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pmid: "35536831"
title: "Perfis de aminoácidos, açúcares, fenóis e terpenoides são capazes de distinguir o status de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em cultivares de citros: toranja, limão, tangerina e laranja-doce."
authors: "Wallis CM, Gorman Z, Rattner R, Hajeri S, Yokomi R"
journal: "PloS one"
pubdate: "2022"
doi: "10.1371/journal.pone.0268255"
source: "PMC Full Text"

Perfis de aminoácidos, açúcares, fenóis e terpenoides são capazes de distinguir o status de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em cultivares de citros: toranja, limão, tangerina e laranja-doce.

Autores

Wallis CM, Gorman Z, Rattner R, Hajeri S, Yokomi R

Periodico

PloS one (2022)

Conteudo

Perfis de aminoácidos, açúcares, fenóis e terpenoides são capazes de distinguir o status de infecção do Citrus tristeza virus em cultivares de citros: Toranja, limão, tangerina e laranja doce

O Citrus tristeza virus (CTV) é a doença viral mais grave para a produção de citros. Muitas estirpes do CTV foram caracterizadas e sua sintomatologia varia amplamente, desde infecções assintomáticas ou leves até sintomatologia grave que resulta em perda substancial de produtividade ou morte do hospedeiro. A capacidade das diferentes estirpes do CTV de afetar a bioquímica de diferentes espécies de citros permaneceu amplamente não estudada, apesar de que mudanças metabolômicas associadas seriam relevantes para o desenvolvimento de sintomas. Assim, os níveis de aminoácidos, açúcares, fenóis e terpenoides foram avaliados em folhas de toranja, limão, tangerina e duas cultivares diferentes de laranja doce, saudáveis e infectadas pelo CTV. Foram utilizadas tanto estirpes genotípicas leves [VT-negativo (VT-)] quanto graves [VT-positivo (VT+)] do CTV. Ao observar os totais gerais dessas classes de metabólitos, apenas os níveis de aminoácidos foram significativamente aumentados pela infecção de citros com estirpes graves do CTV, em relação a estirpes leves do CTV ou plantas saudáveis. Nenhuma tendência significativa da infecção pelo CTV nas quantidades totais de todos os compostos de açúcares, fenóis ou terpenoides foi observada. No entanto, os níveis de compostos individuais foram afetados pelas infecções pelo CTV. A subsequente análise discriminante canônica (CDA) que utilizou perfis de aminoácidos, terpenoides ou fenóis individuais distinguiu com sucesso amostras de folhas para variedades específicas de citros e identificou o status de infecção com boa precisão. Coletivamente, este estudo revela padrões bioquímicos associados à gravidade das infecções pelo CTV que podem potencialmente ser utilizados para ajudar a identificar infecções pelo CTV em campo de relevância econômica.

Introdução

O Citrus tristeza virus (CTV) (família Closteroviridae, gênero Closterovirus), a principal ameaça viral patogênica à produção de citros, é composto por um complexo de estirpes distintas. O CTV é um vírus de origem no intestino anterior, semipersistente, disseminado por vetores afídeos, incluindo Aphis gossypii e Toxoptera citricida.
A sintomatologia do CTV é impulsionada pela cepa viral, pela cultivar de citros e pela combinação de copa/porta-enxerto do hospedeiro. Portanto, os efeitos da infecção pelo CTV podem variar amplamente em termos de gravidade. Algumas infecções resultam em sintomas graves que impactam muito a produção, o que pode incluir declínio rápido (frequentemente causado por anelamento em um porta-enxerto de laranja azeda), depressões no caule em troncos e ramos, baixa qualidade e produção de frutos, entre outros. Alternativamente, algumas interações entre cepas de CTV e cultivares resultam em infecções leves ou assintomáticas, que geralmente ocorrem em cultivares tolerantes. Essa variabilidade na sintomatologia dificulta o manejo eficaz do CTV onde cultivares de citros vizinhas são diferentes e exige a identificação de cepas específicas de CTV que resultam em nanismo severo, depressões no caule e ramos quebradiços. O monitoramento e a erradicação do CTV têm sido utilizados em certas áreas para o manejo do CTV. No entanto, práticas não discriminatórias podem remover tanto citros infectados com cepas de CTV virulentas e com sintomas que impactam a produção quanto citros infectados com cepas assintomáticas de CTV que não afetarão a produção. Assim, a erradicação apenas de cepas específicas de CTV que resultam em sintomas redutores de produção é economicamente vantajosa.
Para o propósito deste estudo, existem dois tipos definidos de cepas de CTV considerados como causadores de maior gravidade que outros, chamados de cepas não-VT MCA13 e VT MCA13. Ambos foram especificamente visados em levantamentos no passado devido à chance de causarem sintomas graves da doença. No entanto, estudos têm observado que entre essas cepas pode haver grande variabilidade na gravidade causada, incluindo nenhuma diferença clara entre algumas dessas cepas e aquelas consideradas mais leves. Dentre essas categorias, surgem cepas adicionais de CTV de preocupação, incluindo cepas que quebram a resistência (RB), que se replicam em porta-enxertos de laranjeira trifoliata antes considerados imunes ao CTV, e outras cepas que não estão presentes na Califórnia. Assim, existe a necessidade de uma maior biocaracterização de diferentes cepas em diferentes cultivares de citros, incluindo exames das mesmas cepas em diferentes espécies de citros e focando nas alterações subjacentes no metabolismo do hospedeiro causadas por diferentes cepas.
Embora tenha sido realizada uma caracterização extensa de diferentes combinações de estirpe/cultivar do CTV, houve poucas investigações sobre os mecanismos bioquímicos por trás de diferentes sintomatologias do CTV. O CTV, como outros vírus, induz alterações fisiológicas em seus hospedeiros como resultado do processo de infecção. Algumas dessas alterações poderiam aumentar a replicação viral ou a sobrevivência nas células hospedeiras, como a criação de novos “drenos” para metabólitos primários (aminoácidos e açúcares simples) para aumentar as matérias-primas necessárias para a reprodução viral em tecidos infectados. Outras alterações poderiam envolver a modificação das respostas de defesa ou estresse do hospedeiro. Por exemplo, a produção alterada de compostos fenólicos ou voláteis poderia tornar os tecidos mais adequados para insetos vetores, incluindo a redução de terpenoides voláteis envolvidos na defesa contra vetores do CTV. Algumas alterações adicionais na fisiologia do hospedeiro poderiam criar um ambiente mais estável para as populações de vírions, como mudanças para compostos osmorregulatórios ou antioxidantes em tecidos infectados para limitar estresses que, de outra forma, poderiam ser difíceis de superar. Algumas dessas alterações fisiológicas poderiam representar respostas genéricas de plantas hospedeiras a vírus, mas muitas provavelmente são específicas de patossistemas de diferentes espécies hospedeiras e patógenos ou estirpes virais.
Apenas alguns estudos examinaram os efeitos do CTV na química do hospedeiro. Estes foram geralmente realizados para desenvolver técnicas de diagnóstico e não para esclarecer o desenvolvimento de sintomas, e foram quase inteiramente focados em terpenoides voláteis. Cheung et al. observaram que uma abordagem estatística multivariada poderia distinguir as emissões voláteis de árvores infectadas pelo CTV daquelas de árvores saudáveis, e que as árvores infectadas apresentavam menor produção de monoterpenoides do que as plantas saudáveis. Em outro estudo, variedades de citros suscetíveis e resistentes ao CTV foram analisadas, com as variedades resistentes exibindo maiores níveis de terpenoides do que as variedades suscetíveis. A produção de terpenoides não depende apenas dos enxertos hospedeiros, pois um estudo recente mostrou que os porta-enxertos também podem afetar a quantidade de terpenoides no enxerto. Notavelmente, plantas infectadas não foram examinadas por Guarino et al. ou Albrecht et al., portanto, permanece incerto como os voláteis do hospedeiro teriam mudado nesses estudos após a infecção pelo CTV.
Este estudo teve como objetivo caracterizar melhor as alterações fisiológicas do hospedeiro em diferentes cultivares de citros após a infecção por diferentes genótipos de CTV com diferentes capacidades de causar doença. Além disso, fenóis, terpenoides, aminoácidos e açúcares livres foram perfilados para elucidar melhor como essas classes de metabólitos são moduladas pela infecção com cepas leves ou graves de CTV. Os perfis de metabólitos de plantas saudáveis ou infectadas, de cada cultivar de planta hospedeira, foram então usados para verificar se as espécies de citros e/ou o estado de infecção por CTV das amostras poderiam ser corretamente identificados. No geral, os resultados deste estudo melhoram a compreensão sobre as interações vírus-planta e destacam alterações fisiológicas do hospedeiro que podem ser favoráveis à sobrevivência e disseminação viral.
Materiais e métodos
Materiais vegetais, inoculações virais e experimentos de título de CTV
Seis cultivares de citros propagadas em porta-enxerto Carrizo foram obtidas de um viveiro comercial de citros usando borbulha certificada (livre de patógenos) e transplantadas para vasos de um galão (3,8 L) com mistura de solo UC para citros e estabelecidas em casa de vegetação. As cultivares de citros incluíram limão Lisboa (Citrus limon L. Burm.f.), Minneola (Citrus × tangelo), W. Murcott (C. reticulata Blanco), toranja Oro Blanco (C. paradisi Macfadyen), laranjas doces Midknight Valencia e Washington Navel (C. sinensis (L.) Osbeck), totalizando seis cultivares. Após seis meses, as plantas foram inoculadas por enxertia com cinco genótipos diferentes de CTV, incluindo as cepas T30 (uma), T36 (uma), S1 (uma), RB (uma) e VT (cinco), totalizando nove tratamentos com CTV e um controle saudável inoculado com mock. Essas cepas foram isoladas e caracterizadas de pomares comerciais de citros no centro da Califórnia, exceto SY568, que foi isolada de citros em Riverside, Califórnia. Para fins deste estudo, as cepas virais e seu fenótipo foram simplificados como cepas não-VT = "leves" ou VT-positivo = "graves" (Fig 1).
Comparação da virulência de cepas do vírus da tristeza dos citros (CTV) mostrada por sintomas de caneluras (SP) em laranja Washington navel.
A) Controles saudáveis, B) T36-leve sem caneluras, e C) VT SY568 grave com fortes caneluras e necrose. A virulência das caneluras variou sazonalmente com os novos ciclos de crescimento.
A condição de infecção por CTV das propagações cítricas foi determinada pelo ensaio imunoenzimático (ELISA) de sanduíche indireto de anticorpos duplos (DAS-I) com um antissoro policlonal de CTV e MCA13. Uma vez que a infecção sistêmica por CTV foi estabelecida em todas as plantas, as plantas foram transferidas para uma casa de vegetação telada coberta com tela anti-insetos (moscas-brancas, pulgões, psilídeos, minadores de folhas e tripes) de malha 50 (tamanho do furo 0,78 x 0,25 mm) e plantadas no solo em um delineamento de parcelas subdivididas aleatorizadas com três repetições. A casa de vegetação telada tinha 26 pés (7,9 m) de largura e 120 pés (36,6 m) de comprimento, e o espaçamento entre árvores era de 3 pés (0,9 m) entre árvores e 6 pés (1,8 m) entre fileiras. A casa de vegetação telada era equipada com um vestíbulo de entrada telado, mas não possuía sistemas de circulação de ar ou temperatura controlada. Durante o verão, uma tela de sombreamento foi adicionada na face oeste da casa de vegetação telada para ajudar a reduzir a carga de calor no final da tarde. Para facilitar a avaliação dos sintomas, as três repetições foram plantadas uma ao lado da outra na mesma fileira, e cada fileira constituía uma cultivar diferente. As árvores na casa de vegetação telada foram irrigadas por microaspersores. Para monitorar o título de CTV nas plantas da casa de vegetação telada, foi realizada a PCR quantitativa em tempo real por transcrição reversa (RT-qPCR) com iniciadores universais e específicos para cepa e sondas TaqMan. O título de CTV foi monitorado sazonalmente. Todas as plantas foram mantidas em uma estrutura cítrica aprovada pelo Departamento de Alimentos e Agricultura da Califórnia (CDFA) sob licença e em conformidade com a Quarentena Interna Estadual §3407.
Avaliação fenotípica
Após quatro anos de crescimento na casa de vegetação telada, cada árvore foi decapitada ao nível do solo e a circunferência do tronco foi medida a 30 cm acima da união da gema. A biomassa da árvore foi medida pelo peso úmido da árvore inteira. O encanoamento do caule foi avaliado descascando o tronco acima da união da gema, bem como descascando ramos. O melhor local para observar o encanoamento do caule foi nos ramos que se desenvolveram no último ou nos dois últimos anos.
Análises químicas
Um ano após as infecções, todas as árvores utilizadas neste estudo tiveram três folhas coletadas e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido. As amostras foram armazenadas a -20°C até processamento posterior. As amostras foram processadas pulverizando os tecidos foliares em nitrogênio líquido com almofariz e pistilo. Um total de 0,1 g de tecido foliar pulverizado foi então pesado e colocado em cada um de dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL identificados separadamente. Um desses tubos teve o tecido extraído duas vezes em 0,5 mL de metanol (Thermo-Fisher, Pittsburgh, EUA) a 4°C durante a noite em cada extração, com as duas extrações combinadas para um total de 1 mL de extrato de metanol. Outro tubo teve o tecido extraído duas vezes em 0,5 mL de metil terc-butil éter (MTBE) (Millipore-Sigma, St. Louis, EUA), com 0,1% (v/v) de n-pentadecano (Millipore) adicionado como padrão interno, a 4°C durante a noite em cada extração, para um total de 1 mL de extrato de MTBE.
Para analisar compostos fenólicos, 50 µL do extrato metanólico foi injetado em um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) baseado em bomba LC-20AD da Shimadzu (Columbia, MD, EUA) com uma coluna Supelco Ascentis RP-18 (25 cm x 4,6 mm de diâmetro interno x 5 µm de tamanho de partícula), mantida a 50°C em um forno de coluna, e lida com um detector de arranjo de fotodiodos SPD-20 da Shimadzu. Um gradiente binário foi utilizado para passar de 95% de solvente A (água com 0,2% (v/v) de ácido acético) (Millipore) para 100% de solvente B (metanol com 0,2% de ácido acético) e retornar em 40 minutos, conforme descrito. Os picos foram lidos a 280 nm. Condições semelhantes foram utilizadas para processar amostras selecionadas para cada combinação de tratamento em um sistema HPLC Shimadzu equipado com um espectrômetro de massas LC-MS2020 da Shimadzu. Isso permitiu a obtenção de espectros de massa para cada pico e, juntamente com os espectros UV/Visível e os tempos de retenção, possibilitou identificações putativas dos picos quando comparadas com informações semelhantes na literatura publicada. Uma seleção de padrões foi obtida da Millipore-Sigma para criar curvas padrão para converter os compostos em valores de mg/g de peso fresco para cada classe principal de compostos e para identificar definitivamente certos picos.
Para analisar compostos terpenoides, 2 µL do extrato de MTBE foi injetado em um cromatógrafo a gás-espectrômetro de massas (GC-MS) Shimadzu QP2010S equipado com uma coluna SHRXI-5MS (30 cm x 0,25 mm x 0,25 µm) e utilizando hélio como gás de arraste a uma velocidade linear constante de 30 cm/s. O gradiente do forno foi de 60°C a 200°C em 35 min, depois a 250°C em 8 min e 20 s, seguido por uma manutenção a 250°C por 6 min e 40 s, totalizando 45 min de corrida. Os picos foram identificados e quantificados por padrões comerciais obtidos da Millipore-Sigma.
Para analisar aminoácidos, 100 µL do extrato metanólico foi utilizado com o kit de aminoácidos EZ-FAAST da Phenomenex (Torrance, CA, EUA) para cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (GC-FID) e a coluna Zebron AA fornecida pela Phenomenex. Os procedimentos do kit EZ-FAAST foram seguidos rigorosamente, e os padrões interno e externo incluídos foram utilizados para identificar e quantificar os picos de compostos derivatizados.
Para analisar açúcares/carboidratos, 50 µL do extrato metanólico foi injetado em um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência baseado em bomba LC-10AD da Shimadzu (Columbia, MD, EUA) com uma coluna Supelcogel (Millipore-Sigma) H (25 cm x 4,8 mm de diâmetro interno x 9 µm de tamanho de partícula) mantida em um aquecedor de coluna a 40°C. O solvente foi ácido fosfórico 0,1 M (Thermo-Fisher) e foi fornecido de forma isocrática a 0,1 mL/min por 60 minutos por amostra. Os resultados foram registrados em um detector de índice de refração RID-10 da Shimadzu. Curvas padrão foram feitas para sacarose, glicose e frutose utilizando as mesmas condições das amostras.
Análises estatísticas
Análises de variância (ANOVA), quando os pressupostos de normalidade foram atendidos conforme avaliado por gráficos de resíduos, foram utilizadas para determinar os efeitos de tratamento do cultivar, status de infecção por CTV e a interação sobre os títulos de CTV, sintomas e níveis totais de cada classe de composto (fenólicos, terpenoides ou aminoácidos) e níveis individuais de açúcares (frutose e glicose). Testes de Tukey HSD foram utilizados para comparações pareadas subsequentes. Testes de Kruskal-Wallis ou Mann-Whitney U foram utilizados quando os pressupostos de normalidade não foram atendidos. Para compostos individuais, MANOVAs foram realizadas usando cultivar, status de infecção por CTV e a interação como variáveis, seguidas por ANOVAs nos compostos individuais e então separações por testes de Tukey HSD. Todas essas estatísticas foram realizadas no SPSS versão 24.0 (IBM, Armonk, NY, EUA).

Além disso, o perfil de metabólitos foi conduzido para revelar o acúmulo diferencial de fenólicos, terpenoides, aminoácidos e açúcares selecionados, para verificar se esses compostos poderiam ser usados para discriminar espécies de citros, bem como entre plantas saudáveis e infectadas com CTV. Assim, a análise discriminante canônica linear stepwise (CDA) foi realizada utilizando o programa estatístico JMP Pro versão 15.2.0 (SAS Institute Inc., NC, EUA). A CDA utilizou dados de metabólitos de cada espécie de citros de controles inoculados com mock (saudáveis) e árvores inoculadas com CTV (leve e severa) com fenólicos, terpenoides ou aminoácidos como variáveis dependentes. Apenas as dez principais variáveis de cada classe foram utilizadas para evitar superajuste dos modelos. Os modelos foram autotestados com os mesmos dados para determinar sua precisão na identificação de espécies de citros e status de infecção.

Resultados

Efeitos do cultivar e do status de infecção por CTV no título observado, na canelura do caule e no crescimento da planta

Para simplificar, as cepas de CTV foram organizadas em duas classes: leve e severa (Tabela 1). ANOVA observou que os títulos das duas classes de CTV apresentaram valores de Ct mais baixos, o que indica títulos maiores, do que os controles saudáveis (F2, 162 = 755,904; P < 0,001), e cepas severas de CTV tiveram valores de Ct ainda mais baixos do que as cepas leves. A espécie de citros também afetou significativamente os títulos, com Oro Blanco apresentando títulos mais baixos de CTV, enquanto laranjas doces Navel e Valencia possuíam títulos altos (F5, 162 = 3,532; P = 0,005) (Fig 2). Não houve interação significativa entre classe de CTV e tipo de citros (F10, 162 = 1,322; P = 0,223). Independentemente disso, foram realizados efeitos das classes de CTV sobre os títulos dentro de cada classe de citros, com diferenças gerais sendo que as cepas severas geralmente apresentaram títulos significativamente maiores (P < 0,05) do que as classes de cepas leves, exceto para Oro Blanco (Fig 2).

Títulos de CTV.

Títulos de CTV (± EP) (como valores de Ct de PCR em tempo real, com valores menores representando títulos maiores) em árvores cítricas saudáveis, infectadas com cepa leve de CTV e infectadas com cepa severa de CTV. Letras diferentes representam médias significativamente diferentes pelos testes de Tukey HSD para cada espécie de citros individualmente.

Cepas de CTV leves e severas utilizadas neste estudo.
CTV Characterization CTV Isolate Name CTV Strain Type Mild CCTEA 65 S1-mild P09.1b T36-mild Mur-AT4 T30-mild CCTEA 115 RB-mild Severe CCTEA 441 VT-severe RH VT-severe Svl VT-severe SY568 VT-severe P108-AT39 VT-severe
Testes de Kruskal-Wallis não paramétricos revelaram diferenças significativas entre as cultivares no desenvolvimento de depressão no caule (X²5, 113 = 20,300; P = 0,001). Testes de Mann-Whitney U de acompanhamento (P < 0,05) revelaram mais depressão no caule com CTV severo em todas as outras espécies de citros do que em Lisboa, e mais depressão no caule em Oro Blanco do que em Murcott (Fig 3A). Testes de Kruskal-Wallis e testes de Mann-Whitney U também observaram mais depressão no caule em cepas severas de CTV do que em cepas atenuadas ou controles (X²2, 116 = 31,698; P < 0,001) (Fig 3A).
Doença e medições de crescimento das árvores.
Medições de doença e crescimento de árvores saudáveis e infectadas com CTV. A) Classificação de depressão no caule (0–5) (± EP) para cada cultivar de citros que estava saudável, infectada com cepa atenuada de CTV ou infectada com cepa severa de CTV. Letras diferentes representam médias significativamente diferentes pelos testes de Mann-Whitney U para cada espécie de citros individualmente. B) Peso médio (± EP) da biomassa para árvores saudáveis e infectadas. C) Diâmetro médio (± EP) do tronco a 30 cm do nível do solo para árvores saudáveis e infectadas.
O peso das árvores diferiu devido à cultivar de citros (F5, 101 = 35,545; P < 0,001), com árvores de Lisboa pesando mais do que todas as outras espécies de árvores, Oro Blanco pesando mais do que todas as outras espécies, exceto Lisboa, e árvores de Murcott pesando mais do que árvores de Navel (Fig 3B). O peso das árvores também diferiu devido à classe de CTV (F2, 101 = 4,949; P = 0,009), com maiores pesos em árvores infectadas com cepas atenuadas de CTV do que em controles saudáveis (Fig 3B). Não houve efeito de interação significativo entre cultivar de citros e classe de CTV no peso das árvores (F10, 101 = 1,643; P = 0,105).
O diâmetro do tronco das árvores a 30 cm da linha do solo não diferiu devido à classe de CTV (F2, 101 = 2,346; P = 0,101), mas variou devido à espécie de citros (F5, 101 = 21,094; P < 0,001), com Oro Blanco apresentando diâmetros maiores do que as outras espécies de árvores, exceto Lisboa, e Lisboa e Valência apresentando diâmetros maiores do que Minneola, Murcott e Navel (Fig 3C). A interação entre tipo de citros e tipo de CTV foi significativa (F10, 101 = 3,253; P = 0,001), mas nenhum padrão discernível foi observado por trás dela.
Efeitos da cultivar e do status de infecção por CTV nos níveis fenólicos
Os níveis fenólicos totais diferiram entre as cultivares de citros (F5, 162 = 68,650; P < 0,001), com Oro Blanco possuindo mais níveis fenólicos do que todos os outros citros, e Lisboa e Murcott com mais níveis fenólicos do que Minneola, Navel e Valência (Fig 4). Os níveis fenólicos totais não foram diferentes devido ao status de infecção (F2, 162 = 2,296; P = 0,104). Não houve interação significativa entre cultivar de citros e status de CTV (F10, 162 = 1,028; P = 0,422).
Soma total de todos os compostos fenólicos.
Média dos níveis totais de compostos fenólicos (± EP) para cada cultivar de citros que era saudável, infectada com estirpe leve de CTV ou infectada com estirpe severa de CTV. Letras diferentes representam médias significativamente diferentes pelos testes de Tukey HSD para cada espécie de citros individualmente.

A MANOVA dos compostos fenólicos individuais revelou efeitos significativos da cultivar (traço de Pillai = 4,470; F = 35,549; P < 0,001), do status de infecção por CTV (traço de Pillai = 0,931; F = 3,596; P < 0,001) e da interação entre cultivar e status de CTV (traço de Pillai = 3,099; F = 1,964; P < 0,001). Testes ANOVA de acompanhamento revelaram efeitos significativos da cultivar em todos os compostos fenólicos (Fig 5 e Tabela A no Apêndice S1). A cultivar Lisbon apresentou níveis significativamente maiores de 14 fenóis (apigenina 6-C-glucosil-7-O-(6-malil-glicosídeo), didimina, eriocitrina, hesperidina, isoroifolina-4-glicosídeo, lucenina-2, lucenina-2 4-metil éter, luteolina-7-rutinosídeo, naringina, narirutina, estelarina-2, vicenina-2, flavanona desconhecida 1 e flavona desconhecida 2) do que todas as outras cultivares, e a cultivar Murcott apresentou níveis significativamente maiores de 10 fenóis (heptametoxiflavona, hexametoxiflavona, hexametil-O-quercetagetina, isosinensetina, natsudaidaina, nobiletina, sinensetina, tangeretina, tetrametil-O-escutelareína, éster metílico de flavonol desconhecido e flavona polimetoxilada desconhecida) do que a maioria das outras cultivares (Tabela A no Apêndice S1).

Mapa de calor dos níveis de compostos individuais entre os tratamentos.

Mapa de calor mostrando diferentes padrões de níveis de compostos individuais para A) fenóis, B) terpenoides ou C) aminoácidos entre cultivares e árvores com diferentes status de infecção. Para estatísticas de suporte, consulte as tabelas ANOVA fornecidas no Apêndice S1.

Testes ANOVA de acompanhamento também revelaram que o status de CTV afetou significativamente os níveis de compostos fenólicos (Tabela A no Apêndice S1). Plantas com infecções por estirpe severa de CTV apresentaram níveis maiores de diosmina, estelarina-2, flavona desconhecida 1 e flavona polimetoxilada desconhecida do que plantas infectadas com estirpe leve de CTV. Plantas infectadas com CTV leve apresentaram níveis maiores de heptametoxiflavona, isoroifolina-4-glicosídeo, lucenina-2 4-metil éter, luteolina-7-rutinosídeo, nobiletina e flavona desconhecida 2 do que plantas infectadas com estirpes severas de CTV. Plantas saudáveis apresentaram níveis maiores de diosmina, roifolina e éster metílico de flavonol desconhecido do que plantas infectadas com estirpe leve de CTV. Por fim, plantas saudáveis apresentaram níveis maiores de hesperetina-7-O-glicosídeo e flavona desconhecida 2 do que plantas infectadas com estirpes severas de CTV. As ANOVAs de acompanhamento para as interações entre cultivar e status de infecção foram significativas para diosmina, heptametoxiflavona, isosinensetina, luteolina-7-rutinosídeo, natsudaidaina, nobiletina, roifolina, tangeretina, flavona desconhecida 1, flavona desconhecida 2, éster metílico de flavonol desconhecido, flavona polimetoxilada desconhecida e dímero de flavona polimetoxilada desconhecido (Tabela A no Apêndice S1).

Efeitos da cultivar e do status de infecção por CTV nos níveis de terpenoides
Os níveis totais de terpenoides foram significativamente diferentes entre os tipos de citros (F5, 162 = 72.928; P < 0.001), mas não diferiram entre os tratamentos de infecção por CTV (F2, 162 = 0.567; P = 0.568). Não houve interação significativa entre cultivar e tratamento de infecção por CTV (F10, 162 = 1.009; P = 0.438). Lisbon apresentou níveis de terpenoides maiores do que todos os outros citros, Murcott apresentou quantidades maiores do que todos os outros citros, exceto Lisbon, e Navel apresentou quantidades maiores do que Minneola, Oro Blanco e Valencia (Fig 6).

Total somado de todos os compostos terpenoides.

Média dos níveis totais de terpenoides (± SE) para cada cultivar de citros que estava saudável, infectada pela cepa leve de CTV ou infectada pela cepa grave de CTV.

Assim como para os fenóis, a MANOVA dos compostos terpenoides individuais revelou efeitos significativos do cultivar (traço de Pillai = 4.175; F = 28.749; P < 0.001), do status de infecção por CTV (traço de Pillai = 0.671; F = 2.807; P < 0.001) e da interação entre cultivar e status de CTV (traço de Pillai = 2.370; F = 1.826; P < 0.001).

Testes ANOVA de acompanhamento revelaram efeitos significativos do cultivar em todos os terpenoides, exceto α-felandreno (Fig 5 e Tabela B no Apêndice S1). Murcott apresentou níveis maiores de 12 terpenoides individuais (α-pineno, α-terpineno, α-terpinoleno, cis-β-ocimeno, trans-β-ocimeno, β-pineno, γ-terpineno, canfeno, damasceona isômero 2, linalol, p-cimeno e um terpenoide desconhecido/não identificado) do que a maioria das outras cultivares, e Lisbon apresentou níveis maiores de 11 terpenoides individuais (β-cariofileno, β-mirceno, trans-β-ocimeno, β-pineno, acetato de bornila, canfeno, carvona, citral, um damasceona isômero 1, limoneno e mirtenol) do que as outras cultivares, exceto Murcott. Para os compostos restantes, os resultados foram variáveis (Tabela B no Apêndice S1).

Testes ANOVA revelaram que o status de infecção por CTV afetou significativamente apenas α-terpineno (plantas saudáveis e infectadas com cepa leve de CTV apresentaram níveis maiores do que plantas infectadas com cepas graves de CTV), β-pineno (plantas infectadas com cepa leve de CTV apresentaram níveis maiores do que plantas infectadas com cepas graves de CTV e controles), linalol (plantas infectadas com CTV leve apresentaram níveis maiores do que plantas saudáveis) e p-cimeno (plantas infectadas com cepa grave de CTV apresentaram níveis maiores do que plantas infectadas com CTV leve) (Tabela B no Apêndice S1). ANOVAs de acompanhamento para as interações entre cultivar e status de infecção foram significativas para α-terpineno, α-terpinoleno, linalol, p-cimeno e pulegona (Tabela B no Apêndice S1).

Efeitos do cultivar e do status de infecção por CTV nos níveis de aminoácidos e açúcares das plantas

Os níveis totais de aminoácidos diferiram entre as diferentes cultivares de citros (F5, 161 = 28.611; P < 0.001), com Murcott possuindo mais aminoácidos do que todos os outros citros (Fig 7). Navel teve mais aminoácidos do que Lisbon, Oro Blanco e Valencia. Minneola teve mais do que Lisbon e Oro Blanco. Oro Blanco teve a menor quantidade de aminoácidos entre todas as cultivares de citros testadas.

Total somado de todos os compostos de aminoácidos.
Média dos níveis totais de aminoácidos (± EP) para cada cultivar de citros que era saudável, infectada com estirpe leve de CTV ou infectada com estirpe severa de CTV. Letras diferentes representam médias significativamente diferentes pelos testes de Tukey HSD para cada espécie de citros individualmente.

O status do CTV também afetou os níveis totais de aminoácidos em todas as cultivares, com citros infectados com estirpes severas de CTV apresentando níveis maiores de aminoácidos totais do que citros infectados com estirpes leves de CTV ou árvores saudáveis (F2, 161 = 17,708; P < 0,001). Não houve interação significativa entre cultivar de citros e status de infecção por CTV (F10, 161 = 1,729; P = 0,078).

A MANOVA nos aminoácidos individuais revelou efeitos significativos da cultivar (traço de Pillai = 3,823; F = 25,116; P < 0,001), do status de infecção por CTV (traço de Pillai = 0,722; F = 4,285; P < 0,001) e da interação entre cultivar e status de infecção por CTV (traço de Pillai = 2,159; F = 2,202; P < 0,001). Testes ANOVA de acompanhamento revelaram efeitos significativos da cultivar em todos os aminoácidos (Fig 5 e Tabela C no Apêndice S1). Para quase todos os aminoácidos (com exceção da asparagina), Murcott apresentou níveis significativamente maiores do que pelo menos três das outras cultivares. Oro Blanco apresentou quantidades significativamente menores de todos os aminoácidos individuais, exceto asparagina. Para a asparagina, Minneola apresentou níveis maiores do que todas as outras cultivares, exceto Navel, e Navel apresentou níveis maiores do que Lisbon e Valencia.

Testes ANOVA revelaram que o tipo de infecção por CTV afetou significativamente oito aminoácidos individuais (Tabela C no Apêndice S1). Destes, os testes de Tukey não observaram diferenças entre as estirpes para glutamina ou metionina. No entanto, folhas infectadas por estirpes severas de CTV apresentaram níveis maiores de ácido glutâmico, glicina, fenilalanina, prolina, triptofano e tirosina do que as estirpes leves. Os níveis de ácido glutâmico e prolina também foram maiores em folhas infectadas com estirpe severa de CTV do que nos controles não infectados. As ANOVAs de acompanhamento para as interações entre cultivar e status de infecção foram significativas para glutamina, isoleucina, leucina, lisina, fenilalanina, prolina, treonina, tirosina e valina (Tabela C no Apêndice S1).
Os níveis de frutose foram significativamente afetados pela cultivar (F5, 162 = 7,020; P < 0,001), mas não pelo estado de infecção pelo CTV (F2, 162 = 2,121; P = 0,123), e apresentaram interação significativa entre cultivar e estado de infecção pelo CTV (F10, 162 = 2,881; P = 0,002). Níveis mais elevados de frutose estavam presentes em árvores Minneola (107 ± 6 mg/g) e Valencia (100 ± 5 mg/g) do que em Navel (80 ± 4 mg/g) e Oro Blanco (82 ± 4 mg/g). As árvores Lisbon (90 ± 5 mg/g) e Murcott (94 ± 4 mg/g) ficaram entre esses valores. Observou-se que os níveis de glicose eram diferentes entre as cultivares (F5, 162 = 6,007; P < 0,001), mas não devido ao estado de infecção pelo CTV (F2, 162 = 0,837; P = 0,435). Houve interação significativa entre cultivar e estado de infecção (F15, 162 = 4,014; P < 0,001). Níveis mais elevados de glicose estavam presentes em árvores Lisbon (273 ± 15 mg/g; média ± EP) do que em Murcott (206 ± 8 mg/g) e Oro Blanco (218 ± 15 mg/g). Os níveis em Minneola (256 ± 17 mg/g), Navel (236 ± 14 mg/g) e Valencia (227 ± 11 mg/g) ficaram entre esses valores.
Análise discriminante canônica (CDA) do estado de infecção pelo CTV em diferentes cultivares de citros com base no perfil metabolômico
O perfil metabolômico de citros infectados com diferentes cepas de CTV revelou acúmulo diferencial de compostos fenólicos, terpenoides, aminoácidos e açúcares selecionados entre citros com diferentes estados de infecção pelo CTV. Assim, este conjunto robusto de dados metabolômicos foi utilizado para verificar se compostos fenólicos, terpenoides e aminoácidos poderiam ser usados para discriminar entre diferentes cultivares de citros e diferentes estados de CTV dentro de uma cultivar. Além disso, os metabólitos mais importantes dentro dessas classes para a discriminação foram identificados. Para isso, foi realizada uma análise discriminante canônica linear stepwise (CDA) de diferentes cultivares de citros e de citros saudáveis e infectados com CTV leve e severo, utilizando compostos fenólicos, terpenoides e aminoácidos selecionados como variáveis dependentes. Apenas os dez metabólitos mais variáveis de cada classe foram utilizados nas CDAs para evitar o superajuste dos modelos. Esses metabólitos estão listados na Tabela 2 e na Tabela A no Apêndice S1. As CDAs de diferentes cultivares com compostos fenólicos, terpenoides e aminoácidos foram capazes de prever a cultivar correta de cada amostra com pelo menos 98% de precisão para cada classe de metabólito (Tabela B no Apêndice S1). Isso destaca as diferenças significativas desses vários metabólitos entre as diferentes cultivares de citros utilizadas. Devido às diferenças significativas, a CDA do estado de CTV foi realizada separadamente para cada cultivar. Consequentemente, os compostos fenólicos, terpenoides e aminoácidos ideais para a CDA diferiram entre cada cultivar de citros (Tabela 2).
Dez compostos fenólicos, terpenoides e aminoácidos mais variáveis identificados na CDA.
Cultivar de Citros Fenólicos Terpenoides Aminoácidos Lisboa uk Flavona 1 uk terpenoide 1 Alanina Naringina α-Pineno Glicina Eriocitrina β-Mirceno Serina uk Flavanona 1 δ-3-Careno Prolina Hesperidina para-Cimeno Ácido aspártico uk Dímero de flavona polimetoxilada cis-β-Ocimeno Metionina uk Flavona polimetoxilada trans-β-Ocimeno Ácido glutâmico Isosinensetina α-Terpineno Ornitina Nobiletina Pulegona Tirosina Tangeretina Damasceona 2 Triptofano Minneola uk Flavona 2 α-pineno Glicina Lucenina-2 Canfeno Isoleucina Vicenina-2 δ-3-Careno Treonina uk Flavanona 1 para-Cimeno Serina Lucenina-2 4-metil éter Linalol Prolina uk Dímero de flavona polimetoxilada Carvona Ácido aspártico uk Éster metílico de flavonol β-Cariofileno Ácido glutâmico Sinensetina uk terpenoide 3 Glutamina Nobiletina γ-Terpineno Ornitina Natsudaidaina Damasceona 2 Tirosina Murcote uk Flavona 1 Canfeno Valina Luteolina-7-rutinosídeo β-Mirceno Leucina Lucenina-2 para-Cimeno Serina Vicenina-2 Limonenio Prolina Eriocitrina Linalol Ácido aspártico Stelarina-2 α-Terpineno Metionina Diosmina Pulegona Ácido glutâmico uk Dímero de flavona polimetoxilada Acetato de bornila Lisina Nobiletina Damasceona 1 Tirosina Natsudaidaina Damasceona 2 Triptofano Navel uk Flavona 2 β-Mirceno Alanina Apigenina 6-C-glucosil-7-O-(6-malil-glicosídeo) δ-3-Careno Glicina Naringina Limonenio Treonina Hesperetina-7-O-glicosídeo cis-β-Ocimeno Serina Hesperidina trans-β-Ocimeno Prolina Diosmina α-Terpinoleno Asparagina Crisoeriol-7-O-rutinosídeo Linalol Ácido glutâmico uk Éster metílico de flavonol Citral Glutamina Hexametil-O-quercetagetina Mircenol Histidina Nobiletina Damasceona 2 Triptofano Oro Blanco Luteolina-7-rutinosídeo Canfeno Leucina Isoroifolina-4-glicosídeo β-Pineno A Isoleucina Lucenina-2 β-Mirceno Treonina Roifolina α-Felandreno Serina Hesperidina para-Cimeno Prolina Rutina Citral Metionina Lucenina-2 4-metil éter β-Cariofileno Ácido glutâmico Diosmina α-Terpineno Fenilalanina uk Dímero de flavona polimetoxilada Pulegona Ornitina uk Éster metílico de flavonol Acetato de bornila Tirosina Valência Luteolina-7-rutinosídeo α-Pineno A Alanina Isoroifolina-4-glicosídeo β-Pineno Valina Vicenina-2 β-Mirceno Isoleucina Didimina α-Felandreno Serina Hesperetina-7-O-glicosídeo δ-3-Careno Prolina Stelarina-2 cis-β-Ocimeno Asparagina Lucenina-2 4-metil éter Carvona Ácido aspártico Sinensetina β-Cariofileno Ácido glutâmico Tetrametil-O-escutelareína Pulegona Fenilalanina Heptametoxiflavona Damasceona 2 Tirosina
Os 10 fenóis, terpenoides e aminoácidos mais variáveis identificados na ACD de plantas inoculadas com mock (saudáveis) e infectadas com CTV dentro de cada cultivar.
Gráficos canônicos gerados a partir de CDA utilizando compostos fenólicos revelaram que citros saudáveis tenderam a se agrupar mais distantes de citros infectados com CTV, enquanto citros infectados com cepas leves e severas de CTV se agruparam mais próximos entre si (Fig 8). Isso foi verdadeiro na maioria das cultivares, exceto em Lisboa e Navel. Embora os citros infectados com CTV leve tenham tendido a se agrupar mais próximos dos citros com CTV severo, eles ainda se agruparam de forma separada de maneira eficaz. Amostras pertencentes a um status específico de CTV foram agrupadas corretamente, com pelo menos 97% de precisão geral entre as cultivares (Tabela 3).
Gráficos canônicos utilizando os 10 compostos fenólicos individuais mais variáveis.
Gráficos canônicos de diferentes plantas exibindo sintomas leves (triângulo verde), severos (losango azul) ou ausentes (círculo vermelho) após inoculação com CTV ou simulada, dentro de cada cultivar de citros. Os canônicos foram gerados por análise discriminante stepwise utilizando os 10 fenóis mais variáveis entre plantas diferencialmente infectadas de cada cultivar. As elipses externas representam 50% estimados das amostras dentro de uma cultivar, e as elipses internas mostram a região de 95% de confiança das médias da cultivar.
CDA utilizando compostos fenólicos.
    Contagem Prevista Precisão Cultivar Status de Infecção por CTV Saudável Leve Severo % de Acerto % Global Lisboa Saudável 3 0 0 100% 97% Leve 0 12 0 100% Severo 0 1 14 93% Minneola Saudável 3 0 0 100% 97% Leve 0 12 0 100%   Severo 0 1 14 93%   Murcott Saudável 3 0 0 100% 100% Leve 0 12 0 100% Severo 0 0 15 100% Navel Saudável 3 0 0 100% 100% Leve 0 12 0 100%   Severo 0 0 15 100%   Oro Blanco Saudável 3 0 0 100% 97% Leve 0 11 1 92%   Severo 0 0 15 100%   Valência Saudável 3 0 0 100% 97% Leve 0 12 0 100%   Severo 0 1 14 93%  
CDA utilizando compostos fenólicos entre árvores saudáveis, infectadas com CTV leve e infectadas com CTV severo dentro de cada cultivar de citros. Diferentes cultivares de citros eram saudáveis (inoculadas simuladamente) ou infectadas com cepas leves ou severas de CTV.
A CDA do status de CTV com terpenoides produziu resultados semelhantes em comparação com os fenóis. Gráficos canônicos gerados a partir de CDA utilizando terpenoides mostram que todos os tipos de tratamento se agruparam separadamente uns dos outros, com citros infectados com CTV leve e severo se agrupando mais próximos entre si do que com citros saudáveis (Fig 9), assim como com os fenóis. Isso foi verdadeiro para a maioria das cultivares, exceto Navel e Oro Blanco. No geral, as amostras foram atribuídas ao tratamento correto dentro de cada cultivar com alta precisão (Tabela 4). A maioria das cultivares teve suas amostras corretamente atribuídas com 97% de precisão, enquanto Minneola e Navel apresentaram 90% e 87% de atribuições corretas das amostras, respectivamente.
Gráficos canônicos utilizando os 10 compostos terpenoides individuais mais variáveis.
Gráficos canônicos de diferentes plantas exibindo sintomas leves (triângulo verde), graves (losango azul) ou ausentes (círculo vermelho) após inoculação com CTV ou inoculação simulada, dentro de cada cultivar de citros. Os canônicos foram gerados por análise discriminante stepwise utilizando os 10 terpenoides mais variáveis entre plantas diferencialmente infectadas de cada cultivar. As elipses externas representam 50% estimados das amostras dentro de uma cultivar, e as elipses internas mostram a região de confiança de 95% das médias da cultivar.
ACD utilizando terpenoides.
    Contagem Prevista Precisão Cultivar Status de Infecção por CTV Saudável Leve Grave % de Correspondência % Geral Lisboa Saudável 3 0 0 100% 97% Leve 0 12 0 100% Grave 0 1 14 93% Minneola Saudável 2 1 0 67% 90% Leve 0 11 1 91%   Grave 0 1 14 93%   Murcott Saudável 3 0 0 100% 100% Leve 0 12 0 100% Grave 0 0 15 100% Navel Saudável 2 0 1 67% 87% Leve 2 10 0 83%   Grave 1 0 14 93%   Oro Blanco Saudável 3 0 0 100% 97% Leve 0 12 0 100%   Grave 0 1 14 93%   Valência Saudável 3 0 0 100% 97% Leve 0 12 0 100%   Grave 0 1 14 93%  
ACD utilizando terpenoides entre árvores saudáveis, infectadas com CTV leve e infectadas com CTV grave dentro de cada cultivar de citros. Diferentes cultivares de citros foram saudáveis (inoculadas simuladamente) ou infectadas com cepas de CTV leve ou grave.
A ACD utilizando aminoácidos mostrou que citros infectados com CTV leve e grave tenderam a se agrupar mais próximos entre si do que com plantas saudáveis, exceto para laranjas Navel (Fig 10). Apesar disso, todos os tratamentos se agruparam suficientemente distantes uns dos outros em todas as cultivares, com amostras de metade das cultivares agrupando-se corretamente com 97% de precisão (Tabela 5). Amostras da outra metade das cultivares agruparam-se com 90–93% de precisão. No geral, esses dados sugerem que todos os três grupos de metabólitos podem ser usados para discriminar efetivamente o estado de saúde do CTV em citros, embora fenóis e terpenoides tenham sido mais eficazes que aminoácidos. Esses resultados destacam as mudanças que esses grupos de metabólitos em citros sofrem coletivamente durante a infecção pelo CTV.
Gráficos canônicos utilizando os 10 aminoácidos individuais mais variáveis.
Gráficos canônicos de diferentes plantas exibindo sintomas leves (triângulo verde), graves (losango azul) ou ausentes (círculo vermelho) após inoculação com CTV ou inoculação simulada, dentro de cada cultivar de citros. Os canônicos foram gerados por análise discriminante stepwise utilizando os 10 aminoácidos mais variáveis entre plantas diferencialmente infectadas de cada cultivar. As elipses externas representam 50% estimados das amostras dentro de uma cultivar, e as elipses internas mostram a região de confiança de 95% das médias da cultivar.
ACD utilizando aminoácidos.
Contagem Prevista Precisão Cultivar Status de Infecção por CTV Saudável Leve Grave % de Acerto % Geral Lisbon Saudável 3 0 0 100% 97% Leve 0 11 0 100% Grave 0 1 14 93% Minneola Saudável 3 0 0 100% 93% Leve 0 12 0 100%   Grave 0 2 13 87%   Murcott Saudável 3 0 0 100% 97% Leve 0 12 0 100% Grave 0 1 14 93% Navel Saudável 3 0 0 100% 93% Leve 0 11 1 92%   Grave 0 1 14 93%   Oro Blanco Saudável 3 0 0 100% 97% Leve 0 12 0 100%   Grave 0 1 14 93%   Valencia Saudável 3 0 0 100% 90% Leve 0 10 2 83%   Grave 0 1 14 93%  
Análise de Discriminante Canônica (CDA) utilizando aminoácidos entre árvores saudáveis, infectadas com CTV leve e infectadas com CTV grave dentro de cada cultivar de citros. Diferentes cultivares de citros foram saudáveis (inoculadas com mock) ou infectadas com cepas leves ou graves de CTV.
Discussão
A avaliação das infecções por CTV revelou que as cepas categorizadas como graves atingiram significativamente títulos virais maiores do que as cepas leves, embora tenha existido alguma variação dependendo da cultivar. Da mesma forma, as cepas graves de CTV apresentaram significativamente mais enrugamento do caule (stem pitting) do que as cepas leves.
O perfil metabolômico dos principais grupos químicos (fenóis, terpenoides, aminoácidos e açúcares) revelou uma variabilidade substancial entre diferentes cultivares, que foi muito mais significativa do que as diferenças entre os tratamentos com CTV, conforme evidenciado por interações significativas em muitas das ANOVAs e MANOVAs. De fato, os compostos fenólicos e terpenoides já eram conhecidos por diferirem bastante entre as diferentes cultivares de citros utilizadas neste estudo (toranja, limão, tangerina e laranjas doces). Devido à disparidade na variabilidade dos compostos, foi necessário avaliar as diferenças metabólicas dentro de cultivares específicas.
Dito isso, algumas tendências gerais devido às classificações das cepas de CTV foram consistentes em todas as cultivares. Para fenóis solúveis, os níveis gerais em plantas infectadas com cepas graves de CTV foram menores do que os controles saudáveis. Isso pode ser devido ao fato de as cepas graves neutralizarem as respostas das plantas hospedeiras para reduzir os níveis de fenóis solúveis, talvez para bloquear a formação de paredes celulares, já que muitos fenóis são precursores de polifenóis, como lignina e taninos, que compõem as paredes celulares. As cepas graves de CTV também podem induzir paredes celulares mais espessas, o que, por sua vez, removeria alguns dos fenóis. Finalmente, as reduções nos fenóis podem ser devidas a uma mudança no fotossintato, desviando-o dos fenóis para os aminoácidos e açúcares.
Por outro lado, para os terpenoides totais, houve diferenças significativas entre as cultivares de citros. No entanto, o status de infecção por CTV não afetou os níveis gerais de terpenoides. Como as infecções por CTV parecem ter efeitos mínimos nos níveis de terpenoides do hospedeiro, parece que as medições dos níveis basais entre cultivares tolerantes e suscetíveis seriam mais significativas, apoiando assim o trabalho de Guarino et al..
Para os aminoácidos, as diferenças nos níveis gerais ocorreram tanto em função do cultivar quanto do estado de infecção. Notavelmente, infecções por cepas severas do CTV induziram o maior acúmulo de aminoácidos, cepas brandas do CTV resultaram em um aumento intermediário de aminoácidos, e árvores saudáveis apresentaram os menores níveis de aminoácidos. O aumento do conteúdo de aminoácidos livres em árvores infectadas pode ser resultado de quantidades substanciais de aminoácidos sendo utilizadas para replicação e montagem viral, criando efetivamente um "dreno" metabólico, conforme descrito para outros patossistemas planta-vírus. Além disso, os aminoácidos são precursores de muitos compostos relacionados à defesa (incluindo hormônios, proteínas e compostos fenólicos), portanto, o acúmulo pode ser devido a um aumento desses compostos. Contrariamente, os açúcares analisados neste estudo (frutose, sacarose e glicose) diferiram em função do cultivar, mas não devido ao estado de infecção pelo CTV. Como os açúcares estão associados a drenos metabolômicos, permanece não resolvido se a modulação de aminoácidos pelo CTV em citros se deve à criação de um "dreno" de recursos, necessitando de investigação adicional. No geral, esses achados foram inesperados e, por vezes, os padrões sugerem possíveis trade-offs entre metabólitos primários (nomeadamente aminoácidos) em detrimento de outros metabólitos secundários, especialmente compostos fenólicos. Os mecanismos responsáveis por essas alterações metabólicas permanecem desconhecidos e justificam estudos futuros.
Apesar dos achados básicos sobre alterações na química da planta hospedeira, a utilização da ACD revelou tendências maiores que as estatísticas tradicionais não detectaram. A utilização da ACD com compostos fenólicos, terpenoides e aminoácidos mostrou que apenas os dez metabólitos mais variáveis de cada classe foram capazes de diferenciar citros saudáveis de árvores infectadas pelo CTV e citros infectados com CTV brando de citros infectados com CTV severo. Destes, observou-se que os perfis fenólicos foram os mais precisos em distinguir o estado de infecção dentro do cultivar, variando de 97 a 100%. Isso pode ser, em parte, devido ao alto número de diferentes espécies moleculares fenólicas disponíveis para uso na ACD, o que é amplamente atribuível à sua diversidade estrutural e capacidade de serem detectadas.
Este estudo mostra o potencial que a CDA tem de ser uma ferramenta útil para o discernimento de tendências e padrões em mudanças bioquímicas que, de outra forma, não são prontamente observáveis. Além disso, a CDA pode potencialmente ser usada para identificar árvores infectadas e determinar se as infecções são causadas por estirpes severas ou leves do CTV. É claro que isso pressupõe que seja possível a consistência na padronização das amostras, incluindo o uso da mesma cultivar em condições de crescimento semelhantes. Da mesma forma, ainda é necessária uma compreensão mais completa sobre as diferenças na gravidade relativa das estirpes de CTV, pois presumivelmente diferentes estirpes poderiam, no final, resultar em sintomatologia semelhante e respostas do hospedeiro semelhantes. Mais pesquisas são necessárias para verificar se a CDA é consistentemente precisa em uma variedade maior de condições, mas ela representa uma ferramenta potencialmente poderosa para o manejo do CTV em pomares comerciais.

Informações complementares
Referências
O desafio contínuo do controle do Citrus tristeza virus
Passado e futuro de uma coleção centenária do Citrus tristeza virus: uma história de germoplasma cítrico da Califórnia
Um anticorpo monoclonal que discrimina estirpes do Citrus tristeza virus
Caracterização molecular de um epítopo estrutural que é amplamente conservado entre isolados severos de um vírus de planta
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Diferenciação e identificação rápida de potenciais cepas severas do vírus da tristeza dos citros por ensaios de reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa em tempo real
Seção 3407 Quarentena Interna do Vírus da Tristeza dos Citros
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Uma comparação da resposta metabolômica da videira à infecção por fungos ascomicetos que infectam a madeira
Mapeamento da diversidade genética e tecidual de 64 compostos fenólicos em espécies de Citrus usando uma abordagem UPLC-MS
Diálogo cruzado dinâmico entre o metabolismo primário do hospedeiro e vírus durante infecções em plantas
10.1371/journal.pone.0268255.r001
Carta de Decisão 0
Šiler
Branislav T.
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15 de Março de 2022
PONE-D-22-03106Perfis de aminoácidos, açúcares, fenóis e terpenóides são capazes de distinguir o estado de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em folhas de toranja, limão, tangerina e laranja docePLOS ONE
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A significância da análise de CDA é bastante questionável, de acordo com os relatórios dos revisores. Portanto, aprofundar a seção Discussão no sentido de esclarecer esses resultados e as conclusões construídas a partir deles deve ser o foco principal dos autores para a revisão do manuscrito. Esteja ciente dos comentários adicionais fornecidos no arquivo anexado pelo Revisor nº 1.

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3. Os autores disponibilizaram integralmente todos os dados subjacentes aos resultados de seu manuscrito?
   A política de dados da PLOS exige que os autores disponibilizem todos os dados subjacentes aos resultados descritos em seu manuscrito, sem restrições, com raras exceções (consulte a Declaração de Disponibilidade de Dados no arquivo PDF do manuscrito). Os dados devem ser fornecidos como parte do manuscrito ou de suas informações complementares, ou depositados em um repositório público. Por exemplo, além das estatísticas resumidas, os pontos de dados por trás de médias, medianas e medidas de variância devem estar disponíveis. Se houver restrições para compartilhar dados publicamente — por exemplo, privacidade dos participantes ou uso de dados de terceiros — elas devem ser especificadas.
   Revisor #1: Sim
   Revisor #2: Não

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4. O manuscrito é apresentado de forma inteligível e escrito em inglês padrão?
   A PLOS ONE não realiza revisão de texto (copyedit) em manuscritos aceitos, portanto, o idioma nos artigos submetidos deve ser claro, correto e inequívoco. Quaisquer erros tipográficos ou gramaticais devem ser corrigidos na revisão, portanto, anote quaisquer erros específicos aqui.
   Revisor #1: Sim
   Revisor #2: Sim

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5. Comentários de Revisão ao Autor
   Use o espaço fornecido para explicar suas respostas às perguntas acima. Você também pode incluir comentários adicionais para o autor, incluindo preocupações sobre publicação dupla, ética em pesquisa ou ética em publicação. (Carregue sua revisão como anexo se exceder 20.000 caracteres)
   Revisor #1: Este manuscrito "Perfis de aminoácidos, açúcares, fenólicos e terpenoides são capazes de distinguir o status de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em folhas de toranja, limão, tangerina e laranja doce" é bem organizado e fornece uma avaliação das mudanças nos níveis de aminoácidos, açúcares, fenólicos e terpenoides em cultivares saudáveis e infectadas com CTV de toranja, limão, tangerina e laranja doce. Os resultados podem melhorar a compreensão sobre as interações citrus-CTV e a bioquímica em plantas infectadas por CTV. O estudo demonstrou novidade e utilidade dos dados para distinguir a infecção por CTV severa e leve em árvores cítricas infectadas, portanto, este manuscrito pode ser publicado.
   Revisor #2: O manuscrito "Perfis de aminoácidos, açúcares, fenólicos e terpenoides são capazes de distinguir o status de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em folhas de toranja, limão, tangerina e laranja doce" fornece uma visão geral interessante de vários metabólitos em diferentes espécies de citros.
   O artigo é bastante inteligível. No entanto, não é publicável na versão atual.
   Considerando que a descoberta de diferenças nos perfis de metabólitos entre diferentes espécies e cultivares de citros é bem conhecida e geralmente relatada na literatura, esses dados não são novos.

Os autores afirmam que, usando seus dados, seria possível distinguir o status de infecção em plantas infectadas pelo CTV. Na minha opinião, essa afirmação não está correta, levando em consideração os resultados apresentados, pois as únicas diferenças significativas em função do status de infecção estão nos níveis de fenóis totais entre o status saudável e severo na cultivar Lisbon.

Os autores também escreveram "Oro Blanco teve a menor quantidade de aminoácidos entre todas as cultivares de citros testadas. O status do CTV também afetou os níveis totais de aminoácidos, com citros infectados por cepas severas de CTV apresentando níveis maiores de aminoácidos totais do que citros infectados por cepas leves de CTV ou árvores saudáveis (F2, 161 = 17,708; P < 0,001), mas na figura relativa .n5) os diferentes status de infecção apresentaram a mesma letra (a) e isso significa que não houve diferenças estatísticas significativas.

Achei difícil entender como os autores realizaram a análise CDA, quando não há diferenças significativas presentes nos níveis de metabólitos.

Por esse motivo, a discussão é atualmente muito especulativa e deve ser reescrita após apresentar os resultados de maneira correta.

Os níveis de cada metabólito em cada espécie/cultivar de citros devem ser fornecidos para controlar a confiabilidade da análise estatística, atualmente apenas para fins de revisão e, em seguida, carregados em um repositório público.

Na Fig. 2b e 2c e na Fig. 5: Não há letras ou símbolos mostrando diferenças significativas entre as espécies e cultivares de citros.

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6. Os autores da PLOS têm a opção de publicar o histórico da revisão por pares de seu artigo (o que isso significa?). Se publicado, isso incluirá sua revisão por pares completa e quaisquer arquivos anexados.
   Se você escolher "não", sua identidade permanecerá anônima, mas sua revisão ainda poderá ser tornada pública.
   Você quer que sua identidade seja pública para esta revisão por pares? Para obter informações sobre essa escolha, incluindo a retirada do consentimento, consulte nossa Política de Privacidade.
   Revisor #1: Não
   Revisor #2: Não
   [NOTA: Se os comentários do revisor foram enviados como um arquivo anexo, eles serão anexados a este e-mail e acessíveis através do site de submissão. Faça login em sua conta, localize o registro do manuscrito e verifique se há o link de ação "Visualizar Anexos". Se este link não aparecer, não há arquivos anexos.]
   Ao revisar sua submissão, faça o upload dos arquivos de figuras para a ferramenta de diagnóstico digital Preflight Analysis and Conversion Engine (PACE), https://pacev2.apexcovantage.com/. O PACE ajuda a garantir que as figuras atendam aos requisitos da PLOS. Para usar o PACE, você deve primeiro se registrar como usuário. O registro é gratuito. Em seguida, faça login e navegue até a aba UPLOAD, onde você encontrará instruções detalhadas sobre como usar a ferramenta. Se encontrar problemas ou tiver dúvidas ao usar o PACE, envie um e-mail para PLOS em figures@plos.org. Observe que os arquivos de Informações de Suporte não precisam passar por esta etapa.
   10.1371/journal.pone.0268255.r002
   Resposta do autor à Carta de Decisão 0
   5 de abril de 2022
   Perfis de aminoácidos, açúcares, fenóis e terpenóides são capazes de distinguir o estado de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em folhas de toranja, limão, tangerina e laranja doce
   Requisitos do Periódico: Devolução da Revisão até 29 de abril de 2022
   Ao enviar sua revisão, precisamos que você atenda a estes requisitos adicionais.
7. Certifique-se de que seu manuscrito atenda aos requisitos de estilo da PLOS ONE, incluindo os de nomenclatura de arquivos. Os modelos de estilo da PLOS ONE podem ser encontrados em
   https://journals.plos.org/plosone/s/file?id=wjVg/PLOSOne_formatting_sample_main_body.pdf e
   https://journals.plos.org/plosone/s/file?id=ba62/PLOSOne_formatting_sample_title_authors_affiliations.pdf.
   Resposta do Autor: O manuscrito foi editado para atender aos requisitos do periódico.
8. Inclua legendas para seus arquivos de Informações de Suporte no final do manuscrito e atualize todas as citações no texto para corresponder. Consulte nossas diretrizes de Informações de Suporte para mais informações: http://journals.plos.org/plosone/s/supporting-information.
   Resposta do Autor: Os arquivos de Informações de Suporte foram renomeados, legendas adicionadas ao final do manuscrito e citações no texto ajustadas para atender às diretrizes do periódico.
9. Revise sua lista de referências para garantir que esteja completa e correta. Se você citou artigos que foram retratados, inclua a justificativa para isso no texto do manuscrito, ou remova essas referências e substitua-as por referências atuais relevantes. Quaisquer alterações na lista de referências devem ser mencionadas na carta de réplica que acompanha seu manuscrito revisado. Se você precisar citar um artigo retratado, indique o status de retratação do artigo na lista de Referências e inclua também uma citação e referência completa do aviso de retratação.
   Resposta do Autor: A lista de referências foi editada para garantir que esteja completa e correta.
   Comentário do Editor:
   A significância da análise CDA é bastante questionável, de acordo com os relatórios dos revisores. Portanto, aprofundar a seção de Discussão no sentido de esclarecer esses resultados e as conclusões fundamentadas neles deve ser o foco principal dos autores na revisão do manuscrito. Esteja ciente de comentários adicionais fornecidos no arquivo anexado pelo(s) Revisor(es), se isso for aplicável a você.
   Resposta do Autor: No geral, pareceu haver alguma confusão sobre a natureza da CDA que resultou nos comentários questionando sua significância. Ou seja, as figuras, que representam as quantidades totais somadas de classes inteiras de compostos, foram presumidas como sendo usadas na CDA. Este não foi o caso, e, em vez disso, valores de compostos individuais foram utilizados, os quais foram consistentemente sugeridos como sendo significativamente diferentes devido ao status de infecção pela MANOVA. É sob essa luz que a CDA deve ser vista, e não tentando fazer comparações desiguais com as Figuras. O texto foi editado ao longo de todo o documento para tornar esse ponto mais claro. Uma nova Figura (Fig 5), um mapa de calor mostrando diferenças em compostos individuais, foi adicionada. Mover as Tabelas do arquivo Suplementar para o manuscrito poderia ser outra opção para esclarecer e apoiar as CDAs, mas isso torna o manuscrito ainda mais pesado. Dito isso, os autores não terão problema se o editor desejar fazer isso.

Comentários do Revisor 1:
Este manuscrito "Perfis de aminoácidos, açúcares, fenóis e terpenoides são capazes de distinguir o status de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em folhas de toranja, limão, tangerina e laranja doce" é bem organizado e fornece uma avaliação das mudanças no nível de aminoácidos, açúcares, fenóis e terpenoides em cultivares saudáveis e infectadas com CTV de toranja, limão, tangerina e laranja doce. Os resultados podem melhorar a compreensão sobre as interações citros-CTV e a bioquímica em plantas infectadas por CTV. O estudo demonstrou novidade e utilidade dos dados para distinguir a infecção por CTV severo e leve em árvores cítricas infectadas, portanto, este MS pode ser publicado.
O título deve ser alterado para: "Perfis de aminoácidos, açúcares, fenóis e terpenoides são capazes de distinguir o status de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em cultivares cítricas de toranja, limão, tangerina e laranja doce".

Resposta do Autor: O título foi alterado conforme sugerido.

Linha 24-30: Na parte do resumo (No entanto, a análise discriminante canônica (CDA) utilizando perfis de aminoácidos, terpenoides ou fenóis individuais foi capaz de classificar corretamente as amostras de folhas em variedades específicas de citros e identificar seu status de infecção com boa precisão. Esta análise distinguiu de forma confiável os citros infectados com estirpes leves de CTV daqueles infectados com estirpes severas de CTV. Coletivamente, este estudo revela padrões bioquímicos associados à gravidade das infecções por CTV que podem ser potencialmente utilizados para ajudar a identificar infecções por CTV de relevância econômica no campo.) - Deveria ser mais claro.
Resposta do Autor: Essas frases foram revisadas para ficarem mais claras.

Linha 55-76: Parte da introdução (Parágrafos 3 e 4) deve ser fundida e encurtada. A sintomatologia não deve ser tão destacada, pois a correlação com a gravidade dos sintomas e as mudanças metabólicas não foi mostrada claramente neste artigo.
Resposta do Autor: Os dois parágrafos mencionados foram combinados e bastante reduzidos para brevidade, conforme sugerido.
Referências citadas no texto não estão de acordo com o padrão da revista – devem ser corrigidas (numeração?).

A lista de referências bibliográficas deve estar de acordo com o padrão PLOS ONE. Consulte qualquer reimpressão recente do PLOS ONE e corrija-a de acordo.

Resposta do Autor: As referências foram reformatadas para atender às diretrizes da revista.

Linha 441: “Por fim, este estudo fornece uma visão única sobre os mecanismos bioquímicos associados ao CTV, estabelecendo padrões metabólicos distintos associados à gravidade diferencial da cepa de CTV 443.” – mecanismos bioquímicos – sinto que esses termos não são necessários aqui.

Resposta do Autor: Esta frase foi removida conforme solicitado.

Linha 443: “Este estudo mostra que as CDAs são uma ferramenta útil para discernir tendências e padrões em mudanças bioquímicas que, de outra forma, não são prontamente observáveis.” As CDAs poderiam ser úteis… pois é necessária mais padronização. Elas têm um potencial imenso para distinguir a infecção causada por cepas severas e leves, já que os antissoros, desenvolvidos como específicos (chamados) para CTV severo e leve, nem sempre funcionam. Como mencionado na introdução: “No entanto, 59 um estudo recente observando cepas MCA13+ e MCA13 negativas (MCA13-) infectando árvores nos 60 mesmos pomares não observou diferenças nos sintomas ou na produtividade (Yokomi et al. 2020).”

Resposta do Autor: Este ponto foi abordado adicionando uma nova frase ao parágrafo final, solicitando a necessidade de melhor descrever as cepas de CTV e a gravidade das doenças que causam. Uma nova Fig. 1 foi adicionada para mostrar a diferença entre a sintomatologia de CTV leve e severa em Washington Navel. O CTV severo causa depressões no caule (stem pitting) debilitantes em cultivares sensíveis de laranja e toranja, levando a nanismo, galhos quebradiços e redução da produtividade.

Comentários do Revisor 2:

O manuscrito "Perfis de aminoácidos, açúcares, fenólicos e terpenoides são capazes de distinguir o status de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em folhas de toranja, limão, tangerina e laranja doce" fornece uma visão geral interessante de vários metabólitos em diferentes espécies de citros.

O artigo é bastante inteligível. No entanto, não é publicável na versão atual.

Considerando que a descoberta de diferenças entre os perfis de metabólitos em diferentes espécies e cultivares de citros é bem conhecida e geralmente relatada na literatura, esses dados não são novos.

Resposta do Autor: Houve múltiplos efeitos significativos devido à cepa de CTV encontrados quando compostos individuais foram analisados, conforme indicado pelos testes MANOVA significativos (e ANOVA de acompanhamento) para fenólicos, terpenoides e aminoácidos, o que está claramente declarado no texto, mas reconhecidamente não representado nas figuras que examinam o total somado dessas classes de compostos. Examinar as Tabelas Suplementares torna isso claro. Também adicionamos uma nova Figura (Fig 5) para mostrar ainda mais essas diferenças. Portanto, essas descobertas são uma adição sólida aos relatos anteriores.
Autores afirmam que, utilizando seus dados, seria possível distinguir o status de infecção em plantas infectadas pelo CTV. Na minha opinião, essa afirmação não está correta, considerando os resultados apresentados, pois as únicas diferenças significativas em função do status de infecção estão nos níveis de fenóis totais entre o status sadio e severo na cultivar Lisboa.

Resposta do Autor: O revisor baseou este e outros comentários principalmente na análise das Figuras, mas não considerou as análises de MANOVA (e ANOVA subsequente) no texto que examinam compostos fenólicos, terpenoides e aminoácidos individuais, os quais variaram significativamente devido às infecções como um todo. Uma nova Figura (Figura 5) também mostra essas observações. Os compostos individuais foram utilizados nas análises de CDA, e não nos níveis totais somados dos compostos que compunham as Figuras 4, 6-7 e, portanto, foi possível chegar a outras conclusões.

Além disso, os autores escreveram: "Oro Blanco apresentou a menor quantidade de aminoácidos entre todas as cultivares de citros testadas. O status de CTV também afetou os níveis totais de aminoácidos, com citros infectados com estirpes severas de CTV possuindo níveis maiores de aminoácidos totais do que citros infectados com estirpes leves de CTV ou árvores sadias (F2, 161 = 17,708; P < 0,001), mas na figura relativa (.n5) os diferentes status de infecção apresentaram a mesma letra (a), o que significa que não há diferenças estatísticas significativas.

Resposta do Autor: Isso foi uma leitura equivocada do texto declarado, pois as frases não pretendiam fluir uma na outra. Um novo parágrafo foi inserido e uma cláusula de suporte para esclarecer os resultados da ANOVA de forma mais precisa, ou seja, quando as médias de plantas sadias, infectadas com estirpes leves ou severas de TODAS as cultivares foram consideradas, houve uma diferença significativa presente. Isso não foi representado pelas letras presentes na Figura 7 (anteriormente Figura 5), que se referia apenas a diferenças dentro de cultivares (não para diferenças entre todas as cultivares).

Achei difícil entender como os autores realizaram a análise de CDA, quando não há diferenças significativas nos níveis dos metabólitos. Por essa razão, a discussão é atualmente muito especulativa e deveria ser reescrita após apresentar os resultados de forma correta.

Resposta do Autor: Havia múltiplas diferenças consistentes presentes nos níveis de metabólitos individuais, conforme sugerido pelas MANOVAs significativas e pelas ANOVAs de acompanhamento descritas no texto. O mapa de calor na Fig. 5 mostra essas observações, e é apoiado pelo material suplementar. Uma rápida olhada nas Figuras seria enganosa, pois essas figuras focaram em quantidades somadas (níveis totais de fenóis, terpenoides ou aminoácidos), e não nos níveis de compostos individuais (que estão presentes no arquivo suplementar). As análises de CDA NÃO foram baseadas nos dados de compostos somados das figuras, mas sim nos dados de compostos individuais (conforme abordado nas várias Tabelas) e, portanto, devem ser interpretadas apenas sob essa luz.
Os níveis de cada metabólito em cada espécie/cultivar de citros devem ser fornecidos para controlar a confiabilidade da análise estatística, atualmente apenas para fins de revisão, e depois carregados em um repositório público.
Resposta do Autor: Os dados já foram carregados em um depósito, o Ag Data Commons, que é administrado pela Biblioteca Nacional de Agricultura dos Estados Unidos e é de livre acesso. Há um embargo até o início de abril, portanto, o arquivo carregado será fornecido com esta revisão para uso do editor e do revisor.
Nas Figs 2b e 2c e Fig. 5: Não há letras ou símbolos mostrando diferenças significativas entre as espécies e cultivares de citros.
Resposta do Autor: De fato, as letras representam diferenças do vírus para cada cultivar individual, não diferenças gerais entre cultivares ou diferenças gerais no status de infecção independentemente da cultivar. O texto fornece essas informações em vez disso.
10.1371/journal.pone.0268255.r003
Carta de Decisão 1
Šiler
Branislav T.
Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados.
13 Abr 2022
PONE-D-22-03106R1Os perfis de aminoácidos, açúcares, fenólicos e terpenoides são capazes de distinguir o status de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em folhas de toranja, limão, tangerina e laranja docePLOS ONE
Prezado Dr. Wallis,
Agradecemos por submeter seu manuscrito ao PLOS ONE. Após uma análise cuidadosa, consideramos que ele tem mérito, mas não atende totalmente aos critérios de publicação do PLOS ONE em seu estado atual. Portanto, convidamos você a submeter uma versão revisada do manuscrito que aborde os pontos levantados durante o processo de revisão.

Em sua resposta, os autores afirmaram que alteraram o título principal para "Os perfis de aminoácidos, açúcares, fenólicos e terpenoides são capazes de distinguir o status de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em cultivares de citros toranja, limão, tangerina e laranja doce", conforme sugerido pelo Revisor #1. No entanto, eles não o fizeram.
Adicione dois pontos após "cultivares".

Por favor, submeta seu manuscrito revisado até 28 de maio de 2022, às 23:59. Se precisar de mais tempo para concluir as revisões, responda a esta mensagem ou entre em contato com o escritório da revista pelo e-mail plosone@plos.org. Quando estiver pronto para submeter sua revisão, acesse https://www.editorialmanager.com/pone/ e selecione a pasta 'Submissões que Necessitam de Revisão' para localizar seu arquivo de manuscrito.
Uma carta de réplica que responda a cada ponto levantado pelo editor acadêmico e revisor(es). Você deve enviar esta carta como um arquivo separado intitulado 'Resposta aos Revisores'.
Uma cópia marcada do seu manuscrito que destaque as alterações feitas em relação à versão original. Você deve enviar isso como um arquivo separado intitulado 'Manuscrito Revisado com Controle de Alterações'.
Uma versão não marcada do seu artigo revisado, sem alterações controladas. Você deve enviar isso como um arquivo separado chamado 'Manuscrito'.
Inclua os seguintes itens ao enviar seu manuscrito revisado: Se desejar fazer alterações em sua declaração financeira, inclua sua declaração atualizada em sua carta de apresentação. Diretrizes para reenviar seus arquivos de figuras estão disponíveis abaixo dos comentários do revisor no final desta carta.
Se aplicável, recomendamos que você deposite seus protocolos de laboratório em protocols.io para aumentar a reprodutibilidade de seus resultados. O protocols.io atribui ao seu protocolo um identificador próprio (DOI) para que possa ser citado de forma independente no futuro. Para obter instruções, consulte: https://journals.plos.org/plosone/s/submission-guidelines#loc-laboratory-protocols. Além disso, a PLOS ONE oferece uma opção para publicar artigos de Protocolos de Laboratório revisados por pares, que descrevem protocolos hospedados em protocols.io. Leia mais informações sobre compartilhamento de protocolos em https://plos.org/protocols?utm_medium=editorial-email&utm_source=authorletters&utm_campaign=protocols.
Aguardamos ansiosamente o recebimento do seu manuscrito revisado.
Atenciosamente,
Branislav T. Šiler, Ph.D.
Editor Acadêmico
PLOS ONE
Requisitos da Revista:
Revise sua lista de referências para garantir que esteja completa e correta. Se você citou artigos que foram retratados, inclua a justificativa para isso no texto do manuscrito, ou remova essas referências e substitua-as por referências atuais relevantes. Quaisquer alterações na lista de referências devem ser mencionadas na carta de réplica que acompanha seu manuscrito revisado. Se você precisar citar um artigo retratado, indique o status de retratação do artigo na lista de Referências e também inclua uma citação e referência completa para o aviso de retratação.
[Nota: A marcação HTML está abaixo. Por favor, não edite.]
[NOTA: Se os comentários do revisor foram enviados como um arquivo anexo, eles serão anexados a este e-mail e acessíveis através do site de submissão. Por favor, faça login em sua conta, localize o registro do manuscrito e verifique o link de ação "Visualizar Anexos". Se este link não aparecer, não há arquivos anexos.]
Ao revisar sua submissão, envie seus arquivos de figuras para a Ferramenta de Análise e Conversão de Pré-verificação (PACE), https://pacev2.apexcovantage.com/. O PACE ajuda a garantir que as figuras atendam aos requisitos da PLOS. Para usar o PACE, você deve primeiro se registrar como usuário. O registro é gratuito. Em seguida, faça login e navegue até a guia UPLOAD, onde encontrará instruções detalhadas sobre como usar a ferramenta. Se encontrar algum problema ou tiver alguma dúvida ao usar o PACE, envie um e-mail para PLOS em figures@plos.org. Observe que os arquivos de Informações de Apoio não precisam desta etapa.
10.1371/journal.pone.0268255.r004
Resposta do autor à Carta de Decisão 1
13 Abr 2022
Comentário do Editor:
Em sua resposta, os autores afirmaram que alteraram o título principal para "Amino acid, sugar, phenolic, and terpenoid profiles are capable of distinguishing Citrus tristeza virus infection status in citrus cultivars: grapefruit, lemon, mandarin, and sweet orange" conforme sugerido pelo Revisor nº 1. No entanto, eles não o fizeram.
Por favor, adicione dois pontos após "cultivars".
Resposta dos Autores: Pedimos desculpas pelo descuido. O título foi alterado conforme sugerido, incluindo a adição de dois pontos após “cultivars”.
10.1371/journal.pone.0268255.r005
Carta de Decisão 2
Šiler
Branislav T.
Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons de Atribuição, que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados.
26 de abr de 2022
Os perfis de aminoácidos, açúcares, fenóis e terpenoides são capazes de distinguir o status de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em cultivares de citros: toranja, limão, tangerina e laranja doce
PONE-D-22-03106R2
Prezado Dr. Wallis,
Temos o prazer de informar que seu manuscrito foi considerado cientificamente adequado para publicação e será formalmente aceito para publicação assim que atender a todos os requisitos técnicos pendentes.
Dentro de uma semana, você receberá um e-mail detalhando as alterações necessárias. Quando essas forem resolvidas, você receberá uma carta de aceitação formal e seu manuscrito será agendado para publicação.
Uma fatura para pagamento será enviada logo após a aceitação formal. Para garantir um processo eficiente, faça login no Editorial Manager em http://www.editorialmanager.com/pone/, clique no link 'Update My Information' no topo da página e verifique se suas informações de usuário estão atualizadas. Se você tiver alguma dúvida relacionada a faturamento, entre em contato diretamente com nosso Departamento de Faturamento de Autores em authorbilling@plos.org.
Se sua instituição ou instituições tiverem uma assessoria de imprensa, notifique-os sobre seu próximo artigo para ajudar a maximizar seu impacto. Se eles estiverem preparando materiais de imprensa, informe nossa equipe de imprensa o mais rápido possível -- no máximo 48 horas após receber a aceitação formal. Seu manuscrito permanecerá sob embargo de imprensa rigoroso até as 14h (horário do leste) na data de publicação. Para mais informações, entre em contato com onepress@plos.org.
Atenciosamente,
Branislav T. Šiler, Ph.D.
Editor Acadêmico
PLOS ONE
Comentários Adicionais do Editor (opcional):
Comentários dos Revisores:
10.1371/journal.pone.0268255.r006
Carta de Aceitação
Šiler
Branislav T.
Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons de Atribuição, que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados.
29 de abr de 2022
PONE-D-22-03106R2
Os perfis de aminoácidos, açúcares, fenóis e terpenoides são capazes de distinguir o status de infecção pelo vírus da tristeza dos citros em cultivares de citros: toranja, limão, tangerina e laranja doce
Prezado Dr. Wallis:
Tenho o prazer de informar que seu manuscrito foi considerado adequado para publicação na PLOS ONE. Parabéns! Seu manuscrito está agora com nosso departamento de produção.

Se sua instituição ou instituições possuem uma assessoria de imprensa, por favor, comunique-as sobre seu próximo artigo agora para ajudar a maximizar seu impacto. Se elas estiverem preparando materiais de imprensa, informe nossa equipe de imprensa nas próximas 48 horas. Seu manuscrito permanecerá sob rigoroso embargo de imprensa até as 14:00 (horário da costa leste dos EUA) na data de publicação. Para mais informações, entre em contato pelo e-mail onepress@plos.org.

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Atenciosamente,

Equipe do Escritório Editorial da PLOS ONE
em nome de
Dr. Branislav T. Šiler
Editor Acadêmico