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pmid: "30595630"
title: "Isolamento guiado por bioatividade de compostos ansiolíticos potentes a partir de folhas de"
authors: "Gupta V, Sharma R, Bansal P, Kaur G"
journal: "Ayu"
pubdate: "2018"
doi: "10.4103/ayu.AYU_173_17"
source: "PMC Full Text"

Isolamento guiado por bioatividade de compostos ansiolíticos potentes a partir de folhas de

Autores

Gupta V, Sharma R, Bansal P, Kaur G

Periodico

Ayu (2018)

Conteudo

Isolamento guiado por bioatividade de compostos ansiolíticos potentes de folhas de Citrus paradisi

Contexto:
Fragrâncias cítricas têm sido atribuídas a propriedades de melhora do humor por aromaterapeutas. Folhas desta planta foram relatadas como exercendo atividade ansiolítica. Até o momento, nenhum fitoconstituinte específico responsável por isso foi identificado.

Objetivo:
Isolamento do constituinte ansiolítico de Citrus paradisi utilizando fracionamento guiado por bioatividade.

Materiais e Métodos:
Extratos foliares de quatro variedades de C. paradisi em éter de petróleo, clorofórmio, metanol e água foram avaliados quanto à atividade ansiolítica em camundongos utilizando o aparato de labirinto em cruz elevado. Devido à atividade no extrato metanólico, este foi utilizado para estudos de segurança/toxicidade aguda em animais. A fração bioativa do extrato metanólico foi submetida a cromatografia em coluna e a estrutura do composto isolado foi elucidada por ponto de fusão, ultravioleta, infravermelho, ressonância magnética nuclear e espectroscopia de massa. Os constituintes isolados foram posteriormente avaliados quanto à atividade ansiolítica utilizando o modelo claro/escuro e o modelo de placa de buracos de ansiedade.

Resultados:
Os resultados não mostraram mortalidade em dose de até 2000 mg/kg de peso corporal, o que reflete indiretamente o perfil de segurança dos extratos foliares. O fracionamento do extrato metanólico levou ao isolamento de quatro flavonoides (rutina, quercetina, kaempferol e mirecetina). Os compostos isolados exibiram atividade ansiolítica significativa em diferentes modelos animais.

Conclusão:
O estudo confirma a presença de quatro flavonoides responsáveis pela atividade ansiolítica.

Introdução
Os transtornos de estresse e ansiedade são um dos distúrbios mentais mais comuns do mundo moderno, vivenciados por crianças e adolescentes. Em algumas circunstâncias, o estresse e a ansiedade são benéficos, pois podem motivar e ajudar a pessoa a se tornar mais produtiva, mas quando se tornam excessivos, prejudicam a vida cotidiana e levam a doenças físicas ou psicológicas. A ansiedade é um distúrbio do sistema nervoso central com um estado emocional, de natureza desagradável, associado a inquietação, desconforto e preocupação ou medo em relação a alguma ameaça futura definida ou indefinida. Estudos mostram que a taxa de prevalência ao longo da vida de ansiedade está entre 13,6% e 28,8% nos países ocidentais e em 4,5% da população mundial. Foi relatado que a prevalência de ansiedade em homens adultos na Índia é de 24,4%. A farmacoterapia convencional está associada a efeitos colaterais como comprometimento psicomotor, disfunção sexual e dependência. Vários estudos foram realizados sobre a atividade ansiolítica de plantas medicinais, mas nenhum composto isolado foi concebido na forma de medicamento devido à falta de um composto marcador responsável pela atividade ansiolítica e à indisponibilidade de materiais vegetais. Portanto, este estudo foi planejado para isolar um biomarcador com atividade ansiolítica.
Plantas cítricas pertencentes à família Rutaceae são originárias da Ásia e hoje são cultivadas em todo o mundo. Os frutos cítricos são fontes ricas em compostos bioativos que apresentam atividades farmacológicas, como atividade antioxidante, antimicrobiana, antitumoral e anti-inflamatória, e, portanto, a família Citrus é uma das plantas hortícolas mais importantes comercialmente. Os óleos voláteis obtidos do gênero Citrus têm sido recomendados e utilizados para o tratamento da ansiedade. Uma quantidade significativa de literatura reflete que a Citrus paradisi tem sido amplamente utilizada na fitoterapia, bem como na aromaterapia, e um trabalho preliminar importante já foi realizado por autores e outros pesquisadores sobre os efeitos ansiolíticos dos extratos da planta.

Neste estudo, os autores pretendiam selecionar quatro variedades da planta C. paradisi disponíveis mundialmente e testar a atividade ansiolítica de extratos de folhas. Esta espécie em particular foi selecionada porque uma quantidade insignificante de trabalho foi realizada nesta espécie em comparação com outras espécies. A folha foi selecionada para o isolamento de compostos porque pode ser disponibilizada em escala comercial. Assim, o presente estudo foi desenhado para isolar o composto biomarcador responsável pela atividade ansiolítica das folhas de diferentes variedades de C. paradisi.

Materiais e Métodos

Coleta e identificação do material vegetal

As folhas de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby foram obtidas e identificadas a partir de fonte cultivada do Centro Regional da Universidade Agrícola de Punjab, Abohar (Punjab, Índia) nos meses de março de 2012 e março de 2013. O material vegetal foi seco à sombra.

Solventes

Clorofórmio, metanol, tolueno, acetato de etila e ácido fórmico (Merck specialties limited, Mumbai) foram empregados para cromatografia em camada fina. Todos os solventes eram de grau reagente garantido, exceto clorofórmio e metanol (grau reagente de laboratório), que foram utilizados para cromatografia em coluna após destilação sob pressão atmosférica normal. Éter de petróleo (60°C–80°C), clorofórmio e metanol (Merck specialties limited), todos de grau LR, foram empregados para a extração do material vegetal. Diazepam (Ranbaxy) foi utilizado como fármaco padrão.

Animais

Os 216 animais experimentais (camundongos albinos Swiss (20–25 g) de ambos os sexos) foram obtidos do Biotério Central, Akal College of Pharmacy and Technical Education, Sangrur. Os animais receberam ração padrão de laboratório e água ad libitum, ambos sendo retirados 12 h antes da experimentação. Os experimentos foram realizados entre 6h00 e 12h00. Os experimentos foram conduzidos em um laboratório semi-antirruído. Os estudos biológicos foram realizados de acordo com as diretrizes do comitê de ética animal institucional. A aprovação do comitê de ética animal institucional foi obtida antes da realização dos estudos biológicos, conforme carta nº ATRC/05/13 datada de 04/05/13.
Os estudos de toxicidade aguda foram realizados de acordo com as diretrizes da OCDE. Os animais selecionados receberam extrato metanólico por via oral nas doses de 400, 800, 1200, 1600 e 2000 mg/kg de peso corporal após jejum noturno. Os animais foram observados por 7 dias quanto à morbidade e à apresentação de toxicidade.

Preparação dos extratos e frações

Folhas de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby foram secas à sombra e pulverizadas. Um quilograma de folhas pulverizadas foi submetido à extração sequencial em Soxhlet por solventes em ordem crescente de polaridade, a saber: éter de petróleo (60°C–80°C), clorofórmio, metanol e água. Antes de cada extração, o material pulverizado foi seco em estufa de ar quente abaixo de 50°C. Cada extrato foi concentrado por destilação do solvente em evaporador rotatório e, em seguida, evaporado até secura em banho-maria, e os extratos secos foram preservados em dessecador a vácuo.

Grupo I (veículo)

Xarope + carboximetilcelulose (2%) foi utilizado como veículo para a preparação de suspensões de diversas doses teste de diferentes extratos, frações e constituintes bioativos de todas as variedades.

Grupo II (medicamento padrão)

Diazepam (2 mg/kg por via oral).

Grupo III–VI (soluções teste)

Os extratos vegetais secos de todas as variedades foram separadamente suspensos no veículo. Diferentes doses, nomeadamente 50, 100, 200 e 400 mg/kg de cada extrato (éter de petróleo, clorofórmio, metanol e água) foram administradas por 5 dias por via oral (p.o.) uma vez ao dia, e a última dose foi administrada no 5º dia, 60 minutos antes do início do experimento. Um protocolo semelhante foi seguido para os grupos padrão e controle. Os compostos isolados nas doses de 2, 5 e 10 mg/kg foram testados utilizando o modelo de placa de buracos e o modelo claro-escuro.

Preparação da fração de acetato de etila e da fração metanólica residual

O extrato metanólico ativo das folhas de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby foi suspenso em água, colocado em balão de fundo redondo de três bocas conectado a um agitador de Teflon e particionado com acetato de etila por aquecimento (50°C) por 30 minutos com agitação contínua. O procedimento foi repetido cinco vezes. Todas as frações de acetato de etila (FAEs) foram reunidas e o solvente foi recuperado utilizando evaporador rotatório a vácuo Buchi 461. Assim, duas frações foram obtidas – FAE e a fração metanólica residual (FMR) – e cada fração foi avaliada quanto à atividade ansiolítica utilizando o labirinto em cruz elevado (LCE).

Fracionamento da fração de acetato de etila e atividade ansiolítica das frações
A EAF bioativa (35 g) de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby foi carregada em uma coluna empacotada com gel de sílica (#60–120) e eluída usando clorofórmio/clorofórmio-metanol/metanol como fase móvel. Um total de 189, 201, 187 e 211 frações de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby, respectivamente, de 200 ml cada, foram coletadas. Estas foram agrupadas com base em cromatogramas de camada fina semelhantes, para obter 8 (EAF1F–EAF8F), 9 (EAF1D–EAF9D), 12 (EAF1M–EAF12M) e 10 (EAF1S–EAF10S) subfrações, que foram avaliadas quanto à atividade ansiolítica em várias doses (5, 10 e 20 mg/kg VO) usando o aparato EPM.
As EAF bioativas EAF5F (6 g), EAF5D (6 g), EAF5M (6 g) e EAF5S (6 g) das frações foster, duncan, marsh seedless e star ruby foram submetidas à cromatografia em coluna usando gel de sílica (#230–400) e a eluição foi realizada com éter de petróleo, clorofórmio e clorofórmio-metanol para obter um total de 53, 65, 57, 63 frações de EAF5 de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby, respectivamente, de 200 ml cada, coletadas. Estas foram agrupadas com base em cromatogramas de camada fina semelhantes, para obter 3, 4, 3 e 3 subfrações, que foram avaliadas quanto à atividade ansiolítica em várias doses (5, 10 e 20 mg/kg VO) usando o aparato EPM.
As frações bioativas EAF5F.3 (3 g), EAF5D.3 (3 g), EAF5M.3 (3 g) e EAF5S.3 (3 g) de foster, duncan, marsh seedless e star ruby foram novamente cromatografadas em coluna sobre gel de sílica (#230–400). A eluição foi realizada com éter de petróleo, clorofórmio e clorofórmio-metanol. Um total de 121, 103, 153 e 93 frações de EAF5.3 de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby, respectivamente, de 100 ml cada, foram coletadas. Estas foram agrupadas com base em cromatogramas de camada fina semelhantes, para obter 3, 3, 2, 2 subfrações, que foram avaliadas quanto à atividade ansiolítica em várias doses (2, 5 e 10 mg/kg VO) usando o aparato EPM.
EAF5F.3.2, EAF5D.3.2, EAF5M.3.2 e EAF5S.3.2 de C. paradisi foster, duncan, marsh seedless e star ruby foram submetidas à cromatografia em coluna flash e o composto puro (Z1, Z2, Z3 e Z4) foi isolado de todas as variedades, o qual foi posteriormente avaliado quanto ao efeito ansiolítico usando o modelo de placa de buracos e o modelo claro-escuro.
Caracterização dos compostos isolados
O ponto de fusão de Z1, Z2, Z3 e Z4 foi determinado e eles foram então submetidos à análise espectroscópica (ultravioleta [UV], infravermelho [IV], ressonância magnética nuclear de prótons [RMN] e espectrometria de massas) para elucidação estrutural. Os espectros de UV foram obtidos em espectroscopia Perkin Elmer Hitachi 330 (espectroscopia UV/visível lambda 15). Os espectros de IV da amostra teste como filme puro foram obtidos em um espectrofotômetro de IV (sistema de monitoramento de síntese por transformada de Fourier multiespectral, Perkin Elmer, Alemanha). Os espectros de RMN de 1H foram obtidos em um espectrômetro Bruker (Avane, Alemanha). Os espectros de massas foram adquiridos no modo de íons positivos em um espectrômetro de massas (Finnigan, EUA) equipado com ionização química à pressão atmosférica assistida pneumaticamente.
Estatísticas
As atividades ansiolíticas das frações, diazepam e controle foram analisadas por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey/teste de Dunnett. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando P < 0,05.

Resultados
Estudo de toxicidade aguda
Os estudos de toxicidade oral aguda revelaram a natureza não tóxica de diferentes extratos de diferentes variedades de C. paradisi. Não foi observada morbidade nem quaisquer reações tóxicas profundas na dose de até 2000 mg/kg de peso corporal, o que reflete indiretamente o perfil de segurança do extrato da planta.

Atividade ansiolítica de vários extratos
A atividade ansiolítica de vários extratos foliares foi avaliada utilizando o modelo de labirinto em cruz elevado. Extratos de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby foram triados quanto ao potencial ansiolítico usando o EPM. O extrato metanólico de todas as quatro variedades exibiu atividade ansiolítica significativa em camundongos na dose de 100 mg/kg VO, e a atividade foi comparável à do diazepam. Houve um aumento acentuado no tempo gasto nos braços abertos do EPM com a administração de 100 mg/kg VO do extrato metanólico das folhas de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby [Tabela 1].

Atividade ansiolítica de vários extratos de folhas de Citrus paradisi utilizando o aparelho de labirinto em cruz elevado
O extrato metanólico de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby foi selecionado para fracionamento guiado por bioatividade com o objetivo de isolar composto(s) ansiolítico(s). O fracionamento do extrato metanólico bioativo das folhas de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby rendeu duas frações, ou seja, EAF e RMF, que foram posteriormente avaliadas quanto à atividade ansiolítica em camundongos usando o aparelho EPM. A EAF de C. paradisi var. foster, duncan, star ruby e marsh seedless na dose de 20 mg/kg VO usando o EPM mostrou atividade ansiolítica comparável ao diazepam [Tabela 2].

Atividade ansiolítica da fração acetato de etila e da fração metanol residual de diferentes espécies de Citrus paradisi utilizando o labirinto em cruz elevado

Cromatografia em coluna da fração acetato de etila
As subfrações bioativas EAF5F, EAF5D, EAF5M e EAF5S de foster, duncan, marsh seedless e star ruby na dose de 20 mg/kg VO mostraram atividade ansiolítica usando o EPM, comparável ao diazepam [Tabela 3].

Perfil de atividade ansiolítica no aparelho de labirinto em cruz elevado de várias subfrações obtidas após cromatografia em coluna da fração acetato de etila
As subfrações bioativas EAF5F.3, EAF5D.3, EAF5M.3 e EAF5S.3 de C. paradisi foster, duncan, marsh seedless e star ruby na dose de 20 mg/kg VO mostraram atividade ansiolítica usando o EPM, comparável ao diazepam [Tabela 4].

Perfil de atividade ansiolítica no aparelho de labirinto em cruz elevado de várias subfrações obtidas após cromatografia em coluna da fração acetato de etila
As frações bioativas EAF5F.3.2, EAF5D.3.2, EAF5M.3.2 e EAF5S.3.2 de C. paradisi foster, duncan, marsh seedless e star ruby na dose de 10 mg/kg VO na dose de 10 mg/kg VO apresentaram atividade ansiolítica utilizando o LCE, comparável ao diazepam [Tabela 5].
Perfil de atividade ansiolítica no aparato de labirinto em cruz elevado de várias subfrações obtidas por cromatografia em coluna da fração acetato de etila
EAF5F.3.2, EAF5D.3.2, EAF5M.3.2 e EAF5S.3.2 de C. paradisi foster, duncan, marsh seedless e star ruby foram submetidas à cromatografia em coluna flash. Isso resultou na separação de 4 frações, que foram então analisadas por CCD utilizando clorofórmio:metanol (7:3). Todas as quatro frações apresentaram diferentes valores de Rf (F1, F2, F3, F4 de C. paradisi foster; D1, D2, D3, D4 de C. paradisi Duncan; M1, M2, M3, M4 de C. paradisi marsh seedless; e S1, S2, S3, S4 de C. paradisi star ruby). Verificou-se que F1, D1, M1 e S1 apresentavam os mesmos valores de Rf, portanto, foram agrupadas. Da mesma forma, F2, D2, M2, S2; F3, D3, M3, S3; e F4, D4, M4, S4 foram agrupadas. Todas as frações foram novamente corridas em cinco fases móveis aleatórias e apresentaram uma única mancha, sendo então consideradas compostos puros e denominadas Z1, Z2, Z3 e Z4.
Caracterização dos compostos isolados
Z1: Cor: Pó amarelo pálido; Ponto de Fusão: 241°C–242°C; Rendimento: 252 mg; UVmax (MeOH): 359 nm; IV: 3483 (estiramento O-H), 2931 cm−1 (estiramento C-H), 1669 cm−1 (C = O), 1504 cm−1 (estiramento C = C aromático), 1348 cm−1, 1141 cm−1 (C-O-C); 1H-RMN (400 MHz, solvente DMSO): δ 12,5 (C5-OH), 10,9 (C7-OH), 6,4 (d, 1H, J = 1,4, C8-H), 6,2 (m, 1H, J = 1,4, C6-H), 5,3 (s, 1H, J = 7,0, C1”-H), 4,3 (sl, 1H, C1’’’-H), 3,0–3,7 (m, prótons do açúcar), 1,0 (s, 3H, J = 6,0, C6’’’-H); EM: [M + H] +=611, [M + H] +-Ramnose=465, [M + H] +-Ramnose-Glicose=303. Isso corresponde a C27H30O16. O composto na fração F1, D1, M1, S1 é identificado como rutina e denominado Z1.
Z2: Cor: Pó amarelo; Ponto de Fusão: 314°C–315°C; Rendimento: 330 mg; UVmax (MeOH): 375 nm; IV: 3349 cm−1 (estiramento O-H), 2899 cm−1 (estiramento C-H), 1673 cm−1 (C = O), 1489 cm−1 (estiramento C = C); 1H-RMN (400 MHz, solvente DMSO): δ 6,85 (s, 1H, OH), δ 6,79 (s, 1H, OH), δ 6,54 (s, 1H, OH); EM: [M + H] +=302, [M + H-H2O] +=285, [M + H-CO] +=275, [M + H-H2O-CO] +=257, [M + H-H2O-2CO] +=229. Isso corresponde a C15H10O7. O composto na fração F2, D2, M2, S2 é identificado como quercetina e denominado Z2.
Z3: Cor: Pó amarelo; Ponto de Fusão: 272°C–274°C; Rendimento: 267 mg; UVmax (MeOH): 260 nm; IV: 3467 cm−1 (estiramento O-H), 2835 cm−1 (estiramento C-H), 1679 cm−1 (C = O), 1573 e 1412 cm−1 (Anel aromático); 1H-RMN (400 MHz, solvente DMSO): 10,76 (s, 1H, 7-OH), 7,78 (s, 2H, H-2’), 7,45 (d, 1H, H-8), 7,24 (d, 2H, H-3’ e H-5’), 5,35 (s, 1H, H-6); EM: [M + H] +=286. Isso corresponde a C15H10O6. O composto na fração F3, D3, M3, S3 é identificado como Kaempferol e denominado Z3.
Z4: Cor: Cristais amarelos; Ponto de Fusão: 353°C–355°C; Rendimento: 264 mg; UVmax (MeOH): 375 nm; IV: 3384 cm−1 (estiramento O-H), 1678 e 1631 cm−1 (estiramento C-O), 1593 cm−1 (estiramento C-C), 1536 cm−1 (Anel aromático), 1359 e 1165 cm−1 (estiramento C-O-C); 1H-RMN (400 MHz, solvente DMSO): 6,3 (s, 2H, H-2′, 6′), 5,8 (s, 2H, H-8), 4,98 (m, 5H, H); EM: M+=318, [M + H-H2O] =301, [M + H-H2O-CO] +=273. Isso corresponde a C15H10O8. O composto na fração F4, D4, M4, S4 é identificado como Mricetina e nomeado como Z4 [Figura 1].
Estrutura dos compostos isolados
Confirmação da atividade ansiolítica dos compostos isolados
A atividade ansiolítica dos compostos isolados foi posteriormente confirmada usando o modelo de placa perfurada e o teste claro-escuro.
Modelo de placa perfurada
O número de cruzamentos de linhas e mergulhos de cabeça aumentou significativamente no caso dos animais tratados com diazepam em comparação com os animais controle. Todos os compostos isolados Z1, Z2, Z3 e Z4 mostraram um aumento no número de cruzamentos de linhas e mergulhos de cabeça de forma significativa, e os resultados foram semelhantes aos do fármaco padrão [Tabelas 6 e 7].
Atividade ansiolítica dos compostos isolados no modelo de placa perfurada (mergulho de cabeça)
Atividade ansiolítica dos compostos isolados no modelo de placa perfurada (cruzamento de linhas)
Modelo claro-escuro
O tempo gasto na caixa iluminada aumentou significativamente no caso das doses de 2, 5 e 10 mg/kg dos compostos isolados Z1, Z2, Z3 e Z4, e o resultado foi comparável ao do fármaco padrão, diazepam [Tabela 8].
Atividade ansiolítica dos compostos isolados no modelo claro-escuro
Discussão
Os transtornos de ansiedade são doenças médicas graves que afetaram um oitavo da população total mundial, independentemente de gênero, idade, religião, nacionalidade e profissão. O transtorno mental tem atraído a atenção dos pesquisadores para várias abordagens farmacoterapêuticas. Os benzodiazepínicos (BZDs) são usados como primeira linha de tratamento. Hoje, pelo menos 20 milhões de pessoas em todo o mundo recebem prescrição desses "tranquilizantes menores". O uso regular de BZDs causa deterioração da função cognitiva, dependência, dependência física e tolerância. Devido aos efeitos adversos associados aos fármacos sintéticos, os pesquisadores têm explorado recursos naturais baseados em sistemas tradicionais de medicina para encontrar fármacos mais seguros e eficazes.
A seleção de plantas, ou seja, C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby, tem um longo histórico de uso em sistemas alternativos e tradicionais de medicina e espécies similares na farmacoterapêutica ayurvédica para o tratamento de transtornos mentais. Folhas de diferentes variedades de C. paradisi nunca foram avaliadas quanto ao seu potencial ansiolítico usando protocolos padrão. Portanto, considerou-se válido investigar o potencial ansiolítico de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby e isolar os componentes responsáveis por essa atividade.
Diversos extratos de folhas de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby foram obtidos por extração exaustiva sucessiva do material vegetal utilizando solventes em ordem crescente de polaridade, nomeadamente, éter de petróleo, clorofórmio, metanol e água. A justificativa para o uso desses solventes foi separar os constituintes da planta com base na polaridade.

O LCE (Labirinto em Cruz Elevado) é um método novo, eficaz, barato e simples, não requer treinamento prévio dos animais experimentais e não causa muito desconforto a eles durante o manuseio. O medo devido à altura (acrofobia) induz ansiedade, medida pelo tempo gasto pelos camundongos nos braços abertos do LCE. Compostos ansiolíticos, ao diminuir a ansiedade, aumentam o tempo de exploração dos braços abertos; compostos ansiogênicos têm o efeito oposto. Os camundongos constituem uma ferramenta inestimável para modelar a ansiedade humana em suas várias formas, pois apresentam notáveis semelhanças nos níveis anatômico, fisiológico, bioquímico, molecular e comportamental. No estudo, valores padrão para o tempo médio gasto nos braços abertos do LCE dos grupos controle (veículo) e padrão (diazepam) de camundongos foram gerados inicialmente utilizando 12 camundongos em cada grupo – um número duas vezes maior que o número (6 camundongos) usado para o grupo teste. Esses valores foram então usados como referência em todas as avaliações posteriores de ansiedade das amostras teste. Observou-se também que mesmo na dose de 2000 mg/kg, VO, nenhum efeito tóxico/adverso aparente foi observado com nenhum dos extratos de folhas no estudo. O extrato metanólico de C. paradisi exibiu atividade ansiolítica significativa em camundongos na dose de 100 mg/kg VO e a atividade foi comparável à do diazepam. No entanto, a atividade diminuiu em dose mais alta, o que pode ser devido a sedação leve. O extrato metanólico de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby foi selecionado para fracionamento guiado por bioatividade com o objetivo de isolar composto(s) ansiolítico(s).

Na tentativa de separar os conteúdos do extrato metanólico bioativo de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby que exibiam atividade ansiolítica significativa, ele foi fracionado por agitação com acetato de etila. Entre as duas frações, nomeadamente, EAF e RMF, apenas a EAF de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby na dose de 20 mg/kg VO exibiu atividade ansiolítica significativa usando o modelo LCE.

A EAF bioativa de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby foi submetida à cromatografia em coluna, que rendeu diferentes frações. EAF5F.3.2, EAF5D.3.2, EAF5M.3.2 e EAF5S.3.2 de C. paradisi foster, duncan, marsh seedless e star ruby foram submetidas à cromatografia em coluna flash usando clorofórmio:metanol (80:20) e renderam quatro isolados puros Z1, Z2, Z3 e Z4 denominados rutina, quercetina, kaempferol e miricetina, respectivamente. A atividade anti-ansiedade dos compostos isolados Z1, Z2, Z3 e Z4 foi ainda confirmada usando o modelo de placa de buracos e o teste claro-escuro.
Flavonoides e terpenoides atuam como agentes ansiolíticos modulando os receptores do ácido gama-aminobutírico (GABA) de forma semelhante aos benzodiazepínicos, aumentando assim a frequência de abertura dos canais de cloreto e resultando na hiperpolarização neuronal. Além da atividade moduladora de receptores, os flavonoides também atuam como agentes antioxidantes devido à sua capacidade de doação de hidrogênio, o que, em última análise, resulta em um papel neuroprotetor. Como a investigação fitoquímica, cromatográfica e espectroscópica demonstrou a presença de vários flavonoides em diferentes variedades de C. paradisi, eles são candidatos potenciais para o tratamento de transtornos de ansiedade, conforme justificado pelos resultados de vários modelos animais de ansiedade.

Conclusão
À luz dos achados acima, conclui-se que rutina, quercetina, kaempferol e mirecetina são responsáveis pela atividade ansiolítica das folhas de C. paradisi var. foster, duncan, marsh seedless e star ruby. No entanto, são necessários estudos adicionais para determinar o mecanismo exato pelo qual esses constituintes fitoquímicos isolados de C. paradisi interagem com o GABA ou outros receptores para exercer a atividade ansiolítica.

Suporte financeiro e patrocínio
Nenhum.

Conflitos de interesse
Não há conflitos de interesse.

Transtornos do humor em pacientes clinicamente doentes: Revisão científica e recomendações
Dor persistente e bem-estar: Um estudo da Organização Mundial da Saúde em atenção primária
Um estudo sobre a prevalência de transtornos de ansiedade entre estudantes do ensino médio
Prevalência de depressão, ansiedade e estresse entre adultos jovens do sexo masculino na Índia: Um estudo baseado em diagnósticos dimensionais e categóricos
Citrus (Rutaceae): Uma revisão dos avanços recentes em etimologia, sistemática e aplicações médicas
Atividades ansiolítica e antidepressiva de diferentes extratos de Citrus paradisi var. foster
Atividades ansiolítica e antidepressiva de diferentes extratos de Citrus paradisi var. duncan
Padrões farmacopeicos e estudos farmacognósticos das folhas de Citrus paradisi var. foster
Atividade anti-ansiedade de extratos de Citrus paradisi var. star ruby
Padrões farmacopeicos e estudos farmacognósticos das folhas de Citrus paradisi var. duncan
Desenvolvimento de um substituto farmacêutico econômico à base de plantas a partir de Citrus paradisi (Toranja) para módulos farmacêuticos anti-ansiedade existentes
OCDE. Diretrizes da OCDE para Testes de Produtos Químicos. Efeitos na saúde: Teste nº 425: Toxicidade Oral Aguda: Procedimento Up and Down. Seção 4
NIMH. Estatísticas
Novas perspectivas em glutamato e ansiedade
Estudo dose-efeito de Gelsemium sempervirens em altas diluições sobre respostas relacionadas à ansiedade em camundongos
Agentes de ação central de plantas indianas
Descoberta de Fármacos e Avaliação de Ensaios Farmacológicos
Ansiedade em camundongos e humanos: Uma comparação
Modulação de receptores GABA(A) por flavonoides
Farmacologia do canal do receptor GABA(A)
Compostos derivados de plantas com potenciais atividades sedativas e ansiolíticas
Uma revisão da fitoquímica e farmacologia dos flavonoides
Revitalização, modernização e integração da medicina fitoterápica tradicional indiana na prática clínica: Importância, desafios e futuro