 h após a cirurgia (p < 0,001, Figs. 5 A, B; Figs. 6 A-C), o que foi atenuado pelo tratamento com MB (p < 0,01, Figs. 5 A, B; Figs. 6 A-C). Além disso, descobrimos que a A/S aumentou os níveis cerebrais de dextrano de 10 kDa nos camundongos em comparação com os grupos controle e MB tanto no hipocampo quanto no córtex pré-frontal, enquanto o tratamento com MB atenuou o aumento induzido pela A/S no nível de dextrano extravascular nos camundongos (Figs. 5C; Figs. 6D). Para investigar danos inflamatórios nos componentes da BHE, examinamos os efeitos do MB sobre as alterações na expressão de componentes associados às junções oclusivas após anestesia/cirurgia, incluindo claudina-5, ocludina e zonula occludens 1 (ZO-1). Usando RT-qPCR, observamos que houve uma diminuição visível na expressão de mRNA de claudina-5, ocludina e ZO-1 no hipocampo e córtex pré-frontal após anestesia/cirurgia (p < 0,05, Figs. 5D-F e 6E-G), enquanto o tratamento com MB melhorou a expressão desses mRNA (p < 0,05, Figs. 5D-F e 6E-G). Da mesma forma, para Western blot quantitativo, também descobrimos que a anestesia/cirurgia diminuiu distintamente a proteína de claudina-5, ocludina e ZO-1 no cérebro dos camundongos (p < 0,05, Figs. 5G–J; Figs. 6H–K), enquanto a administração de MB atenuou obviamente a redução dessas proteínas de junção oclusiva (p < 0,05, Fig. 5G-J; Figs. 6H–K). Além disso, o MB também mitigou a desregulação induzida pela anestesia/cirurgia das vias de transporte transcelular de caveolina-1 e Mfsd2a (p < 0,05, Figs. 5G, K-L; Figs. 6H, L-M). Em outras palavras, a anestesia/cirurgia diminuiu a expressão de Mfsd2a, o que desencadeou uma regulação positiva da expressão de caveolina-1; no entanto, essas alterações foram atenuadas pelo MB. Além disso, a administração isolada de MB não teve nenhum efeito sobre a BHE.
MB alivia a ruptura da barreira hematoencefálica no hipocampo em camundongos cirúrgicos. (A, B) Coloração de extravasamento de IgG (fluorescência vermelha) no hipocampo. (C) Quantificação espectrofotométrica dos níveis de dextrano cerebral (10 kDa) no hipocampo. (D-F) Níveis relativos de expressão de mRNA de claudina-5, ocludina e ZO-1 (normalizados em relação ao grupo controle) no hipocampo. (G-L) Os níveis proteicos das proteínas de junção oclusiva (claudina-5, ocludina e ZO-1) e das proteínas relacionadas à transcitose (caveolina-1 e Mfsd2a) no hipocampo (os blots/géis originais são apresentados na Figura Suplementar S3). Os dados são expressos como média ± EPM. N = 3–4 por coorte. A/S, anestesia/cirurgia; MB, azul de metileno. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.
MB alivia a ruptura da barreira hematoencefálica no córtex pré-frontal em camundongos cirúrgicos. (A-C) Coloração de extravasamento de IgG (fluorescência vermelha) no córtex pré-frontal. Quatro campos aleatórios de cada secção foram selecionados para análise da intensidade de imunofluorescência. (D) Quantificação espectrofotométrica dos níveis de dextrano cerebral (10 kDa) no córtex pré-frontal. (E-G) Níveis relativos de expressão de mRNA de claudina-5, ocludina e ZO-1 (normalizados em relação ao grupo controle) no córtex pré-frontal. (H-M) Os níveis proteicos das proteínas de junção oclusiva (claudina-5, ocludina e ZO-1) e das proteínas relacionadas à transcitose (caveolina-1 e Mfsd2a) no córtex pré-frontal (os blots/géis originais são apresentados na Figura Suplementar S4). Os dados são expressos como média ± EPM. N = 3–4 por coorte. A/S, anestesia/cirurgia; MB, azul de metileno. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.
MB inibe a expressão de EMMPRIN e MMP9
Considerando que a degradação das proteínas de junção oclusiva depende de metaloproteinases da matriz, a via EMMPRIN/MMP9 pode mediar o dano à BHE. Observamos que a anestesia/cirurgia induziu um aumento significativo de EMMPRIN/MMP9 tanto no hipocampo quanto no córtex pré-frontal (p < 0,001, Fig. 7), enquanto o tratamento com MB reverteu essa alteração (p < 0,01, Fig. 7). Portanto, o efeito protetor do MB sobre as proteínas de junção oclusiva e a BHE pode ser mediado pela inibição da degradação das proteínas de junção oclusiva dependente de EMMPRIN/MMP9.
MB inibe a expressão de EMMPRIN e MMP9. (A-C) Os níveis proteicos de EMMPRIN e MMP9 no hipocampo. (D-F) Os níveis proteicos de EMMPRIN e MMP9 no córtex pré-frontal (os blots/géis originais são apresentados na Figura Suplementar S5). Os dados são expressos como média ± EPM. N = 3 por coorte. A/S, anestesia/cirurgia; MB, azul de metileno. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001.
Discussão
Neste estudo, descobrimos que o tratamento com MB atenuou o comportamento semelhante ao POD em camundongos adultos causado por A/S de forma flutuante, por meio de seus efeitos anti-inflamatórios e protetores da barreira hematoencefálica (BHE). Nosso estudo mostrou que o MB aliviou a neuroinflamação no hipocampo e no córtex pré-frontal, de acordo com a expressão reduzida de citocinas inflamatórias e a ativação microglial atenuada nessas regiões cerebrais. Além disso, o tratamento com MB restaurou a estrutura e a permeabilidade da barreira hematoencefálica induzidas por A/S, inibindo danos às junções oclusivas e a transcitose. Em resumo, a migração de mediadores inflamatórios periféricos após A/S para o cérebro induziu neuroinflamação e comportamentos semelhantes ao POD, enquanto o MB pôde reduzir a entrada de citocinas inflamatórias periféricas no cérebro ao reparar a BHE danificada, diminuindo assim a incidência de POD. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a relatar o efeito neuroprotetor do MB em um modelo murino de POD.
POD é um distúrbio cerebral agudo e flutuante após A/S. Nosso estudo descobriu que o POD ocorreu principalmente 6 h após a cirurgia e se resolveu em 24 h após a cirurgia em camundongos adultos, consistente com pesquisas anteriores. Em contraste, camundongos idosos exibiram suscetibilidade prolongada ao POD, estendendo-se até 24 h após a cirurgia, indicando maior vulnerabilidade à disfunção cerebral pós-operatória em populações geriátricas. Além disso, estudos anteriores também demonstraram que A/S leva a um comportamento semelhante ao delirium dependente da idade em roedores, e a razão foi que A/S poderia induzir um aumento dependente da idade no nível de inflamação cerebral. Camundongos adultos mantêm neuroinflamação basal mínima e demonstram rápida recuperação pós-operatória, explicando as manifestações transitórias semelhantes ao delirium após A/S. Apoiando esse padrão temporal, uma revisão sistemática relatou que déficits cognitivos em camundongos adultos com cerca de 2 a 3 meses de idade, 24 h após a cirurgia, foram de apenas cerca de 50%, sugerindo que o comprometimento cognitivo em camundongos adultos ocorreu predominantemente durante a recuperação inicial. Outra pesquisa relatou que múltiplas A/S não prejudicaram a função cognitiva em camundongos adultos. Uma razão para esse resultado negativo foi que o momento do teste comportamental foi muito tardio (48 h após a cirurgia). Outra razão foi que o aumento das citocinas neuroinflamatórias ocorreu entre 6 e 24 h após a cirurgia, com pico máximo às 6 h pós-operatórias, de modo que a inflamação central havia diminuído após 48 h pós-operatórias. Portanto, a avaliação cognitiva às 6 h pós-operatórias é essencial para detectar POD em camundongos adultos.
Evidências acumuladas implicam a neuroinflamação como um mecanismo patogênico central na POD. Como a anestesia/cirurgia desencadeou neuroinflamação e comprometimento cognitivo em camundongos adultos, essa faixa etária foi selecionada para nosso modelo experimental. A inflamação asséptica induzida por trauma cirúrgico estimula o sistema imune inato, desencadeando o processo inflamatório que, em última análise, resulta em POD. A regulação positiva pós-operatória de citocinas pró-inflamatórias circulantes (por exemplo, IL-1β, IL-6 e TNF-α) atravessa a BHE comprometida, hiperativando a microglia e desencadeando cascatas neuroinflamatórias nas regiões hipocampal e cortical. Concomitantemente, a ativação da microglia estabelece um ciclo autoperpetuador ao gerar fatores pró-inflamatórios adicionais. Nossos resultados constataram que o MB poderia diminuir o nível de mRNA do fator neuroinflamatório e a ativação da microglia após A/C. Esses achados são consistentes com o potente efeito anti-inflamatório do MB em muitos outros modelos de doenças associadas à inflamação, como hemorragia subaracnóidea, lesão cerebral traumática e neuroinflamação induzida por lipopolissacarídeo. Coletivamente, essas evidências indicam que a potente atividade anti-inflamatória do MB modula as respostas neuroinflamatórias no sistema nervoso central.

Uma BHE totalmente funcional é essencial para manter a homeostase do sistema nervoso central. Os processos-chave que garantem a integridade da BHE são o bloqueio das vias de extravasamento paracelular e intercelular, que necessitam da manutenção das Tjs (ZO-1, ocludina e claudina-5) e da supressão da transcitose. A Mfsd2a inibe a transcitose ao translocar fosfolipídios para reduzir a formação de caveolina-1. Consistente com a literatura existente, nosso estudo confirmou que a A/C reduziu a regulação das proteínas Tj e aumentou a permeabilidade da BHE, correlacionando-se com manifestações semelhantes ao delirium. Avaliamos a integridade da BHE examinando a expressão das proteínas Tj (ZO-1, ocludina e claudina-5), reguladores da transcitose (Mfsd2a e caveolina-1) e extravasamento de IgG e dextrana. Nossos resultados mostraram que a neuroinflamação induzida por A/C comprometeu a função da BHE e desencadeou comportamento semelhante ao POD, enquanto o MB pôde aliviar a neuroinflamação, aumentar a regulação das proteínas Tj, inibir a transcitose e melhorar o comportamento semelhante ao POD. Este trabalho estabeleceu que o direcionamento da disfunção da BHE induzida por A/C representava uma estratégia terapêutica viável para a prevenção do POD.
A disparidade de gênero observada na prevalência de POD permanece clinicamente controversa. Na neurociência e disciplinas relacionadas, o uso mais amplo de roedores machos (especialmente ratos e camundongos) tem sido, de fato, uma prática de longa data. Os ciclos estrais das fêmeas introduzem variabilidade neurobiológica significativa, pois os hormônios sexuais modulam a estrutura e a função cerebral, incluindo excitabilidade neuronal, plasticidade sináptica, sistemas de neurotransmissores e comportamento, como ansiedade, depressão, cognição e interação social. Se animais fêmeas em diferentes estágios do ciclo estral forem misturados em um experimento, essas flutuações hormonais introduzem variabilidade adicional e significativa dentro do grupo, aumentando o “ruído” nos resultados experimentais. Embora o estrogênio tenha demonstrado propriedades neuroprotetoras em estudos cognitivos, isso paradoxalmente reforçou paradigmas de pesquisa centrados no sexo masculino. Notavelmente, a pesquisa do Professor Zongcong Xie incorporou especificamente modelos murinos fêmeas, dada sua vulnerabilidade aumentada demonstrada a déficits cognitivos induzidos por sevoflurano após cirurgia abdominal em fêmeas transgênicas para Alzheimer. Historicamente e atualmente, roedores machos são mais comumente usados em experimentos de neurociência principalmente para evitar a variabilidade significativa introduzida pelo ciclo estral das fêmeas, simplificando assim o desenho experimental, aumentando o poder estatístico e dando continuidade à tradição de pesquisa. No entanto, essa prática ignora diferenças biológicas cruciais entre os sexos, resultando em achados incompletos com relevância translacional limitada. Estudos futuros devem integrar sistematicamente animais fêmeas por meio de orientações políticas e mudanças de paradigma, visando obter conhecimento biomédico mais abrangente e confiável.
No entanto, várias limitações de nossa pesquisa devem ser reconhecidas. Primeiro, o modelo experimental utilizou apenas camundongos machos jovens. Reconhecemos que o POD não apresentou predileção por gênero e demonstrou maior incidência em populações geriátricas. Embora os dados apoiem nossa hipótese, são necessários mais estudos em ambos os sexos e em animais idosos. Segundo, os mecanismos precisos subjacentes à promoção do desenvolvimento de Tj pelo MB e à regulação da transcitose permanecem incompletamente caracterizados. As principais questões não resolvidas incluem: (1) Como o MB modula a localização e a ruptura das proteínas Tj nas células endoteliais. (2) Seus efeitos na localização de EMMPRIN/MMP-9 nas células endoteliais. (3) O papel potencial dos inibidores de MMP-9 (por exemplo, SB-3CT, TIMP-1) na modulação da função da BBB. Esses processos merecem investigação rigorosa em pesquisas subsequentes. Terceiro, nossa avaliação concentrou-se nas contribuições microgliais para a neuroinflamação sem avaliar os astrócitos, outra célula imune residente crítica do sistema nervoso central. Dadas as interações microglia-astrócitos documentadas em patologias neurodegenerativas, o papel das respostas astrocíticas na patogênese do POD requer exploração dedicada. Finalmente, a dosagem de MB foi extrapolada de nossa investigação anterior em modelo de sepse e da literatura existente. A dosagem ideal para proteção cognitiva em diferentes modelos animais necessita de determinação sistemática adicional.

Conclusão
Este estudo demonstrou que o MB pode aliviar a neuroinflamação e preservar a integridade da BBB, melhorando assim o comportamento semelhante ao POD em camundongos adultos. Esses achados sugerem que o MB talvez seja um candidato a medicamento promissor para a prevenção do POD.

Materiais e métodos
Todos os experimentos foram realizados de acordo com todos os regulamentos éticos pertinentes, incluindo a diretriz ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Faculdade de Medicina de Shanghai, Universidade Fudan (Nº de Aprovação 202404FD0003). Foram feitos esforços para minimizar o número de animais utilizados e seu sofrimento.

Anticorpos e reagentes
Anticorpos primários para western blotting: anti-ZO-1 (1:5000), anti-ocludina (1:5000), anti-claudina-5 (1:5000), anti-Iba-1 (1:1000) e anti-β-actina (1:20000) foram obtidos da Proteintech. Anti-MMP9 (1:500) e anti-caveolina-1 (1:500) foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology. Anti-Mfsd2a (1:1000) foi obtido da Abcam; Anti-EMMPRIN (1:1000) foi obtido da Affinity. Anticorpos para imunofluorescência: Anti-Iba-1 (1:300) foi obtido da Proteintech. IgG de cabra anti-camundongo conjugado com Cy-3 (1:200) foi obtido da Affinity. IgG de cabra anti-coelho Alexa Fluor 488 (1:500) foi obtido da proteintech. Reagentes adicionais: MB foi obtido da Jiangsu Jichuan Pharmaceutical Co. Ltd. (Taixin, China). O kit de extração de proteínas, reagentes do ensaio de ácido bicinconínico (BCA), dihidroetídio (DHE), dextrano marcado com FITC (ST2935) e inibidores de protease e fosfatase foram adquiridos do Beyotime Institute of Biotechnology (Xangai, China). DAPI Fluoromount-G foi adquirido da SouthernBiotech.
Animais
Camundongos machos C57BL/6J com 16 semanas de idade foram adquiridos da Suzhou Sibeifu Biotechnology Co., Ltd., Suzhou, China. Todos os animais foram alojados em grupos sob condições laboratoriais padrão (22 ± 2 °C, ciclo claro/escuro de 12 h) com acesso ad libitum a comida e água. Os camundongos tiveram uma semana para se aclimatar ao ambiente do laboratório antes do experimento.
Protocolo experimental
Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos em quatro grupos: grupo controle, grupo anestesia/cirurgia (A/S), grupo A/S + MB e grupo MB. MB (Jiangsu Jichuan Pharmaceutical Co. Ltd., Taixin, China) foi dissolvido em solução salina normal. Os camundongos do grupo MB e do grupo A/S + MB receberam injeções intraperitoneais de solução de MB (5 mg/kg) 1 h antes da cirurgia e 4 h após a cirurgia. Enquanto isso, os camundongos do grupo controle e do grupo A/S receberam um volume igual de solução salina normal administrado da mesma maneira e nos mesmos momentos. A dosagem de MB foi baseada em estudos anteriores utilizando modelos de disfunção cognitiva induzida por sevoflurano e comprometimento neurocognitivo induzido por lipopolissacarídeo, com pequenas modificações.
Modelo de delirium pós-operatório em camundongos
Camundongos do grupo A/S e do grupo A/S + MB foram submetidos a uma laparotomia simples sob anestesia com isoflurano, seguindo os métodos descritos em estudos anteriores com uma modificação usando 60% de oxigênio. A monitorização dos gases sanguíneos arteriais foi omitida, pois nem o procedimento cirúrgico nem a anestesia com 1,4% de isoflurano perturbaram significativamente a pressão arterial ou os valores dos gases sanguíneos nos camundongos. Especificamente, a anestesia foi induzida e mantida usando 1,4% de isoflurano em 60% de oxigênio dentro de uma câmara acrílica transparente. Quinze minutos após a indução, os camundongos foram retirados da câmara e colocados em uma almofada térmica para manutenção da temperatura durante a cirurgia. A anestesia com isoflurano foi mantida por meio de um dispositivo de cone, e uma agulha de calibre 16 foi inserida no cone próximo ao nariz do camundongo para monitorar a concentração de isoflurano. Após a imobilização dos membros, a pele abdominal foi raspada e desinfetada. Anestesia local pré-incisional foi administrada usando lidocaína a 1%. Uma incisão longitudinal na linha média foi feita desde o xifoide até 0,5 cm proximal à sínfise púbica na pele, músculos abdominais e peritônio. Em seguida, exploramos os órgãos abdominais por um minuto e suturamos a incisão em camadas com suturas Vicryl 4-0. Ao final do procedimento, creme composto de lidocaína (lidocaína 2,5% e prilocaína 2,5%) foi aplicado na ferida e repetido a cada 8 h até a eutanásia dos camundongos, para aliviar a dor associada à cirurgia. O procedimento cirúrgico durou aproximadamente 10 min para cada camundongo. e o camundongo foi subsequentemente devolvido à câmara de anestesia para continuar recebendo o restante da anestesia, consistindo em 1,4% de isoflurano em 60% de oxigênio por até 2 h. A temperatura retal dos camundongos foi mantida a 37 ± 0,5 °C durante a anestesia/cirurgia. Após a recuperação da anestesia, o camundongo foi devolvido à gaiola de origem com acesso ad libitum a comida e água. Os camundongos do grupo controle e do grupo MB receberam exposição a 60% de oxigênio por 2 h.
Testes comportamentais
De acordo com estudo anterior descrito, comportamentos semelhantes ao delirium foram avaliados usando uma bateria de testes de comportamento natural e aprendido, incluindo teste do alimento enterrado, teste de campo aberto e teste do labirinto em Y, 24 h antes (linha de base) e depois às 6 e 24 h após a cirurgia, simulando certos aspectos semelhantes aos diagnósticos clínicos de pacientes com POD. Os camundongos foram colocados no ambiente de teste por 1 h antes dos testes e devolvidos às suas respectivas gaiolas ao término. Todos os aparatos foram limpos com álcool 75% entre os sujeitos para eliminar odores residuais (Fig. 8). Ao final do estudo, os camundongos foram colocados em uma câmara selada, e CO2 foi introduzido a uma taxa de fluxo de 20–30% do volume da câmara por minuto até a confirmação da parada respiratória. A morte foi assegurada por deslocamento cervical como método secundário.
Cronograma experimental. Os camundongos receberam testes comportamentais 24 h antes da anestesia/cirurgia (linha de base) e, em seguida, 6 h e 24 h após a cirurgia. Os camundongos do grupo MB e do grupo A/S + MB receberam injeção intraperitoneal de solução de MB na dose de 5 mg/kg 1 h antes da cirurgia e 4 h após a cirurgia. Enquanto isso, um volume igual de solução salina normal foi administrado aos camundongos do grupo controle e do grupo A/S da mesma forma. Os camundongos foram sacrificados para coleta de tecido cerebral 6 h após a anestesia/cirurgia. MB, azul de metileno; NS, solução salina normal.

Teste do alimento enterrado
O teste do alimento enterrado foi realizado conforme descrito em estudos anteriores, com modificações. Especificamente, dois dias antes do teste, cada camundongo recebeu dois pedaços de cereal adoçado. No dia do teste, os camundongos foram habituados por 1 h, colocando suas gaiolas de origem na sala de teste. A gaiola de teste foi preparada com 3 centímetros de forração limpa, na qual um pellet de cereal adoçado foi enterrado 0,5 centímetro abaixo da superfície da forração em um local aleatório e não visível. O camundongo foi colocado no centro da gaiola de teste e mediu-se a latência para encontrar e comer o alimento. A latência foi definida como o tempo decorrido desde o momento em que o camundongo foi colocado na gaiola de teste até o momento em que ele descobriu o alimento e o agarrou com as patas dianteiras e/ou dentes, sendo utilizada como medida de pensamento organizado e atenção. Quando os camundongos encontravam o pellet de alimento em até 5 min, eles podiam consumi-lo e, em seguida, eram devolvidos à gaiola de origem. Se o camundongo não conseguisse encontrar o alimento em 5 min, a sessão de teste era encerrada e a latência era registrada como 300 s para aquele camundongo. Para evitar a transmissão de pistas olfativas, esvaziávamos a forração da gaiola de teste e limpávamos a gaiola com solução de etanol a 75% após cada teste.

Teste de campo aberto
O teste de campo aberto foi realizado conforme descrito em estudos anteriores, com modificações. O camundongo foi colocado suavemente no centro de uma câmara de campo aberto (40 × 40 × 40 centímetros) sob condições de luz fraca e deixado explorar livremente por 5 min. Os parâmetros de movimento foram registrados e analisados automaticamente por meio de uma câmera de vídeo conectada ao software do sistema de rastreamento animal Any-Maze (Noldus Ethovision). A distância total percorrida (centímetros), o tempo (segundos) gasto no centro do campo aberto, o tempo de congelamento (segundos) e a latência (o tempo em segundos para os camundongos alcançarem o centro na primeira tentativa) para o centro do campo aberto foram registrados e analisados. O piso do campo aberto foi limpo com solução de etanol a 75% entre cada teste.

Teste do labirinto em Y
O teste do labirinto em Y avaliou a capacidade de aprendizado e memória espacial após anestesia/cirurgia. Especificamente, o labirinto em Y, feito de polivinil cinza, foi colocado em uma sala silenciosa e iluminada e consistia em três braços que se estendiam a partir de uma plataforma central triangular, com um ângulo de 120 graus entre cada braço. Para ajudar os camundongos a estabelecerem suas memórias espaciais, as paredes dos braços foram marcadas com formas geométricas coloridas. Os três braços incluíam o braço de partida, no qual o camundongo começava a explorar (sempre aberto); o braço novo, que era bloqueado na primeira tentativa, mas aberto na segunda tentativa; e o outro braço (sempre aberto). O braço de partida e o outro braço foram designados aleatoriamente para evitar erros de memória espacial. O teste do labirinto em Y consistiu em duas tentativas separadas por um intervalo de 2 horas entre as tentativas. A primeira tentativa (treino) teve duração de 10 minutos e permitiu que o camundongo explorasse o braço de partida e o outro braço do labirinto, com o braço novo bloqueado. 2 horas após a primeira tentativa, a segunda tentativa foi realizada. Para a segunda tentativa, o camundongo foi colocado de volta no labirinto no mesmo braço de partida, com livre acesso a todos os três braços por 5 minutos. Uma câmera de vídeo, conectada ao software do sistema de rastreamento animal Any-Maze (Noldus Ethovision), foi instalada para monitorar e analisar o número de entradas e o tempo gasto em cada braço. O tempo gasto e as entradas no braço novo indicaram a memória de reconhecimento espacial (comportamento aprendido). Cada um dos braços do labirinto em Y foi limpo com solução de etanol a 75% entre as tentativas.
Escore Z composto comportamental
Os escores Z compostos, que apresentam o comportamento semelhante ao delirium pós-operatório de cada camundongo, foram calculados usando os métodos descritos em estudos anteriores. A fórmula para calcular os escores Z foi Z = [ΔXensaio – MÉDIA(ΔX)controle]/DP(ΔX)controle. Resumidamente, (ΔX)controle foi o escore de mudança dos camundongos no grupo controle em 6 h ou 24 h após a condição controle menos o escore na linha de base; ΔXensaio foi o escore de mudança dos camundongos nos grupos A/S, A/S + MB ou MB em 6 h ou 24 h após a condição dos três grupos menos o escore na linha de base; MÉDIA(ΔX)controle foi a média de ΔXcontrole, e DP(ΔX)controle foi o desvio padrão de ΔXcontrole. O escore Z composto para o camundongo foi calculado como a soma dos valores de 6 escores Z (latência para comer o alimento, tempo gasto no centro, latência para o centro, tempo de congelamento, entradas no braço novo e duração no braço novo) normalizados com o DP para essa soma nas condições controle. Dado que a redução (em vez do aumento) no tempo gasto no centro e no tempo de congelamento (teste de campo aberto) e a redução na duração e nas entradas no braço novo (teste do labirinto em Y) indicam comprometimento do comportamento, multiplicamos os valores do escore Z que representam esses comportamentos por − 1 antes de calcular o escore Z composto usando esses valores.
Análise de Western blot
O hipocampo e o córtex pré-frontal do camundongo foram coletados 6 h após a cirurgia. O conteúdo proteico total desses tecidos foi isolado utilizando tampão de lise de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) contendo inibidores de protease e fosfatase em gelo. O kit BCA foi utilizado para determinar a concentração de proteína. Após misturar com tampão de carregamento 5×, a proteína foi fervida por 10 min. Em seguida, quantidades iguais de proteína foram separadas por géis de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio a 7,5%−12,5%, e as proteínas separadas foram transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno, seguida de bloqueio em leite desnatado por uma a duas horas à temperatura ambiente. As membranas foram incubadas com vários anticorpos primários específicos a 4 °C durante a noite e, em seguida, incubadas com os anticorpos secundários conjugados com HRP apropriados por 2 h à temperatura ambiente. Anti-β-actina foi utilizada para normalizar e controlar as diferenças de carregamento nos níveis proteicos. As bandas foram medidas utilizando software de análise de imagem (v1.37, NIH, EUA), e as alterações nos níveis proteicos foram apresentadas como vezes em relação ao grupo controle.
Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR)
O RNA total foi extraído das amostras de tecido utilizando tampões de lise e lavagem de acordo com as instruções do fabricante (RNOO1A, EZBioscience, EUA) e transcrito para cDNA utilizando 4 × Master Mix de Transcrição Reversa (A0010GQ, EZBioscience, EUA). A qPCR foi realizada utilizando SYBR Green Master Mix (A0012-R2, EZBioscience, EUA) em um instrumento de qPCR em tempo real (Applied Biosystems, QuantStudio 7 Flex). A β-actina foi selecionada como gene de referência interno para normalização, e os dados foram tratados pelo método do ciclo limiar comparativo. Os primers utilizados para qPCR estão listados na Tabela Suplementar S1 e foram adquiridos e validados pela Sangon Biotech (Xangai, China).
Imunofluorescência
Seis horas após a cirurgia, os camundongos foram anestesiados com tribromoetanol e perfundidos transcranialmente com solução salina normal gelada, seguida de paraformaldeído (PFA) a 4% em tampão fosfato-salino (PBS) 0,1 M, pH 7,4. Os cérebros foram coletados e fixados em PFA a 4% em PBS 0,1 M a 4 °C, crioprotegidos em sacarose a 30% por 72 h, congelados em TissueTek OCT (Feica) e cortados sequencialmente em fatias de 20 µm de espessura. Para a coloração das seções cerebrais, as seções foram enxaguadas com PBS por 10 min, permeabilizadas por 20 min com PBS contendo Triton X-100 a 0,2% e bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA) a 5% à temperatura ambiente para bloquear ligações inespecíficas. Em seguida, as seções foram incubadas durante a noite com anticorpo primário anti-Iba-1 de coelho (1:300) a 4 °C. Após lavagem, as seções foram incubadas com anticorpos secundários IgG(H+L) anti-coelho de burro conjugado com CoraLite488 (1:500) por 1 h à temperatura ambiente no escuro. Os núcleos foram contracorados com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e as seções foram montadas em DAPI Fluoromount-G. Todas as imagens foram capturadas com EVOS M700. A análise foi realizada com o software Image J (v1.37, NIH, EUA).
Coloração com di-hidroetídio (DHE)
As secções cerebrais foram lavadas com PBS por 10 min, e então as secções dos quatro grupos foram bloqueadas com BSA a 5% por 30 min a 37 °C. Após lavagem, as secções foram incubadas com DHE diluído em PBS (10 µM) à temperatura ambiente por 30 min em condições protegidas da luz. As imagens foram observadas em EVOS M700, onde a fluorescência vermelha refletiu o conteúdo de ROS, e a intensidade de fluorescência foi analisada com o software Image J.
Avaliação da permeabilidade da barreira hematoencefálica
O extravasamento de imunoglobulina G (IgG) foi realizado para avaliar a permeabilidade da BHE. As secções cerebrais foram aquecidas por 20 min a 37 °C, seguidas de coloração com IgG anti-camundongo de cabra conjugada com Cy-3 (1:200) por 2 h. Após montagem com lamínula de vidro, as lâminas foram escaneadas em microscópio de fluorescência.
Dextrano foi usado para medir a permeabilidade da BHE conforme descrito em estudos anteriores com modificações. A quantificação espectrofotométrica do traçador dextrano de 10 kDa (4 mg/ml) a partir de extratos do hipocampo e córtex pré-frontal foi usada como descrito em estudo anterior. Especificamente, cada camundongo recebeu injeção intravenosa de 100 µl do traçador dextrano 6 h após a cirurgia. Quinze minutos após a injeção do traçador, o camundongo foi submetido a toracotomia sob anestesia breve (1,4% de isoflurano por 5 min) e perfundido com solução salina tamponada com fosfato transcraniana (150 ml por 5 min). Em seguida, os camundongos foram sacrificados e o hipocampo e o córtex pré-frontal foram coletados. Então, o tecido cerebral foi homogeneizado e os lisados teciduais foram centrifugados a 16.000 rpm por 20 min. A fluorescência do sobrenadante foi medida em um Leitor de Microplacas Multimodo Synergy H1 (BioTek) (ex/em 492/520 nm).
Análise estatística
Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM), com as barras de erro indicando o EPM. O teste de Shapiro-Wilk foi usado para analisar a distribuição normal. Comparações de múltiplos grupos foram realizadas por ANOVA de uma via com teste post hoc de Bonferroni. A análise estatística foi realizada usando o GraphPad Prism 7.0 (GraphPad, Nova York, NY, Estados Unidos). As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando P < 0,05.
Informações Suplementares
Abaixo está o link para o material suplementar eletrônico.
Nota do editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Estes autores supervisionaram conjuntamente este trabalho: Yixu Deng e Jie Hua.
Contribuições dos autores
Y. D. formulou o conceito do estudo, projetou os estudos e preparou o manuscrito; J. H. e H. P. realizaram os estudos; Y. D. e J. H. interpretaram os resultados; Y. D. redigiu o manuscrito; J. Z. projetou os estudos e revisou o manuscrito. Os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Disponibilidade de dados
Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e seus arquivos de informação suplementar, e estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável.
Declarações
Conflitos de interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Aprovação ética e consentimento para participação
O protocolo de uso e cuidados com animais estava em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde e foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Faculdade de Medicina de Shanghai, Universidade Fudan.
Referências
Delirium em pacientes idosos e o risco de mortalidade pós-alta, institucionalização e demência: uma meta-análise
Trajetórias cognitivas após delirium pós-operatório
Delirium em pessoas idosas
Delirium pós-operatório no paciente geriátrico
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