pmid: "27304960"
title: "Síntese e Propriedades Farmacológicas de Novos Ésteres Baseados em Terpenos Monocíclicos e GABA."
authors: "Nesterkina M, Kravchenko I"
journal: "Pharmaceuticals (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2016 Jun 13"
doi: "10.3390/ph9020032"
source: "PMC Full Text"
Síntese e Propriedades Farmacológicas de Novos Ésteres Baseados em Terpenos Monocíclicos e GABA.
Autores
Nesterkina M, Kravchenko I
Periodico
Pharmaceuticals (Basel, Switzerland) (2016 Jun 13)
Conteudo
Síntese e Propriedades Farmacológicas de Novos Ésteres Baseados em Terpenos Monocíclicos e GABA
Novos ésteres do ácido γ-aminobutírico (GABA) com terpenos monocíclicos foram sintetizados via esterificação de Steglich e caracterizados por estudos de 1H-RMN, IV e espectrometria de massas. Suas atividades anticonvulsivante, analgésica e anti-inflamatória foram avaliadas por um modelo de convulsão induzida por PTZ, hiperalgesia induzida por AITC e edema de pata induzido por AITC, respectivamente. Todos os ésteres estudados, bem como seus terpenos precursores, apresentaram efeitos antinociceptivos no modelo induzido por AITC e atenuaram a dor aguda mais do que o fármaco de referência benzocaína após sua aplicação tópica. Os ésteres de GABA do l-mentol e do timol também demonstraram superar o fármaco de referência ibuprofeno em sua capacidade de reduzir o estado inflamatório induzido pela injeção intraplantar do ativador de TRPA1, AITC. Os presentes achados indicam que os ésteres de GABA do carvacrol e do guaiacol não são um pró-fármaco clássico e possuem sua própria atividade farmacológica. Uma ação anticonvulsivante prolongada do éster baseado no aminoácido e no guaiacol (200 mg/kg) foi revelada 24 horas após a administração oral. Além disso, o gidazepam (1 mg/kg) e os ésteres de GABA do l-mentol, timol e carvacrol administrados por via oral produziram efeitos sinérgicos de prevenção de convulsões.
Introdução
Até o momento, progressos significativos foram feitos em nossa compreensão da nocicepção e da reação inflamatória graças à identificação, clonagem e caracterização da família de canais catiônicos de potencial receptor transitório (TRP). Os canais TRP são divididos em sete subfamílias com base na homologia de sua sequência de aminoácidos: TRPC, TRPV, TRPM, TRPN, TRPA, TRPP e TRPML, cada um dos quais pode ser ativado por vários fitoquímicos. Por exemplo, o timol e o carvacrol podem ativar os canais iônicos TRPV1 e TRPV3; o guaiacol pode exercer seus efeitos antinociceptivos via TRPV1; o mentol foi identificado como um agonista do TRPM8. Além disso, os terpenos monocíclicos mencionados acima são ativos no SNC e atuam como moduladores alostéricos positivos dos receptores GABAA, apresentando uma variedade de efeitos, como ações anticonvulsivante, analgésica e nootrópica.
O ácido γ-aminobutírico (GABA) é bem conhecido como o principal neurotransmissor inibitório do SNC, e seus baixos níveis são responsáveis por muitos estados de dor. Adicionalmente, os dados experimentais e estudos clínicos confirmam claramente um papel importante do GABA no mecanismo e tratamento de crises epilépticas. No entanto, estudos recentes forneceram fortes evidências de que os receptores GABAB também estão localizados na periferia; surpreendente nesse contexto é a descoberta da localização do GABA nas terminações terminais dos nociceptores da córnea. Assim, a combinação de moduladores de canais TRP e compostos que se ligam aos receptores GABA é conveniente para o desenvolvimento de novos fármacos com uma ampla gama de atividade farmacológica.
Recentemente, relatamos a síntese de ésteres de GABA com l-mentol e timol e a avaliação de sua atividade anticonvulsivante e analgésica. O presente estudo é uma extensão lógica de nossa pesquisa anterior, visando a síntese e investigação de novos compostos com efeitos biológicos combinados. No presente estudo, investigamos uma gama de propriedades farmacológicas, como a ação anticonvulsivante, analgésica e anti-inflamatória de ésteres de GABA com diferentes terpenos.Resultados e Discussão
2.1. Química
A síntese de ésteres baseados em terpenos monocíclicos e GABA (1–4) foi realizada via esterificação de Steglich com N,N′-diciclohexilcarbodiimida (DCC) e 4-dimetilaminopiridina (DMAP) como catalisador em diclorometano (DCM). Os seguintes terpenos foram utilizados para a preparação dos ésteres: l-mentol (5), timol (6), carvacrol (7) e guaiacol (8). Destes ésteres, os compostos 1 e 2 foram preparados anteriormente e são mostrados aqui apenas para comparação. A condensação de 1,0 equivalente de um terpeno apropriado com 1,05 equivalente de GABA protegido com terc-butiloxicarbonil (Boc) na presença de DCC (1,1 equiv) e DMAP (quantidade catalítica) em DCM seco forneceu os ésteres correspondentes como um líquido oleoso amarelo (Esquema 1). O grupo Boc foi removido com HCl 1 M em ácido acético glacial de acordo com o procedimento da literatura.
Os ésteres de GABA sintetizados foram isolados como sólidos brancos (composto 3) ou acastanhados (composto 4) e totalmente caracterizados por RMN de 1H, espectroscopia de IV e espectrometria de massas FAB e ESI. Os espectros de FAB-MS dos ésteres 3 e 4 exibem o pico do íon molecular protonado [M + H]+ em m/z 236 e m/z 210, respectivamente. A HRMS (ESI-TOF) revelou um pico de íon do composto 3 em m/z 236,1666 [M + H]+, sugerindo assim uma fórmula molecular C14H22NO2 (calc. 236,3300), bem como um pico de íon do éster 4 em m/z 210,2502 [M + H]+ correspondente a uma fórmula molecular C11H16NO3 (calc. 210,2497). Os espectros de IV dos ésteres 3 e 4 exibem bandas de absorção de ligações N–H, grupos éster C=O, C–H aromático e C–H alquílico. Os dados espectrais de RMN de 1H contêm sinais de ressonância descritos por seu deslocamento químico, integração e multiplicidade que estão em total concordância com as fórmulas moleculares apresentadas.
2.2. Farmacologia
2.2.1. Teste de Antinocicepção
Os canais TRP são amplamente expressos em tecidos de mamíferos; populações de células não neuronais na pele expressam muitos tipos diferentes de canais TRP, tornando-os um bom alvo terapêutico para liberação transdérmica de fármacos. Recentemente, investigamos a atividade analgésica dos ésteres 1–4 por meio de modelos farmacológicos de estímulos térmicos e químicos (formalina e capsaicina) em camundongos após aplicação tópica em pomada (2% p/p). Todos esses modelos farmacológicos estão associados à ativação de canais TRP: TRPV1, TRPV3 e TRPV4 contribuem para a sensação aguda de calor nocivo; TRPA1 é alvo da formalina; capsaicina é agonista de TRPV1. Para expandir nossa pesquisa e elucidar a influência dos ésteres obtidos sobre os canais TRP, o agonista de TRPA1, alil isotiocianato (AITC), foi utilizado como estimulante químico, com posterior avaliação da resposta analgésica em camundongos. Para comparação, os terpenos monocíclicos iniciais—l-mentol (5), timol (6), carvacrol (7) e guaiacol (8)—também foram estudados nas mesmas condições experimentais. A benzocaína (BZC) foi selecionada como fármaco de referência devido ao uso generalizado desse anestésico local como analgésico tópico e também com base na capacidade dos anestésicos locais de ativar TRPV1 e, em menor grau, canais TRPA1. Os camundongos tratados com a pomada base (grupo controle) apresentaram duração média da resposta nocifensiva induzida por AITC de 71,3 ± 1,8 s (Tabela 1).
Uma diminuição estatisticamente significativa no tempo de lambedura da pata foi observada em camundongos tratados com todos os compostos estudados 1–8 (p < 0,01 vs. camundongos controle). A BZC, que serviu como controle positivo em nosso experimento, também causou supressão significativa da dor, com duração média do tempo de lambedura de 48,0 ± 2,0 s. Vale destacar que todos os ésteres estudados 1–4 e terpenos 5–8 atenuaram melhor a reação de dor induzida pela injeção subplantar de AITC em comparação com o controle positivo (BZC), conforme evidenciado pelo tempo de lambedura registrado para esses compostos. A analgesia máxima foi observada para l-mentol 5 (6,8 ± 1,2 s) e seu éster GABA 1 (2,7 ± 0,3 s). Ao comparar o tempo de lambedura dos camundongos tratados com os ésteres sintetizados ou terpenos, diferença estatisticamente significativa foi observada apenas entre os compostos 3 e 7 (p < 0,05). A partir desses resultados e devido ao fato de o GABA estar localizado nas terminações dos nociceptores corneanos, muitos dos quais também expressam TRPV1, podemos concluir que a ação antinociceptiva dos ésteres investigados foi causada pela contribuição tanto dos terpenos quanto do GABA.
2.2.2. Atividade Anti-Inflamatória
A ativação dos canais TRPA1 pelo AITC leva não apenas ao desenvolvimento de hiperalgesia, mas também resulta em edema inflamatório. Para examinar a atividade anti-inflamatória dos ésteres de GABA 1–4, o AITC foi injetado na superfície dorsal da pata direita de ratos em uma dose selecionada a partir do estudo da relação dose-resposta − 100 μg/pata. O ibuprofeno, que de acordo com dados da literatura inibe claramente o edema inflamatório evocado pelo AITC, foi selecionado em nossa pesquisa como fármaco de referência. Conforme mostrado na Figura 1, o edema induzido por AITC foi máximo em 3 h e diminuiu completamente até o nível basal (105% ± 3,9%, dados não mostrados) em 24 h após a injeção. Como observado, após a administração transdérmica (pomada a 2% p/p) dos compostos 1–4 e ibuprofeno, o máximo de inflamação foi observado 1,5 h após a injeção de AITC. Nossos dados indicam que o volume da pata afetada do rato, usado como medida de edema (em porcentagem), atingiu o nível basal (100%) em 6 h após a administração de AITC.
A aplicação tópica de todos os ésteres estudados reduziu significativamente o nível de inflamação em comparação com o grupo de ratos tratado com veículo (curva de inflamação). A maior ação anti-inflamatória foi demonstrada pelos compostos 1 e 2, que após aplicação tópica reduziram significativamente o nível de edema induzido por AITC para 136% e 112%, respectivamente; enquanto o tratamento com pomada de ibuprofeno reduziu o volume da pata afetada para 172%. Assim, os ésteres 1 e 2 superaram o fármaco de referência ibuprofeno em sua capacidade de diminuir o estado inflamatório induzido pela injeção intraplantar de AITC, um ativador do TRPA1.
2.2.3. Ação Anticonvulsivante
A refratariedade aos fármacos antiepilépticos é um grande problema neurológico, e esforços para identificar moléculas alternativas são atualmente necessários, especialmente para a epilepsia do lobo temporal, que é o tipo mais comum de transtorno epiléptico de difícil tratamento. Modelos químicos de convulsão são amplamente utilizados na avaliação pré-clínica das propriedades anticonvulsivantes de fármacos. Tendo em mente o fato de que tanto o carvacrol quanto o guaiacol modulam positivamente os receptores GABAA de forma alostérica, o comportamento convulsivo dos animais experimentais foi induzido pelo pentilenotetrazol (PTZ) convulsivante, que é um agonista do receptor GABA. Os ésteres de carvacrol e guaiacol do GABA foram triados quanto ao seu potencial anticonvulsivante através do teste PTZ, que representa um modelo válido para convulsões mioclônicas generalizadas humanas.
Anteriormente, investigamos a atividade anticonvulsivante do éster 1 de GABA menthílico em uma dose de 87–1350 mg/kg e mostramos que este composto exibe efeito antiepiléptico em toda essa faixa de doses. A dinâmica da ação foi estudada de forma estendida para uma dose de 175 mg/kg, em 0,5–96 h após administração oral única; o efeito anticonvulsivante máximo foi alcançado em 18 h, com valores de DCTC e DTE de 191% e 196%, respectivamente. A ação anticonvulsivante dependente da dose também foi detectada para o éster 2 em uma faixa de doses de 5–20 mg/kg. A investigação da relação tempo-resposta (1–24 h) do composto 2 foi realizada em uma dose de 20 mg/kg. Os achados demonstraram o efeito antiepiléptico ao longo de todo o período de tempo, com os seguintes valores apropriados de DCTC e DTE: 263% e 256% em 1 h após a administração; 181% e 183% em 24 h após a administração.
Com base nos dados da literatura, o efeito antiepiléptico foi estudado para o carvacrol (200 mg/kg), guaiacol (200 mg/kg) e seus ésteres com GABA (quantidades equimolares) administrados a camundongos por via oral em emulsão de Tween 80/água, e a emulsão de Tween 80/água foi usada como controle veículo. Conforme ilustrado na Figura 2, a ação anticonvulsivante máxima do éster 3 foi observada em 3 h após sua administração, com valores de DCTC e DTE de 197%.
Para comparação, verificou-se que o carvacrol demonstra atividade antiepiléptica máxima entre 1 h e 6 h após administração e apresenta, em média, os seguintes dados: 154% para DCTC e 144% para DTE. Considerando a possível ação prolongada dos ésteres obtidos, a avaliação anticonvulsivante foi realizada ao longo de 24 h após administração oral única. De acordo com nossos dados, o tratamento com o éster 24 h antes da administração intravenosa de PTZ produziu atividade antiepiléptica com valores de DCTC e DTE de 138% e 144%, respectivamente, indicando um baixo efeito prolongado do composto 3.
No modelo de convulsão induzida por PTZ, tanto o guaiacol quanto seu éster 4 mostraram potência antiepiléptica semelhante, com máximo em 1 h para o éster 4 e 0,5 h para o terpeno parental após administração, com valores apropriados de DCTC e DTE: 239% e 218% para o composto 4; 248% e 252% para o composto 8 (Figura 3).
No entanto, a ação anticonvulsivante do éster 4 é mantida em 24 h após administração, comprovando que o composto 4 possui efeito antiepiléptico prolongado: 157% e 147% para DCTC e DCTE, respectivamente. Tendo em mente que os ésteres 3 e 4 demonstram seu efeito em curto período de tempo (1–3 h), podemos concluir que esses compostos não são pró-fármacos clássicos e possuem atividade farmacológica própria.
2.2.4. Efeito da Co-Administração de Gidazepam e Ésteres de GABA 1–4
Camundongos foram distribuídos em 10 grupos de cinco animais cada, tratados por via oral com gidazepam (GDZ, 1 mg/kg); éster 1 (175 mg/kg); éster 2 (20 mg/kg); ésteres 3 e 4 (200 mg/kg); misturas de GDZ e ésteres 1–4. Conforme ilustrado na Figura 4, todos os ésteres de GABA com monoterpenos exibem efeitos anticonvulsivantes 3 horas após a administração oral, evidenciados pelo aumento dos valores de DCTC e DTE. Verificou-se que o GDZ (1 mg/kg) protege contra convulsões com valores de DCTC e DTE de 250% e 215%, respectivamente; enquanto a coadministração de GDZ e ésteres 5–7 mostrou aumento da atividade anticonvulsivante em comparação com cada composto isoladamente. Vale ressaltar que o éster de GABA do guaiacol 4 combinado com GDZ não demonstrou efeito sinérgico, o que pode ser explicado pelas diferenças estruturais deste composto em comparação com os ésteres 1–3.
Nossos dados experimentais demonstram que a coadministração oral de gidazepam e ésteres de GABA de monoterpenos (l-mentol, timol e carvacrol) produz efeito sinérgico na prevenção de convulsões, sugerindo que esses ésteres não atuam por meio do sítio benzodiazepínico; esses resultados estão de acordo com os obtidos por investigação eletrofisiológica.
3. Materiais e Métodos
3.1. Geral
Os seguintes produtos químicos e fármacos foram utilizados conforme obtidos de seus fornecedores comerciais: l-mentol, DMAP, GABA (Acros Organics, Geel, Bélgica; Darmstadt, Alemanha), carvacrol, guaiacol, DCC, di-terc-butil dicarbonato (TCI, Filadélfia, PA, EUA), timol (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemanha). O GABA protegido com Boc não foi obtido comercialmente e foi sintetizado de acordo com o procedimento da literatura. As estruturas do composto obtido foram estabelecidas por espectroscopia de 1H-RMN em um instrumento AVANCE DRX 500 (500 MHz) (Bruker, Davis, CA, EUA) usando DMSO-d6 e CDCl3 como solventes e TMS como padrão interno. O espectro de massa FAB foi obtido em um espectrômetro de massa VG 70-70EQ (VG Analytical Ltd., Manchester, Reino Unido) equipado com canhão de íons Xe (8 kV); a amostra foi misturada com matriz de álcool m-nitrobenzílico. A espectrometria de massa de alta resolução (HRMS) foi realizada em um espectrômetro de tempo de voo quadrupolo (Q-TOF) 6530 Accurate Mass (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) usando ESI (ionização por eletrospray) acoplado a um sistema HPLC Agilent 1260 Infinity. Os espectros de IV foram medidos com um espectrômetro FT-IR Frontier (Perkin-Elmer, Hopkinton, MA, EUA) usando pastilhas de KBr. A pureza e identidade do composto foram monitoradas por CCD em placas Merck (TLC Silica gel 60 F254) (Darmstadt, Alemanha).
3.2. Procedimento Geral para a Síntese dos Ésteres de GABA 1–4
A uma solução agitada de terpeno (0,5 g, 3,2 mmol) em CH2Cl2 (20 mL) à temperatura ambiente, foram adicionados GABA protegido com Boc (0,662 g, 3,26 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,097 g, 0,794 mmol). A mistura reacional foi resfriada a 0 °C, agitada por 10 min, e N,N′-diciclohexilcarbodiimida (DCC) foi adicionada gota a gota (0,727 g, 3,53 mmol). A agitação foi continuada por 30 min, então o balão foi gradualmente aquecido à temperatura ambiente e a agitação continuou por mais 10 h. O término da reação foi monitorado por CCD. A mistura reacional foi filtrada, o filtrado foi diluído para 100 mL e lavado com HCl aquoso 1 M, NaHCO3 aquoso 10% e água. A desproteção do grupo N-Boc foi realizada usando HCl/CH3COOH de acordo com o procedimento da literatura.
(1R,2S,5R)-2-Isopropil-5-metilcicloexil 4-[(terc-butoxicarbonil)amino]butirato (1.1): Óleo amarelado (80%). 1H-RMN (CDCl3, δ, ppm): 4.60–4.66 (td, 1H, H-1), 2.91 (t, 2H, γ-CH2), 2.19 (t, 2H, α-CH2), 1.82–1.90 (m, 1H, H-8), 1.71–1.78 (m, 2H, β-CH2), 1.53 (d, J = 12.10 Hz, 1H, H-6e), 1.42–1.46 (m, 1H, H-6a), 1.39 (s, 9H, Boc), 1.31–1.35 (m, 1H, H-5), 1.28–1.35 (m, 1H, H-2), 1.25–1.32 (m, 3H, H-4e + H-3e + H-3a), 1.16–1.24 (m, 1H, H-4a), 0.90 (d, J = 6.92 Hz, 3H, CH3–9), 0.81 (d, J = 6.53 Hz, 3H, CH3–7), 0.72 (d, J = 6.92 Hz, 3H, CH3–10). EM (FAB) m/z: 342 [M + H]+.
2-Isopropil-5-metilfenil 4-[(terc-butoxicarbonil)amino]butirato (2.1): Óleo amarelado (75%). 1H-RMN (CDCl3, δ, ppm): 7.03 (d, J = 7.03 Hz, 1H, Ar-H), 6.49 (d, J = 7.28 Hz, 1H, Ar-H), 6.42 (s, 1H, Ar-H), 3.13–3.20 (m, 1H, CH), 2.91 (t, 2H, γ-CH2), 2.35 (t, 2H, α-CH2), 2.34 (s, 3H, CH3), 1.71–1.78 (m, 2H, β-CH2), 1.39 (s, 9H, Boc), 1.23 (d, J = 6.77 Hz, 6H, CH3). EM (FAB) m/z: 336 [M + H]+.
5-Isopropil-2-metilfenil 4-[(terc-butoxicarbonil)amino]butirato (3.1): Óleo amarelado (75%). 1H-RMN (CDCl3, δ, ppm): 7.17 (d, J = 6.90 Hz, 1H, Ar-H), 7.06 (d, J = 6.73 Hz, 1H, Ar-H), 6.76 (s, 1H, Ar-H), 3.16 (t, 2H, γ-CH2), 2.82 (t, 2H, α-CH2), 2.37 (s, 3H, CH3), 2.27–2.33 (m, 1H, CH), 1.81–1.86 (m, 2H, β-CH2), 1.43 (s, 9H, Boc), 1.14 (d, J = 5.22 Hz, 6H, CH3). EM (FAB) m/z: 336 [M + H]+.
2-Metoxifenil 4-[(terc-butoxicarbonil)amino]butirato (4.1): Óleo amarelado (77%). 1H-RMN (CDCl3, δ, ppm): 7.20 (t, 1H, Ar-H), 7.05 (t, 1H, Ar-H), 6.98 (d, J = 8.00 Hz, 1H, Ar-H), 6.95 (d, J = 8.01 Hz, 1H, Ar-H), 3.79 (s, 3H, CH3), 3.16 (t, 2H, γ-CH2), 2.82 (t, 2H, α-CH2), 1.79–1.86 (m, 2H, β-CH2), 1.43 (s, 9H, Boc). EM (FAB) m/z: 310 [M + H]+.
Os compostos 1 e 2 foram sintetizados e caracterizados em nossos estudos anteriores.
(1R,2S,5R)-2-Isopropil-5-metilciclohexil 4-aminobutirato cloridrato (1): Sólido branco (96%). IV νmax (cm−1): 3021, 2957–2868, 1721, 1573, 1604. 1H-RMN (DMSO-d6, δ, ppm): 4,53–4,59 (td, 1H, H-1), 2,74 (t, 2H, α-CH2), 2,37 (m, 2H, β-CH2), 1,82 (d, J = 12,10 Hz, 1H, H-6e), 1,76 (t, 2H, γ-CH2), 1,59 (m, 2H, H-3e + H-4e), 1,40 (m, 1H, H-3a), 1,27–1,32 (m, 1H, H-5), 0,96–1,01 (m, 1H, H-2), 0,87–0,93 (m, 1H, H-6a), 0,81–0,84 (m, 7H, CH3-9,10 + H-4a), 0,67 (d, 3H, J = 6,53, CH3-7). EM (FAB) m/z: 242 [M + H]+.
2-Isopropil-5-metilfenil 4-aminobutirato cloridrato (2): Sólido branco (80%). IV νmax (cm−1): 3430, 3330, 2929–2851, 1723, 1577, 1244. 1H-RMN (DMSO-d6, δ, ppm): 7,18 (d, J = 7,03 Hz, 1H, Ar-H), 6,99 (d, J = 7,28 Hz, 1H, Ar-H), 6,80 (s, 1H, Ar-H), 2,79–2,86 (m, 1H, CH), 2,29 (t, 2H, α-CH2), 2,21 (s, 3H, CH3), 1,87–1,92 (m, 2H, β-CH2), 1,74 (t, 2H, γ-CH2), 1,06 (d, J = 6,77 Hz, 6H, CH3). EM (FAB) m/z: 236 [M + H]+.
5-Isopropil-2-metilfenil 4-aminobutirato cloridrato (3): Sólido branco (85%). IV νmax (cm−1): 3429, 3219, 2957–2868, 1734, 1377, 1180, 826. 1H-RMN (DMSO-d6, δ, ppm): 7,18 (d, J = 6,87 Hz, 1H, Ar-H), 7,04 (d, J = 6,58 Hz, 1H, Ar-H), 6,92 (s, 1H, Ar-H), 2,76 (t, 2H, α-CH2), 2,29–2,38 (m, 1H, CH), 2,05 (s, 3H, CH3), 1,95 (t, 2H, γ-CH2), 1,76–1,79 (m, 2H, β-CH2), 1,16 (d, J = 5,22 Hz, 6H, CH3). EM (FAB) m/z: 236 [M + H]+. HRMS (ESI-TOF) calculado para C14H22NO2 [M + H]+ 236,3300, encontrado 236,1666.
2-Metoxifenil 4-aminobutirato cloridrato (4): Sólido acastanhado (80%). IV νmax (cm−1): 3433, 3051, 2918, 1720, 1505, 1215, 771. 1H-RMN (DMSO-d6, δ, ppm): 7,20 (t, 1H, Ar-H), 7,06 (t, 1H, Ar-H), 7,03 (d, J = 8,01 Hz, 1H, Ar-H), 6,94 (d, J = 8,01 Hz, 1H, Ar-H), 3,79 (s, 3H, CH3), 2,77 (t, 2H, α-CH2), 2,33 (t, 2H, γ-CH2), 1,74–1,80 (m, 2H, β-CH2). EM (FAB) m/z: 210 [M + H]+. HRMS (ESI-TOF) calculado para C11H16NO3 [M + H]+ 210,2497, encontrado 210,2502.
3.3. Animais
As atividades anticonvulsivante e analgésica do composto sintetizado foram estudadas usando camundongos albinos machos não consanguíneos (18–22 g) como animais experimentais. A investigação do efeito anti-inflamatório foi realizada em ratos Wistar machos (150–180 g). Todos os animais foram mantidos sob regime de luz de 12 h e em uma instalação animal padrão com livre acesso a água e alimento, em conformidade com a Convenção Europeia para a Proteção dos Animais Vertebrados Utilizados para Fins Experimentais e Outros Fins Específicos (Estrasburgo, 1986) e os princípios do Congresso Nacional de Bioética da Ucrânia (Kiev, 2003). Todos os animais foram adquiridos da Universidade Nacional de Medicina de Odessa, Ucrânia. O Comitê de Ética Animal (acordo nº 29/2016) da Universidade Nacional de Odessa (Ucrânia) aprovou o estudo.
3.4. Administração de Fármacos
A aplicação tópica dos ésteres 1–4 e dos monoterpenos iniciais 5–8 foi utilizada para avaliar seu efeito analgésico e anti-inflamatório. As pomadas (2% p/p) foram preparadas utilizando uma mistura de polietilenoglicol (PEG 1500), óxido de polietileno (PEO 400) e 1,2-propilenoglicol na proporção de 4:2:3 como base. A ação anticonvulsivante foi estudada para carvacrol e guaiacol na dose de 200 mg/kg e seus ésteres com GABA (quantidades equimolares); todos os compostos foram administrados a camundongos por via oral em emulsão de Tween 80/água, e a emulsão de Tween 80/água foi usada como controle veicular.
3.5. Teste de Antinocicepção
A atividade antinociceptiva foi avaliada pelo modelo de estímulo químico com o uso do agonista TRPA1 isotiocianato de alila (AITC). O método utilizado foi semelhante ao descrito em. Após a adaptação às condições experimentais, 20 μL de solução de AITC a 0,5% (p/p) foram injetados por via subcutânea sob a pele da superfície dorsal da pata traseira direita. As pomadas foram aplicadas na superfície plantar da pata direita, massageando suavemente, 5 min antes da avaliação da atividade antinociceptiva. Os animais controle receberam apenas uma quantidade correspondente da base da pomada. A dose de AITC foi selecionada com base em nossos ensaios preliminares e em citações da literatura. Os animais foram observados individualmente por 10 min após a administração de AITC. O tempo que os camundongos passaram lambendo a pata injetada (tempo de reação em segundos) foi registrado e considerado como um índice de dor.
3.6. Modelo Inflamatório Agudo Induzido por AITC
A atividade anti-inflamatória dos compostos 1–4 e do fármaco de referência ibuprofeno foi determinada usando um ensaio de edema de pata de rato induzido por AITC. O edema foi induzido por injeção subplantar de 30 μL de solução de AITC (100 μg/pata) em propilenoglicol 30 min antes da aplicação da pomada. O edema foi medido antes (dados controle) e após 1,5, 3, 6 e 24 h da injeção de AITC, utilizando um pletismômetro. As pomadas foram adicionalmente aplicadas massageando suavemente a pata afetada em cada ponto de tempo. Os valores do volume da pata em cada ponto de tempo são expressos como uma porcentagem em relação ao controle (pata não inflamada).
3.7. Convulsões Induzidas por Pentilenotetrazol em Camundongos
A atividade anticonvulsivante dos compostos testados foi avaliada pelo modelo do pentilenotetrazol (PTZ), que inclui a determinação das doses mínimas efetivas (DME) de pentilenotetrazol que induzem convulsões clônico-tônicas (CCT) e extensão tônica (ET) nos animais teste após infusão intravenosa de solução aquosa a 1% na veia da cauda. As doses de pentilenotetrazol para induzir convulsões clônico-tônicas (DCCT) e extensão tônica (DET) foram calculadas em relação ao controle. O efeito anticonvulsivante dos compostos foi estimado em determinados pontos de tempo (0,5, 1, 3, 6, 18 e 24 h) a partir do aumento da DME do pentilenotetrazol em comparação com um grupo controle. A DME em porcentagem foi calculada usando a fórmula: onde DME—dose mínima efetiva de PTZ que induz DCCT ou DET; V—volume da solução de PTZ, mL; m—peso do animal, g.
3.8. Efeito da Co-Administração de Gidazepam e Ésteres de GABA 1–4
Camundongos foram distribuídos em 10 grupos de cinco animais cada, tratados por via oral com gidazepam 1 mg/kg (GDZ); éster de GABA do mentol 175 mg/kg (1); éster de GABA do timol 20 mg/kg (2); éster de GABA do carvacrol 200 mg/kg (3); éster de GABA do guaiacol 200 mg/kg (4); mistura de GDZ e 1; mistura de GDZ e 2; mistura de GDZ e 3; mistura de GDZ e 4. As doses dos ésteres 1–4 foram calculadas em quantidades equimolares em relação aos monoterpenos com base em nossa investigação preliminar e em citações da literatura. A atividade anticonvulsivante dos compostos 1–4 e GDZ, bem como das misturas de GDZ com 1–4, foi avaliada no modelo de crises generalizadas agudas conforme descrito acima; o efeito farmacológico dos compostos foi estimado em 3 horas.
3.9. Análise Estatística
Todos os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (EPM). A análise de variância unidirecional (ANOVA) foi utilizada para determinar a significância estatística dos resultados, seguida pela comparação post hoc de Tukey. p < 0,05 foi considerado significativo.
4. Conclusões
Sintetizamos novos ésteres de GABA com alguns terpenos monocíclicos (l-mentol, timol, carvacrol e guaiacol) e demonstramos suas altas atividades analgésica e anti-inflamatória. Ação anticonvulsivante prolongada foi encontrada para o éster 4; os compostos 1–3 adicionalmente produzem efeitos sinérgicos de prevenção de crises quando coadministrados com gidazepam. Assim, mostramos a possibilidade de desenvolvimento de novos fármacos com uma ampla gama de atividade farmacológica que são simultaneamente capazes de modular os canais TRP e se ligar aos receptores GABA.
Contribuições dos Autores
Iryna Kravchenko concebeu e desenhou os experimentos; Mariia Nesterkina realizou a síntese e analisou os compostos químicos; tanto Iryna Kravchenko quanto Mariia Nesterkina conduziram os experimentos farmacológicos e escreveram o artigo.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Canais de potencial receptor transitório como alvos para fitoquímicos
Canais TRP
Contribuição de produtos naturais para a descoberta da família de canais de potencial receptor transitório (TRP) e suas funções
O mentol potencializa as correntes fásicas e tônicas mediadas pelo receptor GABAA em neurônios da substância cinzenta periaquedutal do mesencéfalo
Interações comparativas de alquilfenóis anestésicos com membranas lipídicas
GABA interrompe a dor
GABA bloqueia sinais de dor patológicos, mas não agudos, do TRPV1
Síntese e atividade anticonvulsivante do γ-aminobutirato de mentila
Éster de timol do ácido gama-aminobutírico: Síntese e atividade anticonvulsivante
Ativação de ácidos carboxílicos com pirocarbonatos. Esterificação de N-acilaminoácidos com álcoois secundários usando di-terc-butilpirocarbonato—Piridina como reagentes de condensação
Canais de potencial receptor transitório como alvos terapêuticos
Atividade analgésica de novos ésteres de GABA após administração transdérmica
O papel emergente dos canais TRP nos mecanismos de sensação de temperatura e dor
O receptor vaniloide TRPV1 é ativado e sensibilizado por anestésicos locais em neurônios sensoriais de roedores
Mecanismos subjacentes à hiperalgesia e edema mediados pelo receptor potencial transitório anquirina 1 (TRPA1)
O TRPA1 contribui para a resposta inflamatória aguda e medeia o edema de pata induzido por carragenina em camundongos
Fisiopatogênese da epilepsia do lobo temporal mesial: A prevenção do dano é antiepileptogênica?
Modelos químicos de epilepsia com alguma referência à sua aplicabilidade no desenvolvimento de anticonvulsivantes
O carvacrol, (−)-borneol e citral reduzem a atividade convulsivante em roedores
Interação positiva alostérica do timol com o receptor GABAA em culturas primárias de neurônios corticais de camundongos
Síntese facilitada de dendrômeros de segunda geração com um grupo funcional ortogonal no ponto focal
Atividade antinociceptiva de antagonistas dos canais de receptor potencial transitório TRPV1, TRPA1 e TRPM8 em modelos de dor neurogênica e neuropática em camundongos
Figuras, Esquema e Tabela
Via sintética dos compostos 1–4. Reagentes e condições: (i) DMAP, CH2Cl2, t.a., 10 min; DCC, 0 °C, 30 min; t.a., 10 h; (ii) HCl, CH3COOH. Todos os ésteres foram preparados como cloridratos.
Edema induzido por AITC. Dependência temporal do volume da pata de rato afetada após administração tópica (pomada 2% p/p) dos ésteres 1–4 e ibuprofeno. ** p < 0,01 em comparação com o grupo tratado com veículo. Análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pela comparação post hoc de Tukey.
Atividade anticonvulsivante dos compostos 3 e 7; relação tempo-resposta. Os valores são apresentados como média ± EPM, n = 5 camundongos; ** p < 0,01 em comparação com o controle veicular. Análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pela comparação post hoc de Tukey.
Atividade anticonvulsivante dos compostos 4 e 8; relação tempo-resposta. Os valores são apresentados como média ± EPM, n = 5 camundongos; ** p < 0,01 em comparação com o controle veicular. Análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pela comparação post hoc de Tukey.
Atividade anticonvulsivante dos compostos 1–4, GDZ e misturas de GDZ com 1–4 3 horas após administração oral. Para todos os grupos p < 0,01 em comparação com o controle. Análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pela comparação post hoc de Tukey.
Atividade analgésica dos compostos 1–8 no teste AITC em camundongos (pomada 2% p/p).
Composto Tempo de Reação (em s) Composto Tempo de Reação (em s) Controle 71,3 ± 1,8 4 25,3 ± 1,5 Benzocaína 48,0 ± 2,0 5 6,8 ± 1,2 1 2,7 ± 0,3 6 25,3 ± 3,8 2 20,3 ± 5,8 7 34,5 ± 2,2 3 22,8 ± 4,3 8 20,7 ± 2,8
Todos os valores são expressos como média ± EPM; n = 6 camundongos; para todos os grupos p < 0,01 em comparação com o grupo controle. Análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pela comparação post hoc de Tukey.