pmid: "36728846"
title: "Estrutura e Reatividade Cruzada de IgE entre Peptídeos Enterrados de Vicilina de Castanha-de-caju, Pistache, Noz e Amendoim."
authors: "Foo ACY, Nesbit JB, Gipson SAY, DeRose EF, Cheng H, Hurlburt BK, Kulis MD, Kim EH, Dreskin SC, Mustafa S, Maleki SJ, Mueller GA"
journal: "Journal of agricultural and food chemistry"
pubdate: "2023 Feb 15"
doi: "10.1021/acs.jafc.2c07061"
source: "PMC Full Text"

Estrutura e Reatividade Cruzada de IgE entre Peptídeos Enterrados de Vicilina de Castanha-de-caju, Pistache, Noz e Amendoim.

Autores

Foo ACY, Nesbit JB, Gipson SAY, DeRose EF, Cheng H, Hurlburt BK, Kulis MD, Kim EH, Dreskin SC, Mustafa S, Maleki SJ, Mueller GA

Periodico

Journal of agricultural and food chemistry (2023 Feb 15)

Conteudo

Estrutura e Reatividade Cruzada de IgE entre Peptídeos Ocultos de Vicilina de Castanha-de-caju, Pistache, Noz e Amendoim
A alergia ao amendoim e a nozes é frequentemente comórbida por razões não completamente compreendidas. Os peptídeos ocultos de vicilina (VBPs) são uma família emergente de alérgenos alimentares cuja estrutura conservada pode mediar a co-alergia amendoim/nozes. Microarranjos de peptídeos foram usados para identificar epítopos de imunoglobulina E (IgE) do N-terminal dos alérgenos vicilina Ara h 1, Ana o 1, Jug r 2 e Pis v 3 usando soro de três grupos de diagnóstico de pacientes: monoalérgicos a amendoim ou castanha-de-caju/pistache, ou duplamente alérgicos. Os peptídeos de ligação a IgE foram altamente prevalentes nos domínios VBP AH1.1, AO1.1, JR2.1 e PV3.1, mas não em AO1.2, JR2.2, JR2.3 e PV3.2 nem nas regiões não estruturadas. Os perfis de IgE não se correlacionaram com o grupo de diagnóstico. A estrutura dos VBPs de castanha-de-caju e pistache foi resolvida usando RMN em solução. Comparações de características estruturais sugerem que o arcabouço dos VBPs de amendoim e nozes pode sustentar a reatividade cruzada. Isso pode ajudar a entender a comorbidade e a reatividade cruzada apesar de uma origem evolutiva distante.
INTRODUÇÃO
O amendoim (AM) está entre as alergias alimentares mais comuns encontradas nas sociedades da Europa Ocidental, com uma taxa de prevalência de 1–2%. Além disso, as alergias ao amendoim estão entre as principais causas de anafilaxia quase fatal nos Estados Unidos, exigindo o uso de estratégias rigorosas de evitação. Essa abordagem de manejo é complicada pelo fato de que a alergia ao amendoim é frequentemente comórbida com sensibilização ou alergia a nozes, sendo as nozes, nozes-pecã, castanhas-de-caju e pistaches as mais comuns (30%). Essa comorbidade poderia ser facilitada pela presença de epítopos de reatividade cruzada. Tais epítopos permitiriam uma resposta robusta de imunoglobulina E (IgE) contra uma variedade de fontes alergênicas, embora a grande distância filogenética entre o amendoim (leguminosa) e suas contrapartes de nozes torne essa interação incomum. Dado o ônus econômico e social da alergia ao amendoim, quantificar o potencial de reatividade cruzada das proteínas do amendoim/nozes e a base molecular através da qual essa interação ocorre representa uma preocupação fundamental para a comunidade científica e forneceria uma visão valiosa para o projeto de estratégias imunoterapêuticas, ao mesmo tempo em que facilitaria abordagens de evitação e mitigação de alérgenos.
Vicilinas são uma família de proteínas de reserva ricas em cisteína encontradas na maioria das angiospermas, incluindo muitas fontes alimentares comuns, como amendoim, leguminosas, frutas e grãos. A proteína vicilina é expressa com uma sequência líder N-terminal (LS), que contém um número variável de peptídeos enterrados de vicilina (VBPs) que são clivados da vicilina parental durante o processo de maturação. VBPs reativos a IgE foram identificados em amendoim e frutas secas como nozes, castanha de caju e pistache. A vicilina alergênica com o maior número de VBPs é o alérgeno de avelã recentemente descrito, Cor a 16, com uma dúzia. Estudos anteriores sobre a LS do amendoim, que contém um domínio VBP (AH1.1), revelaram que os níveis de ligação à IgE não estão correlacionados com sua vicilina parental maior, sugerindo que essas sequências de VBP representam uma nova família de alérgenos cujas propriedades imunológicas são independentes de suas vicilinas parentais.

Os VBPs são caracterizados por uma dobra α-hairpin comum. Diferentemente de outras estruturas α-hairpin, a estrutura do VBP é mediada quase inteiramente por pontes dissulfeto entre motivos CxxxC altamente conservados. Esta arquitetura única fornece um arcabouço estrutural comum que pode mediar a reatividade cruzada de IgE entre espécies evolutivamente distantes. De fato, estudos anteriores identificaram a presença de vários epítopos de reatividade cruzada amendoim/noz entre essas sequências de VBP. Curiosamente, os pacientes avaliados nesses trabalhos exibiram ligação de IgE a peptídeos semelhantes em uma análise de microarranjo, independentemente do perfil clínico (por exemplo, monoalérgico a amendoim, dual alérgico a amendoim e noz, etc.). Esse padrão compartilhado de reatividade de IgE sugere que os VBPs podem representar um sensibilizador comum com potencial para mediar tanto a sensibilização inicial quanto a reatividade cruzada entre diferentes fontes de alérgenos.
Além de amendoins e nozes, VBPs reativos a IgE foram identificados em várias outras espécies de nozes, incluindo amêndoas, caju e pistache. Estes dois últimos são um estudo interessante: cajus e pistaches geralmente têm diferentes padrões de reatividade cruzada de ligação de IgE em comparação com nozes e outras nozes arbóreas. No entanto, o motivo VBP compartilhado poderia potencialmente mediar a reatividade cruzada entre esses grupos de pacientes, independentemente do agente sensibilizante inicial. Assim, caracterizar a reatividade de IgE das VBPs de caju e pistache revelaria o papel dos alérgenos VBP na reatividade cruzada e a base estrutural/biofísica para tal interação. Para tanto, examinamos as propriedades imunológicas de quatro VBPs de caju (AO1.1, AO1.2) e pistache (PV3.1, PV3.2), juntamente com as VBPs previamente identificadas de amendoim (AH1.1) e noz (JR2.1, JR2.2 e JR2.3). Usando microarranjos de peptídeos, identificamos numerosos epítopos imunodominantes de IgE de pistache, caju e amendoim principalmente em AH1.1, JR2.1, AO1.1 e PV3.1. Para fornecer mais informações sobre a base biofísica dessas diferenças, todos os quatro domínios das VBPs de caju e pistache foram expressos recombinantemente, e suas estruturas foram resolvidas usando RMN em solução para fornecer informações sobre o potencial de reatividade cruzada apesar da baixa identidade de sequência. Em conjunto, esses estudos fornecem insights valiosos sobre os determinantes moleculares específicos da reatividade e reatividade cruzada de IgE de amendoim, caju/pistache e possivelmente noz, com implicações tanto para testes diagnósticos alérgicos quanto para estratégias imunoterapêuticas.
MATERIAIS E MÉTODOS
Dados de Microarranjo.
Peptídeos de 15 aminoácidos sobrepostos representando as sequências líder completas dos alérgenos vicilina de amendoim, caju, noz e pistache foram impressos em microarranjos de peptídeos e avaliados quanto à ligação de IgE usando soros de pacientes alérgicos. O procedimento para medir a ligação de IgE foi idêntico ao realizado anteriormente. A Tabela S1 detalha os peptídeos específicos de Ara h 1, Ana o 1, Jug r 2 e Pis v 3 que foram utilizados.
A mediana da relação sinal-ruído (SNR) para cada ponto de peptídeo no microarranjo foi determinada. Cada valor de SNR foi então convertido em escores-z modificados usando a mediana e o desvio absoluto mediano (MAD). A mediana e o MAD foram calculados para cada combinação de paciente e sequência líder. O MAD foi calculado no MATLAB usando a constante de 1,4826 para aproximar o desvio padrão. Após calcular a mediana e o MAD específicos do paciente e da VBP, os escores-z foram calculados subtraindo a mediana do SNR de um ponto relevante e dividindo esse valor pelo MAD. Definimos um evento verdadeiro de ligação de IgE como um SNR com um escore-z convertido ≥3.
Coorte de Pacientes.
Soros de pacientes alérgicos a amendoim e/ou castanha-de-caju/pistache foram obtidos de múltiplas clínicas para avaliar a ligação de IgE usando microarranjo. Uma tabela completa de pacientes desidentificados mostrando alergias e condições conhecidas é apresentada na Tabela S2. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com o Institutional Review Board nas respectivas instituições no que diz respeito a doações humanas.

Construções e Purificação.

As sequências para AO1.1, AO1.2, PV3.1 e PV3.2 foram identificadas a partir das sequências completas dos alérgenos Ana o 1.0101 e Pis v 3.0101, respectivamente. De acordo com a WHO/IUIS, os alérgenos estudados aqui devem ser anotados como Ana o 1.0101 (20–75), Ana o 1.0101 (82–132), Pis v 3.0101 (5–52), Pis v 3.0101 (56–115) (Figura S1). Neste artigo, abreviámo-los como AO1.1, AO1.2, PV3.1 e PV3.2, respectivamente. Os domínios VBP AH1.1 de Ara h 1, JR2.1, JR2.2 e JR2.3 de Jug r 2 são definidos de forma semelhante em Foo et al. As sequências foram inseridas no sistema de expressão pDest com uma etiqueta de afinidade de glutationa S-transferase (GST) N-terminal separada da sequência principal por um sítio de clivagem da protease do vírus do mosaico do tabaco (TEV). Os plasmídeos foram transformados em células de Escherichia coli BL21 (DE3) (Millipore, Burlington, MA), cultivadas até uma DO de aproximadamente 0,8 em meio 2xYT a 37 °C e induzidas usando 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) durante a noite a 16 °C. Amostras uniformemente marcadas com 13C–15N foram cultivadas durante a noite em 1 L de Luria Broth (LB), colhidas e subsequentemente transferidas para meio M9 com 15NH4Cl e 13C-glicose como únicas fontes de nitrogênio e carbono, respectivamente. As células foram deixadas aclimatizar às novas condições por 1 h antes da indução.

As VBPs foram purificadas usando protocolos descritos anteriormente. Em resumo, a GST-VBP foi isolada do lisado celular bruto usando uma coluna de glutationa imobilizada e eluída com 10 mM de glutationa reduzida em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4. As pontes dissulfeto nativas foram reduzidas usando 2 mM de ditiotreitol (DTT) e a etiqueta GST removida por incubação durante a noite com protease TEV a 4 °C. A proteína clivada foi isolada usando uma coluna de filtração em gel Superdex75 26/600 (Cytivia, Marlborough, MA). A proteína resultante foi então incubada com 1 e 0,5 mM de glutationa oxidada e reduzida, respectivamente, para garantir o padrão correto de ligação dissulfeto, e trocada para PBS usando a coluna de filtração em gel Superdex75 26/600 para obter o produto purificado final. As concentrações de proteína foram quantificadas usando um kit de ensaio BCA (Pierce Scientific, Rockford, IL).

Caracterização Estrutural por RMN.
Espectros de RMN foram coletados em amostras de proteína de 0,1–1 mM em PBS, utilizando um console Varian DD2 de 600 ou 800 MHz equipado com sonda resfriada criogenicamente. As atribuições de aminoácidos e as restrições de distância por espectroscopia de realce nuclear Overhauser (NOESY) foram obtidas usando técnicas padrão de ressonância tripla, empregando as sequências de pulso padrão VARIAN Biopack ou BEST-TROSY modificadas, com a primeira utilizando um esquema de amostragem não uniforme com uma taxa de amostragem de 0,25. A estrutura secundária foi estimada a partir dos deslocamentos químicos disponíveis usando o algoritmo TALOS+. Espectros de NOESY em conjunto com as atribuições da cadeia principal e das cadeias laterais foram usados para calcular a estrutura tridimensional (3D) por meio do servidor PONDEROSA. As estruturas de AO1.1, AO1.2, PV3.1 e PV3.2 estão depositadas no banco de dados PDB como 7UV1, 7UV2, 7UV3 e 7UV4, respectivamente.

Caracterização Biofísica.
Espectros de dicroísmo circular (CD) foram coletados usando um espectropolarímetro Jasco J-815 CD (Jasco, Easton, MD); amostras de 2 μM em PBS foram colocadas em uma cubeta de caminho óptico de 1 cm e lidas a 25 °C com uma taxa de varredura de 20 nm/min e um total de quatro acumulações. A previsão da estrutura secundária foi realizada usando o servidor web BESTSEL.
Ensaios de digestão in vitro foram realizados conforme descrito anteriormente. Para a digestão gástrica, amostras de VBP (25 μM) foram preparadas em fluido gástrico simulado (30 mM NaCl, pH 2,0) e incubadas a 37 °C na presença de 0,16–3,2 mg/mL de pepsina de mucosa gástrica suína (Sigma, St. Louis, MO). Para simular a digestão intestinal, amostras de 25 μM de VBP foram preparadas em tampão de digestão (10 mM Tris pH 7,8, 100 μM de azida sódica). A digestão foi iniciada pela adição de tripsina suína (Sigma, St. Louis, MO) a uma concentração final de 1,15 μg/mL. A degradação endossomal simulada foi realizada usando uma amostra de 25 μM de VBP em tampão endossomal (75 mM de citrato pH 5,4, 25 mM de NaCl, 1 mM de DTT). A digestão foi iniciada com a adição de 0,25 U de catepsina S (CatS) (humana, recombinante - EMD Millipore, Burlington, MA). Em todos os ensaios, amostras foram retiradas em intervalos fixos e neutralizadas usando tampão de dodecil sulfato de sódio (SDS) 4× contendo 0,1 mM de NaOH (pH 11) e 2 mM de DTT. A perda do substrato inicial de VBP foi monitorada usando eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE). A intensidade da banda de SDS-PAGE correspondente ao substrato inicial foi quantificada usando ImageJ, e os dados resultantes foram ajustados a uma função de decaimento exponencial a partir da qual uma meia-vida (t1/2) de digestão poderia ser obtida.

RESULTADOS
As sequências líder de amendoim, noz, caju e pistache foram avaliadas quanto à sua capacidade de ligar IgE de pacientes alérgicos a PN, PN&CP ou CP. Os peptídeos reativos a IgE resultantes estão representados na Figura 1A. Numerosos peptídeos reativos a IgE foram identificados principalmente nos VBPs AH1.1, AO1.1, JR2.1 e PV3.1 (Figura 1). Esses peptídeos pareciam estar agrupados em regiões específicas dentro do VBP, indicando potencialmente a presença de epítopos comuns de IgE. Por outro lado, houve muito pouca ligação de IgE a AO1.2, JR2.2, JR2.3 e PV3.2, nem houve alta prevalência de ligação de IgE fora dos domínios VBP. Os putativos epítopos de VBP parecem ser amplamente semelhantes entre todos os três grupos de pacientes (Figura 1B). Da mesma forma, a falta de ligação de IgE a AO1.2, JR2.2, JR2.3 e PV3.2 também foi independente do grupo de diagnóstico do paciente. Embora diferenças menores, como a ligação de IgE à região C-terminal de PV3.1, possam ocasionalmente diferenciar pacientes com PN de seus equivalentes sensibilizados a frutos secos duplos e arbóreos, o padrão geral de reconhecimento de peptídeos VBP entre os três grupos de pacientes mostra mais semelhanças do que diferenças. Esta observação pode ser estendida aos VBPs da noz: Embora o status alérgico à noz dos pacientes empregados neste estudo não tenha sido avaliado, todos os grupos de pacientes mostraram padrões semelhantes de reatividade de IgE contra JR2.1, mas não contra JR2.2 nem JR2.3, reforçando ainda mais a uniformidade da resposta de IgE.

Caracterização Estrutural dos VBPs de Caju e Pistache.
As quatro VBPs de caju e pistache foram resolvidas usando RMN em solução para fornecer mais informações sobre as propriedades fisioquímicas que podem mediar a reatividade cruzada. Todas as quatro VBPs adotaram a dobra característica em α-hairpin com duas α-hélices conectadas por uma volta (Figuras S2 e S3). Assim como suas contrapartes de amendoim e noz, foi observada uma escassez de restrições de distância de longo alcance (Figura S4) em relação a outras pequenas proteínas globulares, sugerindo que a dobra do VBP é mantida principalmente por ligações dissulfeto entre motivos CxxxC adjacentes. Experimentos de dicroísmo circular nos VBPs confirmam essa hipótese: os espectros de CD do VBP intacto mostram mínimos em 220 e 210 nm, indicativos de uma estrutura predominantemente α-helicoidal (Figura 2A). A redução desses dissulfetos com tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) alterou a forma dos espectros de CD, com um aumento nos espectros de CD em 220/210 nm e um novo mínimo emergindo em 205 nm, indicativo de perda de conteúdo α-helicoidal e aumento de estrutura aleatória. O conteúdo de estrutura secundária dos vários VBPs obtido dos espectros de CD é mostrado na Figura 2B, ilustrando a escala da conversão α-hélice–aleatório.
Para avaliar o papel da estrutura das VBP na reatividade da IgE, a prevalência de ligação de peptídeos foi usada para colorir as estruturas das VBP, a fim de identificar regiões de reconhecimento comum de IgE. A Figura 3 mostra que a hélice 2 e os resíduos adjacentes foram comumente reconhecidos em AH1.1, JR2.1, AO1.1 e PV3.1. A hélice 1 foi comumente reconhecida principalmente em JR2.1 e AO1.1. Em contraste, AO1.2 e PV1.2 tiveram uma prevalência muito baixa de ligação de peptídeos, semelhante a JR2.2 e JR2.3 (não representados, veja a Figura 1B). Para avaliar se essas regiões provavelmente sustentariam epítopos de reação cruzada, as superfícies das estruturas foram coloridas com base em uma comparação das propriedades físico-químicas dos resíduos em posições semelhantes (Figura 4). A métrica de distância de propriedade (PD) foi utilizada em vez da matriz Blossum mais comum, que é baseada em mudanças evolutivas. Essas colorações mostram que existem regiões de similaridade substancial de resíduos que poderiam sustentar epítopos de reação cruzada. Para fornecer uma métrica abrangente, calculou-se a similaridade de área de superfície (SAS) (Figura 4). Esses valores de SAS são substancialmente mais altos do que se poderia esperar de uma comparação com a porcentagem de identidade de sequência, sugerindo que a reatividade cruzada é de fato viável; veja a seção Discussão.

Uma explicação para o alto SAS pode ser que as VBP provêm de uma distribuição surpreendentemente limitada de aminoácidos. De fato, as proteínas de armazenamento de sementes geralmente contêm mais cadeias laterais contendo nitrogênio, refletindo seu papel na germinação. A Figura 5 representa a distribuição normal de aminoácidos em proteínas vegetais não membranares em comparação com os domínios vicilina e as sequências líder. Se compararmos o conteúdo de aminoácidos dos domínios vicilina de Ara h 1, Ana o 1, Jug r 2 e Pis v 3 com a distribuição normal, ambos os gráficos de pizza exibem uma grande variedade de aminoácidos (Figura 5A,B). Existem poucas alterações, talvez refletindo a natureza predominantemente folha β dos domínios vicilina. No entanto, observando a distribuição de aminoácidos nas sequências líder dos mesmos alérgenos, há claramente uma distribuição mais estreita de conteúdo, com 46% do conteúdo dominado por arginina, glutamina e glutamato, em comparação com 22% nas vicilinas e 16% nas proteínas vegetais não membranares. Finalmente, notamos que, nas VBP, os grandes aumentos em C, E, Q, K e R ocorrem às custas dos aminoácidos hidrofóbicos (L, I, F, W, V, M, A, G e P), que mostram diminuições na Figura 5D. Esses resíduos normalmente residem no núcleo de proteínas globulares "normais", fornecendo interações hidrofóbicas estabilizadoras. A falta desses resíduos nas VBP é consistente com nossas observações de que a redução das pontes dissulfeto leva ao desenovelamento das VBP. Essa distribuição incomum de aminoácidos, aliada às restrições estruturais do enovelamento das VBP, limita o espaço estrutural disponível para essas VBP, potencialmente contribuindo para a reatividade cruzada, apesar de sua baixa identidade de sequência.
Resistência Proteolítica de AO e PV VBP.
Estudos anteriores identificaram a resistência à clivagem proteolítica, particularmente a catepsina S, como um potencial determinante da alergenicidade entre as VBPs de amendoim e noz. Para determinar se a imunogenicidade dos equivalentes de castanha de caju e pistache segue uma tendência similar, todas as quatro VBPs foram submetidas à digestão simulada gástrica, duodenal e endossomal (Figura 6). Destas, apenas a AO1.1 apresentou resiliência significativa a todos os três modos de digestão. Deve-se notar que as outras sequências apresentaram resistência significativamente menor à digestão gástrica/duodenal mesmo quando comparadas com suas contrapartes de amendoim/noz (t1/2 > 100 minutos), potencialmente prevenindo a exposição significativa ao sistema imunológico.
DISCUSSÃO
Neste trabalho, fornecemos um estudo bioquímico abrangente das VBPs na família Anacardiaceae. A capacidade da IgE de reconhecer sequências de peptídeos de amendoim e de castanha de caju/pistache sugere que essas VBPs podem atuar tanto como um potente agente sensibilizante inicial em pacientes alérgicos a pistache/castanha de caju quanto mediar a ligação cruzada da IgE gerada contra VBPs de outras fontes alergênicas, como amendoim e outras nozes. Embora o status alérgico à noz dos pacientes empregados neste estudo não tenha sido avaliado, sua alta taxa de co-alergia com amendoim/outras nozes torna provável que a maioria dos pacientes testados tenha pelo menos alguma sensibilização a nozes. De fato, peptídeos da VBP de noz JR2.1 foram reconhecidos por todos os três grupos de pacientes (Figura 1A,B). Notavelmente, o padrão geral de reconhecimento de peptídeos espelha de perto os observados em estudos anteriores em pacientes alérgicos a amendoim/noz, apesar de serem derivados de uma coorte separada de pacientes com diferentes diagnósticos alérgicos. Em conjunto, esses estudos reforçam o papel das VBPs, particularmente a primeira VBP de nozes, castanhas de caju e pistaches, na mediação de possível reatividade cruzada entre amendoim e diferentes nozes. A estrutura molecular de todas as quatro VBPs revela um enovelamento em grampo α compartilhado com altos níveis de similaridade superficial com outras estruturas de VBP previamente relatadas. A arquitetura única mediada por dissulfeto dessas sequências de VBP permite que elas suportem um motivo estrutural conservado com epítopos de reação cruzada, mesmo na ausência de alta identidade de sequência, potencialmente contribuindo para sua reatividade cruzada.
Há uma literatura considerável sobre as propriedades biofísicas de alérgenos que podem se correlacionar com a sensibilização. Uma hipótese é que a estabilidade nos alérgenos alimentares confere resistência à digestão gastrointestinal, facilitando a apresentação do alérgeno ao sistema imunológico como proteína intacta com epítopos B nativos. A estabilidade também confere resistência à digestão endossomal. Isso reduz a taxa de apresentação de células T em moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), o que se correlaciona com o aumento da sensibilização Th2. Ambas as formas de estabilidade demonstraram desempenhar um papel no processo de sensibilização em várias famílias de alérgenos. Neste trabalho, o AO1.1 exibiu tanto a maior resistência à digestão gástrica quanto a maior prevalência de ligação a IgE. Em contraste, a digestão endossomal não pareceu se correlacionar com a ligação a IgE entre as VBPs testadas. Isso contrasta com estudos anteriores sobre as VBPs do amendoim e da noz, onde a taxa de digestão endossomal foi um melhor preditor de ligação a IgE. Embora o potencial de sensibilização e a alergenicidade não tenham sido diretamente avaliados neste trabalho, essas observações, juntamente com as relações de estabilidade descritas em outros lugares da literatura, sugerem que as VBPs do caju/pistache representam um agente sensibilizante independente, separado dos equivalentes do amendoim/noz, com diferentes determinantes de imunogenicidade. Isso poderia potencialmente resultar em diferenças sorológicas, que diferenciam pacientes alérgicos com base em seu agente sensibilizante inicial.

Prever a reatividade cruzada entre proteínas é um problema surpreendentemente difícil. Tipicamente, a reatividade cruzada seria suspeitada quando a identidade de sequência entre proteínas é maior que 70% e rara quando é menor que 50%. As diretrizes atuais da Organização Mundial da Saúde sugerem conservadoramente que identidade de sequência >35% deve ser testada para reatividade cruzada em novos produtos alimentícios. Comparando as VBPs de amendoim e nozes (Figura 4), a identidade de sequência está claramente abaixo mesmo deste limiar. Também comparamos as VBPs com o índice A-RISC de Chruszcz et al., que estima a reatividade cruzada entre alérgenos na mesma família proteica usando uma combinação de escores de similaridade e identidade. No entanto, também não sugeriu um alto risco de reatividade cruzada. Portanto, buscamos uma métrica diferente que pudesse incluir comparações estruturais.
Outras tentativas de usar propriedades de estrutura e área de superfície para prever reatividade cruzada incluem o algoritmo SPADE e a métrica de similaridade de área de superfície (SAS). No caso do SAS, existem algumas comparações calibradas com reatividade cruzada clínica. Por exemplo, Der p 1 e Der f 1 têm numerosos relatos de reatividade cruzada e medições de suas estruturas mostram pontuações SAS de 0,86. Os alérgenos de ciclofilina Mala s 6 e Cat r 1 foram sugeridos como sendo reativos cruzados, e a pontuação SAS foi de 0,75. Por outro lado, o alérgeno GST de barata (Bla g 5) não foi reativo cruzado com os alérgenos GST de ácaros (Der p 8 e Blo t 8), que tiveram pontuações SAS de 0,47 e 0,46, respectivamente. Portanto, as comparações SAS para os alérgenos VBP com peptídeos IgE dominantes (AH1.1, AO1.1, JR1.1, PV3.1), que variam de 0,57 a 0,61, devem ser consideradas como estando em uma área cinzenta onde testes adicionais são justificados. O fato de as pontuações serem tão altas é mais notável quando se considera que a maior parte da identidade de sequência é dominada pelos resíduos centrais de cisteína, que estão principalmente enterrados e não contribuem muito para a superfície acessível. Essas observações, juntamente com a prevalência quase universal do reconhecimento de peptídeos IgE independentemente do perfil de alergia do paciente e a natureza ubíqua das sequências VBP em muitas fontes alimentares, demonstram a necessidade de aumentar os testes de reatividade e reatividade cruzada de VBP ao avaliar alérgenos alimentares tanto para o diagnóstico do paciente quanto para estratégias de prevenção de alérgenos.

As descobertas estruturais e imunoquímicas apresentadas aqui sugerem que os VBPs são uma fonte importante de epítopos tanto reativos a IgE quanto de reatividade cruzada. No entanto, mais estudos são necessários para descobrir completamente as implicações clínicas dessas descobertas. Por exemplo, a reatividade cruzada de IgE em nível molecular pode não resultar em sintomas clínicos – um fenômeno talvez melhor ilustrado pelos determinantes de carboidratos de reação cruzada, que confundiram o diagnóstico de alergia a plantas por muitos anos. Também é possível que alguns pacientes sejam simplesmente co-alérgicos a diferentes fontes de alérgenos, e experimentos de competição podem ajudar a resolver essa questão. Finalmente, a ligação de IgE a alérgenos frequentemente não se correlaciona bem com os escores de sintomas em alergia alimentar. No entanto, está se tornando cada vez mais evidente que os VBPs de plantas representam uma espécie imunogênica importante que pode mediar tanto a sensibilização alérgica quanto a ligação cruzada de IgE em uma variedade de fontes alimentares comuns, incluindo amendoim e nozes. Trabalhos recentes identificando sequências reativas a IgE em VBPs de nozes macadâmia, gergelim e amêndoas enfatizam ainda mais seu potencial imunológico. Os dados estruturais e imunológicos apresentados neste trabalho sugerem que os VBPs de castanha-de-caju e pistache podem mediar tanto a alergia a castanha-de-caju/pistache quanto a reatividade cruzada com amendoim e outras nozes por meio de um motivo de hairpin conservado, com implicações tanto para o diagnóstico molecular quanto para estratégias de prevenção de alérgenos.
Material Suplementar
Informações de Apoio
As Informações de Apoio estão disponíveis gratuitamente em https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.2c07061.
Peptídeos de microarray de Ara h 1, Ana o 1, Jug r 2 e Pis v 3 (Tabela S1); informações da coorte de pacientes (Tabela S2); construções utilizadas para as estruturas destacando as regiões helicoidais em cinza e as ligações dissulfeto com linhas vermelhas (Figura S1); estruturas de RMN dos alérgenos VBP de caju (AO1.1, AO1.2) e pistache (PV3.1, PV3.2) (Figura S2); estrutura secundária determinada por RMN (Figura S3); e caracterização por RMN dos alérgenos VBP (Figura S4) (PDF)
Informações completas de contato estão disponíveis em: https://pubs.acs.org/10.1021/acs.jafc.2c07061
Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.
REFERÊNCIAS
Prevalência e distribuição da sensibilização a alimentos no Inquérito de Saúde Respiratória da Comunidade Europeia: uma análise EuroPrevall
Alergia Alimentar
Prevalência e características da alergia ao amendoim em adultos nos EUA
Os Resultados de Saúde e Econômicos das Práticas de Manejo da Alergia ao Amendoim
Uma atualização sobre o impacto da alergia alimentar na ansiedade e na qualidade de vida
Caracterização de alérgenos de baixo peso molecular da noz inglesa (Juglans regia)
Epítopos de Ligação a IgE de Pis v 1, Pis v 2 e Pis v 3, os Alérgenos da Semente de Pistache (Pistacia vera)
Estrutura, Imunogenicidade e Reatividade Cruzada de IgE entre Peptídeos Enterrados de Vicilina de Noz e Amendoim
Estratégia de Imunização Não Tendenciosa Produzindo Nanocorpos Específicos contra o Alérgeno de Macadâmia de Proteína Semelhante à Vicilina para Desenvolvimento de Imunoensaio
Um novo alérgeno semelhante à vicilina em avelã dando origem a um espectro de fragmentos N-terminais de baixo peso molecular que se ligam a IgE
Identificação do fragmento amino-terminal de Ara h 1 como um alvo principal da atividade de ligação a IgE na fração proteica básica do amendoim
Definindo o Dobramento Familiar da Família de Peptídeos Enterrados da Vicilina
Uma Família de Peptídeos Antiga Enterrada dentro de Precursores de Vicilina
A importância das albuminas 2S para alergenicidade e reatividade cruzada de amendoim, nozes e sementes de gergelim
Alérgeno de Amêndoa (Prunus dulcis) Pru du 8, o Primeiro Membro de uma Nova Família de Alérgenos Alimentares
Ana o 1, um alérgeno de caju (Anacardium occidentale) da família de proteínas de armazenamento de sementes vicilina
Reatividade Cruzada de IgE dos Alérgenos da Castanha de Caju
Avanços recentes no diagnóstico e manejo de alergias a nozes com foco em avelãs, nozes e castanhas de caju
Utilidade clínica do mapeamento de epitopos de células B em microarray em alergias alimentares: Uma revisão sistemática
Expressão e redobramento do alérgeno de ácaro pro-Der f1 a partir de corpos de inclusão em Escherichia coli
Recuperando magnetização perdida: aumento de polarização em RMN biomolecular
Espectroscopia de RMN acelerada usando sensoriamento comprimido
Dinâmica da cadeia principal do domínio RNase H da transcriptase reversa do HIV-1
TALOS+: um método híbrido para predizer ângulos de torção da cadeia principal de proteínas a partir de deslocamentos químicos de RMN
Avaliando estruturas de proteínas determinadas por consórcios de genômica estrutural
Combined automated NOE assignment and structure calculation with CYANA
PONDEROSA, um programa automatizado de picking de picos 3D-NOESY, permite a determinação automatizada da estrutura de proteínas
BeStSel: um servidor web para predição precisa de estrutura secundária de proteínas e reconhecimento de dobramento a partir de espectros de dicroísmo circular
Predição precisa de estrutura secundária e reconhecimento de dobramento para espectroscopia de dicroísmo circular
Um método padronizado de digestão in vitro estática adequado para alimentos - um consenso internacional
O método de digestão in vitro harmonizado INFOGEST: Do conhecimento à ação
Fiji: uma plataforma de código aberto para análise de imagens biológicas
Novos descritores quantitativos de aminoácidos baseados em escalonamento multidimensional de um grande número de propriedades físico-químicas
ConSurf: uma ferramenta algorítmica para a identificação de regiões funcionais em proteínas por mapeamento superficial de informações filogenéticas
Análise da reatividade cruzada de alérgenos de glutationa S-transferase em uma população norte-americana: Relevância para o diagnóstico molecular
Análise da Reatividade Cruzada de Alérgenos GST em uma População Norte-Americana para Diagnóstico Molecular
Distribuição da Frequência de Aminoácidos entre Proteínas Eucarióticas
As Propriedades Físico-Químicas Estão Moldando o Potencial Alergênico de Alérgenos Vegetais?
Abundância e Estabilidade como Propriedades Comuns de Alérgenos
A estabilidade do dobramento durante a acidificação endolisossomal é um fator chave para a alergenicidade e imunogenicidade do principal alérgeno do pólen de bétula
Múltiplos papéis dos ligantes de Bet v 1 na estabilização de alérgenos e modulação da atividade protease endossomal
Biologia estrutural de alérgenos
Um método robusto para a estimativa e visualização da probabilidade de reatividade cruzada de IgE entre alérgenos pertencentes à mesma família proteica
Predição de epítopos de ligação a IgE por meio de comparação de superfície de alérgenos e correlação com reatividade cruzada
Serviço web SPADE para predição de epítopos de IgE de alérgenos
Estruturas cristalinas dos alérgenos de ácaro Der f 1 e Der p 1 revelam diferenças em resíduos expostos na superfície que podem influenciar a ligação de anticorpos
Determinantes Antigênicos de Der p 1: Especificidade e Reatividade Cruzada Associadas ao Reconhecimento de Anticorpos IgE
Identificação primária, caracterização bioquímica e propriedades imunológicas do ciclofilina alergênica do pólen Cat r 1
Lidando com determinantes carboidratos de reação cruzada no diagnóstico de alergia
Alergia alimentar: Uma revisão e atualização sobre epidemiologia, patogênese, diagnóstico, prevenção e manejo
Identificação de vicilina, legumina e peptídeo antimicrobiano 2a como alérgenos da noz-macadâmia
Microarray analysis of IgE binding to the leader sequence of vicilin allergens Ara h 1, Ana o 1, Jug r 2, and Pis v 3. (A) IgE binding of individual patients against VBP peptides. Squares representing individual peptides examined in this work are arrayed along the x-axis. Peptides are color-coded by source organism. The identified VBP domains are represented in the boxes below. A table showing the full sequence of the individual peptides is shown in Table S1. Individual patients are arrayed on the y-axis and are grouped according to diagnoses: peanut monoallergic (PN), peanut and either cashew or pistachio (PN&CP), cashew or pistachio (CP). Patient data are in Table S2. Peptides that displayed significant IgE binding, defined as a microarray signal more than 3 standard deviations from the mean using a modified z-score for each patient, are highlighted. (B) Prevalence of IgE binding to each peptide by patient group in a heatmap colored from green (0%) to yellow (100%).

Secondary structure of VBP’s. (A) CD spectra of the VBP domains before and after treatment with TCEP. (B) Secondary structure prediction based on the CD spectra in (A).

Prevalence of IgE peptide binding mapped to VBP structures. VBP domains AH1.1 (7LXK), JR2.1 (7LVF), AO1.1 (7UV1), AO1.2 (7UV2), PV3.1 (7UV3), and PV3.2 (7UV4) were colored from 0% (green) to 100% (yellow) prevalence of IgE peptide binding similar to Figure 1B. A color scale was calculated for the central five residues of each 15 mer, weighted by 1/5 for each adjacent 15 mer, and normalized for the whole VBP from 0 to 1. Structures shown are ribbon diagrams with semitransparent surface rendering. N and C termini are annotated.

Surface similarity compared to sequence identity. (A) Surface rendering of various VBPs colored for residue similarity using PD scores to another VBP as indicated in the panel. The color scale is shown at the bottom where 0 is the least similar and 1 is identical. Gray coloring indicates residues that do not align between the two VBPs either due to structural distance or a sequence insertion. (B) Comparison of the sequence identity of six VBPs with the surface area similarity (SAS). SAS is a normalized score from 0 to 1 where the accessible surface area is weighted by the PD comparison of residues in similar positions.

Relative distributions of amino acids in plants and vicilins. (A) Plants, nonmembrane proteins. (B) Vicilin domains of Ara h 1, Ana o 1, Jug r 2, and Pis v 3. (C) Leader sequences of Ara h 1, Ana o 1, Jug r 2, and Pis v 3. (D) Bar graph showing the fold-change in the individual amino acid levels of the vicilins and leader sequences shown in (B) and (C) relative to the plant nonmembrane proteins (A).

Simulated endosomal, duodenal, and endosomal digestion of cashew and pistachio VBPs. T1/2 in minutes of the simulated digestion using pepsin, trypsin, and cathepsin S (CatS) respectively, as assessed from staining of SDS-PAGE gels for each of the indicated VBPs.