pmid: "37388457"
title: "O picolinato de cromo nano e o estresse térmico aumentam a sensibilidade à insulina em ovinos cruzados."
authors: "Hung AT, Leury BJ, Sabin MA, Fahri F, DiGiacomo K, Lien TF, Dunshea FR"
journal: "Animal nutrition (Zhongguo xu mu shou yi xue hui)"
pubdate: "2023 Jun"
doi: "10.1016/j.aninu.2023.01.003"
source: "PMC Full Text"

O picolinato de cromo nano e o estresse térmico aumentam a sensibilidade à insulina em ovinos cruzados.

Autores

Hung AT, Leury BJ, Sabin MA, Fahri F, DiGiacomo K, Lien TF, Dunshea FR

Periodico

Animal nutrition (Zhongguo xu mu shou yi xue hui) (2023 Jun)

Conteudo

Nano-picolinato de cromo e estresse térmico aumentam a sensibilidade à insulina em ovinos mestiços
Este estudo avaliou os efeitos do estresse térmico (ET) e da suplementação alimentar com nano picolinato de cromo (nCrPic) nas respostas metabólicas de ovinos a um teste de tolerância à glicose intravenosa (TTGIV), um teste de tolerância à insulina intravenosa (TTII) e um desafio com hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) intramuscular em ovinos. Trinta e seis ovinos alojados em gaiolas metabólicas foram distribuídos aleatoriamente em 3 grupos dietéticos (0, 400 e 800 μg/kg de nCrPic suplementar) em condições termoneutras (22 °C) ou de ET cíclico (22 a 40 °C) por 3 semanas. A glicose plasmática basal tendeu a aumentar durante o ET (P = 0,052) e diminuiu com o nCrPic dietético (P = 0,013), enquanto as concentrações plasmáticas de ácidos graxos não esterificados diminuíram (P = 0,010) com o ET. O nCrPic dietético reduziu a área sob a curva da glicose plasmática (P = 0,012), enquanto não houve efeitos significativos do ET sobre a área sob a curva da glicose plasmática em resposta ao TTGIV. A resposta plasmática de insulina nos primeiros 60 min após o TTGIV foi reduzida pelo ET (P = 0,013) e pelo nCrPic dietético (P = 0,022), com efeitos aditivos. Em resposta ao TTII, a glicose plasmática atingiu um nadir mais rapidamente (P = 0,005) em ovinos expostos ao ET, embora não tenha havido efeito sobre a profundidade do nadir. O nCrPic dietético diminuiu (P = 0,007) o nadir da glicose plasmática após o TTII. Durante a duração do TTII, as concentrações plasmáticas de insulina foram menores em ovinos expostos ao ET (P = 0,013), enquanto não houve efeito significativo da suplementação com nCrPic. Não houve efeito do ET ou do nCrPic na resposta do cortisol ao ACTH. A suplementação dietética com nCrPic diminuiu (P = 0,013) a expressão de mRNA da proteína quinase ativada por mitógeno-8 (JNK) e aumentou (P = 0,050) a expressão de mRNA da carnitina palmitoiltransferase 1B (CPT1B) no músculo esquelético. Os resultados deste experimento demonstraram que animais sob ET e suplementados com nCrPic apresentaram maior sensibilidade à insulina.
Introdução
Haverá uma demanda crescente por proteína animal de alta qualidade no futuro, à medida que a população mundial cresce e as pessoas nos países em desenvolvimento se tornam mais ricas. Os efeitos prejudiciais do estresse térmico ambiental (ET) na produção pecuária provavelmente aumentarão se o clima continuar a aquecer conforme previsto. O estresse térmico afeta vários aspectos da produtividade pecuária, incluindo produção de leite, crescimento, reprodução e características de carcaça. Portanto, a pecuária em áreas tropicais e subtropicais precisará se expandir para acompanhar o crescente apetite global por proteína animal de alta qualidade, e serão necessários meios para mitigar os efeitos do ET na produção.
Aclimatação é um mecanismo fisiológico desenvolvido pelo animal em resposta ao estresse ambiental. A aclimatação de um animal para se adaptar à alta temperatura ambiente resulta na redução da ingestão de alimentos e em alterações nos sinais hormonais que afetam os tecidos-alvo para reduzir a carga térmica. Concentrações plasmáticas de glicose mais baixas podem, às vezes, ocorrer em animais sob estresse térmico, mas essa redução não é inteiramente atribuível à diminuição da ingestão de alimentos em altas temperaturas ambientes. Essas alterações fisiológicas podem ser responsáveis por modificar o metabolismo energético e a função hepática quando os animais estão sob ET. Por exemplo, e descobriram que a disposição da glicose foi maior em vacas sob estresse térmico, e vacas sob estresse térmico tiveram uma resposta de insulina maior a um teste de tolerância à glicose, sugerindo maior sensibilidade à insulina. Esse aumento na sensibilidade à insulina indica uma utilização melhorada ou preferencial da glicose para reduzir a produção de calor metabólico. Além disso, a exposição ao calor pode melhorar a tolerância à glicose em ratos alimentados com dieta rica em gordura. Há evidências de que as proteínas de choque térmico (HSPs) podem reduzir a inflamação via proteína quinase ativada por mitógeno-8 (JNK) e o fator nuclear κB (NFκB). JNK e NFκB são quinases de estresse implicadas na resistência à insulina. Além disso, a HSP72 pode facilitar a oxidação de ácidos graxos, pois células musculares L6 sob tratamento térmico ativam a HSP72, resultando em aumento do consumo de oxigênio mitocondrial e da oxidação de ácidos graxos.
O cromo (Cr) é um mineral essencial que desempenha um papel regulador na ação da insulina e no metabolismo energético. Além de sua função metabólica, a insulina é um fator crucial no controle da peroxidação lipídica; assim, o Cr também pode exercer um efeito antioxidante. Além disso, a suplementação com Cr beneficia os animais de produção, especialmente quando estão sob estresse nutricional ou térmico, porque o Cr mobilizado das reservas corporais é excretado irreversivelmente na urina em animais estressados. Portanto, animais expostos a estressores como calor podem precisar de mais Cr para manter o metabolismo normal de carboidratos e lipídios. O Cr geralmente é mal absorvido pelos animais quando fornecido em formas inorgânicas ou mesmo em algumas orgânicas. O Cr em nanoescala, tanto na forma orgânica quanto inorgânica, é mais digestível do que as partículas de tamanho normal e, portanto, pode ser uma abordagem potencial para atender ao aumento da demanda por Cr durante o calor ou outro estresse.
A hipótese abordada neste experimento é que o picolinato de cromo nano dietético (nCrPic) pode melhorar a sensibilidade à insulina e aumentar a oxidação de ácidos graxos para reduzir a produção de calor em ovinos sob estresse por calor (HS). Para testar essa hipótese, foram utilizados um teste de tolerância à glicose intravenoso (IVGTT), um teste de tolerância à insulina intravenoso (ITT) e um desafio intramuscular com hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) para examinar as respostas metabólicas de ovinos sob HS. Além disso, a expressão gênica específica em glóbulos brancos (WBC), músculo esquelético e tecido adiposo também foi determinada para elucidar os mecanismos subjacentes do HS e do nCrPic na sensibilidade à insulina e na oxidação de ácidos graxos. Assim, este experimento investiga o efeito do nCrPic dietético nas respostas metabólicas de ovinos sob HS.
Materiais e métodos
Declaração de ética animal
Todos os procedimentos realizados neste experimento foram conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas no Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes e foram aprovados pelo comitê de ética animal da University of Melbourne, Science, Optometry & Vision Science and Land & Environment.
Animais e tratamentos experimentais
Trinta e seis ovelhas e carneiros castrados cruzados Merino × Poll de 9 meses de idade (peso vivo inicial = 42,5 ± 1,04 kg; média ± erro padrão) foram alojados em gaiolas metabólicas individuais em uma de 2 salas de controle climático mantidas em condições termoneutras (TN) (n = 18) ou de estresse por calor (HS) (n = 18). Os ovinos foram aclimatados nas salas de controle climático por 1 semana, seguidas por um período experimental de tratamento térmico de 3 semanas.
Ingredientes e composição nutricional das dietas experimentais (%, matéria seca).
Tabela 1
Item Conteúdo Ingredientes  Trigo 40,0  Millmix 24,9  Cevada 20,0  Farelo de canola 36% 2,93  Grãos de tremoço 33% 4,53  Água 1,09  Melaço 2,00  Sal 1,30  Calcário 2,13  Sulfato de cálcio 0,33  Cloreto de amônio 0,54  Tampão ruminal1 0,54  Premix para cordeiros 2,3 0,11  Lasalocida4 0,011  Total 100 Composição nutricional calculada5  EM, MJ/kg 12,3  Gordura 2,12  Proteína bruta 16,8  Cálcio 1,08  Fósforo total 0,52 Composição nutricional analisada6  Cr, μg/kg 780
Acid Buf (Feedworks Australia, Romsey, VIC, Austrália).
Alltech Lienert Australia, Roseworthy, SA, Austrália. Fornece os seguintes microminerais por quilograma de dieta: Se, 0,2 mg; Fe, 60; Mn, 25 mg; Zn, 50 mg; I, 0,2 mg; Cu, 25 mg.
Fornece as seguintes vitaminas por quilograma de dieta: vitamina A, 2,5 mg; vitamina D3, 1 mg; vitamina E, 30 mg; niacina, 10 mg; Ca-D-pantotenato, 5 mg; riboflavina, 2 mg; vitamina B12 (Cianocobalamina), 5 mg.
Bovatec 20% (Zoetis, Silverwater, NSW, Austrália).
Calculado a partir do pacote de formulação (Saltwater Feedmania, Armidale, NSW, Austrália).
Teor de cromo da dieta com alto teor de picolinato de cromo nano (nCrPic) formulado para ser 800 μg/kg.
Durante todo o experimento, as ovelhas receberam palha de cevada 100 g/ovelha por dia em conjunto com uma dieta peletizada basal de crescimento para ovinos (dieta à base de trigo e cevada contendo 11,3 MJ EM/kg e 15,5% PB) ou uma dieta basal suplementada com 400 ou 800 μg/kg de Cr como nCrPic (Tabela 1) fornecida à vontade.

As partículas de nCrPic foram preparadas de acordo com nosso estudo anterior. O pó de Cr nanonizado foi preparado na Hsin-fang Nanotech Co. Ltd. (Tainan) por moagem em um sistema de moagem criogênica a seco, utilizando uma placa de peneira de tamanho adequado para coletar o CrPic nanonizado. Nenhum solvente foi utilizado e a temperatura foi mantida abaixo de 40 °C durante o processo de moagem. A distribuição do tamanho das partículas foi determinada usando o método relatado por, com algumas modificações. Resumidamente, os pós de CrPic moídos (tamanho médio de partícula 310 ± 129 μm) foram vibrados em uma solução alcoólica, depositando os fragmentos ultrafinos em uma grade de cobre coberta por um filme fino de carbono (CF200–Cu, Electron Microscopy Science) na solução. As imagens de campo claro e escuro das amostras foram obtidas usando um microscópio eletrônico de transmissão de emissão de campo JEM-2100F (FE-TEM; JEOL Ltd, Tóquio, Japão) operando a 200 kV. As imagens foram então manipuladas pelo software “Digisscan Image Acquisition System” para obter os dados de área de cada partícula reconhecida. Esses dados foram então convertidos em dados de diâmetro de partícula. Um total de 40 dados de partículas reconhecidas selecionadas aleatoriamente foi utilizado para a distribuição do tamanho das partículas. O tamanho médio de partícula do nCrPic foi de 49,7 ± 12,37 nm (média ± DP).

A sala TN foi mantida a uma temperatura ambiente média de 22 °C e umidade relativa (UR) de 70% a 80% por 24 h durante todo o período experimental. As ovelhas na sala HS experimentaram temperaturas diárias cíclicas começando às 09:00, quando a temperatura foi aumentada (15 °C/h) até um máximo de 40 °C, onde permaneceu até as 17:00 antes de ser reduzida para 22 °C, onde foi mantida até as 09:00 do dia seguinte, e a UR foi de aproximadamente 50% durante o dia e 70% durante a noite. Ambas as salas foram mantidas sob um ciclo de 12 h de luz e 12 h de escuro. O acesso à ração e à água foi fornecido por cochos e baldes fixados na lateral da gaiola. A ração e a água estavam disponíveis à vontade, com reposição de ração às 09:00 e 17:00 de cada dia. O desaparecimento de ração e água foi registrado diariamente durante todo o período experimental. O índice de temperatura e umidade (ITU) foi calculado e registrado durante os períodos experimentais. O ITU foi calculado combinando temperatura e umidade relativa com a seguinte equação: ITU = T - (0,31 - 0,31UR) × (T - 14,4), onde T é a temperatura (°C) e UR é a umidade relativa (%). O ITU médio foi de 21,8 ± 0,83 e 36,7 ± 2,13 para as condições TN e HS, indicando ausência de HS e HS severa, respectivamente.

Testes de tolerância intravenosa à glicose e insulina e desafio com hormônio adrenocorticotrófico
Os animais foram submetidos ao IVGTT, ITT e um desafio intramuscular com ACTH nos dias 21, 22 e 23 dos tratamentos térmicos. Cateteres jugulares foram inseridos 2 h antes do IVGTT no dia 21. Resumidamente, a ovelha foi contida e uma pequena área do pescoço (sobre a veia jugular) foi tosquiada para remover a lã e limpa com etanol 70%. Um cateter (14 G × 3,25 polegadas, BD Angiocath; NSW, Austrália) foi inserido na veia e fixado. Uma extensão de cateter plástico de 22 cm com conexão Luer-lock foi conectada e o cateter foi lavado com 8 a 10 mL de solução salina heparinizada (50 UI/L) e selado com uma válvula sem agulha (Safesite, B. Braun). O local de inserção e o tubo do cateter foram então cobertos com uma bandagem coesiva de 10 cm.
Para o IVGTT, as concentrações basais de glicose, insulina e ácidos graxos não esterificados (NEFA) no sangue foram determinadas nos animais por meio da coleta de pequenas amostras (aproximadamente 5 mL), 3 vezes durante os 30 min antes da administração de glicose (−30, −15, −1 min) através do cateter jugular. No tempo 0, um bolus de glicose foi administrado por via intravenosa através do cateter a uma taxa de 0,4 g/kg de peso vivo usando uma solução de glicose 50% (dextrose) (#AHB0253; Baxter Healthcare, Toongabbie, NSW, Austrália). Amostras de sangue (5 mL) foram coletadas aos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 min após a administração de glicose. O cateter foi lavado com solução salina estéril e heparina (diluída para 10 UI/mL) entre as amostras.
Para o ITT, as concentrações basais de glicose, insulina e NEFA no sangue foram determinadas nos animais por meio da coleta de pequenas amostras (aproximadamente 5 mL), 3 vezes durante os 30 min antes da administração de insulina (−30, −15, −1 min) a partir do cateter jugular. A insulina (ActRapid Human Insulin 100 UI/mL; Novo Pharmaceuticals Pty Ltd., Baulkham Hill, NSW, Austrália) foi administrada por via intravenosa através do cateter a uma taxa de 0,125 UI/kg de peso vivo, seguida de 4 mL de solução salina. Amostras de sangue repetidas foram coletadas aos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 150, 180, 210, 240, 270 e 300 min após a administração de insulina. O cateter foi lavado com solução salina estéril e heparina (diluída para 10 UI/mL) entre as amostras.
Para o desafio de ACTH, foi administrada ACTH na dose de 2 μg de Synacthen/kg de peso vivo (Novartis, North Ryde NSW, Austrália). A ACTH foi aspirada em uma seringa de 1 mL e o volume restante da seringa foi preenchido com solução salina estéril para que o volume total injetado permanecesse igual para cada animal (aproximadamente 1 mL). A ACTH foi injetada por via intramuscular na garupa do animal com uma agulha 20G. Amostras de sangue foram coletadas através do cateter jugular em −30, −1, 30 e 60 min em relação à injeção. O cateter foi lavado com solução salina estéril e heparina (diluída a 10 UI/mL) entre as amostras. O Synacthen contém um polipeptídeo sintético, tetracosactrina, com os primeiros 25 aminoácidos na sequência iguais aos da ACTH endógena e, portanto, apresenta atividade e eficácia semelhantes às da ACTH purificada. A dose de ACTH foi escolhida com base em um estudo anterior que identificou a dose necessária para maximizar a resposta do cortisol.

As concentrações plasmáticas de insulina (Millipore Corporation, EUA) e cortisol (Diagnostica, Finlândia) foram determinadas por radioimunoensaio usando kits comerciais. As concentrações plasmáticas de glicose (Infinity, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e NEFA (Wako Chemicals, Kawagoe, Japão) foram quantificadas por procedimentos colorimétricos enzimáticos.

Biopsias de leucócitos e tecidos
No dia 24, amostras de sangue foram obtidas através do cateter jugular para isolar leucócitos antes das biópsias de músculo e gordura subcutânea. Animais estressados pelo calor foram amostrados após serem expostos a temperaturas elevadas por 2 h antes da coleta de amostras de sangue e tecido. Para as biópsias, as ovelhas foram colocadas sob anestesia geral usando 0,1 mg/kg de peso vivo de xilazina por injeção intramuscular como sedativo e relaxante muscular, administrado 10 min antes da anestesia, seguido por 5 mg/kg de peso vivo de cetamina por via intravenosa. O local da biópsia foi entre a 2ª e a 4ª vértebras lombares, a meio caminho entre a coluna vertebral e os processos transversos. Uma incisão de bisturi de 5 cm foi feita e aproximadamente 2 g de gordura subcutânea foram removidos com tesouras de dissecação. Cerca de 1 g de amostra de músculo foi extraído usando um punch de biópsia de 8 mm, e o local interno da biópsia foi fechado com sutura absorvível. As amostras de tecido foram imediatamente pesadas e colocadas em um tubo Eppendorf estéril etiquetado, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e depois armazenadas a −80 °C até análise posterior. O local externo foi fechado com suturas não absorvíveis, e o local foi coberto com pó antibiótico tópico. As suturas não absorvíveis foram removidas 2 semanas depois.
O RNA foi extraído de amostras de músculo esquelético, tecido adiposo subcutâneo e leucócitos. As amostras de tecido adiposo subcutâneo foram analisadas quanto à expressão de mRNA de adiponectina, leptina, TNF-α, proteína quinase serina/treonina (AKT), transportador de glicose 4 (GLUT4), HSP72, HSP90 e receptores ativados por proliferadores de peroxissoma-γ (PPARγ). As amostras de músculo esquelético foram analisadas quanto à expressão de mRNA de AKT, GLUT4, JNK, NFκB, carnitina palmitoiltransferase-1B (CPT1B), HSP72 e HSP90. As amostras de leucócitos foram analisadas quanto à expressão de mRNA de HSP72 e HSP90. O RNA extraído foi transcrito em DNA complementar (cDNA) usando o sistema SuperScript III First-Strand Synthesis para RT-PCR (Invitrogen, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Um Light Cycler 480 II (Roche Diagnostics) foi utilizado para a análise de Q-PCR. Cada mistura de reação de Q-PCR consistiu em 4 μL de SYBR Green 1 Master (Roche Diagnostics), 1 μL de primer direto, 1 μL de primer reverso, 1 μL de cDNA e 3 μL de água livre de RNase. O seguinte protocolo de ciclagem térmica foi seguido: 1 ciclo de pré-desnaturação (95 °C por 10 min), seguido por 40 ciclos de amplificação (95 °C por 10 s, 57 a 63 °C por 10 s (dependente do primer), 72 °C por 10 s), 1 ciclo de fusão (95 °C por 5 s, 65 °C por 1 min, 97 °C para análise contínua) e resfriamento (40 °C por 30 s). As alterações na expressão gênica foram calculadas como 2-△Ct, onde Ct representa o ciclo no qual o limiar de fluorescência é atingido e △Ct = Cttarget gene - Cthousekeeping gene, com β-actina e r18S utilizados como genes de referência. As características dos primers estão detalhadas na Tabela Suplementar S1.
Análise estatística
Relações entre glicose plasmática (A), insulina (B), razão insulina/glicose (C) e ácidos graxos não esterificados (NEFA) (D) e o tempo relativo à injeção de glicose (400 mg/kg PC) em ovinos sob condições termoneutras (TN) alimentados com dieta controle () ou suplementada com nanopicolinato de cromo (nCrPic) () e ovinos sob estresse térmico (ET) alimentados com dieta controle () ou suplementada com nCrPic (). O erro padrão da diferença para a interação entre temperatura (Temp), nCrPic na dieta (Cr) e tempo (T) é exibido em 240 min. Os insertos referem-se ao período entre 0 e 30 min. Os valores de P para os efeitos de temperatura Temp, T, Cr, Temp × T, Temp × Cr, T × Cr e Temp × T × Cr foram 0,081, < 0,001, < 0,001, 0,39, 0,44, < 0,001 e 0,65 para glicose; 0,004, < 0,001, 0,002, 0,002, 0,50, < 0,001 e < 0,001 para insulina; < 0,001, < 0,001, < 0,28, < 0,001, 0,48, < 0,001 e < 0,001 para a razão insulina/glicose; e 0,44, < 0,001, 0,61, 0,067, 0,93, 0,34 e 0,85 para NEFA, respectivamente.
Fig. 1
Relações entre (A) glicose, (B) insulina, (C) razão insulina/glicose e (D) ácidos graxos não esterificados (AGNE) no plasma e o tempo relativo à injeção de insulina (0,125 UI/kg PC) em ovinos em condições termoneutras (TN) alimentados com dieta controle () ou suplementada com nanopicolinato de cromo (nCrPic) () e ovinos sob estresse térmico (ET) alimentados com dieta controle () ou suplementada com nCrPic (). O erro padrão da diferença para a interação entre temperatura (Temp), dieta com nCrPic (Cr) e tempo (T) é apresentado em 300 min. Os inserts referem-se ao período entre 0 e 30 min. Os valores de P para os efeitos da temperatura Temp, T, Cr, Temp × T, Temp × Cr, T × Cr e Temp × T × Cr foram 0,11, < 0,001, < 0,001, 0,006, 0,62, 0,39 e 0,26 para glicose; 0,013, < 0,001, 0,41, 0,001, 0,71, 0,84 e 1,00 para insulina; 0,036, < 0,001, 0,20, 0,16, 0,83, 0,54 e 1,00 para a razão insulina/glicose; e 0,21, < 0,001, 0,80, 0,002, 0,65, 0,99 e 0,80 para AGNE, respectivamente.
Fig. 2

Para os desafios de IVGTT, ITT e ACTH, os dados de metabólitos e hormônios plasmáticos foram analisados pelo procedimento de máxima verossimilhança restrita (REML) adequado para medidas repetidas, com os contrastes principais sendo sexo (macho vs. fêmea), temperatura (TN vs. ET), tempo (−30 vs. −15, −1, … 300 min), Cr dietético (0 vs. 400 e 800 mg/kg de Cr como nCrPic) e dentro de Cr dietético (400 vs. 800 mg/kg de Cr como nCrPic) e suas interações, com a réplica como fator de bloqueio. Como não houve efeitos principais ou de interação do sexo, os dados foram agrupados entre os sexos. Além disso, não houve efeitos principais ou de interação dentro da dose de Cr, portanto os efeitos do Cr são apresentados como contrastes entre ovinos alimentados com 0 mg/kg de Cr suplementar e os dados agrupados de ovinos alimentados com 400 e 800 mg/kg de Cr nas Fig. 1, Fig. 2. As concentrações basais de metabólitos e hormônios plasmáticos e as respostas aos desafios de IVGTT, ITT e ACTH em termos de área sob a curva (AUC) de concentração × tempo, concentrações de pico e concentrações de nadir foram analisadas por ANOVA com os contrastes principais sendo sexo, temperatura, Cr dietético (0 vs. 400 e 800 mg/kg de Cr como nCrPic) e dentro de Cr dietético (400 vs. 800 mg/kg de Cr como nCrPic) e suas interações, com a réplica como fator de bloqueio. O mesmo modelo foi utilizado para analisar os dados de expressão gênica (como △Ct) e esses dados foram expressos em gráficos radares em relação a ovinos alojados em condições TN e alimentados com 0 mg/kg de Cr suplementar para tecido muscular e adiposo. Dentro de um tecido, os dados de expressão gênica também foram submetidos a uma ANOVA multivariada (MANOVA) para determinar se havia respostas generalizadas aos tratamentos dentro dos tecidos. Todos os dados foram analisados usando o pacote estatístico GenStat (GenStat release 18; VSN International Ltd., Hemel Hempstead, Reino Unido).

Resultados
A resposta produtiva e fisiológica ao HS e ao nCrPic suplementar foi relatada em outro lugar. Resumidamente, o HS diminuiu o consumo de ração (1.195 vs 1.035 g de matéria seca/d, P = 0,002) enquanto os ovinos sob HS tiveram um ganho diário reduzido (114 vs −55 g/d, P < 0,001). O nCrPic dietético aumentou tanto o CMSD (1.042 vs 1.152 g de matéria seca/d, P = 0,040) quanto o GPD (−24 vs 56 g/d, P = 0,05) sob ambas as condições TN e HS. A frequência respiratória e a temperatura retal foram aumentadas pelo HS e diminuídas pelo nCrPic dietético, com as respostas sendo maiores no período mais quente do dia, à tarde.
Concentrações basais de metabólitos e hormônios plasmáticos
Efeito do estresse térmico e do nano picolinato de cromo dietético sobre as concentrações basais plasmáticas de glicose, insulina, ácidos graxos não esterificados (AGNE) e cortisol e sobre a avaliação estimada do modelo homeostático de resistência à insulina (HOMA-IR) e o índice de sensibilidade à insulina quantitativo revisado (RQUICKI) em ovinos.1
Tabela 2
Item Termoneutra Estresse térmico e.p.d.2 Valor-P 0 Cr, μg/kg 400 Cr, μg/kg 800 Cr, μg/kg 0 Cr, μg/kg 400 Cr, μg/kg 800 Cr, μg/kg Temperatura 3 Cr4 Dentro de Cr5 Glicose, mmol/L 4.24 3.61 3.83 4.31 4.12 4.05 0.230 0.052 0.013 0.64 Insulina, mU/L 14.0 15.9 11.7 11.8 12.5 12.2 2.08 0.16 0.89 0.14 Insulina:glicose, mU/mmol 3.10 4.28 2.93 2.63 2.84 2.92 0.533 0.042 0.26 0.13 AGNE, mmol/L 0.356 0.334 0.384 0.269 0.311 0.283 0.0444 0.010 0.58 0.72 HOMA-IR 2.68 2.55 2.05 2.26 2.56 2.22 0.415 0.45 0.44 0.36 RQUICKI 0.401 0.408 0.413 0.431 0.429 0.431 0.0212 0.072 0.73 0.81 Cortisol,6 nmol/L 20.6 10.7 8.19 7.29 18.2 10.3 7.796 0.78 0.66 0.35
Os dados são agrupados entre os dias de desafio de glicose e insulina. Não houve interações entre temperatura e Cr, portanto os efeitos principais são apresentados, exceto onde indicados por sobrescrito e nota de rodapé.
Erro padrão da diferença para o efeito de temperatura × Cr.
Termoneutra vs estresse térmico (n = 18 vs 18).
Controle vs Cr (n = 12 vs 24).
400 vs 800 μg/kg Cr (n = 12 vs 12).
Interação temperatura × Cr (P = 0.067).
A glicose plasmática basal tendeu a aumentar durante o HS (3.89 vs 4.16 mmol/L, P = 0.052) e foi diminuída pelo nCrPic dietético (4.28 vs 3.90 mmol/L, P = 0.013) (Tabela 2). Não houve efeitos significativos do HS ou do nCrPic sobre a concentração plasmática basal de insulina. A relação entre insulina plasmática basal e glicose foi menor em ovinos expostos ao HS (3.44 vs 2.74 mU/mmol, P = 0.042) mas não foi alterada pelo nCrPic dietético (Tabela 2). Os AGNE plasmáticos basais diminuíram durante o HS (0.358 vs 0.288 mmol/L, P = 0.010) e não foram alterados pelo nCrPic dietético (Tabela 2). Não houve efeitos significativos do HS ou do nCrPic sobre o HOMA. O RQUICKI tendeu a aumentar com o HS (0.407 vs 0.430 mmol/L, P = 0.072) mas não foi alterado pelo nCrPic dietético. Não houve efeitos significativos do HS ou do nCrPic sobre a concentração plasmática basal de cortisol.
Teste de tolerância à glicose intravenosa
Efeito do estresse térmico e do picolinato de cromo nanométrico dietético sobre a glicose plasmática, insulina e área sob a curva (AUC) de ácidos graxos não esterificados (NEFA) em resposta a uma infusão de glicose em ovelhas termoneutras e com estresse térmico suplementadas com nCrPic dietético.
Tabela 3
Item Termoneutro Estresse térmico e.p.d.² Valor de P 0 Cr, μg/kg 400 Cr, μg/kg 800 Cr, μg/kg 0 Cr, μg/kg 400 Cr, μg/kg 800 Cr, μg/kg Temperatura ³ Cr⁴ Dentro de Cr⁵ Glicose  Pico, mmol/L 17,8 15,7 15,1 18,1 16,6 16,2 0,73 0,098 <0,001 0,44  AUC 0-30, mmol·min/L 258 225 224 253 234 206 14,7 0,62 <0,001 0,20  AUC 0-60, mmol·min/L 417 352 368 410 339 392 30,6 0,95 0,012 0,13 Insulina  AUC 0-30, mU·min/L 92,5 83,5 80,6 102 58,7 57,1 18,0 0,22 0,013 0,86  AUC 0-60, mU·min/L 217 171 185 178 127 127 31,4 0,012 0,022 0,75 NEFA  Nadir, mmol/L 0,061 0,058 0,084 0,054 0,069 0,059 0,0216 0,59 0,45 0,61  AUC 0-30, mmol·min/L −2,94 −3,70 −3,77 −1,82 −2,41 −1,82 1,15 0,038 0,44 0,76  AUC 0-60, mmol·min/L −11,2 −12,2 −13,4 −9,02 −9,55 −8,97 2,421 0,035 0,53 0,86
Não houve interações entre temperatura e Cr, portanto os efeitos principais são apresentados.
Erro padrão da diferença para o efeito da temperatura × Cr.
Termoneutro vs estresse térmico (n = 18 vs 18).
Controle vs Cr (n = 12 vs 24).
400 vs 800 μg/kg Cr (n = 12 vs 12).
A glicose plasmática aumentou rapidamente em resposta ao IVGTT antes de declinar exponencialmente e finalmente retornar à linha de base aos 180 minutos após a injeção (Fig. 1A). Durante a duração do IVGTT, a concentração de glicose plasmática tendeu a ser maior em ovelhas expostas ao HS (9,6 vs 10,1 mmol/L, P = 0,081) e foi menor em ovelhas alimentadas com nCrPic suplementar (10,5 vs 9,2 mmol/L, P < 0,001) (Fig. 1A). No entanto, houve uma interação entre tempo e Cr (P < 0,001) de modo que a menor glicose plasmática em ovelhas alimentadas com nCrPic suplementar foi mais pronunciada nos primeiros 30 minutos após o IVGTT (Fig. 1A). O pico na concentração de glicose plasmática tendeu a ser maior em ovelhas expostas ao HS (16,2 vs 17,0 mmol/L, P = 0,098) e foi reduzido pelo nCrPic dietético (18,0 vs 15,9 mmol/L, P < 0,001) (Tabela 3). Embora não tenha havido efeito do HS na AUC da glicose plasmática após o IVGTT, a AUC foi reduzida pelo nCrPic dietético durante os primeiros 30 minutos (255 vs 222 mmol·min/L, P < 0,001) e 60 minutos (414 vs 363 mmol·min/L, P = 0,012) após a injeção (Fig. 1A; Tabela 3).
A insulina plasmática aumentou rapidamente em resposta ao IVGTT, permanecendo elevada por pelo menos 1 h antes de retornar ao basal aproximadamente 180 min após a injeção (Fig. 1B). Ao longo da duração do IVGTT, as concentrações de insulina plasmática foram menores em ovinos expostos ao HS (27,7 vs 23,8 mU/L, P = 0,004) e foram menores em ovinos alimentados com nCrPic suplementar (28,1 vs 23,3 mU/L, P < 0,001), com os efeitos parecendo aditivos (Fig. 1B). Consequentemente, houve interações de 2 e 3 vias (temperatura × tempo, P = 0,002; Cr × tempo, P < 0,001; temperatura × Cr × tempo, P < 0,001) de modo que as concentrações de insulina plasmática atingiram pico mais baixo e retornaram ao basal mais cedo em ovinos alimentados com nCrPic suplementar e expostos ao HS, enquanto permaneceram elevadas por um período prolongado em ovinos consumindo a dieta controle e alojados em condições TN (Fig. 1B). A insulina plasmática foi mais pronunciada em ovinos alimentados com nCrPic suplementar durante os primeiros 30 min após o IVGTT (Fig. 1B). A AUC da insulina plasmática após o IVGTT foi diminuída pelo HS nos primeiros 60 min (191 vs 144 mU·min/L, P = 0,013) e pelo nCrPic dietético nos primeiros 30 min (97 vs 70 mU·min/L, P = 0,012) e 60 min (198 vs 153 mU·min/L, P = 0,022) pós-injeção e além (Fig. 1B; Tabela 3).
A razão insulina/glucose plasmática diminuiu rapidamente após o IVGTT antes de aumentar e eventualmente atingir um platô novamente, embora a natureza do platô tenha variado entre os tratamentos (Fig. 1C). A razão insulina/glucose plasmática foi menor para expostos ao HS (3,23 vs 2,56, P < 0,001) enquanto não houve efeito principal do nCrPic dietético. No entanto, houve interações de duas e três vias (P < 0,001) de modo que a razão insulina/glucose plasmática retornou a um basal mais baixo mais rapidamente em ovinos expostos ao HS (aproximadamente 60 min) em comparação com aqueles expostos a condições TN. De fato, a razão insulina/glucose permaneceu elevada por pelo menos 240 min após o IVGTT em ovinos alimentados com a dieta controle e expostos a condições TN, enquanto havia retornado ao basal aos 150 min em ovinos recebendo a dieta suplementada com nCrPic e alojados em condições TN (Fig. 1C).
Após um pico transitório, os NEFA plasmáticos diminuíram rapidamente em resposta ao IVGTT, atingindo um nadir entre 60 e 90 min antes de retornar gradualmente ao basal (Fig. 1D). Durante a duração do IVGTT, não houve efeitos principais do HS ou do picolinato de cromo nano dietético sobre as concentrações plasmáticas de NEFA. No entanto, houve uma indicação de uma interação temperatura × tempo (P = 0,067), provavelmente devido às concentrações basais mais altas de NEFA plasmático antes do IVGTT em ovinos mantidos em condições TN (Tabela 2 e Fig. 1D). Não houve efeito do HS nem do picolinato de cromo nano dietético sobre o nadir das concentrações plasmáticas de NEFA (Tabela 3). A magnitude da AUC plasmática de NEFA até 30 (−3,5 vs −2,0 mmol·min/L, P = 0,038) e 60 min (−12,3 vs −9,2 mmol·min/L, P = 0,035) após a injeção foi menor em ovinos expostos ao HS, provavelmente devido às menores concentrações basais de NEFA (Tabela 2 e Fig. 1D). Não houve efeito do picolinato de cromo nano dietético sobre a AUC após o IVGTT.

Teste de tolerância à insulina

Efeito do estresse térmico e do picolinato de cromo nano dietético sobre a área sob a curva (AUC) de glicose plasmática, insulina e ácidos graxos não esterificados (NEFA) em resposta a uma infusão de insulina em ovinos termoneutros e com estresse térmico suplementados com picolinato de cromo nano.¹

Tabela 4
Item Termoneutro Estresse térmico e.p.d.² Valor de P 0 Cr, μg/kg 400 Cr, μg/kg 800 Cr, μg/kg 0 Cr, μg/kg 400 Cr, μg/kg 800 Cr, μg/kg Temperatura 3 Cr⁴ Dentro do Cr⁵ Glicose Nadir, mmol/L 1,88 1,65 1,44 1,92 1,62 1,44 0,144 1,00 0,007 0,20 AUC 0-30, mmol·min/L −30,0 −28,1 −32,5 −27,6 −36,0 −30,8 4,79 0,65 0,30 0,91 AUC 0-60, mmol·min/L −91,7 −77,4 −90,9 −73,5 −86,5 −81,8 8,80 0,25 0,78 0,48 AUC 0-120, mmol·min/L⁶ −156 −134 −149 −107 −145 −127 16,2 0,048 0,48 0,91 Insulina Pico 444 402 387 381 400 346 43,5 0,17 0,28 0,28 AUC 0-30, mU·min/L 6606 5770 5860 5436 5523 5039 598,3 0,041 0,20 0,65 AUC 0-60, mU·min/L 8064 7133 7012 6632 6568 6193 685,1 0,025 0,15 0,61 AUC 0-120, mmol·min/L 8090 7035 7141 6783 6279 6581 684,0 0,029 0,10 0,68 NEFA Nadir, mmol/L 0,074 0,102 0,091 0,054 0,082 0,063 0,0206 0,051 0,092 0,30 AUC 0-30, mmol·min/L −3,05 −2,64 −3,44 −1,63 −2,13 −1,40 1,281 0,077 0,93 0,97 AUC 0-60, mmol·min/L 2,30 4,57 1,20 8,79 5,15 8,17 3,110 0,014 0,69 0,94 AUC 30-60, mmol·min/L 5,35 7,21 4,64 10,4 7,28 9,57 2,611 0,034 0,66 0,94

Não houve interações entre temperatura e Cr, portanto, os efeitos principais são apresentados.
Erro padrão da diferença para o efeito de temperatura × Cr.
Termoneutro vs estresse térmico (n = 18 vs 18).
Controle vs Cr (n = 12 vs 24).
400 vs 800 μg/kg de Cr (n = 12 vs 12).
Interação temperatura × Cr (P = 0,037).
As concentrações plasmáticas de glicose diminuíram rapidamente em resposta ao ITT, atingindo um nadir aproximadamente 30 min após a injeção, antes de retornar gradualmente ao basal (Fig. 2A). Durante a duração do ITT, não houve efeitos principais do ET sobre as concentrações plasmáticas de glicose, enquanto o nCrPic dietético diminuiu as concentrações plasmáticas de glicose (2,92 vs 2,62 mmol/L, P < 0,001) (Tabela 4 e Fig. 2A). No entanto, houve uma interação temperatura × tempo (P = 0,005), tal que a glicose plasmática levou menos tempo para atingir o nadir e começou a retornar ao basal mais cedo em ovinos mantidos sob condições de ET (Tabela 4 e Fig. 2A). Não houve efeito do ET sobre o nadir das concentrações plasmáticas de glicose, enquanto o nCrPic dietético diminuiu o nadir (1,90 vs 1,54 mmol/L, P = 0,007) (Tabela 4). Embora não tenham sido observados efeitos significativos do ET ou do nCrPic dietético sobre a AUC da glicose plasmática até 60 min após a injeção, a magnitude da AUC da glicose plasmática até 120 min foi menor naqueles ovinos expostos ao ET (−146 vs −126 mmol·min/L, P = 0,048). Isso é consistente com a interação temperatura × tempo mencionada anteriormente.

As concentrações plasmáticas de insulina aumentaram rapidamente em resposta ao ITT, antes de declinar exponencialmente e finalmente retornar ao basal aos 180 min após a injeção (Fig. 2B). Durante a duração do ITT, as concentrações plasmáticas de insulina foram menores em ovinos expostos ao ET (58,9 vs 52,1 mU/L, P = 0,013), enquanto não houve efeito significativo da suplementação com nCrPic (Fig. 2B). No entanto, houve uma interação entre tempo e temperatura (P < 0,001) tal que a menor insulina plasmática em ovinos expostos ao ET foi mais pronunciada nos primeiros 30 a 60 min após o ITT (Fig. 2B). Consequentemente, embora não tenha havido efeito significativo do ET sobre as concentrações máximas de insulina, a AUC da insulina plasmática até 30 (6.078 vs 5.333 mU min/L, P = 0,041), 60 (7.403 vs 6.464 mU min/L, P = 0,025) e 120 min (7.422 vs 6.548 mU min/L, P = 0,029) foram menores nos ovinos expostos ao ET (Tabela 4). Não houve efeito do nCrPic dietético sobre o pico de insulina ou sobre a AUC da insulina plasmática até 60 min após a injeção, embora a AUC da insulina plasmática até 120 min do ITT tenha tendido a ser diminuída pelo nCrPic dietético (7.437 vs 6.759 mU·min/L, P = 0,10).

A razão entre insulina plasmática e glicose aumentou rapidamente após o ITT, antes de diminuir e eventualmente retornar ao basal novamente após aproximadamente 90 min (Fig. 1C). A razão entre insulina plasmática e glicose foi menor para os expostos ao ET (24,8 vs 21,6 mU/mmol, P = 0,036), enquanto não houve efeito principal do nCrPic dietético e não houve quaisquer outras interações.
Para NEFA plasmático, houve o característico efeito antilipolítico rápido do ITT seguido por um rebote igualmente rápido e sustentado nas concentrações plasmáticas de NEFA (Fig. 2 D). Durante a duração do ITT, não houve efeitos principais do HS ou do nCrPic dietético nas concentrações plasmáticas de NEFA. No entanto, houve uma interação temperatura × Cr (P = 0,002) de modo que as concentrações plasmáticas de NEFA começaram mais baixas e retornaram a uma linha de base mais baixa mais cedo em ovinos expostos ao HS (Fig. 2D). O nadir do NEFA plasmático ocorreu 20 a 30 min após a injeção e tendeu a ser diminuído pelo HS (0,089 vs 0,066 mmol/L, P = 0,051) e aumentado pelo nCrPic (0,064 vs 0,085 mmol/L, P = 0,092) (Tabela 4). A magnitude da AUC do NEFA plasmático até 30 min tendeu a ser menor em ovinos sob HS (−3,04 vs −1,72 mmol·min/L, P = 0,077) enquanto a AUC até 60 min (2,69 vs 7,37 mmol·min/L, P = 0,014) e entre 30 e 60 min (5,73 vs 9,08 mmol·min/L, P = 0,034) foram maiores nesses ovinos (Tabela 4). Não houve efeitos do nCrPic dietético sobre a AUC do NEFA plasmático.

Desafio da ACTH
As concentrações plasmáticas de cortisol foram elevadas quase 10 vezes aos 30 min após a injeção de ACTH, com um pequeno aumento adicional entre 30 e 60 min (10,9 vs 105 e 118 nmol/L aos 0, 30 e 60 min, P < 0,001; Fig. Suplementar S1), como esperado. Não houve efeitos principais ou de interação significativos do HS ou do nCrPic dietético sobre a resposta do cortisol plasmático à ACTH.

Expressão gênica
A expressão de mRNA de proteína quinase B (AKT), carnitina palmitoiltransferase 1B (CPT1B), transportador de glicose 4 (GLUT4), proteína de choque térmico 72 (HSP72), HSP90, proteína quinase ativada por mitógeno-8 (JNK1) e fator nuclear-κ B (NFκB) em tecido muscular esquelético de ovinos alojados sob condições termoneutras (TN) ou estresse térmico (HS) e suplementados com 0, 400 ou 800 μg/kg de picolinato de cromo nano (nCrPic) (0, 400 ou 800). Todos os dados de expressão gênica foram analisados como o ciclo limiar (Ct) em relação ao da β-actina e 18s (ΔCt) e avaliados quanto aos efeitos principais e de interação da temperatura (Temp), nCrPic (Cr) e dentro de Cr por máxima verossimilhança restrita (REML). Uma diferença no ΔCt de −1,0 está associada a uma duplicação (200%) e +1,0 a uma redução pela metade (50%) da expressão e, para facilidade de apresentação, os dados são apresentados como porcentagem em relação à expressão em tecido de marrãs alimentadas com a dieta controle sem gordura suplementar ou nCrPic. Este método de apresentação impede a apresentação do termo de erro. Os valores-P resultantes de uma MANOVA de todos os genes para os efeitos de Temp, Cr, Temp × Cr, dentro de Cr e Temp × dentro de Cr foram 0,010, < 0,001, 0,43, 0,22 e 0,040.
Fig. 3
A suplementação dietética com nCrPic diminuiu significativamente a expressão do gene JNK no músculo esquelético (94% vs 54% de expressão relativa, P = 0,013) (Fig. 3). Além disso, a expressão do gene CPT1B foi aumentada de forma dependente da dose, conforme indicado por efeito significativo de Cr (P = 0,050) e uma tendência dentro de Cr (P = 0,094) nos tratamentos (108% vs 124% e 168% de expressão relativa para 0, 400 e 800 μg/kg de nCrPic, respectivamente). Embora não tenham sido observados efeitos principais ou de interação significativos da temperatura ou Cr sobre a expressão gênica de HSP72, HSP90, AKT, GLUT4 e NFκB no músculo esquelético, a MANOVA indicou claramente alterações gerais no padrão de expressão gênica, conforme indicado por efeitos significativos de HS (P = 0,010) e Cr (P < 0,001) (Fig. 3).

Expressão de mRNA de proteína quinase B (AKT), adiponectina, transportador de glicose 4 (GLUT4), proteína de choque térmico 72 (HSP72), HSP90, leptina, receptor ativado por proliferador de peroxissomo γ (PPARγ) e fator de necrose tumoral α (TNFα) no tecido adiposo subcutâneo de ovinos alojados sob condições termoneutras (TN) ou de estresse térmico (HS) e suplementados com 0, 400 ou 800 μg/kg de nano picolinato de cromo (nCrPic) (0, 400 ou 800). Todos os dados de expressão gênica foram analisados como o ciclo limiar (Ct) em relação ao da β-actina e r18s (ΔCt) e avaliados quanto aos efeitos principais e de interação da temperatura (Temp), nCrPic (Cr) e dentro de Cr por máxima verossimilhança restrita (REML). Uma diferença no ΔCt de −1,0 está associada a uma duplicação (200%) e +1,0 a uma redução pela metade (50%) da expressão e, para facilidade de apresentação, os dados são apresentados como % em relação à expressão no tecido de marrãs alimentadas com a dieta controle sem gordura ou nCrPic suplementares. Este método de apresentação impede a apresentação do termo de erro. Os valores de P resultantes de uma MANOVA de todos os genes para os efeitos de Temp, Cr, Temp × Cr, dentro de Cr e Temp × dentro de Cr foram 0,003, < 0,001, 0,61, 0,020 e 0,026.

Fig. 4

O estresse térmico reduziu a expressão de HSP90 no tecido adiposo (74% vs 25% de expressão relativa, P = 0,013) enquanto a expressão de HSP90 foi reduzida (P = 0,017) na dose mais alta, mas não na mais baixa de nCrPic (64% vs 70% e 16% de expressão relativa) (Fig. 4). A suplementação dietética com nCrPic aumentou significativamente a expressão gênica de GLUT4 (95% vs 158% de expressão relativa, P = 0,027) e tendeu a reduzir a de AKT (95% vs 132% de expressão relativa, P = 0,081) no tecido adiposo (Fig. 4). Embora não tenham sido observados efeitos principais ou de interação significativos da temperatura ou Cr sobre a expressão de mRNA de HSP72, leptina, PPARγ e TNFα no tecido adiposo, a MANOVA sugeriu alterações gerais no padrão de expressão gênica, conforme indicado por efeitos significativos de HS (P = 0,003), Cr (P < 0,001) e dentro de Cr (P = 0,020) (Fig. 4).

Não houve efeitos principais ou de interação da temperatura ou do nCrPic dietético em leucócitos (Tabela Suplementar S2).

Discussão
Os principais achados deste estudo foram que ovinos alimentados com a dieta nCrPic e expostos ao HS apresentaram aumento da sensibilidade à insulina. A suplementação dietética com nCrPic diminuiu as concentrações basais de glicose, a resposta plasmática da glicose ao IVGTT, o nadir da glicose plasmática e a resposta da insulina ao ITT, todos indicativos de aumento da sensibilidade à insulina. No entanto, não houve efeitos da suplementação dietética com nCrPic em nenhum aspecto do metabolismo dos NEFA. Essas observações são consistentes com a maioria dos estudos anteriores. Por exemplo, foi relatado que a suplementação dietética com Cr diminui a resposta da glicose ao IVGTT em ovinos e aumenta a taxa de clearance de glicose em bezerros. Foi relatado que a suplementação com CrPic aumentou a taxa de clearance de glicose e diminuiu a meia-vida da glicose em suínos durante um IVGTT. Também foi indicado que a suplementação com nCrPic diminuiu o HOMA e aumentou o QUICKI, melhorando assim a sensibilidade à insulina e reduzindo a resistência à insulina em suínos. Esses achados foram apoiados por melhorias em alguns dos genes envolvidos na sinalização da insulina no músculo esquelético e no tecido adiposo de suínos suplementados com nCrPic. Por outro lado, foi relatado que não houve efeito da levedura de Cr na sensibilidade à insulina em ovinos, sugerindo que alguns outros fatores também podem afetar a função do Cr no metabolismo da glicose. Foi indicado que a função do Cr é mais propensa a provocar uma resposta maior quando os animais são submetidos a estresse.

As altas temperaturas ambientes aumentaram as concentrações basais de glicose plasmática e o RQUICKI e reduziram as concentrações plasmáticas de NEFA e a razão entre insulina plasmática e glicose, sendo essas últimas três medidas indicativas de melhora na sensibilidade à insulina. Além disso, a resposta da insulina plasmática ao IVGTT foi reduzida em ovinos expostos ao HS, o que novamente indica melhora na sensibilidade à insulina. Sob estresse por alta temperatura ambiente, melhorias semelhantes na sensibilidade à insulina foram encontradas em vacas no início da lactação, vacas no periparto, bezerros pós-desmame, suínos e frangos de corte suplementados com Cr. No presente estudo, a resposta da insulina plasmática à infusão de glicose foi menor em ovinos alimentados com nCrPic e naqueles ovinos expostos ao HS. Esses efeitos foram aditivos, sugerindo que os efeitos do nCrPic na sensibilidade à insulina são mais pronunciados em ovinos expostos ao HS.
Uma das alterações endócrinas mais consistentes durante o HS em ovinos é o aumento das concentrações plasmáticas de prolactina. Já se passaram mais de 40 anos desde que foram propostos possíveis papéis para a somatotropina e a prolactina como reguladores homeorréticos dos sinais homeostáticos que controlam o metabolismo lipídico. Atualmente, está bem estabelecido que a somatotropina induz resistência à insulina e estimula a responsividade às catecolaminas, enquanto os dados para a prolactina são mais ambíguos. Propuseram que a prolactina inibia a mobilização de gordura em vacas leiteiras lactantes com base em uma relação inversa entre as concentrações plasmáticas de NEFA e prolactina. Por outro lado, com base em estudos em ratos, propuseram que a prolactina inibia as vias lipogênicas no tecido adiposo e no fígado. Em apoio a um papel da prolactina como regulador homeorrético de um sinal homeostático como a insulina, descobriu-se que a concentração plasmática de prolactina estava positivamente relacionada à sensibilidade à insulina, embora houvesse diferenças relacionadas à idade nessa relação. É interessante especular que o aumento na sensibilidade à insulina observado durante o HS possa ser mediado pelo aumento das concentrações de prolactina.
A manutenção da homeostase da glicose plasmática é um processo complexo que envolve vários genes. Uma resposta coordenada adequada nos genes envolvidos na via de sinalização da insulina é crucial para a manutenção da sensibilidade à insulina. Normalmente, a insulina se liga ao receptor de insulina (RI) no sarcolema da célula, resultando em um aumento na atividade da tirosina quinase do RI e na fosforilação dos substratos do receptor de insulina (IRS). O substrato do receptor de insulina 1 (IRS1) fosforilado em tirosina recruta e ativa a fosfatidilinositol 3 quinase (PI3K) e aumenta a fosforilação em serina da AKT a jusante. A AKT fosforilada facilita a translocação e o recrutamento de vesículas GLUT4 para o sarcolema e, consequentemente, medeia a captação celular de glicose. A fosforilação do IRS1 em um resíduo de serina, em vez de tirosina, é um alvo inibitório emergente para a sinalização prejudicada da insulina. A fosforilação do resíduo de serina inibe a fosforilação em tirosina estimulada pela insulina e a ativação do IRS1. No presente estudo, o nCrPic dietético aumentou a expressão de mRNA dos genes da via de sinalização da insulina AKT e GLUT4 no tecido adiposo, mas não no músculo esquelético. Esses dados são consistentes com um aumento na sensibilidade à insulina no tecido adiposo. Além disso, a expressão de mRNA de JNK no músculo esquelético foi regulada negativamente e a expressão de mRNA de CPT1B foi regulada positivamente pela suplementação dietética com nCrPic. Isso indicou que a melhora da sinalização da insulina pelo Cr foi associada à diminuição da fosforilação de IRS1-Ser307 e da atividade de JNK. Acredita-se que a JNK cause resistência à insulina ao provocar a fosforilação do IRS1 no resíduo de serina. Os resultados do teste de tolerância à glicose não foram consistentes com a expressão gênica, possivelmente porque o nível de mRNA pode não refletir a fosforilação da proteína AKT e a translocação da proteína GLUT4 devido à redução da JNK causando fosforilação do resíduo de serina do IRS1. Mais trabalhos são necessários para compreender melhor a expressão da sinalização da insulina em nível proteico.
indicaram que um meio pelo qual o Cr regula a ação da insulina pode ser através da alteração da secreção de cortisol, já que a secreção de cortisol aumenta durante o estresse e pode atuar como antagonista da insulina. Neste modelo, o cortisol aumentou as concentrações de glicose plasmática através da redução da utilização de glicose pelos tecidos periféricos, induzindo resistência à insulina. Uma redução no cortisol plasmático é uma das respostas metabólicas típicas à suplementação de Cr em animais de produção, especialmente quando os animais estão sob estresse. Curiosamente, neste estudo, a concentração basal de cortisol antes do ACTH e a concentração de cortisol após a infusão de ACTH não foram alteradas nem pelo nCrPic dietético nem pelo tratamento térmico. também relataram que a suplementação de Cr não teve efeitos sobre as concentrações plasmáticas de cortisol durante alta temperatura ambiente em comparação com porcos em condição termoneutra. relataram que o HS não teve efeito sobre o cortisol plasmático em ovinos, enquanto os antioxidantes dietéticos tenderam a diminuir as concentrações de cortisol plasmático. Por outro lado, descobriram que o cortisol tendeu a aumentar durante 2 semanas de HS, mas não foi afetado pelos antioxidantes dietéticos. No presente estudo, as concentrações de cortisol plasmático em jejum não foram afetadas pelo tratamento térmico. relataram que a secreção de cortisol em cordeiros aumentou por 6 h em resposta ao HS (35 °C), retornando ao basal dentro de 12 h. Essa descoberta sugere que o efeito do HS na secreção de cortisol pode ser agudo, e não crônico.
Antes do IVGTT e ITT, as ovelhas do grupo HS apresentaram NEFA plasmático mais baixo em comparação com as ovelhas do grupo TN. O NEFA plasmático geralmente é mais baixo sob condições quentes. indicaram que o HS reduz as taxas lipolíticas in vivo, conforme evidenciado pela atividade da enzima lipolítica in vitro em ratos. Além disso, o HS aumenta a lipoproteína lipase no tecido adiposo, indicando que o animal estressado pelo calor tem uma capacidade aumentada de liberar ácidos graxos dos triglicerídeos circulantes para armazenamento no tecido adiposo. Estudos anteriores relataram que o HS pode resultar em uma dissociação da relação entre balanço energético e mobilização de gordura do tecido adiposo. Animais de produção geralmente entram em balanço energético negativo quando não conseguem consumir nutrientes suficientes para atender às necessidades de manutenção, crescimento, produção de leite, lã e ovos. O balanço energético negativo está associado a uma variedade de alterações metabólicas. As concentrações de NEFA circulante estão positivamente associadas à gravidade do balanço energético negativo, e é geralmente aceito que existe uma relação linear entre a liberação de NEFA, a captação de NEFA pelos tecidos e a oxidação de NEFA. As concentrações plasmáticas de NEFA geralmente aumentam durante o balanço energético negativo, mas parece haver um desacoplamento dessa relação durante o HS. No presente estudo, houve uma diminuição do NEFA durante o HS, apesar de uma diminuição na ingestão de alimentos, consistente com um desacoplamento.
relataram que a terapia térmica pode melhorar a sensibilidade à insulina em humanos. Além disso, o estresse térmico (ET) pode melhorar biomarcadores de sensibilidade à insulina em ratos diabéticos e ratos alimentados com dieta rica em gordura. O aumento da sensibilidade à insulina pode ser um componente essencial do mecanismo de aclimatação ao ET. Por exemplo, indivíduos resistentes à insulina, como humanos diabéticos, são mais suscetíveis a doenças e morte relacionadas ao calor. O aumento da sensibilidade à insulina pode estar associado a uma redução na produção de calor metabólico, implicando que a manutenção da sensibilidade à insulina desempenha um papel crítico na função termorreguladora, especialmente quando os animais estão sob ET. Portanto, manter a homeostase da glicose é uma abordagem possível para melhorar a adaptação ao ET.

O aumento da sensibilidade à insulina garantiria que as ovelhas reduzissem a mobilização lipídica do tecido adiposo e o uso de ácidos graxos não esterificados (NEFA) como substrato energético preferido, apesar de uma redução na ingestão de alimento durante o ET. Em vez disso, a glicose se tornaria o substrato energético preferido para os tecidos periféricos. O ET causa uma redução na pCO2 sanguínea e um aumento na pO2 sanguínea, resultando em uma diminuição do excesso de base e aumento do pH sanguíneo em ovelhas (Gonzalez-Rivas et al., 2017). Essas mudanças nos parâmetros gasométricos são muito provavelmente resultado do aumento da frequência respiratória durante o ET, como foi o caso no presente estudo. O uso de lipídios como substrato metabólico durante o ET resultaria em um baixo quociente respiratório e, portanto, diminuiria ainda mais o excesso de base sanguíneo, resultando em alcalose respiratória. Um aumento na sensibilidade à insulina sem alteração na insulina circulante, conforme observado aqui, inibiria a lipólise e a mobilização de gordura, ao mesmo tempo que garantiria a gliconeogênese hepática, uma vez que a dose efetiva para inibir as concentrações plasmáticas de NEFA está dentro da faixa fisiológica e é menor do que aquela que inibe a gliconeogênese.
Outra explicação possível, mas menos provável, para as concentrações plasmáticas mais baixas de NEFA durante o ET é o aumento da oxidação de ácidos graxos. A CPT1B é uma enzima importante para a oxidação mitocondrial de ácidos graxos, regulando a translocação interna de NEFA e sendo limitante para a β-oxidação de NEFA dentro das mitocôndrias. No entanto, o ET não teve efeito principal na expressão do mRNA da CPT1B, enquanto a suplementação dietética de nCrPic aumentou a expressão do mRNA da CPT1B de maneira dose-dependente. Além disso, conforme observado acima, um aumento na oxidação de NEFA agravaria ainda mais o impacto do ET na alcalose respiratória.
A exposição de animais a altas temperaturas ambientais desencadeia várias vias de sinalização, algumas das quais facilitam a sobrevivência celular e outras iniciam a morte celular. O resultado para os animais sob estresse térmico (HS) pode ser o desenvolvimento de um estado de tolerância à alta temperatura ambiente e outros estresses por meio de vias de sobrevivência, ou morte celular por meio de vias de morte. As vias de sobrevivência ativadas por HSPs, como HSP72 e HSP90, são mediadas por fatores de transcrição do choque térmico (HSFs). Indicou-se que o HS pode ativar as vias AKT (sobrevivência celular) ou JNK (morte celular), e as HSPs são o regulador chave para controlar a direção para a via de sobrevivência ou morte celular. Vários estudos in vitro e in vivo demonstraram que a HSP72 pode inibir a JNK, e um nível mais baixo de HSP72 resulta na ativação da JNK. Por sua vez, a atividade das HSPs é regulada pela AKT por meio da inibição da glicogênio sintase quinase-3β (GSK3β), um regulador negativo do HSF1. A inibição da GSK3β significa aumento da glicogênese, o que pode ajudar a manter a homeostase normal da glicose. Esses dados implicam que a melhora na sinalização da insulina está associada à apoptose celular quando os animais estão sob HS. Descobriu-se que o HS aumentou a expressão de HSP70 e JNK no músculo esquelético. No presente estudo, a expressão do mRNA de JNK foi reduzida pela suplementação dietética de nCrPic. Além disso, o nCrPic também foi capaz de manter a homeostase da glicose, conforme evidenciado pelos resultados do desafio com glicose, que mostraram que as ovelhas alimentadas com dieta contendo nCrPic apresentaram menor AUC de glicose. Além disso, nosso estudo anterior mostrou que a suplementação dietética de nCrPic pode diminuir a temperatura retal e aumentar o consumo de ração em ovelhas sob o mesmo regime de temperatura do presente estudo. Em conjunto, esses dados sugerem que a suplementação dietética de nCrPic atenuou as respostas fisiológicas negativas em ovelhas sob HS ao diminuir a expressão de JNK no músculo esquelético e, consequentemente, prevenir a apoptose celular. Curiosamente, a suplementação dietética de nCrPic e o HS não tiveram efeito na expressão gênica de HSP72 e HSP90 nos glóbulos brancos e no músculo esquelético, embora o HS e altas doses de nCRPic tenham diminuído a HSP90 no tecido adiposo. A ausência de uma resposta consistente na expressão gênica tecidual ao HS ou à suplementação dietética de nCrPic também pode ser devida ao fato de que as amostras de tecido foram coletadas apenas em um único ponto temporal durante este experimento e, portanto, não foi possível examinar as alterações temporais na expressão gênica em resposta ao HS ou ao nCrPic. Isso é particularmente importante se a resposta fosse de natureza transitória. Além disso, os mecanismos metabólicos envolvem vários sistemas de retroalimentação que podem regular e alterar a expressão gênica.

Conclusão
Os resultados deste experimento demonstraram claramente que as ovelhas sob HS apresentaram maior sensibilidade à insulina. Além disso, a suplementação dietética de nCrPic também mostrou melhora na sensibilidade à insulina. A melhora na sensibilidade à insulina pode ser devida à redução da expressão do mRNA de JNK no músculo esquelético e, portanto, à prevenção da progressão das células em direção à via de apoptose quando os animais estão sob HS.
Alex T. Hung: Conceituação, Investigação, Metodologia, Coleta de dados, Curadoria de dados, Análise formal, Redação – Rascunho original. Brian J. Leury: Conceituação, Redação – Revisão e Edição, Supervisão. Matthew A. Sabin: Conceituação, Redação – Revisão e Edição, Supervisão. Fahri Fahri: Investigação, Coleta de dados. Kristy DiGiacomo: Investigação, Coleta de dados, Redação – Revisão e Edição. Tu-Fa Lien: Conceituação, Recursos, Redação – Revisão e Edição. Frank R. Dunshea: Conceituação, Recursos, Análise formal, Curadoria de dados, Redação – Revisão e Edição, Supervisão.
Declaração de interesses concorrentes
Declaramos que não temos relações financeiras e pessoais com outras pessoas ou organizações que possam influenciar inadequadamente nosso trabalho, e não há nenhum interesse profissional ou pessoal de qualquer natureza ou tipo em qualquer produto, serviço e/ou empresa que possa ser interpretado como influenciando o conteúdo deste artigo.
Referências
Fosforilação da Ser307 no substrato do receptor de insulina-1 bloqueia interações com o receptor de insulina e inibe a ação da insulina
Efeito do tripicolinato de cromo no crescimento, tolerância à glicose, sensibilidade à insulina, metabólitos plasmáticos e hormônio do crescimento em suínos
Efeitos benéficos do cromo nas variáveis de glicose e lipídios em controle e
Cromo e polifenóis da canela melhoram a sensibilidade à insulina
Regulação do turnover de ácidos graxos livres plasmáticos
Partição de nutrientes durante a gestação e lactação: uma revisão dos mecanismos envolvendo homeostase e homeorrese
Produção de ruminantes e respostas metabólicas ao estresse térmico
Metabolismo em jejum de ovinos adultos
Técnicas em estudos de metabolismo energético e suas limitações
Utilização de nutrientes e turnover de proteínas no membro posterior de bovinos tratados com somatotropina bovina
Interações imune-endócrinas em espécies agrícolas: cromo e seu efeito na saúde e desempenho
Influência do picolinato de cromo no uso de glicose e critérios metabólicos em bezerros Holandeses em crescimento
Cromo suplementar para bezerros de engorda estressados e em crescimento
Antioxidantes dietéticos em doses supranutricionais melhoram o estado oxidativo e reduzem os efeitos negativos do estresse térmico em ovinos
Antioxidantes dietéticos em doses supranutricionais modulam a proteína de choque térmico do músculo esquelético e a expressão de genes inflamatórios em ovinos expostos ao estresse térmico
Altos níveis dietéticos de vitamina E e selênio melhoram a ingestão de alimento e o ganho de peso de cordeiros em terminação e mantêm a homeostase redox sob condições quentes
A suplementação de cromo melhora a sinalização da insulina no músculo esquelético de camundongos diabéticos obesos KK/HlJ
O efeito da temperatura ambiente tropical no crescimento e metabolismo em suínos
HSP72 protege contra a resistência à insulina induzida pela obesidade
Estratégias nutricionais para aliviar o estresse térmico em suínos
Cinética de ácidos graxos não esterificados e glicerol e re-esterificação de ácidos graxos em cabras durante o início da lactação
Efeitos da somatotropina bovina e da insulina no metabolismo da glicose em corpo inteiro e em membros posteriores de novilhos em crescimento
Atenuação dos impactos do estresse térmico em vacas leiteiras
Produção de calor determinada pelos métodos RQ e CN, produção de calor em jejum e efeito da ingestão de energia na oxidação de substratos em ovelhas Manchega nativas
Interação entre chaperonas moleculares e vias de sinalização na sobrevivência ao choque térmico
Efeitos do nanoco bre na disponibilidade de cobre e digestibilidade de nutrientes, desempenho de crescimento e características séricas de leitões
Reduzir a fermentação do amido do trigo no rúmen com 3% de NaOH tem potencial para amenizar o efeito do estresse térmico em ovinos alimentados com grãos
O tratamento térmico melhora a tolerância à glicose e previne a resistência à insulina no músculo esquelético de ratos alimentados com dieta rica em gordura
O tratamento térmico agudo melhora a captação de glicose estimulada por insulina no músculo esquelético envelhecido
O nano-picolinato de crômio tri-picolínico na dieta aumenta o consumo de ração e diminui o cortisol plasmático em marrãs de terminação durante o verão
O picolinato de crômio dietético de tamanho de partícula variável melhora as características de carcaça e a sensibilidade à insulina em suínos de terminação alimentados com dietas baixas e altas em gordura
O nano picolinato de crômio melhora a expressão gênica associada à sinalização da insulina no músculo esquelético e tecido adiposo suíno
O nano picolinato de crômio dietético pode amenizar alguns dos impactos do estresse térmico em ovinos mestiços
Influência do calor na insulina e glucagon plasmáticos em resposta a secretagogos em vacas leiteiras não lactantes
Efeitos de estressores ambientais e outros nos parâmetros hormonais sanguíneos em animais lactantes
Avaliação comparativa da termotolerância em cordeiros Dorper e de segundo cruzamento (Poll Dorset/Merino x Border Leicester)
Os efeitos do picolinato de crômio(III) dietético no desempenho de crescimento, medidas sanguíneas e frequência respiratória em suínos mantidos em temperatura ambiente alta e baixa
Influência do picolinato de crômio tripicolínico no metabolismo da glicose e partição de nutrientes em cordeiros em crescimento
Carneiros com baixa eficiência alimentar são altamente responsivos a um desafio de estresse induzido pelo hormônio adrenocorticotrófico (ACTH)
Perfis de expressão gênica de camundongos diabéticos tratados com hipertermia corporal total: uma análise de microarranjo de DNA de alta densidade
Estresse térmico e saúde pública: uma revisão crítica
Nanopartículas de picolinato de crômio aumentam a digestibilidade e absorção de crômio
Crômio e nutrição suína
Efeitos da suplementação de crômio na fisiologia, consumo de ração e metabolismo relacionado à insulina em suínos em crescimento submetidos ao estresse térmico
Características fisiológicas afetadas pelo estresse térmico em ovinos – uma revisão
A terapia térmica regular pode promover a sensibilidade à insulina enquanto aumenta a expressão da óxido nítrico sintase endotelial – efeitos comparáveis aos do treinamento físico
O sistema carnitina palmitoiltransferase mitocondrial – do conceito à análise molecular
Entrega lipossomal da proteína de choque térmico 72 em células tubulares renais bloqueia a ativação do fator nuclear kappaB, a produção do fator de necrose tumoral alfa e a subsequente apoptose induzida por isquemia
Efeito de estressores agudos nas funções endocrinológicas e imunológicas em cordeiros
Cromo melhora a produção e altera o metabolismo de vacas no início da lactação no verão
Efeitos das mudanças climáticas na produção animal e na sustentabilidade dos sistemas pecuários
Hsp72 funciona como uma proteína inibitória natural da c-Jun N-terminal quinase
Gravidez e subnutrição alteram as respostas metabólicas da glicose à insulina em ovelhas
A gravidez, mas não a subnutrição moderada, atenua a supressão da insulina na mobilização de gordura em ovelhas
Papéis dos fatores de transcrição de choque térmico na regulação da resposta ao choque térmico e além
O metabolismo basal e estimulado por hormônios em cordeiros pode variar com o genótipo e a qualidade da dieta
Efeitos de diferentes compostos de cromo na pressão arterial e na peroxidação lipídica em ratos espontaneamente hipertensos
Influência da alta temperatura ambiente no desempenho de porcas reprodutoras
Alterações na expressão de genes gliconeogênicos durante estresse térmico e administração exógena de somatotropina bovina
Concentração dietética ideal de cromo para aliviar o efeito do estresse térmico no crescimento, qualidades da carcaça e alguns metabólitos séricos de frangos de corte
A suplementação de cromo não influencia o metabolismo da glicose ou a ação da insulina em resposta à exposição ao frio em ovelhas adultas
Somatotropina em vacas lactantes: efeito na resposta à epinefrina e insulina
Excesso de internações hospitalares durante a onda de calor de julho de 1995 em Chicago
Mecanismos celulares da resistência à insulina
Efeitos de uma cultura de levedura suplementar em vacas Holandesas lactantes estressadas pelo calor
O picolinato de cromo pode amenizar os efeitos negativos do estresse térmico e melhorar o desempenho, as características da carcaça e da carne em frangos de corte, reduzindo o nível de cortisol circulante
Respostas metabólicas e hormonais a infusões de glicose ou propionato em vacas leiteiras no periparto suplementadas com cromo
A fosforilação da serina 307 do substrato-1 do receptor de insulina se correlaciona com a atividade da JNK no músculo esquelético atrófico
Efeito da hipertermia nos processos lipolíticos no sangue e tecido adiposo de ratos
Associação dependente da idade entre prolactina sérica, glicemia e sensibilidade à insulina em humanos
Respostas do cortisol plasmático a três preparações corticotróficas em cães normais
Resistência à insulina no músculo esquelético: papel das citocinas inflamatórias e espécies reativas de oxigênio
Efeitos do estresse térmico no metabolismo energético em vacas Holandesas lactantes
A glicogênio sintase quinase 3beta regula negativamente as atividades de ligação ao DNA e transcricionais do fator de choque térmico 1
Respostas fisiológicas de bezerros ao aumento do fornecimento de cromo no verão
Nanopartículas de cromo(III) afetam as respostas hormonais e imunes em ratos estressados pelo calor
Dados suplementares
A seguir estão os dados suplementares para este artigo:
Revisão por pares sob responsabilidade da Associação Chinesa de Ciência Animal e Medicina Veterinária.
Dados suplementares a este artigo podem ser encontrados online em https://doi.org/10.1016/j.aninu.2023.01.003.