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pmid: "24975826"
title: "Os canais de dor humanos TRPM8 e TRPA1, incluindo uma variante genética com sensibilidade aumentada a agonistas (TRPA1 R797T), exibem regulação diferencial pelo inibidor da tirosina quinase SRC."
authors: "Morgan K, Sadofsky LR, Crow C, Morice AH"
journal: "Bioscience reports"
pubdate: "2014 Aug 06"
doi: "10.1042/BSR20140061"
source: "PMC Full Text"

Os canais de dor humanos TRPM8 e TRPA1, incluindo uma variante genética com sensibilidade aumentada a agonistas (TRPA1 R797T), exibem regulação diferencial pelo inibidor da tirosina quinase SRC.

Autores

Morgan K, Sadofsky LR, Crow C, Morice AH

Periodico

Bioscience reports (2014 Aug 06)

Conteudo

Os canais de dor humanos TRPM8 e TRPA1, incluindo uma variante gênica com sensibilidade aumentada a agonistas (TRPA1 R797T), exibem regulação diferencial pelo inibidor da tirosina quinase SRC
TRPM8 (receptor de potencial transitório M8) e TRPA1 (receptor de potencial transitório A1) são nociceptores sensíveis à temperatura fria expressos em neurônios sensoriais, mas seu comportamento em células neuronais é pouco compreendido. Portanto, construções de expressão de DNA contendo cDNAs humanos de TRPM8 ou TRPA1 foram transfectadas em células HEK-293 (células embrionárias humanas de rim) ou células de neuroblastoma SH-SY5Y, e clones resistentes a G418 foram analisados quanto aos efeitos de agonistas e antagonistas nos níveis intracelulares de Ca2+. Aproximadamente 51% dos clones de células HEK-293 e 12% dos clones de células SH-SY5Y expressaram o canal TRP transfectado. Os ensaios de TRPM8 e TRPA1 foram inibidos pelo probenecida, indicando a necessidade de evitar este agente em estudos de canais TRP. Uma mutação de dois resíduos no ICL-1 (alça intracelular-1) do TRPM8 (SV762,763EL, mimetizando fosforilação de serina) ou uma na região da cauda C-terminal (FK1045,1046AG, um knockout de lisina) manteve a sensibilidade a agonistas (WS 12, mentol) e antagonista {AMTB [N-(3-Aminopropil)-2-[(3-metilfenil)metoxi]-N-(2-tienilmetil)benzamida]}. Variantes de SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) no ICL-1 do TRPA1 (R797T, S804N) e proteína de fusão TRPA1 contendo C-terminal (His)10 mantiveram sensibilidade a agonistas (cinamaldeído, alil-isotiocianato, carvacrol, eugenol) e antagonistas (HC-030031, A967079). Uma variante de SNP, 797T, apresentou sensibilidade aumentada a agonistas. O TRPA1 tornou-se reprimido em clones SH-SY5Y, mas foi rapidamente resgatado pelo inibidor da família Src PP2 [4-amino-5-(4-clorofenil)-7-(t-butil)pirazolo[3,4-d]pirimidina]. Por outro lado, o TRPM8 em células SH-SY5Y foi inibido pelo PP2. Estudos adicionais utilizando SH-SY5Y podem identificar características estruturais do TRPA1 e TRPM8 envolvidas na conferência de regulação pós-traducional diferencial.
Os canais de potencial receptor transitório M8 e A1 detectam o ambiente celular e ativam a entrada de Ca2+ no citoplasma. Identificamos uma variante do TRPA1 (receptor de potencial transitório A1) com sensibilidade aumentada e modulação diferencial dos canais por um inibidor de tirosina quinase em células de neuroblastoma.
INTRODUÇÃO
Vários canais TRP (receptor de potencial transitório) humanos, codificados por uma família multigênica, modulam a função celular ao iniciar elevações transitórias da concentração intracelular de Ca2+. Embora suas propriedades bioquímicas fundamentais sejam agora bem compreendidas, aspectos da função dos canais TRP em tipos celulares especializados e a importância potencial das canalopatias permanecem incompletamente caracterizados. Consequentemente, os papéis de mutantes específicos de canais TRP e sua influência na resposta terapêutica requerem elucidação.
Os neurônios sensoriais são um local primário para a ativação de nociceptores de canais TRP pelo ambiente externo ou fatores endógenos. Por exemplo, TRPM8 (potencial receptor transitório M8) e TRPA1 (potencial receptor transitório A1) afetam a fisiologia humana ao iniciar respostas a agentes químicos voláteis ou ar frio por meio da ativação mediada por Ca2+ do sistema nervoso periférico, epitélios e tecidos subjacentes. Eles são modulados por espécies bioquímicas específicas ou estresse celular e ambos os canais TRP podem estar envolvidos em condições patológicas como asma, doença pulmonar obstrutiva crônica e tosse crônica. Portanto, eles estão emergindo como alvos para intervenção farmacológica.

As características básicas da biologia dos canais TRPM8 e TRPA1 foram estabelecidas, em parte, pela superexpressão em modelos de linhagens celulares, como células de ovário de hamster chinês e células HEK-293 humanas (células embrionárias de rim humano), acopladas a medições de elevações transitórias de Ca2+ intracelular. Tais estudos permitiram a identificação de múltiplos agonistas e antagonistas e identificaram os efeitos moduladores dos canais de condições ambientais, como baixo pH externo. A mutagênese sítio-dirigida ou de deleção e experimentos de troca de domínios proteicos, às vezes acoplados à marcação com epítopo ou GFP (proteína verde fluorescente) de canais recombinantes, revelaram resíduos e domínios de aminoácidos-chave que influenciam a função de TRPM8 e TRPA1 (Tabela 1). Apesar do acúmulo de dados fisiológicos in vivo de modelos animais e da identificação de diferenças interespecíficas interessantes (e em contraste com análises moleculares avançadas de TRPV1), apenas alguns estudos examinaram os efeitos funcionais de polimorfismos genéticos recentemente catalogados que afetam a estrutura proteica do TRPM8 ou TRPA1 humano. Da mesma forma, os efeitos de modificações estruturais projetadas experimentalmente na função de variantes de canais em diferentes tipos de células humanas, incluindo resíduos putativamente envolvidos na regulação pós-traducional, ainda precisam ser explorados.

Lista resumida de mutações funcionalmente informativas em TRPM8 e TRPA1 de mamíferos (excluindo o domínio N-terminal)
Localização TRPM8 TRPA1 S2 Y745 Ligação ao mentol (camundongo) ICL-1 SV 762,763 EL retém função (este estudo) R797T T altera EC50 (este estudo) S804N N, sem efeito no EC50 (este estudo) S3 ECL-2 ICL-2 N855S (dor episódica) S873E, E não expressou (este estudo) S4 N799E/Y perda de sensibilidade à icilina D802A G805A S5 Domínio do poro N934 sítio de glicosilação essencial C929, C940 necessários para atividade S6 S943, I946 críticos para abertura Domínio C-terminal FK 1045,1046 AG retém função (este estudo) 1064 L–1104 K 1077E, 1080D, 1082D Domínio de tetramerização coiled-coil Regulação por Ca2+
Estudos em modelos de células semelhantes a neurônios podem ser de grande importância, por exemplo, para compreender o papel potencial da regulação alterada dos canais TRP na hipo ou hipersensibilidade neuronal aferente característica de muitos estados patológicos. Modelos de células neuronais humanas também serão necessários para avaliar dados de estudos de canais TRP expressos endogenamente no sistema nervoso periférico de animais. Nesse aspecto, células SH-SY5Y, uma linhagem de neuroblastoma humano capaz de biossíntese de neurotransmissores e extensão de dendritos neuronais in vitro, foram recentemente transfectadas de forma estável com TRPV1, mas estudos com TRPM8 e TRPA1 não foram relatados anteriormente.

Portanto, comparamos clones celulares HEK-293 e SH-SY5Y transfectados de forma estável, expressando mutantes normais ou novos do TRPM8 humano, e SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único) naturais que geram variantes de sequência do TRPA1, juntamente com uma proteína de fusão TRPA1 marcada com poli-His com extensão C-terminal. Focamos principalmente em modificações que afetam o ICL-1 (alça intracelular-1), pois este é um pequeno domínio com probabilidade de perturbar a função do canal quando estruturalmente modificado, mas incluímos modificações distantes do ICL-1 para comparação. As propriedades farmacológicas e funcionais desses canais foram determinadas em ambos os tipos celulares.

MATERIAIS E MÉTODOS

Reagentes

O potente agonista do TRPM8 WS 12 [(1R,2S)-N-(4-metoxifenil)-5-metil-2-(1-metiletil)ciclohexanocarboxamida], o antagonista do TRPM8 AMTB [cloridrato de N-(3-aminopropil)-2-[(3-metilfenil)metoxi]-N-(2-tienilmetil)benzamida] e os antagonistas do TRPA1 HC 030031 [2-(1,3-dimetil-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetra-hidro-7H-purin-7-il)-N-(4-isopropilfenil)acetamida] e A967079 foram adquiridos da Tocris Bioscience. A maioria dos outros reagentes, incluindo mentol, ionóforo de Ca2+ ionomicina (A23187), probenecida, sulfimpirazona, acetato de bradicinina e os ativadores do TRPA1 [cinamaldeído, AITC (alil-isotiocianato), carvacrol, eugenol] foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Soluções estoque dos reagentes foram preparadas e diluídas em série em DMSO e armazenadas a −20°C, salvo indicação em contrário. As endonucleases de restrição foram adquiridas da Thermo Scientific.

Construções de expressão de cDNA
O cDNA do TRPM8 humano foi clonado por RT–PCR a partir da linhagem celular de câncer de próstata humano LNCaP (da American Type Culture Collection) por ligação em pcDNA3.1neo e sua sequência de DNA foi validada (L.R. Sadofsky, trabalho não publicado). O cDNA normal do TRPM8 foi mutado usando oligonucleotídeos sintéticos (da Eurofins, MWG, Operon) para amplificar o DNA plasmidial de comprimento total com a DNA polimerase Pfu (Thermo Scientific). O DNA amplificado foi usado para transformar Escherichia coli competente (Agilent) e clones plasmidiais individuais foram selecionados por eletroforese em gel de agarose com digestão por enzimas de restrição diagnóstica. O mutante TRPM8 SV 762,763 EL foi identificado usando uma digestão com SacI (GAGCTC) da sequência plasmidial gerada pelos primers de PCR: sense 5′ATGGATTTCCATGAGCTCCCACA CCCC 3′ e sua sequência complementar. O mutante TRPM8 FK 1045,1046 AG foi identificado usando digestão com NaeI (GCCGGC) do DNA plasmidial gerado usando os primers de PCR: sense 5′ TCTTCTGTCTGCTGTGCCGGCAATGA AGA CAA TGAG 3′ e sua sequência complementar.
O cDNA do TRPA1 humano em pcDNA3.1neo foi mutado para criar variantes de SNP usando PCR de mudança rápida com pares de primers apropriados: R797T forward 5′ CAACAGAAAACGAATTA TT e reverse 5′ AATAATTCGTTTTCTGTTG, S804N forward 5′ ATGGATATAAACA ATGTTC e reverse 5′ GAACATTGTTTATATCCAT. Da mesma forma, o mutante experimental S873E, no ICL-2 (alça intracelular-2), foi criado usando primers de PCR: forward 5′ TTGTTGAGGGA GACAGTTG e reverse 5′ CAACTGTCTCCCTCAACAA. Para a extensão C-terminal, o cDNA do TRPA1 foi modificado pela excisão da seção 3′ da região codificadora (digestão com BamHI–XbaI) e substituição por uma seção amplificada por PCR digerida com BamHI–XbaI contendo códons para dez resíduos de histidina (His)10 antes do códon de parada da tradução usando a DNA ligase T4 (Promega). Os primers de PCR foram: sense 5′ TTTAC AGGATCCCTTCAGCTCTC CATT 3′ e antisense 5′ AGACTCGAGAAGCTTA GTGGTGATGATGGTGGTGAT GATGATGGTGTGTTTT TGCCTT 3′. O DNA plasmidial recombinante clonado foi identificado usando eletroforese em gel de agarose com digestão por enzimas de restrição diagnóstica NheI–HindIII.
Cultura de células
Células HEK-293 transfectadas de forma estável com construções de pcDNA3.1neo (Invitrogen) contendo cDNA para TRPM8 ou TRPA1 humano foram cultivadas em DMEM 10% (v/v) FBS, penicilina e estreptomicina sob seleção com 0,5 mg/ml de G418 (PAA Laboratories GmbH). As células HEK-293 foram mantidas em plásticos revestidos com matrigel (BD Biosciences). Células HEK-293 ou SH-SY5Y (LGC) foram transfectadas em placas de 6 cm de diâmetro usando Fugene 6 (Promega) seguindo as instruções do fornecedor. Após seleção com G418, clones distintos foram coletados usando cilindros de clonagem e expandidos sequencialmente em placas de 12 poços, e depois em frascos T25 e T75 antes de realizar análises funcionais e geração de estoques congelados.
Medições de Ca2+ intracelular
Quando as células atingiram aproximadamente 80% de confluência, foram colhidas para ensaios de medição de transientes de Ca2+ em resposta à ativação de canais TRP. Após uma breve lavagem com PBS, as células foram destacadas de cada frasco T75 por imersão com 2 ml de solução salina tamponada com Hepes-EDTA (10 mM Hepes pH7,4, 155 mM NaCl, 1,7 mM EDTA) por vários minutos e colhidas pela adição de 10 ml de PBS com agitação suave e transferência para um frasco universal de 25 ml. Uma amostra foi retirada para calcular o rendimento celular usando um hemocitômetro, e as células foram sedimentadas por centrifugação a 1500 rpm por 4 min. O sedimento foi ressuspenso em tampão isotônico (145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM Hepes pH7,4, 10 mM glicose, um teor variável de probenecida (0, 0,13, 0,26, 0,52, 1,0, 2,0 ou 2,5 mM) ou 0,18 mM de sulfimpirazona, com 10 mg/ml opcionais de BSA (todos da Sigma-Aldrich) a uma densidade de 5×106/ml e misturado com 2,5 ou 5,0 μl de Fluo-3AM (Invitrogen) de uma solução estoque de 2,5 μg/μl preparada em (DMSO, Sigma-Aldrich). As células foram incubadas em um frasco universal de 25 ml no escuro à temperatura ambiente com agitação rotativa suave (50 rpm) por 30–45 min e, em seguida, lavadas pela adição de 18 ml de PBS, seguidas de centrifugação e ressuspensão em tampão isotônico sem BSA a 5×106 células/ml.

Alíquotas da suspensão celular (geralmente 100 μl) foram usadas para medição de transientes de Ca2+ intracelular usando um sistema de detecção por fotomultiplicador PTI (Photon Technology International) 814 interfaceado com um computador de mesa (PTI Inc.). A suspensão celular para ensaio foi adicionada a 1,9 ml de tampão de ensaio isotônico (sem BSA) em uma cubeta de poliestireno de 10×10×45 mm (Sarstedt Ltd) contendo uma pequena barra magnética para agitação contínua (~50 rpm), para levar o volume final a 2 ml, e colocada dentro da caixa de luz do fotomultiplicador. A cubeta foi iluminada usando luz em um comprimento de onda de 506 nm (largura de fenda 8 nm) e monitorada usando detecção de fluorescência a 526 nm (largura de fenda 8 nm) acoplada ao software FeliX GX (PTI Inc.). As aberturas das fendas foram ajustadas para permitir máxima sensibilidade enquanto mantinham baixo ruído. O agonista do canal TRP foi administrado por injeção na cubeta usando uma pipeta de 1–20 μl equipada com uma ponteira descartável estreita e de alcance estendido. Antagonistas foram pré-adicionados às cubetas quando apropriado. Medições de intensidade de fluorescência em tempo real foram coletadas e os dados foram exportados para o Microsoft Excel para análise. Os tratamentos experimentais foram realizados em triplicata em três ocasiões separadas para facilitar análises estatísticas de reprodutibilidade.

Análises gráficas e estatísticas
Dados da medição de transientes de Ca2+ (cada tratamento incluindo um controle com 2 μM do ionóforo de Ca2+ A23187) foram utilizados para gerar traçados de intensidade de fluorescência no Microsoft Excel. Os valores de UFR (unidade de fluorescência relativa) para a linha de base e para o pico de fluorescência de fluo-3-Ca2+ induzido por agonista foram determinados pela análise manual dos gráficos. As alterações dependentes da dose do agonista no pico de UFR foram expressas como ΔUFR em relação à linha de base e em relação à UFR máxima eliciada por A23187. Esses dados foram utilizados para traçar curvas dose-resposta usando ajuste de curva por regressão não linear com o software GraphPad Prism (GraphPad). Isso permitiu a estimativa da concentração excitatória CE50 para agonistas e dos valores de concentração inibitória CI50 onde a pré-incubação com antagonista foi empregada. Comparações entre dados gerados em triplicata dentro de experimentos individuais e entre experimentos realizados em quatro ocasiões separadas foram analisadas usando o teste t de Student e ANOVA de uma via com análise post-hoc das médias dos grupos usando o teste de comparação múltipla de Tukey.
RESULTADOS
Construções de expressão de cDNA plasmidial para variantes normais ou mutantes de TRPM8, ou TRPA1 e proteína de fusão C-terminal foram preparadas e transfectadas nas linhagens celulares HEK-293 e SH-SY5Y. Clones individuais foram isolados e expandidos após seleção para resistência a G418. O crescimento das células SH-SY5Y foi mais lento do que o das HEK-293, com tempos aproximados de duplicação celular de 48 e 24 h, respectivamente.
Os clones celulares foram triados quanto à expressão de canais TRPM8 ou TRPA1 funcionais usando um ensaio de Ca2+ intracelular baseado em fluo-3. Ambas as linhagens celulares ativaram eficientemente o fluo-3-AM na ausência de soro ou BSA em tampão isotônico dentro de 30–45 min à temperatura ambiente.
Um total de 45 clones de células HEK-293 e 85 clones de células SH-SY5Y foram triados e uma proporção deles expressou o canal TRP transfectado (Tabelas Suplementares S2 e S3 em http://www.bioscirep.org/bsr/034/bsr034e131add.htm). A taxa de sucesso para o isolamento de clones SH-SY5Y expressando construções de canal TRP funcional foi menor do que com células HEK-293. As tentativas de isolar SH-SY5Y expressando o mutante TRPM8 SV 762,763 EL falharam, apesar da triagem de múltiplos clones. Nenhum dos clones HEK-293 transfectados com o mutante TRPA1 873E apresentou Ca2+ intracelular elevado em resposta ao tratamento com agonista (20 clones foram testados).
Concentrações elevadas de probenecida (acima de 1 mM, e até 2,5 mM), comumente usada como inibidor da bomba de ânions para auxiliar a retenção intracelular de fluo-3, inibiram os ensaios de Ca2+ intracelular induzidos por TRPM8 e TRPA1 (Figura 1a e Figura Suplementar S1f em http://www.bioscirep.org/bsr/034/bsr034e131add.htm). A baixa concentração de probenecida (0,13 mM) não afetou os resultados do ensaio de Ca2+ em relação aos dados derivados do uso de sulfimpirazona. Após essas observações, tanto a probenecida quanto a sulfimpirazona foram omitidas de todos os ensaios subsequentes, uma vez que não apresentavam benefício aparente.
Traçados representativos de intensidade de fluorescência de células carregadas com Fluo-3 medindo respostas intracelulares de Ca2+ em tempo real ao agonista de TRPM8
Unidades de intensidade de fluorescência relativa (RFU) são plotadas em função do tempo (s). (a) Células HEK-293 expressando TRPM8 humano preparadas na presença de concentrações crescentes de probenecida (A: 0,13 mM, B: 1,3 mM, C: 2,5 mM) tratadas com 40 nM de WS 12 (injetado na primeira seta), depois 2 μM de A23187 (seta com asterisco, indicada para o primeiro traço). A exposição à probenecida suprimiu a resposta ao WS 12. (b) Exemplos de traços de transiente de Ca2+ mostrando a ativação dependente da dose do mutante de duplo resíduo SV 762,763 EL do TRPM8 pelo WS 12 em células HEK-293 (A: 1 μM, B: 100 nM, C: 30 nM de WS 12). (c) A resposta de transiente de Ca2+ a 125 nM de WS 12 em células SH-SY5Y transfectadas com TRPM8 foi semelhante em magnitude à resposta à ativação mediada por 2 nM de bradicinina dos receptores de bradicinina endógenos. (d) (e) Curvas dose-resposta derivadas de medições do pico de fluorescência intracelular de Ca2+ em clones de células HEK-293 e SH-SY5Y expressando construções de TRPM8. Estimativa do EC50 para WS 12 (média±E.P.M., n=3 experimentos independentes cada um realizado em triplicata). Os valores médios de EC50 para a sequência de referência e o TRPM8 mutante não foram estatisticamente significativos em nenhuma das linhagens celulares. (f) Valores de IC50 estimados para o antagonista de TRPM8 AMTB determinados usando uma dose constante de 150 nM de WS 12 (média±E.P.M., n=3). Os valores médios de IC50 para TRPM8 do tipo selvagem e mutante não foram estatisticamente significativos em nenhum dos tipos celulares.

Clones de células HEK-293 e SH-SY5Y transfectadas expressaram de forma estável os mutantes funcionais do TRPM8 humano SV 762,763 EL e FK 1045,1046 AG
Clones de células expressando canais TRPM8 mutantes foram comparados com um clone de célula HEK-293 transfectada de forma estável expressando TRPM8 humano normal. Cada clone exibiu elevação transitória no Ca2+ intracelular quando tratado com concentrações nanomolares do potente agonista sintético do TRPM8, WS 12 (Figuras 1b e 1c) ou com mentol micromolar (resultados não mostrados).

Após um curto período de equilíbrio, a fluorescência basal de fluo-3-Ca2+ durante a mistura de células em suspensão permaneceu estável por até (ou mais de) 10 min para cada alíquota de células, permitindo múltiplas análises separadas de um lote de células. A amplitude de pico (mudança nas RFUs, ΔRFU) do sinal de fluorescência de fluo-3-Ca2+ (526 nm) variou de acordo com a concentração de WS 12 (Figura 1e) ou mentol e dependeu da concentração de Ca2+ extracelular (resultados não mostrados). O tempo necessário para atingir a amplitude de pico aumentou à medida que a concentração do agonista foi reduzida. Os transientes de Ca2+ intracelular induzidos pelo agonista foram especificamente bloqueados pelo potente antagonista de TRPM8, AMTB, sem efeito sobre as alterações induzidas por A23187 (Figura 1b). As alterações transitórias no Ca2+ intracelular eliciadas pelo WS 12 foram semelhantes àquelas eliciadas pela bradicinina atuando em receptores expressos endogenamente (Figura 1d). Células HEK-293 controle transfectadas com o vetor vazio pcDNA3.1neo não exibiram transientes de Ca2+ intracelular após tratamento com WS 12 (Figura Suplementar S1a), mentol ou veículo (DMSO; resultados não mostrados).
A intensidade do sinal de fluorescência basal variou entre os experimentos de acordo com o número de células carregadas com fluo-3AM, a quantidade de fluo-3AM adicionada às células e a duração da incubação com o corante antes dos tratamentos experimentais. Portanto, comparações da amplitude de pico da RFU para cada transient de Ca2+ iniciado por diferentes tratamentos foram feitas em proximidade temporal próxima e em várias ocasiões diferentes para evitar interpretação errônea dos resultados, e os dados foram padronizados em relação à resposta a 2 μM de A23187 para cada amostra. Isso permitiu estimativas dos valores de EC50 do agonista e dos valores de IC50 do antagonista (AMTB) para mutantes do TRPM8. Os valores para mutantes do TRPM8 expressos em qualquer tipo celular foram semelhantes aos canais TRPM8 normais (Figuras 1e e 1f) e não apresentaram diferenças estatisticamente significativas. A variabilidade inter-ensaio e intra-ensaio foi monitorada em triplicata e representou até 25% de variabilidade nas estimativas dos valores de EC50 e até 40% de variabilidade nas estimativas dos valores de IC50. Os valores para o pico de ΔRFU como porcentagem do pico induzido por A23187 foram semelhantes para os diferentes clones (curvas próximas nas Figuras 1e e 1f).

Clones celulares transfectados de HEK-293 e SH-SY5Y expressaram variantes funcionais do SNP do TRPA1 humano e proteína TRPA1-(His)10 com extensão C-terminal

Clones celulares individuais expressando diferentes proteínas TRPA1 foram isolados. Vários clones foram comparados entre si usando concentrações micromolares de agonista (cinamaldeído) e antagonistas (HC 030031 ou A967079) (Figuras 2a, 2c e 2d e Figuras Suplementares S1g–S1k). Os efeitos nos níveis de Ca2+ intracelular foram comparáveis aos elicitados pela ativação de receptores de bradicinina expressos endogenamente em cada linhagem celular (Figura 2b).

Traço representativo da intensidade de fluorescência de células SH-SY5Y transfectadas carregadas com fluo-3 medindo a mudança em tempo real nos níveis de Ca2+ intracelular em resposta ao agonista do TRPA1

(a) (30 μM de cinamaldeído) comparado com a resposta a 2 nM de bradicinina (b). (c) Curvas dose-resposta para 1: TRPA1 797R, 2: 804N, 3: 797T e 4: TRPA1-(His)10 expressos em células HEK-293 e tratados com cinamaldeído. Média do EC50 (±desvio padrão, n=4 experimentos separados contendo medições em triplicata em cada ocasião). Os valores de EC50 foram 1: TRPA1 797R 15±5 μM, 2: TRPA1 804N 11±3 μM, 3: TRPA1 797T 3±1 μM e 4: TRPA1-(His)10 8±2 μM. (d) Gráfico de barras ilustrando a variação entre experimentos na estimativa do EC50 para as construções de TRPA1 1–4. Dados de experimentos duplicados são mostrados (ou seja, 2 barras por construção de TRPA1), nos quais as medições foram realizadas em triplicata em cada ocasião. O TRPA1 797T apresentou EC50 significativamente menor em comparação com as outras construções de TRPA1, *indica P<0,05, **P<0,01.
Estimativas dos valores de EC50 e IC50 para variantes do SNP do TRPA1 foram realizadas utilizando células HEK-293 (Figuras 2c e 2d). As respostas em diferentes clones medidas em ocasiões distintas foram comparáveis (Figura 2d). A variante do SNP TRPA1 797T apresentou um EC50 significativamente menor em resposta ao cinamaldeído (3±1 μM, n=4 repetições de medições em triplicata) em comparação com a sequência de referência TRPA1 797R (Figura 2c) (15±5 μM) e em comparação com outra variante do SNP, TRPA1 804N (11±3 μM). As diferenças na resposta de EC50 ao cinamaldeído entre a sequência de referência do TRPA1 e o SNP 804N não foram estatisticamente significativas, embora a proteína TRPA1-(His)10 tenha se mostrado marginalmente mais sensível (EC50 8±2 μM de cinamaldeído). O aumento da sensibilidade associado ao TRPA1 797T foi reprodutível independentemente do agonista utilizado (cinamaldeído, AITC, carvacrol ou eugenol, Figura Suplementar S1). As estimativas dos valores de IC50 para o antagonista potente A967079 foram semelhantes para cada variante do SNP do TRPA1 investigada, sem diferenças estatisticamente significativas detectadas (Figura Suplementar S1k).

TRPA1 e TRPM8 exibiram regulação pós-traducional diferencial em células SH-SY5Y

Clones de SH-SY5Y transfectados com cDNA de TRPA1 perderam gradualmente a resposta detectável ao agonista após cultura contínua in vitro por mais de aproximadamente 10–15 passagens (Figuras 3a e 3c). A resposta ao agonista pôde ser recuperada rapidamente, de maneira dose-dependente, por pré-tratamento curto com o inibidor da tirosina quinase da família Src PP2 [4-amino-5-(4-clorofenil)-7-(t-butil)pirazolo[3,4-d]pirimidina] (Figuras 3d–3f). O tratamento apenas com PP2 não provocou elevação no Ca2+ intracelular no mesmo período de tempo (Figura 3b). O tratamento com PP3 (4-amino-7-fenilpirazol[3,4-d]pirimidina), um análogo inativo do PP2, não facilitou a recuperação das respostas aos agonistas do TRPA1 (Figura 3c). O PP2 provocou resgate metade-máximo da resposta a 6 μM de AITC quando aplicado a aproximadamente 18 μM (Figura 3f).

Traçados representativos para a medição em tempo real do Ca2+ intracelular em células SH-SY5Y transfectadas que exibiram perda de resposta aos agonistas do TRPA1

(a) As células foram tratadas com agonista (6 μM de AITC) seguido por 2 μM de A23187, (b) tratadas com inibidor da tirosina quinase da família Src PP2, (c) PP3, um análogo inativo do PP2 seguido por AITC, ou (d, e) PP2 seguido por AITC. A elevação do Ca2+ intracelular induzida pelo agonista do TRPA1 foi fraca na ausência de PP2 e aumentou após o pré-tratamento com PP2 de maneira dose-dependente, com um EC50 de aproximadamente 18 μM, (f) os experimentos foram repetidos em mais de três ocasiões separadas.
Clones SH-SY5Y transfectados com TRPM8 não apresentaram perda gradual dependente de passagem da resposta ao agonista após cultura contínua in vitro (Figura 4a). Além disso, eles responderam ao pré-tratamento curto com PP2 de forma oposta aos clones TRPA1. Aqui, o PP2 inibiu de forma dose-dependente as respostas ao agonista TRPM8 (Figuras 4b–d). O PP3 não afetou as respostas ao agonista TRPM8 (Figura 4e). O efeito semi-máximo do PP2 ocorreu em aproximadamente 24 μM (Figura 4f). Em contraste com as células SH-SY5Y, o tratamento de células HEK-293 com PP2 causou grandes elevações dos níveis intracelulares de Ca2+ que impediram as análises dos efeitos nas respostas TRPA1 e TRPM8 (resultados não mostrados).

Traçados representativos para a medição em tempo real do Ca2+ intracelular em células SH-SY5Y transfectadas com o mutante TRPM8 FK 1045,1046 AG
(a–e) O pré-tratamento com PP2 causou uma inibição dose-dependente da elevação do Ca2+ intracelular induzida pelo agonista (150 nM WS 12). O PP3 não inibiu as respostas ao agonista, (e) A IC50 para inibição da resposta TRPM8 foi de aproximadamente 24 μM de PP2, (f) Os experimentos de dose-resposta foram repetidos em mais de três ocasiões separadas.

DISCUSSÃO
Neste estudo, utilizamos mutagênese sítio-dirigida, engenharia de DNA recombinante e medições do influxo de Ca2+ induzido por agonista para caracterizar a função dos canais TRPM8 e TRPA1 em cultura de células de neuroblastoma. Este é o primeiro estudo a relatar a expressão de proteínas humanas TRPM8 ou TRPA1 modificadas em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y e apresentamos várias descobertas significativas. Os resultados sugerem que os estudos com células SH-SY5Y podem ser uma ferramenta útil para explorar características específicas do tipo celular neuronal do comportamento dos canais TRP através da aplicação de ensaios de sinalização de Ca2+ e análises de interações moleculares usando proteínas marcadas com epítopo.

Descobrimos que o probenecida em concentrações milimolares inibiu os ensaios tanto para TRPM8 quanto para TRPA1, confirmando e estendendo dados anteriores. Esta observação é de importância técnica, uma vez que certos estudos farmacológicos in vitro incluem probenecida nos tampões de ensaio. Recomendamos evitar o uso de probenecida em estudos de TRPM8 e TRPA1.

Mutantes experimentais específicos de TRPM8 e TRPA1 foram gerados para abordar questões hipotéticas particulares. Focamos principalmente no ICL-1 porque é um dos menores domínios estruturais em ambos os canais. Mutações aqui poderiam ser esperadas para ter efeitos importantes na estrutura terciária do canal, impactando a função do canal. Embora SNPs que afetam o ICL-1 no TRPA1 humano tenham sido catalogados, eles não foram estudados anteriormente.
TRPM8 (SV 762,763 EL) é um mutante projetado, mimético de uma fosforilação hipotética (S 762 E) no ICL-1 entre os domínios transmembrana S2 e S3. A fosforilação de canais, geralmente em múltiplos resíduos de serina/treonina ou tirosina, é um mecanismo regulatório pós-traducional comum. Da mesma forma, resíduos de lisina intracelulares podem ser usados como sítios de modificação regulatória, como a ubiquitinação. TRPM8 FK 1045,1046 AG é essencialmente um knockout de lisina (K 1046 G) na região da cauda C-terminal (distante do ICL-1) e é o primeiro do seu tipo estudado no TRPM8.
TRPA1 R797T e S804N são variantes de SNP de ocorrência natural que afetam resíduos no ICL-1. Estes foram escolhidos porque o primeiro é uma substituição não conservativa e o segundo uma substituição semiconservativa e são adequados para comparação entre si. Em nossas mãos, um mutante experimental no TRPA1 ICL-2, S873E, não produziu clones responsivos. É necessária investigação adicional para determinar se esse mutante pode ser expresso.
Curiosamente, ambos os mutantes de TRPM8 mantiveram a abertura do canal em resposta ao agonista (WS 12 ou mentol) e sensibilidade ao antagonista (AMTB), com pouco impacto no influxo de Ca2+ e nenhuma alteração nos valores estimados de EC50 ou IC50 (Figura 1). Eles fornecem um comparador útil com outros mutantes de TRPM8 e SNPs de TRPA1.
Em contraste com a ausência de efeito da mutação no ICL-1 do TRPM8, a variante SNP 797T do ICL-1 do TRPA1 apresentou maior sensibilidade aos agonistas do que o alelo mais comum 797R do TRPA1 (Figura 2) e em comparação com o SNP do TRPA1 que afeta a posição 804, também no ICL-1. Esta é uma descoberta significativa, lembrando o efeito sensibilizante putativo associado a um SNP que afeta o ICL-2, N855S. Estudos adicionais são necessários para avaliar se variantes genéticas contribuem para diferenças fisiológicas na sensibilidade do TRPA1 em humanos.
De igual importância, descobrimos evidências de regulação pós-traducional diferencial do TRPA1 e TRPM8 em células SH-SY5Y. Isso operou através de uma via envolvendo atividade de tirosina quinase (Figuras 3 e 4), sensível ao inibidor PP2. Os valores de EC50 e IC50 para os efeitos do PP2 sobre TRPA1 e TRPM8 foram de magnitude semelhante (cerca de 20 μM). O análogo inativo PP3 não afetou as respostas dos canais TRP. Experimentos semelhantes não puderam ser realizados usando clones HEK-293 porque o PP2 provocou grandes elevações no Ca2+ intracelular nessas células. Um efeito inibitório de 10 μM de PP2 sobre a corrente transmembrana induzida por agonista de TRPV1 em células HEK-293 foi relatado anteriormente.
A tag TRPA1-(His)10 não alterou apreciavelmente a EC50 esperada das respostas ao cinamaldeído. Talvez o uso de etiquetas de epítopos como ferramentas para investigar interações moleculares possa ser útil para examinar se os mutantes de canais TRP relatados neste estudo têm algum impacto atualmente não reconhecido no comportamento do canal. Por exemplo, canais TRP cronicamente ativados são silenciados, em parte, por uma combinação de múltiplas fosforilações e internalização por endocitose (possivelmente modulada por ubiquitinação), seguida de reciclagem ou degradação proteolítica. As interações moleculares que medeiam o equilíbrio entre esses processos para cada subtipo de canal TRP são geralmente mal compreendidas e podem ser relevantes para a resposta de longo prazo das células ao tratamento com antagonistas.

Em resumo, nossos dados indicam que polimorfismos naturais raros podem afetar a sensibilidade do TRPA1 e que as células SH-SY5Y podem ser úteis para o estudo da regulação pós-traducional de mutantes de TRPA1 e TRPM8 em células de neuroblastoma operando por meio de mecanismos potencialmente diferentes daqueles presentes em células HEK-293.

Dados online

CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES
Kevin Morgan concebeu e executou experimentos, analisou dados, escreveu o manuscrito; Laura Sadofsky gerou clones de HEK-293 wt TRPM8 e TRPA1, analisou dados, contribuiu intelectual e na escrita; Christopher Crow forneceu suporte técnico e logístico e reagentes; e Alyn Morice analisou dados e contribuiu intelectual e na escrita.

FINANCIAMENTO
Estes estudos foram apoiados por fundos departamentais.

O papel dos canais catiônicos de potencial receptor transitório na sinalização de Ca2+
Expressão dependente de diferenciação dos canais TRPA1 e TRPM8 em células de neuroblastoma humano IMR-32
Estudo da interação de subunidades e montagem de complexos de canais TRP
Canais de potencial receptor transitório como alvos terapêuticos
Estudos pré-clínicos em pesquisa da tosse: papel dos canais de potencial receptor transitório (TRP)
Um canal TRP que detecta estímulos frios e mentol
ANKTM1, um canal semelhante a TRP expresso em neurônios nociceptivos, é ativado por baixas temperaturas
Expressão do receptor TRPA1 funcional em fibroblastos e células epiteliais pulmonares humanos
A diminuição nos níveis de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato medeia a dessensibilização dos canais TRPM8 sensores de frio
O canal iônico de frio nocivo TRPA1 é ativado por compostos pungentes e bradicinina
Hipersensibilidade das fibras C vagais pulmonares induzida por hipóxia intermitente aguda em ratos: papel das espécies reativas de oxigênio e do TRPA1
A disfunção mitocondrial do terminal nervoso sensorial ativa nervos sensoriais das vias aéreas via canais de potencial receptor transitório (TRP)
Mecanismo do TRPM8 na resposta nervosa autonômica ao frio nas vias aéreas respiratórias
Agonistas do TRPA1 provocam tosse em cobaias e voluntários humanos
Um canal iônico neuronal sensorial essencial para inflamação e hiper-reatividade das vias aéreas na asma
Modulação da resposta de tosse por entradas sensoriais do nariz – papel dos canais trigeminais TRPA1 versus TRPM8
Canais TRP: alvos emergentes para doenças respiratórias
Triagem de mutagênese aleatória de alto rendimento revela resíduos do TRPM8 especificamente necessários para ativação por mentol
Compostos nocivos ativam canais iônicos TRPA1 através de modificação covalente de cisteínas
AMTB, um bloqueador do canal TRPM8: evidências em ratos para atividade na bexiga hiperativa e síndrome da bexiga dolorosa
HC-030031, um antagonista seletivo do TRPA1, atenua a hipersensibilidade mecânica induzida por inflamação e neuropatia
Caracterização de ligantes seletivos do TRPM8 e sua relação estrutura-atividade (S.A.R.)
Derivados tricíclicos de 3,4-di-hidropirimidina-2-tiona como potentes antagonistas do TRPA1
Um mecanismo dependente de TRPA1 para a sensação pungente de ácidos fracos
O receptor de frio e mentol TRPM8 contém um motivo duplo de cisteína funcionalmente importante
Mutantes do sensor de voltagem do TRPM8 revelam um mecanismo para integrar estímulos térmicos e químicos
Identificação do domínio transmembrana 5 como um determinante molecular crítico da sensibilidade ao mentol em canais TRPA1 de mamíferos
O aglomerado ácido C-terminal está envolvido na regulação induzida por Ca2+ do canal de potencial receptor transitório anquirina 1 humano
Importância de um motivo de sequência conservado no segmento transmembrana S3 para a abertura dos canais humanos TRPM8 e TRPM2
Determinantes moleculares da ativação ou bloqueio espécie-específico dos canais TRPA1
Perda de função da variante genética do potencial receptor transitório vaniloide 1 (TRPV1) está associada a menor risco de asma ativa na infância
Genes do potencial receptor transitório, tabagismo, exposições ocupacionais e tosse em adultos
Uma mutação de ganho de função no TRPA1 causa síndrome de dor episódica familiar
Tráfego e montagem do canal TRPM8 sensível ao frio
A segregação de balsas lipídicas modula a atividade do canal TRPM8
Sinais nociceptivos induzem o tráfego do TRPA1 para a membrana plasmática
Inibição direta do canal iônico TRPM8 ativado pelo frio por Gαq
Síntese de múltiplos neurotransmissores por linhagens celulares e clones de neuroblastoma humano
A ativação de receptores TRPV1 humanos recombinantes expressos em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y aumenta Ca(2+), inicia a liberação de neurotransmissores e promove morte celular tardia
Expressão e atividade do TRPV1 durante a diferenciação neuronal induzida por ácido retinoico
O TRPA1 é ativado pela adição direta de resíduos de cisteína aos ésteres N-hidroxisuccinílicos dos ácidos acrílico e cinâmico
A atividade agonista do probenecida no TRPA1 dessensibiliza as respostas do canal: consequências para a triagem
Modulação do TRPV1 pela tirosina quinase não receptora, quinase c-Src