pmid: "38474436"
title: "Picolinato de Cromo Regula o Metabolismo Ósseo e Previne a Perda Óssea em Ratos Diabéticos."
authors: "Zheng H, Yan W, Shao M, Qi S"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2024 Feb 20"
doi: "10.3390/molecules29050924"
source: "PMC Full Text"

Picolinato de Cromo Regula o Metabolismo Ósseo e Previne a Perda Óssea em Ratos Diabéticos.

Autores

Zheng H, Yan W, Shao M, Qi S

Periodico

Molecules (Basel, Switzerland) (2024 Feb 20)

Conteudo

O Picolinato de Cromo Regula o Metabolismo Ósseo e Previne a Perda Óssea em Ratos Diabéticos

A osteoporose diabética (OPD) é uma doença metabólica anormal causada por hiperglicemia de longo prazo. Neste estudo, foi estabelecido um modelo de rato com diabetes induzida por estreptozotocina (STZ), e foi administrado picolinato de cromo (5 mg·kg−1); as alterações na glicemia e no peso corporal foram detectadas antes e após a administração; e a densidade mineral óssea (DMO), a morfologia óssea, os marcadores de remodelação óssea, as citocinas inflamatórias e os indicadores de estresse oxidativo foram observados em cada grupo. Descobrimos que, após a intervenção com picolinato de cromo (PC) por 8 semanas, o nível de glicemia diminuiu; a DMO, os parâmetros histomorfométricos ósseos e a estrutura patológica melhoraram; a expressão de proteínas relacionadas à reabsorção óssea foi regulada negativamente; e a expressão de proteínas relacionadas à formação óssea foi regulada positivamente. Simultaneamente, a atividade antioxidante sérica aumentou e os níveis de citocinas inflamatórias diminuíram. Em conclusão, o PC pode aliviar a OPD por meio de ação antioxidante, inibição da remodelação óssea, anti-inflamação e regulação da via de sinalização OPG/RANKL/RANK. Portanto, o PC possui importantes valores de aplicação para o desenvolvimento posterior como alimento funcional ou medicamento ativo no tratamento da OPD.

1. Introdução

O diabetes é uma das três principais doenças crônicas não transmissíveis do mundo. Em comparação com pessoas saudáveis, os pacientes diabéticos têm maior chance de sofrer de doenças cardiovasculares e o envelhecimento é acelerado; portanto, o diabetes pode induzir muitas doenças e afetar seriamente a saúde. Estima-se que até 2045, haverá 700 milhões de pessoas vivendo com diabetes em todo o mundo. A osteoporose diabética (OPD) é uma osteoporose secundária causada por hiperglicemia. Pacientes com OPD apresentam baixa taxa de remodelação óssea, baixa densidade mineral óssea (DMO) e baixa resistência óssea. Uma pesquisa com pacientes diabéticos mostrou que mais de 35% dos pacientes apresentavam sintomas de perda óssea, e cerca de 20% deles preenchiam os critérios diagnósticos de osteoporose, e na China, mais de um terço dos pacientes diabéticos sofriam de osteoporose.

A osteoporose causada pelo diabetes mellitus é uma doença endócrina sistêmica, e sua patogênese está intimamente relacionada à inflamação crônica e ao estresse oxidativo causados pela hiperglicemia de longo prazo. A inflamação crônica e o excesso de EROs podem promover a diferenciação e formação de osteoclastos, promovendo assim a reabsorção óssea e induzindo fraturas ósseas. Além disso, a via de sinalização OPG/RANK/RANKL também pode regular a diferenciação dos osteoclastos, afetando assim a remodelação e a formação óssea.
O cromo (Cr), como um dos oligoelementos essenciais no corpo humano, está relacionado à atividade do fator de tolerância à glicose (GTF); tem um efeito positivo na intolerância à glicose e na resistência à insulina; e participa do metabolismo de glicose, lipídios, proteínas e ácidos nucleicos. O picolinato de cromo (CP) é um tipo de cromo orgânico com boa estabilidade. O CP tem os efeitos de redução da glicose no sangue, alívio do estresse oxidativo, redução dos lipídios no sangue, melhora de doenças cardiovasculares e promoção da perda de peso. Como tem bons efeitos hipoglicemiantes, é usado clinicamente para o tratamento do diabetes.
Em nosso estudo anterior, verificou-se que o CP melhora os danos no tecido renal induzidos por estreptozotocina (STZ) em ratos diabéticos. Com base em seu bom efeito hipoglicemiante, bem como seus efeitos antioxidante, anti-inflamatório e anti-nefropatia diabética, especulamos que ele poderia ter um efeito protetor contra a osteoporose causada pelo diabetes. Portanto, estabelecemos um modelo de rato diabético e, em seguida, administramos CP para investigar o efeito do CP na DOP. Esperamos que esta pesquisa possa fornecer um novo método para o tratamento da perda óssea e osteoporose induzidas pelo diabetes.
2. Resultados
2.1. O Picolinato de Cromo Aliviou os Sintomas Diabéticos em Ratos Diabéticos
Conforme mostrado na Figura 1, a glicemia de jejum, a ingestão de alimentos e a ingestão de água no grupo DM foram acentuadamente elevadas (p < 0,01 vs. NC), e o peso corporal foi reduzido (p < 0,01 vs. NC). Após a administração de CP ou MET, os níveis de glicemia de jejum nos grupos CP e MET foram obviamente reduzidos (p < 0,05 vs. DM), e o peso corporal foi obviamente elevado (p < 0,05 vs. DM). Isso sugere que o CP poderia aliviar os sintomas do diabetes.
2.2. O Picolinato de Cromo Aumentou a DMO e a Resistência Óssea
Conforme mostrado na Figura 2, a DMO e a resistência óssea do fêmur no grupo DM foram acentuadamente reduzidas (p < 0,01 vs. NC); no entanto, após a administração, a DMO e a resistência óssea do fêmur foram obviamente melhoradas nos grupos CP e MET (p < 0,05 vs. DM), indicando que o estado esquelético dos ratos diabéticos foi melhorado após a administração de CP.
2.3. Resultados do Teste de micro-CT
Conforme indicado na Figura 3, em comparação com o grupo NC, as trabéculas ósseas no grupo DM eram esparsas e soltas, com um grande número de fraturas, e o número de trabéculas (Tb.N), espessura trabecular (Tb.Th), volume ósseo relativo (Tb.BV/TV), conteúdo mineral ósseo (BMC), espessura do osso cortical (Ct.Th), densidade do osso cortical (Ct.TMD), área do osso cortical (Ct.Ar) e área total do osso cortical (Tt.Ar) foram obviamente reduzidos (p < 0,01). Após a intervenção com CP, Tb.Th, Tb.BV/TV, Ct.Th, Ct.TMD e Ct.Ar no grupo CP aumentaram significativamente (p < 0,01 vs. DM); a separação trabecular (Tb.Sp), o fator de padrão trabecular (Tb.Pf), o índice de modelo estrutural (SMI) e a porcentagem da área da cavidade medular (%Ma.Ar) diminuíram significativamente (p < 0,05 vs. DM). Esses resultados indicaram que o CP poderia reparar a estrutura óssea em ratos diabéticos.
2.4. O Picolinato de Cromo Reparou a Microestrutura Óssea
Conforme indicado na Figura 4, no grupo NC, a estrutura trabecular do fêmur estava intacta, e as trabéculas ósseas estavam intimamente alinhadas entre si. A estrutura trabecular do fêmur nos ratos DM foi destruída; um grande número de fraturas apareceu entre as trabéculas ósseas; a porcentagem da área trabecular (%Tb.Ar) e Tb.Th foram obviamente reduzidas (p < 0,01 vs. NC); e Tb.Sp foi marcadamente aumentada (p < 0,01 vs. NC). Os tecidos ósseos dos ratos no grupo CP foram melhorados, Tb.Th e %Tb.Ar aumentaram (p < 0,05 vs. DM), e Tb.Sp diminuiu (p < 0,05 vs. DM). As mudanças na microestrutura óssea no grupo MET foram semelhantes às do grupo CP. Esses resultados indicaram que o CP poderia reparar a microestrutura óssea de ratos diabéticos.

2.5. Picolinato de Cromo Regulou a Remodelação Óssea
Conforme indicado na Tabela 1, os níveis de OPG e osteocalcina no grupo DM foram obviamente reduzidos (p < 0,01 vs. NC), enquanto os níveis de RANKL, TRACP 5b, ALP e CTX-1 foram marcadamente elevados (p < 0,01 vs. NC). Após a intervenção com CP, os níveis de RANKL, TRACP 5b, ALP e CTX foram marcadamente diminuídos (p < 0,01 vs. DM). Esses resultados indicaram que o CP poderia ajustar a remodelação óssea em ratos diabéticos.

2.6. Picolinato de Cromo Aliviou o Estresse Oxidativo
Conforme indicado na Figura 5, o conteúdo das enzimas antioxidantes (SOD, CAT e GSH) no grupo DM foi menor do que no grupo NC (p < 0,01), e o conteúdo de MAD foi marcadamente aumentado, o que indicou que o grau de estresse oxidativo em ratos diabéticos estava aumentado. A atividade das enzimas antioxidantes séricas (SOD, CAT e GSH) foi significativamente aumentada após o tratamento com CP (p < 0,05 vs. DM), e o conteúdo de MAD foi obviamente reduzido após o tratamento com CP (p < 0,05 vs. DM), indicando que o estresse oxidativo foi melhorado após o tratamento com CP.

2.7. Picolinato de Cromo Reduziu as Citocinas Inflamatórias Séricas
Conforme indicado na Figura 6, os níveis de interleucina-1β sérica (IL-1β), interleucina-6 (IL-6), interleucina-18 (IL-18), proteína C-reativa (CRP) e proteína quimioatraente de monócitos-1 (MCP-1) no grupo DM foram marcadamente aumentados (p < 0,05 vs. NC). Após a intervenção com CP, os níveis dessas citocinas inflamatórias séricas diminuíram (p < 0,05 vs. DM). Esses resultados indicaram que o CP poderia reduzir o conteúdo de citocinas inflamatórias séricas em ratos diabéticos.

2.8. Picolinato de Cromo Inibiu a Diferenciação de Adipócitos da Medula Óssea
Conforme indicado na Figura 7, no grupo NC, havia uma grande distribuição de medula óssea na tíbia, com um pequeno número de adipócitos. O número de adipócitos tibiais no grupo DM foi marcadamente aumentado (p < 0,05 vs. NC). O número de adipócitos da medula óssea tibial foi obviamente diminuído nos grupos CP e MET (p < 0,05 vs. DM). Esses resultados indicaram que o CP poderia inibir a diferenciação de adipócitos na medula óssea de ratos diabéticos.
Conforme indicado na Figura 8, a coloração TRAP mostrou que os osteoclastos no fêmur de ratos eram vermelho-arroxeados e distribuídos ao longo da borda do osso trabecular. O número de osteoclastos femorais no grupo DM aumentou acentuadamente (p < 0,01 vs. NC). Nos grupos CP e MET, o número de osteoclastos diminuiu significativamente (p < 0,05 vs. DM), indicando que o CP poderia inibir a osteoclastogênese em ratos diabéticos.
2.10. Picolinato de Cromo Promoveu a Osteoblastogênese
Como mostrado na Figura 9, a coloração ALP mostrou que os osteoblastos femorais em ratos DM estavam principalmente distribuídos ao redor do osso trabecular e dispostos de forma esparsa, e o número de osteoblastos foi obviamente reduzido em ratos DM (p < 0,01 vs. NC). Após a administração de CP ou MET, o número de osteoblastos femorais nos grupos CP e MET aumentou significativamente (p < 0,01 vs. DM).
2.11. Picolinato de Cromo Promoveu a Formação de Fibras de Colágeno Ósseo
A coloração tricrômica de Masson foi realizada nos tecidos ósseos femorais para observar as fibras de colágeno ósseo, e os resultados são mostrados na Figura 10. As fibras de colágeno foram amplamente distribuídas no tecido ósseo femoral do grupo NC, e a proporção da área de fibras de colágeno foi alta, enquanto a porcentagem da área de fibras de colágeno ósseo em ratos DM foi acentuadamente reduzida (p < 0,01 vs. NC). A porcentagem da área de fibras de colágeno nos grupos CP e MET aumentou obviamente (p < 0,05 vs. DM), indicando que o CP poderia promover a formação de colágeno ósseo em ratos diabéticos.
2.12. Efeito do Picolinato de Cromo na Expressão de OPG, RUNX 2 e RANKL no Tecido Ósseo
Conforme indicado na Figura 11, a expressão da proteína OPG e da proteína RUNX 2 foi obviamente menor no grupo DM do que no grupo NC (p < 0,01), mas aumentou acentuadamente após 8 semanas de intervenções com CP ou MET (p < 0,05 vs. DM); a proteína RANKL estava em um nível elevado no grupo DM (p < 0,01 vs. NC) e foi acentuadamente reduzida nos grupos CP e MET (p < 0,05 vs. DM). Esses resultados indicaram que o CP poderia regular a expressão de proteínas relacionadas ao metabolismo ósseo.
3. Discussão
O grau de dano celular causado por STZ em animais do mesmo gênero depende da dosagem de STZ. A injeção intraperitoneal ou intravenosa de 40–90 mg/kg de STZ em ratos pode danificar diretamente as células β das ilhotas pancreáticas, por isso tem sido amplamente utilizada por pesquisadores para a construção de modelos animais diabéticos. O STZ pode danificar especificamente as células beta pancreáticas em um curto período e reduzir a produção de insulina no organismo. Portanto, aqui administramos nos ratos uma injeção intraperitoneal única de STZ (45 mg/kg). Após 72 h, os níveis de glicose no sangue dos ratos aumentaram significativamente, 39 dos 42 ratos injetados com STZ apresentaram glicemia acima de 11,1 mmol/L, e a taxa de sucesso na construção do modelo de diabetes atingiu 93%, o que foi consistente com nossos estudos anteriores. Após 8 semanas, a resistência óssea, a massa óssea e a densidade mineral óssea desses ratos diminuíram, indicando que o modelo de osteoporose diabética foi estabelecido com sucesso. Ao mesmo tempo, em comparação com ratos diabéticos, os níveis de ingestão de água e alimento foram definitivamente menores no grupo controle, e o peso do grupo controle foi definitivamente maior que o dos ratos diabéticos. Alterações semelhantes foram encontradas em todos os estudos experimentais com animais sobre diabetes.
Estudos mostraram que a suplementação de CP pode melhorar a sensibilidade à insulina em pessoas obesas e pacientes diabéticos, melhorar as taxas de disposição de glicose e alcançar efeitos hipoglicemiantes. Assim, o CP tem sido amplamente utilizado nos campos de alimentos funcionais hipoglicemiantes e produtos farmacêuticos. Além disso, foi confirmado que o CP tem um efeito positivo nas complicações diabéticas, como proteger a aterosclerose diabética ao inibir a expressão de Trombospondina-1, melhorar a nefropatia diabética e a doença cardíaca coronariana por meio de efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios. Aqui administramos CP a ratos diabéticos por 8 semanas. Os resultados mostraram que o CP pode melhorar os distúrbios do metabolismo ósseo, a perda óssea e a destruição da microestrutura do tecido ósseo em ratos diabéticos, prevenindo assim a osteoporose diabética. Ao mesmo tempo, neste estudo, a metformina foi usada como controle positivo; aqui observamos o efeito protetor da metformina na osteoporose diabética, o que foi consistente com outros relatos, indicando que nossos métodos de pesquisa eram confiáveis.
Os resultados da micro-TC foram consistentes com os da coloração H&E dos tecidos femorais; as trabéculas ósseas estavam esparsamente arranjadas e as fraturas eram mais frequentes no grupo DM. Após 8 semanas de intervenção com CP, a microestrutura óssea foi melhorada. Ao mesmo tempo, os resultados da medição da histomorfologia óssea foram consistentes com os resultados da micro-TC, todos esses resultados mostraram que o CP pode melhorar o dano à estrutura trabecular óssea e a perda óssea causados pelo diabetes.
A atividade de formação óssea e reabsorção óssea pode ser avaliada pela observação da expressão de marcadores de renovação óssea, que também foram utilizados no diagnóstico e tratamento da osteoporose. A TRACP 5b é liberada quando os osteoclastos absorvem osso e digerem proteínas ósseas (como CTX 1); os osteoblastos secretam osteocalcina e ALP quando trabalham, e esse processo é regulado pelo RUNX 2. Descobrimos que os índices bioquímicos de formação óssea, como osteocalcina e ALP, aumentaram significativamente em ratos diabéticos após intervenção com CP, e os índices bioquímicos de reabsorção óssea, como TRACP 5b e CTX 1, diminuíram significativamente. Isso indica que a CP poderia regular a renovação óssea.

Quando a osteoporose ocorreu, o número de células-tronco mesenquimais da medula óssea que se diferenciam em adipócitos aumenta e a geração de osteoblastos diminui; estudos mostraram que a ativação da proteína morfogenética óssea 2 poderia inibir a adipogênese. Neste estudo, a coloração patológica do tecido ósseo mostrou que o número de adipócitos na medula óssea tibial do grupo DM aumentou acentuadamente, e o número de osteoblastos diminuiu acentuadamente. A diferenciação de adipócitos diminuiu, e a diferenciação de osteoblastos aumentou em ratos com CP. Estudos mostraram que a intervenção com metformina, melatonina ou exercício também poderia reduzir o número de adipócitos da medula óssea, aumentando assim a DMO. Isso foi consistente com nossa pesquisa.

Enquanto isso, o tecido colágeno pode aumentar a DMO e a atividade dos osteoblastos, o que tem um efeito positivo na resistência óssea. Seo, J.Y. et al. mostraram que o 7α,25-diidroxicolesterol reduziu o nível de colágeno tipo II em condrócitos, acelerando assim a perda de proteoglicanos e, finalmente, induzindo a osteoartrite. Huang W et al. descobriram que o defeito ósseo desapareceu em um modelo de defeito ósseo de íleo de coelho após 4 semanas de tratamento com hidrogel multifuncional de quitosana conjugada com catecol, e grande quantidade de novo tecido ósseo no íleo pôde ser observada no Masson tricrômico. Neste estudo, o Masson tricrômico do tecido ósseo mostrou que a intervenção com CP poderia aumentar significativamente a área de fibras colágenas ósseas dos ratos e melhorar a dissolução, fratura e arranjo frouxo das fibras colágenas.
A hiperglicemia sustentada causará a superprodução de ROS no organismo; destrói a homeostase das enzimas antioxidantes e oxidativas; causa estresse oxidativo, ativando assim a diferenciação dos precursores de osteoclastos; aumenta a reabsorção óssea pelos osteoclastos; e acelera a perda óssea. Altas concentrações de glicose no sangue estimularão a liberação de mediadores inflamatórios, enquanto o estresse oxidativo também aumentará as citocinas inflamatórias, e a inflamação, por sua vez, promoverá a geração de ROS. Neste estudo, os níveis de SOD, CAT e GSH séricos no grupo DM foram notavelmente reduzidos, enquanto o conteúdo de MAD e os níveis de citocinas inflamatórias aumentaram significativamente. Após a administração de CP, a atividade das enzimas antioxidantes no soro de ratos diabéticos melhorou marcadamente, e o conteúdo de MAD e os níveis de citocinas inflamatórias diminuíram significativamente. Os resultados mostraram que o CP poderia prevenir a perda óssea causada pelo diabetes ao inibir a atividade da oxidase e anti-inflamação. Ao mesmo tempo, estudos confirmaram que a Pílula Liuwei Dihuang ou puerarina e outros medicamentos poderiam melhorar a perda óssea ao reduzir o nível de citocinas inflamatórias em ratos diabéticos, o que foi consistente com nosso estudo. Bo, S. et al. mostraram que tomar resveratrol em pacientes diabéticos poderia aumentar o nível de marcadores antioxidantes e melhorar o declínio da densidade mineral óssea. Isso é consistente com nosso estudo, sugerindo que antioxidante e anti-inflamação são alguns dos mecanismos do CP na osteoporose antidiabética.

A via de sinalização OPG/RANKL/RANK ajusta a formação óssea e a reabsorção óssea. O RANKL ativa a diferenciação dos osteoclastos e se liga ao receptor RANK para promover a reabsorção óssea. A OPG se liga ao sítio de ligação do RANKL, inibe a ligação e ativação do RANK e inibe a diferenciação dos osteoclastos. A razão OPG/RANKL reflete a tendência da transformação óssea no organismo. Quando a razão diminui, indica que a proliferação de osteoclastos está ativa e a reabsorção óssea é promovida. Examinamos as proteínas OPG, RANKL e RUNX 2 e descobrimos que, após a intervenção com CP, a expressão das proteínas OPG e RUNX 2 aumentou, enquanto a expressão da proteína RANKL diminuiu, a razão OPG/RANKL aumentou. Esses resultados indicaram que o CP poderia aliviar a DOP ao regular a via de sinalização OPG/RANK/RANKL.

4. Materiais e Métodos
   4.1. Produtos Químicos
   STZ foi comprado da Beijing Coolaibo Technology Company Limited (Pequim, China). O picolinato de crômio foi comprado da Sinopharm Chemical Reagent Company (Xangai, China). Anticorpos de coelho anti-OPG, anti-RANKL e anti-RUNX 2 foram comprados da Beijing Bioss Antibodies Company Limited (Pequim, China). IgG de cabra-coelho foi comprado da Beijing TDY Biotechnology Company Limited (Pequim, China).
   4.2. Animais
   Ratos SD machos com 56 dias de idade (n = 52) foram adquiridos da Cheng Du Dashuo Experimental Animal Company (Chengdu, China). Todos os animais foram alojados uma semana antes do experimento sob condições padronizadas. Os animais receberam alimentação e água adequadas. Os experimentos animais foram aprovados pelo comitê de ética animal local (aprovação nº 2022-14).

4.3. Agrupamento dos Animais
Após uma semana de alimentação adaptativa, 52 ratos SD machos saudáveis foram divididos aleatoriamente em dois grupos: os ratos do grupo NC (n = 10) receberam injeção de tampão citrato, e os outros ratos (n = 42) receberam injeção intraperitoneal de STZ 45 mg·kg−1 (a dose de STZ foi selecionada com base em nossa pesquisa anterior). Após 72h, os ratos (n = 39) com glicemia acima de 11,1 mmol·L−1 foram redistribuídos em 3 grupos. Durante 8 semanas, o grupo NC e o grupo modelo diabético (grupo DM, n = 13) receberam água destilada por via intragástrica, o grupo de picolinato de cromo (grupo CP, n = 13) recebeu 5 mg·kg−1·d−1 de CP por via intragástrica, e o grupo de metformina (grupo MET, n = 13) recebeu 200 mg·kg−1·d−1 de metformina por via intragástrica.

A glicemia, o peso corporal, a ingestão de água e a ingestão de alimento foram registrados no último dia de cada semana para cada grupo de ratos. Após 8 semanas, os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical, e o sangue foi coletado do plexo venoso orbital. O sangue foi centrifugado e armazenado no refrigerador a −80 °C. Dois tecidos de fêmur e tíbia de cada rato foram coletados, e um deles foi fixado em paraformaldeído a 4%, e o outro foi congelado em um refrigerador a −80 °C.

4.4. Medição da DMO e da Resistência Óssea
A DMO do fêmur de cada rato foi determinada usando o Sistema de Análise de DMO e Composição Corporal para Animais de Laboratório (KUBTEC Technologies INC., Stratford, CT, EUA). A resistência óssea do fêmur de cada rato foi determinada usando um Testador de Resistência Óssea para Pequenos Animais (Anhui Zhenghua Biologic Apparatus Facilities, Huaibei, China).

4.5. Detecção por Micro-TC Óssea
O tecido conjuntivo na superfície do fêmur do rato foi removido, e então a varredura por raios X foi realizada usando um instrumento de micro-TC (Bruker (Beijing) Scientific Technology Co., Ltd., Pequim, China). A tensão de varredura foi de 70 kV, a corrente de varredura foi de 114 μA, e o tempo de varredura foi de 29,7 min. Após a varredura, a região do tecido ósseo a 1,0 mm distal da placa de crescimento foi selecionada para reconstrução 3D. A estrutura óssea foi analisada de acordo com todos os parâmetros de medição listados na Tabela 2.

4.6. Análise Histopatológica de Secções do Fêmur
Os tecidos do fêmur de ratos foram fixados e descalcificados por 28 dias. Cortes de parafina (5 µm de espessura) foram preparados com um micrótomo de tecidos (Leica, Wetzlar, Alemanha) e corados com TRAP, ALP, hematoxilina-eosina e tricrômico de Masson. As lâminas coradas foram visualizadas ao microscópio e fotografadas de cinco ângulos diferentes usando um sistema de fotografia Leica. O programa de software Image J 1.52 foi utilizado para medir Tb.Th, Tb.Sp, o número de osteoclastos, osteoblastos e a área de fibras colágenas nos tecidos ósseos em cada campo visual. De acordo com a fórmula de cálculo da morfometria óssea, a %Tb.Ar trabecular foi calculada.
4.7. Detecção de Estresse Oxidativo, Marcadores de Remodelação Óssea e Citocinas Inflamatórias
De acordo com as instruções do kit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Pequim, China), o leitor de microplacas (Nanjing Detie Biotechnology Co., Ltd., Nanquim, China) e o espectrofotômetro ultravioleta e visível (Shimadzu Enterprise Management (China) Co., Ltd., Xangai, China) foram utilizados para detectar os níveis de estresse oxidativo (SOD, MDA, CAT e GSH), marcadores de remodelação óssea (OPG, CTX-1, TRACP 5b, ALP, RANKL, osteocalcina e RUNX 2) e citocinas inflamatórias (IL-8, TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1 e CRP) no soro dos ratos.
4.8. Adipócitos da Medula Óssea na Tíbia
Após os tecidos da tíbia de ratos serem fixados e descalcificados por 28 dias, cortes de parafina (5 µm de espessura) foram preparados com um micrótomo de tecidos e corados com hematoxilina e eosina. O número de adipócitos nos tecidos ósseos da tíbia foi contado ao microscópio a partir de dez ângulos diferentes usando o sistema de fotografia Leica.
4.9. Imuno-histoquímica (IHQ)
Os cortes de parafina do fêmur foram desparafinizados com xileno e desidratados, embebidos em TritonX-100 a 1% por 30 min, embebidos em CBS a 95 °C por 20 min, depois resfriados naturalmente, embebidos em solução de peróxido de hidrogênio a 0,3% por 30 min e lavados com PBS. Antígenos inespecíficos foram bloqueados com solução de BSA a 3%. Os cortes do fêmur foram então lavados com PBS; anticorpo primário OPG, RANKL e RUNX 2 (Beijing Bioss Biotechnology Co., Ltd., Pequim, China) foi adicionado por 90 min e incubado a 37 °C. Após lavagem com PBS, gotas de anticorpo secundário (TDY biotech, Pequim, China) foram adicionadas e incubadas por 2 h. Após lavagem com PBS, DAB foi adicionado, o núcleo foi corado com hematoxilina e as lâminas foram seladas com goma neutra. Em cada lâmina, selecionamos dez campos de visão diferentes e calculamos a proporção de áreas de coloração positiva com Image J 1.52.
4.10. Análise de Dados
SPSS (versão 22.0) foi utilizado para analisar os dados. Análise de variância univariada (ANOVA) e teste de Tukey foram utilizados para analisar as diferenças entre os grupos. p < 0,05 indicou significância estatística.
Em suma, este estudo constatou que o CP poderia prevenir a DOP, aumentar a DMO, melhorar a estrutura do tecido ósseo, aumentar o número de fibras de colágeno ósseo e osteoblastos, e reduzir a produção de adipócitos da medula óssea e osteoclastos. Além disso, o CP poderia inibir o estresse oxidativo e a inflamação e regular positivamente a expressão das proteínas OPG e RUNX 2, bem como equilibrar o nível dos marcadores de remodelação óssea. Esses efeitos são propícios para manter o equilíbrio metabólico ósseo normal e aliviar a DOP. Assim, o CP poderia ser usado como um ingrediente eficaz para o tratamento da DOP.
Aviso de isenção de responsabilidade/Nota do Editor: As declarações, opiniões e dados contidos em todas as publicações são de responsabilidade exclusiva do(s) autor(es) e colaborador(es) individual(is) e não do MDPI e/ou do(s) editor(es). O MDPI e/ou o(s) editor(es) se isentam de responsabilidade por qualquer dano a pessoas ou propriedades resultante de quaisquer ideias, métodos, instruções ou produtos mencionados no conteúdo.
Contribuições dos Autores
Conceituação, aquisição de financiamento e administração do projeto, S.Q.; preparação do rascunho original e visualização, W.Y. e H.Z.; redação – revisão e edição, validação, análise formal, H.Z. e S.Q.; software e curadoria de dados, M.S. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Comitê de Revisão Institucional
O estudo animal nesta pesquisa foi conduzido no Instituto de Biotecnologia Shaanxi Daoerfeng, e todos os protocolos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de Biotecnologia Shaanxi Daoerfeng (Nº 2022-14, data: 16 de fevereiro de 2022).
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados apresentados neste estudo estão disponíveis no artigo.
Conflitos de Interesse
A autora Shanshan Qi estava empregada pela Shaanxi Migukang Biotechnology Company. Os demais autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Referências
Senescência Celular: O Vilão da Doença Metabólica?: Descoberta de uma população distinta de células senescentes na disfunção metabólica induzida pela obesidade
Diabetes, hipertensão e doença cardiovascular: Uma atualização
Atlas de diabetes da IDF: Estimativas globais da prevalência de diabetes para 2017 e projeções para 2045
Diabetes e osso
Tendências na osteoporose e densidade óssea média entre pacientes com diabetes tipo 2 nos EUA de 2005 a 2014
Prevalência de osteoporose em pacientes com diabetes mellitus: Uma revisão sistemática e meta-análise de estudos observacionais
Estresse oxidativo: Um estado patológico comum em uma população de alto risco para osteoporose
Estresse oxidativo e inflamação na osteoporose: Mecanismos moleculares envolvidos e a relação com microRNAs
Estresse oxidativo na remodelação óssea: Papel dos antioxidantes
Estresse oxidativo e osteoporose
A baicalina melhora a osteoporose induzida por dexametasona pela regulação do RANK/RANKL/OPG
Efeitos benéficos do extrato de Cuscuta chinensis na osteoporose induzida por glicocorticoides através da modulação dos sinais RANKL/OPG
Efeitos do cromo na tolerância à glicose e sensibilidade à insulina em pessoas com risco de diabetes mellitus
Efeitos da suplementação de cromo na composição corporal, saúde humana e animal, e metabolismo da insulina e glicose
Efeito benéfico da suplementação de cromo na glicose, HbA1C e variáveis lipídicas em indivíduos com diabetes tipo 2 de início recente
O picolinato de cromo atenua o estresse oxidativo induzido por hiperglicemia em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina
O papel da suplementação de cromo nos fatores de risco cardiovascular; uma revisão abrangente dos mecanismos moleculares putativos
Uma revisão abrangente do impacto do picolinato de cromo na esteroidogênese testicular e equilíbrio antioxidante
Suplementação de picolinato de cromo para adultos com sobrepeso ou obesidade
Suplementação de cromo; negociação com diabetes mellitus, hiperlipidemia e depressão
Efeitos protetores do picolinato de cromo contra a disfunção renal induzida por diabetes e fibrose renal em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina
Modelos diabéticos induzidos por estreptozotocina em camundongos e ratos
Os mecanismos do diabetes induzido por aloxana e estreptozotocina
O sulfato de condroitina alivia a osteoporose diabética e repara a microestrutura óssea através de anti-oxidação, anti-inflamação e regulação do metabolismo ósseo
A cianidina-3-glicosídeo do arroz preto melhora a nefropatia diabética através da redução da glicemia, supressão do estresse oxidativo e inflamação, e regulação da expressão do fator de crescimento transformador β1/Smad
Efeito da suplementação de complexos de histidinato e picolinato de cromo juntamente com biotina na sensibilidade à insulina e índices metabólicos relacionados em ratos alimentados com dieta rica em gordura
Efeitos da suplementação de picolinato de cromo nos biomarcadores cardiometabólicos em pacientes com diabetes mellitus tipo 2: Um ensaio clínico randomizado
O picolinato de cromo oral impede a aterosclerose induzida por hiperglicemia e inibe a expressão da proteína proaterogênica TSP-1 em camundongos ApoE−/− diabéticos tipo 1 induzidos por STZ
As influências da suplementação de cromo no status metabólico em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 e doença cardíaca coronária
O futuro da metformina na prevenção da osteoporose relacionada ao diabetes
Metformina; um antigo medicamento antidiabético com novos potenciais em distúrbios ósseos
A metformina ativa Wnt/β-catenina para o tratamento da osteoporose diabética
Marcadores de remodelação óssea: Da biologia básica às aplicações clínicas
Algoritmo para o uso de marcadores bioquímicos de remodelação óssea no diagnóstico, avaliação e acompanhamento do tratamento da osteoporose
Células-tronco mesenquimais: Remédios incríveis para defeitos ósseos e cartilaginosos
Regeneração óssea com células-tronco mesenquimais de sangue de cordão umbilical em defeitos femorais de ratas ovariectomizadas
A proporção adipocítica da medula óssea está inversamente relacionada à formação óssea na osteoporose
Os papéis dos exossomos derivados de células-tronco mesenquimais no diabetes mellitus e suas complicações relacionadas
Células-tronco derivadas do tecido adiposo aliviam a osteoporose ao melhorar a osteogênese e inibir a adipogênese em um modelo de coelho
Disfunções dos adipócitos ligando a obesidade à resistência à insulina e diabetes tipo 2
O acúmulo de gordura na medula óssea acelerado por dieta rica em gordura é suprimido pelo exercício
A metformina afeta a massa óssea cortical e a adiposidade medular na obesidade induzida por dieta em camundongos machos
A melatonina suprime a adiposidade da medula óssea em ratas ovariectomizadas ao resgatar o desequilíbrio entre osteogênese e adipogênese através da ativação de SIRT1
Ligando mudanças estruturais e composicionais no colágeno ósseo humano arqueológico: Uma abordagem FTIR-ATR
O impacto da ingestão de proteína de colágeno na remodelação do tecido conjuntivo musculoesquelético: Uma revisão narrativa
Colágeno marinho: Um biomaterial promissor para cicatrização de feridas, antienvelhecimento da pele e regeneração óssea
Morte condrocítica oxiapoptófaga induzida por 7α,25-diidroxicolesterol via modulação do eixo p53-Akt-mTOR na patogênese da osteoartrite
Hemostasia não compressível e regeneração óssea induzidas por um hidrogel auto-regenerativo bioadesivo absorvível
Osteócitos e diabetes: Função alterada dos osteócitos diabéticos
Senescência acelerada de osteócitos e fragilidade esquelética em camundongos com diabetes tipo 2
Base molecular da via de sinalização KEAP1-NRF2
Caracterização espaço-temporal do acúmulo de microdanos e seus mecanismos de remodelação direcionada no osso fatigado diabético
Diabetes mellitus tipo 2, estresse oxidativo e inflamação: Examinando as relações
Potencial terapêutico da pílula Liuwei Dihuang contra a via de sinalização KDM7A e Wnt/β-catenina na osteoporose relacionada à nefropatia diabética
A puerarina alivia a osteoporose induzida por estreptozotocina (STZ) em ratos ao suprimir inflamação e apoptose via sinalização HDAC1/HDAC3
Efeitos do resveratrol na saúde óssea em pacientes com diabetes tipo 2. Um ensaio clínico randomizado duplo-cego controlado
Os papéis de RANK/RANKL/OPG nos músculos cardíaco, esquelético e liso na saúde e na doença
O sistema RANK/RANKL/OPG e a metástase óssea tumoral: Mecanismos potenciais e estratégias terapêuticas
Níveis circulantes de RANKL, OPG e marcadores de estresse oxidativo em mulheres pós-menopausa com densidade mineral óssea normal ou baixa
Via RANKL/RANK/OPG: Um mecanismo envolvido na remodelação óssea induzida pelo exercício
O licopeno melhora a osteoporose diabética via ação anti-inflamatória, antioxidante e aumento da razão de expressão osteoprotegerina/RANKL
Histomorfometria óssea
Glicemia, peso corporal, ingestão alimentar e ingestão de água dos ratos em cada grupo. (A) Glicemia. (B) Peso corporal. (C) Ingestão alimentar. (D) Ingestão de água. NC, grupo controle normal; DM, grupo modelo diabético; CP, ratos diabéticos tratados com CP (5 mg∙kg−1∙d−1); MET, ratos diabéticos tratados com metformina (200 mg∙kg−1∙d−1). Os valores são apresentados como média ± DP. Em comparação ao grupo NC, (##) p < 0,01. Em comparação ao grupo DM, (*) p < 0,05.

DMO e resistência óssea dos ratos em cada grupo. (A) DMO do fêmur. (B) Resistência óssea do fêmur. Os valores são apresentados como média ± DP. Em comparação ao grupo NC, (##) p < 0,01. Em comparação ao grupo DM, (**) p < 0,01, (*) p < 0,05.

Imagens de reconstrução tridimensional do fêmur e parâmetros de micro-TC óssea em cada grupo. (A) Imagens do fêmur. (B) Corte transversal do osso femoral. (C) Tb.N. (D) Tb.Th. (E) Tb.Sp. (F) Tb.BV/TV. (G) Tb.Pf. (H) SMI. (I) BMC. (J) Ct.Th. (K) Ct.TMD. (L) Ct.Ar. (M) Tt.Ar. (N) %Ma.Ar. Os valores são apresentados como média ± DP. Em comparação ao grupo NC, (##) p < 0,01. Em comparação ao grupo DM, (**) p < 0,01, (*) p < 0,05.

A morfologia femoral dos ratos em cada grupo. (A–D) Coloração H&E dos tecidos femorais, ampliação de 400×; (E) Tb.Th do fêmur; (F) Tb.Sp do fêmur; (G) %Tb.Ar do fêmur. Os valores são apresentados como média ± DP. Em comparação ao grupo NC, (##) p < 0,01. Em comparação ao grupo DM, (**) p < 0,01.

Os níveis de enzimas séricas associadas ao estresse oxidativo em cada grupo. (A) SOD; (B) GSH; (C) CAT; (D) MDA. Os valores são apresentados como média ± DP. Em comparação ao grupo NC, (##) p < 0,01. Em comparação ao grupo DM, (**) p < 0,01, (*) p < 0,05.

Níveis de expressão de citocinas inflamatórias séricas em cada grupo. (A) IL-1β; (B) IL-6; (C) IL-18; (D) PCR; (E) MCP-1; (F) TNF-α. Os valores são apresentados como média ± DP. Em comparação ao grupo NC, (##) p < 0,01. Em comparação ao grupo DM, (**) p < 0,01.

Coloração H&E, ampliação de 400×. (A) Tíbia do grupo NC. (B) Tíbia do grupo DM. (C) Tíbia do grupo CP. (D) Tíbia do grupo MET. (E) Número de adipócitos no tecido tibial dos ratos em cada grupo. A seta vermelha aponta para os adipócitos. Os valores são apresentados como média ± DP. Em comparação ao grupo NC, (#) p < 0,05. Em comparação ao grupo DM, (*) p < 0,05.

Coloração TRAP, ampliação de 400×. (A) Osso femoral do grupo NC. (B) Osso femoral do grupo DM. (C) Osso femoral do grupo CP. (D) Osso femoral do grupo MET. (E) Número de osteoclastos em cada grupo. As setas vermelhas apontam para os osteoclastos. Os valores são apresentados como média ± DP. Em comparação ao grupo NC, (##) p < 0,01. Em comparação ao grupo DM, () p < 0,01, (*) p < 0,05.
Coloração de ALP, aumento de 400×. (A) Fêmur do grupo NC. (B) Fêmur do grupo DM. (C) Fêmur do grupo CP. (D) Fêmur do grupo MET. (E) Número de osteoblastos em cada grupo. As setas vermelhas indicam os osteoblastos. Os valores são apresentados como média ± DP. Em comparação ao grupo NC, (##) p < 0,01. Em comparação ao grupo DM, () p < 0,01, () p < 0,05.
Coloração de Masson, aumento de 200×. (A) Fêmur do grupo NC. (B) Fêmur do grupo DM. (C) Fêmur do grupo CP. (D) Fêmur do grupo MET. (E) Porcentagem da área de fibras colágenas (%) em cada grupo. A caixa vermelha mostra as fibras colágenas. Os valores são apresentados como média ± DP. Em comparação ao grupo NC, (##) p < 0,01. Em comparação ao grupo DM, () p < 0,01.
Expressão das proteínas OPG, RANKL e RUNX 2 no tecido ósseo de ratos em cada grupo, com coloração IHC e aumento de 400×. (A1–A4) OPG; (B1–B4) RANKL; (C1–C4) RUNX 2; (D) Porcentagem da área de coloração positiva para OPG; (E) Porcentagem da área de coloração positiva para RANKL; (F) Porcentagem da área de coloração positiva para RUNX 2. Os valores são apresentados como média ± DP. Em comparação ao grupo NC, (##) p < 0,01. Em comparação ao grupo DM, () p < 0,01, () p < 0,05.
Marcadores de turnover ósseo no soro dos diferentes grupos.
Parâmetro NC DM CP MET OPG (ng mL−1) 8,93 ± 1,07 3,37 ± 0,69 ## 7,04 ± 1,26 ** 7,33 ± 0,97 ** RANKL (ng mL−1) 4,01 ± 0,66 11,37 ± 1,97 ## 5,17 ± 0,74 ** 5,49 ± 0,67 ** Razão OPG/RANKL 2,44 ± 0,47 0,31 ± 0,11 ## 1,51 ± 0,39 ** 1,49 ± 0,37 ** RUNX 2 (ng mL−1)TRACP 5b (U dL−1) 9,57 ± 1,89 3,41 ± 0,79 8,46 ± 1,27 ** 7,96 ± 1,83 ** 2,29 ± 0,63 7,32 ± 1,43 ## 3,37 ± 1,21 ** 4,01 ± 1,34 * ALP (U dL−1)CTX-1 (ng mL−1)Osteocalcina (ng mL−1) 59,64 ± 7,97 137,35 ± 14,31 ## 77,12 ± 8,45 ** 84,36 ± 10,67 ** 35,47 ± 5,21 101,47 ± 11,69 ## 66,47 ± 8,74 ** 61,77 ± 9,14 ** 26,78 ± 4,12 8,45 ± 2,17 ## 19,67 ± 3,64 ** 21,76 ± 3,99 **
Os valores são apresentados como média ± DP. Em comparação ao grupo NC, (##) p < 0,01. Em comparação ao grupo DM, (**) p < 0,01, (*) p < 0,05.
Parâmetros de medição do tecido ósseo detectados por micro-CT.
Tipo de Análise Parâmetro Unidade Osso trabecular—imagem 3D Número de trabéculas (Tb.N) 1/mm Espessura trabecular (Tb.Th) mm Separação trabecular (Tb.Sp) mm Volume ósseo relativo (Tb.BV/TV) % Fator de padrão trabecular (Tb.Pf) 1/mm Índice de modelo estrutural (SMI) Conteúdo mineral ósseo (BMC) mg Osso cortical—imagem 3D Espessura do osso cortical (Ct.Th) mm Densidade do osso cortical (Ct.TMD) mg/cm3 Área do osso cortical (Ct.Ar) mm2 Área total do osso cortical (Tt.Ar) mm2 Porcentagem da área da cavidade medular (%Ma.Ar) %