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pmid: "35646029"
title: "O pH do Substrato Influencia a Absorção de Nutrientes e o Microbioma da Rizosfera de Plantas de Toranja Afetadas pelo Huanglongbing."
authors: "Ferrarezi RS, Lin X, Gonzalez Neira AC, Tabay Zambon F, Hu H, Wang X, Huang JH, Fan G"
journal: "Frontiers in plant science"
pubdate: "2022"
doi: "10.3389/fpls.2022.856937"
source: "PMC Full Text"

O pH do Substrato Influencia a Absorção de Nutrientes e o Microbioma da Rizosfera de Plantas de Toranja Afetadas pelo Huanglongbing.

Autores

Ferrarezi RS, Lin X, Gonzalez Neira AC, Tabay Zambon F, Hu H, Wang X, Huang JH, Fan G

Periodico

Frontiers in plant science (2022)

Conteudo

O pH do Substrato Influencia a Absorção de Nutrientes e o Microbioma da Rizosfera de Plantas de Toranja Afetadas pelo Huanglongbing

O pH do substrato afeta diretamente a disponibilidade de nutrientes na rizosfera e a absorção de nutrientes pelas plantas. Macronutrientes como nitrogênio, potássio, cálcio, magnésio e enxofre são altamente disponíveis em pH 6,0–6,5, enquanto os micronutrientes se tornam menos disponíveis em pH mais alto e alcalino (pH > 7,0). Pesquisas recentes indicaram que pHs baixos podem aumentar a absorção de nutrientes e melhorar a saúde de laranjeiras doces (Citrus sinensis). Projetamos um estudo para compreender a influência de uma ampla gama de valores de pH do substrato no tamanho e biomassa da planta, disponibilidade de nutrientes, trocas gasosas foliares e microbioma da rizosfera de toranja (Citrus paradisi) afetada pelo Huanglongbing (HLB). Plantas de toranja "Ray Ruby" de dois anos enxertadas em porta-enxerto de laranja azeda (Citrus aurantium) foram cultivadas em ambiente interno em vasos de 10 cm de largura × 40 cm de altura com substrato comercial de turfa:perlita (80:20 v/v). Testamos dois status de doença [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] e seis valores de pH do substrato (4, 5, 6, 7, 8, 9) em um arranjo fatorial 2 × 6 em delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições. O volume da copa das plantas HLB+ foi 20% menor do que o das plantas saudáveis, com pHs 7 e 9 resultando em 44% menos volume de copa. A relação raiz:parte aérea do peso seco foi 25,8% menor em plantas HLB+ do que em plantas saudáveis. Crescimento radicular deficiente e diminuição de raízes fibrosas foram encontrados, especialmente nos tratamentos de pH 5 e 6 em plantas HLB+ (p < 0,0001). O status da doença e os pHs do substrato influenciaram a concentração foliar de nutrientes (p < 0,05). O alto pH do substrato afeta a disponibilidade de nutrientes para absorção radicular, influenciando o equilíbrio de nutrientes em todo o sistema da planta. Os valores de pH não afetaram a fotossíntese das plantas, indicando que o pH não recupera as plantas HLB+ para os níveis fotossintéticos das plantas saudáveis—embora o pH alto tenha influenciado positivamente o CO2 interno. Houve coletivamente mais de 200 rizobactérias identificadas pelo sequenciamento do gene 16S rRNA em árvores filogenéticas individuais. A maioria das leituras de rizobactérias foi identificada em pH 9. Nossos resultados indicaram nenhum efeito dos pHs do substrato no status da doença das plantas induzido pelo aumento da absorção de nutrientes.

Introdução

O greening dos citros ou Huanglongbing (HLB) é uma das doenças mais destrutivas dos citros, associada à bactéria limitada ao floema Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) e transmitida pelo psilídeo asiático dos citros (ACP, Diaphorina citri).
A doença impacta todos os principais países produtores de citros de maneira diferente, devido às suas estratégias de comercialização e produção. Os Estados Unidos enfrentam uma diminuição na produção e na área plantada de citros nos últimos 17 anos, já que todas as variedades de citros são suscetíveis à bactéria. Em particular, a produção de toranja (Citrus paradisi) para o mercado fresco é notavelmente afetada por essa doença devastadora, reduzida em 80%, de 2,5 milhões de toneladas em 2000–2001 para 500 mil toneladas em 2019–2020. Os produtores de toranja foram drasticamente impactados pelo declínio acentuado na produção, reduzindo a área comercial de 107.800 acres para 21.700 acres em 2019–2020 (U. S Department of Agriculture,).

Embora o HLB tenha sido relatado pela primeira vez há mais de 100 anos, variedades resistentes e métodos de controle bem-sucedidos não estão disponíveis (Bové,). Para manejar a doença e continuar no negócio, produtores de todo o mundo dependem de múltiplas estratégias para lidar com a doença, utilizando mudas livres de HLB, pulverização química para controlar o vetor inseto ACP, erradicação de árvores infectadas no campo e aplicação de práticas de manejo eficazes (Xia et al.,).

Os nutrientes minerais são vitais para o desenvolvimento das plantas e são fatores indispensáveis nas interações planta–doença, pois sua presença pode criar um ambiente menos favorável ao desenvolvimento da doença (Spann and Schumann,). Elementos-traço são necessários em pequenas quantidades para o crescimento das plantas e são cofatores críticos em processos metabólicos. Boro (B) e zinco (Zn) são exemplos de elementos essenciais para plantas superiores, participando de diversos processos bioquímicos e fisiológicos, como fixação de nitrogênio (N), respiração celular e fotossíntese. Folhas sintomáticas de HLB+ são conhecidas por apresentarem concentrações mais baixas de ferro (Fe) e Zn do que folhas saudáveis (Masaoka et al.,), imitando o padrão mosqueado irregular do sintoma visual clássico do HLB. Uma alternativa para fornecer nutrientes suficientes às árvores HLB+ é aplicar pulverizações foliares direcionadas com concentrações distintas de macro e micronutrientes. Shen et al. mostraram que aplicações foliares de uma mistura de fertilizantes, pesticidas biológicos e agentes indutores de resistência sistêmica aumentaram as concentrações foliares de cálcio (Ca), B, manganês (Mn) e Zn e reduziram o título de CLas em árvores HLB+. As concentrações foliares de fósforo (P), potássio (K), magnésio (Mg) e Fe permaneceram inalteradas, enquanto as concentrações foliares de cobre (Cu) diminuíram. As concentrações foliares de N, Mg e Fe foram 12, 21 e 42% menores em árvores HLB+ do que em árvores saudáveis cultivadas em solos arenosos e franco-argilosos submetidas a diferentes tratamentos com fertilizantes (Pustika et al.,). Tal discrepância é causada pelo desenvolvimento radicular deficiente das árvores HLB+, restringindo a absorção de nutrientes e o transporte de minerais, influenciando as concentrações minerais nas folhas. A aplicação foliar de fertilizantes reduz os sintomas da doença, pois a planta utiliza minerais aplicados via foliar localmente em várias vias de defesa, prolongando a vida da árvore e reduzindo as perdas de produtividade (Pustika et al.,).
Condições alcalinas do solo e da água aumentam a perda de raízes absorventes em laranjeiras HLB+ e afetam seu desempenho independentemente da ocorrência da doença (Morgan e Graham; Ghimire et al.). Assim, manter o pH da zona radicular na camada superficial do solo na faixa de 5,5–6,5 é crucial para o desenvolvimento radicular, pois o manejo da fertilização diminui o pH do solo ao longo do tempo e o pH do solo aumenta com a profundidade (Atta et al.). Solos ácidos podem aumentar a atividade metabólica das raízes e regular positivamente a expressão de genes transportadores de íons em raízes HLB+, a expressão de genes envolvidos na resistência sistêmica adquirida e a via de sinalização do ácido salicílico, aliviando distúrbios fisiológicos causados pelo bloqueio dos tubos crivados do floema (Li et al.).

A rizosfera é responsável pela absorção de água e nutrientes e fornece um nicho viável para a proliferação da atividade microbiana em troca de vários processos nutricionais e metabólicos. A rizosfera é repleta de compostos derivados de plantas que provavelmente seriam usados como fontes de nutrientes ou elicitores para os micróbios que melhoram as respostas de defesa nas plantas contra pragas e doenças. Os táxons predominantes do microbioma na zona da rizosfera incluem Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria e Bacteroidetes. Em árvores HLB+, o processo desequilibrado de carga/descarrega do floema causado pelo bloqueio dos tubos crivados inibe a absorção de nutrientes ao modificar fisiologicamente a endosfera radicular que interage com a rizosfera (Zhang et al.). Pesquisas focadas na interação entre o HLB e o pH do meio de cultivo no crescimento de plantas de toranja e no microbioma ainda são escassas. Estudos de disponibilidade de nutrientes são cruciais para estabelecer as vias de interação entre plantas e micróbios na rizosfera.

Este estudo submeteu plantas de toranja saudáveis e HLB+ a uma ampla gama de valores de pH do substrato e avaliou seus efeitos no desempenho do crescimento das plantas e na diversidade da população de microrganismos da rizosfera. Nossa hipótese é que condições ácidas do substrato aumentarão a disponibilidade de micronutrientes e a fotossíntese das plantas, acelerarão o crescimento vegetal e criarão um microbioma da rizosfera mais diverso e dinâmico, permitindo que a planta lide com os efeitos negativos do HLB.

Materiais e Métodos

Local do Estudo e Condições Ambientais

Este estudo foi conduzido de 27 de agosto de 2019 (Semana 0) a 14 de janeiro de 2020 (Semana 20) no Centro de Pesquisa e Educação Indian River da Universidade da Flórida/Instituto de Ciências Agrícolas e Alimentares (UF/IFAS) em Fort Pierce, Flórida, Estados Unidos (27°25'35"N, 80°24'31"O, elevação de 5,8 m).
Usamos uma estufa com teto de plástico de dupla camada e laterais de policarbonato, equipada com aquecedor e sistema de resfriamento por painel evaporativo e ventilador para controle climático. As condições ambientais dentro da estufa foram monitoradas usando um sensor de temperatura e umidade (HMP 60; Vaisala, Helsinki, Finlândia) e um sensor de densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (PPFD) (#3886i; Spectrum Technologies, Aurora, IL, Estados Unidos). O déficit de pressão de vapor (DPV) foi calculado a partir da pressão de vapor saturada e real usando dados de temperatura do ar e umidade relativa (UR). A temperatura do ar variou de 15,5 a 38,5°C, a UR de 56,3% a 90,5%, o DPV de 0,28 a 4,72 kPa, e a PPFD cumulativa de 2,6 a 54,4 μMol m2 d−1 (Figura 1).
Condições ambientais dentro da estufa com teto de plástico de dupla camada e laterais de policarbonato, equipada com aquecedor e sistema de resfriamento por painel evaporativo e ventilador. A linha tracejada na Semana 11 representa 12 de novembro de 2019 e indica o início do experimento.

Material Vegetal, Substrato, Inoculação de Doenças e Condições de Crescimento

Apesar de ser a espécie mais jovem entre todas as cítricas, a toranja é uma fruta cítrica vital produzida para o mercado fresco nos Estados Unidos. A "Ray Ruby" é a variedade mais prevalente no Distrito Citrícola de Indian River, na Flórida, e foi escolhida para o estudo devido à sua importância comercial.

Plantas de toranja "Ray Ruby" de dois anos de idade enxertadas em porta-enxerto de laranja azeda (C. aurantium) foram obtidas de um viveiro comercial (Brite Leaf Nursery; Lake Panasoffkee, FL, Estados Unidos). As plantas foram transplantadas para vasos de 10 cm de largura × 40 cm de altura com substrato comercial turfa:perlita (80:20 v/v) (Fafard 1P; Sungro Horticulture, Agawam, MA, Estados Unidos). O substrato para todos os tratamentos de pH continha as concentrações iniciais de nutrientes (mg kg−1): N-total = 95,55 [nitrato (NO3)-N = 85,75 e amônio (NH4)-N = 9,80], P = 2,67, K = 90,76, Ca = 188,54, Mg = 77,56, S = 205,86, B = 0,11, Cu = 0,07, Fe = 0,10, Mn = 0,12, Zn = 0,01, pH = 5,90, e condutividade elétrica = 1,80 dS m−1.

Metade das plantas foi enxertada manualmente com borbulhas afetadas por HLB (confirmadas positivas) por meio de reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) colhidas em um pomar comercial localizado em uma área endêmica de HLB. As plantas enxertadas foram mantidas por 6 meses em uma estufa com irrigação por gotejamento e fertilização padrão para cítricos até que um teste positivo para HLB fosse confirmado.

Tratamentos e Condições Experimentais

Testamos dois status de doença das plantas [HLB-livre ou saudável (negativo, HLB–) e HLB-afetado (positivo, HLB+)] e seis pHs do substrato (variando de pH 4 a 9) com quatro repetições para um total de 48 plantas (24 HLB– e 24 HLB+). O pH do substrato foi ajustado com enxofre elementar (S) (Fisher Scientific International, Pittsburgh, DE, Estados Unidos) e hidróxido de cálcio [Ca(OH)2] (Fisher Scientific International) de acordo com um experimento preliminar (dados não mostrados).
Os substratos para os pHs 4 e 5 foram reduzidos adicionando 2,30 g e 0,76 g de S por kg de substrato, respectivamente. Os pHs dos substratos 7, 8 e 9 foram ajustados adicionando 2,30, 24,89 e 47,48 g de Ca(OH)2 por kg de substrato. Pesamos 3 kg de substrato por vaso e adicionamos o S ou Ca(OH)2, misturando bem. As plantas foram transplantadas para novos vasos com substratos misturados. Cada tratamento de pH incluiu oito plantas, sendo metade saudáveis e metade HLB+.
As plantas foram irrigadas usando um sistema de irrigação automatizado com água destilada uma vez ao dia (300 ml por recipiente) e fertilizadas uma vez por mês com 15 g por planta de fertilizante de uso geral solúvel em água 20-20-20 (Everris Inc., Geldermalsen, Países Baixos). A composição do fertilizante é a seguinte: N 20%, P2O5 20%, K2O 20%, Mg 0,05%, B 0,0125%, Cu 0,0125%, Fe 0,05%, Mn 0,025%, Mo 0,005% e Zn 0,025%. Todas as plantas foram monitoradas visualmente na estufa durante o experimento quanto a sintomas de HLB e testadas periodicamente quanto à presença de CLas antes e depois do aparecimento de sintomas graves de HLB.
Medições
Valores de Ct e Título de CLas
Amostras de folhas foram coletadas de cada planta antes do tratamento e 90 dias após o tratamento (DAT). Seções curtas (10–15 cm) de ramos sintomáticos (folhas/galhos) com as folhas e pecíolos anexados foram amostradas, colocadas em um saco plástico vedável de 3,78 L (Ziploc, Bay City, MI, Estados Unidos), mantidas refrigeradas em gelo e protegidas da luz solar. As amostras foram analisadas por RT-qPCR em um laboratório comercial (Southern Gardens Diagnostic Laboratory, Clewiston, FL, Estados Unidos). Os processos de coleta e análise das amostras foliares são detalhados em Phuyal et al.. Amostras que apresentam valores de limiar de ciclo (Ct) ≤ 32 são consideradas HLB+. O título bacteriano também foi quantificado com base em uma curva padrão.
pH do Substrato
O pH do substrato foi medido uma vez por semana após o transplante por medição direta do substrato usando um medidor de pH portátil (HI99121; Hanna Instruments, Woonsocket, RI, Estados Unidos). Se a diferença entre o pH medido e o pH alvo fosse superior a 0,5 dos tratamentos alvo, uma camada de 5 cm do substrato era removida do recipiente. Um novo substrato com S elementar ou Ca(OH)2 era adicionado à superfície para reajustar o pH. Repetimos este procedimento uma vez por semana até que a diferença entre o pH medido e o pH alvo fosse <0,5 (Semana 11), então continuamos medindo o pH por 90 DAT.
Concentração de Nutrientes nas Folhas
Amostras de folhas foram coletadas no início e aos 90 DAT. Utilizamos 12 plantas para o teste no início do ensaio e agrupamos os resultados. Aos 90 DAT, testamos cada repetição. Cerca de 10–15 folhas maduras, completamente expandidas, de quatro quadrantes da planta foram coletadas aleatoriamente para a análise de nutrientes foliares. As amostras foram preservadas em um refrigerador durante o período de amostragem e submetidas à lavagem ácida antes da análise. As amostras foram colocadas em estufa a 80°C durante a noite para secar, e o material seco de cada parcela foi moído para passar por uma peneira de malha de 1 mm (Wiley Laboratory Mill Model 4 3375-E10; Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, Estados Unidos). Cinco gramas de amostras de folhas foram analisados usando o método de incineração a seco e avaliados por espectroscopia de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP–AES) para determinar a concentração de P, K, Ca, Mg, S, B, Cu, Fe, Mn e Zn. A concentração de N foliar foi determinada por combustão seca macro usando um analisador elementar (LECO CNS-2000; LECO Corporation, St. Joseph, MI, Estados Unidos).

Troca Gasosa Foliar
A taxa fotossintética, a condutância estomática, a concentração interna de dióxido de carbono (CO2) e a taxa de transpiração foram medidas em folhas maduras aos 90 DAT ao meio-dia com um analisador portátil de gás infravermelho (LI-6400XT; LI-COR, Lincoln, NE, Estados Unidos).

Tamanho da Planta
A altura da planta, o diâmetro do caule e a largura da copa em duas direções (O–L e N–S) de 48 plantas foram medidos antes do tratamento, aos 30 e 90 DAT. O volume da copa foi calculado usando a equação do esferoide prolato geométrico: [4/3 π (altura da planta/2) (largura média da copa)2] (Obreza and Rouse,).

Biomassa da Planta
A copa foi cortada ao nível do substrato aos 90 DAT, e os brotos foram divididos em folhas e caules. As raízes foram removidas do substrato, enxaguadas cuidadosamente com água corrente, o excesso de água removido e pesadas para determinar o peso fresco das raízes. As folhas, caules e raízes foram secos em estufa a 65°C por 1 semana, e o peso seco foi determinado.

Extração de DNA, Amplificação do 16S rRNA, Sequenciamento Gênico e Análise Filogenética
Amostras de substrato foram coletadas 10–15 cm abaixo da superfície aos 90 DAT. Dois gramas do substrato de cada planta foram misturados de todas as 4 repetições em um tubo estéril e enviados para sequenciamento do 16S rRNA (Omega Bioservices, Norcross, GA, Estados Unidos).
As amostras de DNA foram amplificadas por PCR usando os conjuntos de primers forward CS1_515F (ACACTGACGACATGGTTCTACAGTGCCAGCMGCCGCGGTAA) e reverse CS2_806R (TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGGACTACHVGGGTWTCTAAT). Cada primer forward e reverse continha 5 μl, o que amplifica a região V3–V4 do gene 16S rRNA e inclui adaptadores para preparação de bibliotecas para sequenciamento de nova geração. As amostras com volume final de 25 μl continham 12 ng de DNA da amostra e 12,5 μl de 2 × KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, Estados Unidos). Os testes de PCR foram realizados usando o seguinte protocolo: Uma etapa inicial de desnaturação realizada a 95°C por 3 min, seguida por 25 ciclos de desnaturação (95°C, 30 s), anelamento (55°C, 30 s) e extensão (72°C, 30 s), e uma elongação final de 5 min a 72°C. O produto de PCR foi purificado da mistura de reação com pérolas magnéticas Mag–Bind RxnPure Plus (Omega Bio–Tek, Norcross, GA, Estados Unidos). Uma segunda amplificação por PCR de índice, usada para incorporar códigos de barras e adaptadores de sequenciamento no produto final de PCR, foi realizada em reações de 25 μl usando as mesmas condições de master mix descritas acima. As condições de ciclagem foram as seguintes: 95°C por 3 min, seguido por oito ciclos de 95°C por 30 s, 55°C por 30 s e 72°C por 30 s. Uma etapa final de elongação de 5 min foi realizada a 72°C.
Doze amostras de substrato foram sequenciadas via Illumina (Illumina, Inc., San Diego, CA, Estados Unidos) visando a região ribosomal 16S. Os arquivos Fastq foram carregados em uma plataforma de software comercial (Geneious Prime 2020.2.1; Biomatters, San Diego, CA, Estados Unidos). O conjunto de sequências Fastq de cada amostra foi consultado utilizando a ferramenta componente BLAST do NCBI (NCBI 2021, Baltimore, MD, Estados Unidos). Todas as extremidades das sequências das amostras foram aparadas para quaisquer ambiguidades usando o conjunto de ferramentas padrão do Geneious Prime. O software comercial utilizou um alinhamento de sequências múltiplas, seguido pela seleção das sequências de melhor classificação com base em um valor de bit score superior a 150,00. As sequências foram então usadas para construir uma árvore filogenética com configurações padrão a uma taxa de similaridade de 93%. Um modelo de distância de Tamura–Nei com construção de árvore por vizinhança foi construído, usando um método de bootstrap com reamostragem com semente aleatória na configuração padrão do software de 217.665 e número de réplicas de 18–25 árvores filogenéticas consenso por amostra (Biomatters Ltd,). Cada árvore teve um valor médio de soma de comprimentos de ramos de 0,030, mostrado abaixo em cada uma das árvores filogenéticas. As distâncias evolutivas foram calculadas usando o método de Máxima Verossimilhança Composta (Felsenstein,) e estão nas unidades do número de substituições de base por sítio. Todas as posições com <93% de cobertura de sítio foram eliminadas aos pares usando matrizes de alinhamento construídas com um valor de gap aberto de 12 e uma penalidade de extensão de gap de 3 (opção de deleção parcial) (Tamura et al.,).
Desenho Experimental e Análise Estatística
Testamos dois status de doença [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] e seis valores de pH (4, 5, 6, 7, 8, 9) em um fatorial 2 × 6 arranjado em um delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições. A análise estatística foi realizada usando RStudio (RStudio Team,). Um modelo linear generalizado (GLM) analisou a variância do erro (ANOVA) nos fatores principais e sua interação. Os dados foram verificados quanto às suposições do modelo linear, e transformações foram realizadas para variáveis significativas. As médias marginais estimadas foram calculadas quando as interações foram significativas, e a separação de médias foi realizada usando Tukey a 5% de probabilidade (p < 0,05). O valor de Ct foi analisado como uma resposta não paramétrica, com os efeitos principais do status da doença e pHs do substrato; ferramentas de classificação alinhadas (ARTools) foram realizadas para a resposta de Ct, pois o modelo original apresenta uma interação. Após a validação da interação não significativa do teste não paramétrico, o teste de Kruskall–Wallis foi realizado, e a separação de médias foi realizada com o teste de Wilcoxon. O título bacteriano não foi ortogonal para ARTools; portanto, foi analisado como um GLM, com família Gaussiana e função de ligação identidade. Uma análise post-hoc foi realizada para comparações múltiplas, ajustada por Bonferroni e usando o teste de Student–Newman–Keuls (SNK) para médias ajustadas a 5% de probabilidade (p < 0,05).
Resultados
Valores de Ct e Título de CLas
Como esperado, o valor de Ct foi influenciado exclusivamente pelo status da doença, com todas as plantas inoculadas com gemas HLB+ apresentando valores de Ct abaixo de 32; portanto, as plantas foram positivas para HLB aos 0 e 90 DAT (Tabela 1, p < 0,0001). O aumento do pH do substrato em plantas HLB+ foi insuficiente para suprimir o crescimento bacteriano, e os valores de Ct foram consistentemente abaixo de 32. Aos 90 DAT, os valores de Ct aumentaram para plantas HLB+ cultivadas em pHs 7 e 8, atingindo os valores de Ct mais próximos de 32 (Tabela 1).
Valor de Ct e título de CLas de toranja "Ray Ruby" (C. paradisi) em porta-enxerto de laranja azeda (C. aurantium) exposta a diferentes status de doença HLB [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] sob uma faixa crescente de pHs do substrato (4–9) aos 0 e 90 DAT.
Fator Valor de Cta Título de CLas (ng DNA/100 mg de tecido) 0 DAT 90 DAT 0 DAT 90 DAT Status da doença HLB– 40,0 ± 0,0a 40,0 ± 0,0a 0 ± 0b 168 ± 167,92b HLB+ 30,2 ± 0,2b 30,2 ± 0,4b 3.102.750 ± 434.391a 17.385.792 ± 2.982.332a pHs do substrato 4 35,2 ± 1,8 35,0 ± 1,9 989.500 ± 480.214b 6.131.250 ± 2.659.456 5 34,7 ± 2,0 34,8 ± 2,0 2.912.250 ± 1.298.581a 10.037.500 ± 4.778.708 6 35,3 ± 1,8 34,6 ± 2,0 1.140.125 ± 513.191b 8.441.250 ± 3.806.543 7 35,2 ± 1,8 35,4 ± 1,9 1.133.750 ± 489.668b 8.483.250 ± 4.424.632 8 35,4 ± 1,8 35,9 ± 1,8 896.125 ± 408.112b 6.282.875 ± 5.050.989 9 34,9 ± 1,9 34,9 ± 2,0 2.227.500 ± 920.558ab 12.781.754 ± 7.650.152 Valor-p Status da doença <0,0001** <0,0001** <0,0001** <0,0001** pH 0,0600 0,2500 0,005** 0,842 Status da doença × pH 0,1300 0,1600 0,005** 0,842
Os valores de Ct foram calculados com o teste de Kruskal–Wallis e o título de CLas como um GLM.
Médias ± erro padrão (n = 4) seguidas pelas mesmas letras não diferem pelo teste SNK (α = 0,05). Códigos de significância:
0,01;

• 0,05.
  O título bacteriano de CLas no tecido foliar foi afetado pela interação entre o status da doença e os pHs do substrato testados no 0 DAT (Tabela 1 e Figura 2, p = 0,005). No entanto, comparamos plantas HLB– e HLB+, e a magnitude do título bacteriano (0 comparado a +3M ng DNA/100 mg de tecido no 0 DAT e 168 comparado a +17M ng DNA/100 mg de tecido no 0 DAT, Tabela 1) criou um artefato estatístico sem relevância biológica real (Figura 2). Os pHs ácido e alcalino 5 e 9 produziram a maior concentração de CLas por 100 mg de tecido (Figura 2), enquanto os outros pHs do substrato testados não diferiram entre si. Aos 90 DAT, nem os pHs nem a interação foram significativos (Tabela 1, p = 0,842).
  Título de CLas em toranja "Ray Ruby" (C. paradisi) em porta-enxerto de laranja azeda (C. aurantium) exposta a diferentes status da doença HLB [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] sob uma faixa crescente de pHs do substrato (4–9) no 0 DAT. Médias ± erro padrão (n = 4) seguidas pelas mesmas letras não diferem pelo teste SNK (α = 0,05) dentro de cada pH do substrato para diferentes status da doença.
  pH do substrato
  O pH do substrato apresentou respostas semelhantes tanto em plantas saudáveis quanto em plantas HLB+ antes e após os tratamentos (Figura 3). Como as medições de pH foram instáveis durante as primeiras 11 semanas tanto em plantas saudáveis quanto em HLB+, um substrato com S ou Ca(OH)2 foi adicionado na camada superior para manter o pH na faixa alvo.
  pH do substrato de plantas expostas a diferentes status da doença HLB [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] sob uma faixa crescente de pHs do substrato (4–9). Os tratamentos foram aplicados por 11 semanas até que a camada superior do substrato começasse a ser substituída semanalmente, estabilizando claramente o pH do substrato. A linha tracejada na Semana 11 (12 de novembro de 2019) indica o início do experimento. Cada ponto de dados representa a média ± erro padrão (n = 4).
  Concentração de Nutrientes Foliares
  A concentração de nutrientes foliares no início do ensaio foi N = 2,50%, P = 0,18%, K = 2,50%, Mg = 0,33%, Ca = 2,34%, S = 0,35%, B = 294 ppm, Cu = 298 ppm, Fe = 69 ppm, Mn = 62 ppm e Zn = 35 ppm. B e Cu estavam altos, pois o viveiro pulveriza constantemente para controlar pragas e doenças, mas a toranja tolera altas concentrações desses elementos.
  O status da doença e os pHs do substrato afetaram macro e micronutrientes aos 90 DAT de forma diferente; o valor-p não foi influenciado por nenhum dos fatores principais ou pela interação (Tabela 2). As concentrações de N e S foram afetadas independentemente pelo status da doença e pelos pHs do substrato (Tabela 2, p < 0,01). Plantas HLB+ adquiriram mais N do que plantas saudáveis, enquanto a concentração de S em plantas saudáveis foi maior do que em plantas HLB+. As concentrações de N foram menores em plantas cultivadas sob pH 6 e 9 do que nos outros pHs testados, mas não foram deficientes com base nas recomendações de Morgan et al. As concentrações foliares de S diminuíram com o aumento da alcalinidade do substrato.
  Concentração foliar de nutrientes minerais de grapefruit "Ray Ruby" (C. paradisi) em porta-enxerto de laranja azeda (C. aurantium) exposto a diferentes status da doença HLB [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] sob uma faixa crescente de pHs do substrato (4–9) aos 90 DAT.
  N (%) P (%) K (%) Ca (%) Mg (%) S (%) B (ppm) Cu (ppm) Fe (ppm) Mn (ppm) Zn (ppm) Status da doença HLB– 2,70 ± 0,04b 0,155 ± 0,005 2,54 ± 0,03 2,26 ± 0,05a 0,31 ± 0,006a 0,38 ± 0,02a 538 ± 29a 84,9 ± 4,2b 117 ± 8 55,0 ± 3 23,1 ± 0,7 HLB+ 2,89 ± 0,06a 0,15 ± 0,002 2,48 ± 0,04 2 ± 0,04b 0,27 ± 0,007b 0,34 ± 0,01b 457 ± 26b 98,3 ± 7,0a 105 ± 7 51,2 ± 3 22,1 ± 0,5 pHs do substrato 4 2,99 ± 0,09a 0,0033 ± 0,16 2,31 ± 0,05b 2 ± 0,10 0,28 ± 0,02b 0,45 ± 0,03a 596 ± 60 69,8 ± 7,0b 113 ± 7abc 56,1 ± 3ab 22,0 ± 1,0 5 2,98 ± 0,09a 0,0041 ± 0,15 2,52 ± 0,04ab 2,16 ± 0,12 0,02 ± 0,02ab 0,43 ± 0,01a 550 ± 59 79,2 ± 3,4ab 107 ± 8abc 64,2 ± 6a 25,4 ± 1,0 6 2,61 ± 0,07b 0,0112 ± 0,17 2,48 ± 0,06ab 2,16 ± 0,05 0,31 ± 0,01ab 0,37 ± 0,01b 485 ± 47 113 ± 13,0a 152 ± 16a 55,9 ± 3ab 21,8 ± 0,9 7 2,86 ± 0,07ab 0,006 ± 0,16 2,5 ± 0,03ab 2,14 ± 0,04 0,26 ± 0,01ab 0,34 ± 0,01bc 473 ± 34 72,5 ± 2,6b 118 ± 12ab 53,2 ± 5ab 21,1 ± 1,0 8 2,73 ± 0,10ab 0,0038 ± 0,14 2,66 ± 0,03a 2,21 ± 0,12 0,28 ± 0,01a 0,31 ± 0,02bc 461 ± 28 102,0 ± 7,2ab 100 ± 9bc 42,2 ± 2b 22,8 ± 0,6 9 2,61 ± 0,06b 0,0046 ± 0,15 2,58 ± 0,08a 2,11 ± 0,07 0,3 ± 0,01a 0,29 ± 0,02c 420 ± 45 113,0 ± 10,1a 75 ± 4c 46,6 ± 4b 22,6 ± 0,9 Faixa de nível ótimoy 2,5–2,7 0,12–0,16 1,2–1,7 3,0–4,9 0,3–0,49 0,2–0,4 36–100 5–16 60–120 25–100 25–100 valor-p Status da doença 0,0013** 0,3300 0,2000 <0,0001** <0,0001** 0,0035** 0,0359* 0,0370* 0,1300 0,2100 0,1600 pH 0,0001** 0,0700 0,0010** 0,4000 0,5600 <0,0001** 0,1053 <0,0001** <0,0001** <0,0001** 0,0160 Status da doença × pH 0,1100 0,0600 0,8000 0,0300* 0,2800 0,2400 0,5041 0,0180* 0,5400 0,0620 0,0500*
  Médias ± erro padrão (n = 4) seguidas pelas mesmas letras não são diferentes pelo teste de Tukey honest significant difference (HSD, α = 0,05). Códigos de significância:
  0,01;
  0,05.
  De acordo com Morgan et al. .
  Os pHs do substrato testados afetaram K, Fe e Mn, enquanto Mg e B foram influenciados apenas pelo estado da doença (Tabela 2, p < 0,05). Plantas 'Ray Ruby' cultivadas em pH 4 apresentaram a menor concentração foliar de K, enquanto pHs do substrato mais alcalinos (8 e 9) atingiram as concentrações máximas. A concentração foliar de K enquadrou-se na categoria alta, de acordo com Morgan et al.. Fe apresentou uma distribuição de concentração distinta em relação ao pH do substrato no qual as plantas foram cultivadas (Tabela 2). O pH neutro do substrato permitiu mais Fe nas folhas de 'Ray Ruby' do que pHs muito alcalinos (pH 8 e 9), variando de níveis altos a ótimos de acordo com Morgan et al., respectivamente. A concentração foliar de Mn ao longo dos diferentes pHs do substrato testados não foi tão variável quanto a de Fe. Os substratos com propriedades levemente ácidas produziram mais Mn nas folhas do que os pHs alcalinos testados (Tabela 2), mas todos os pHs tiveram Mn em sua faixa de concentração ótima.

Plantas saudáveis apresentaram concentrações mais altas de B e Mg do que plantas HLB+ (Tabela 2, p < 0,05). As concentrações foliares de B estavam na faixa de excesso para árvores saudáveis e HLB+ (Morgan et al.,). Esses valores elevados são um efeito residual do viveiro, pois eles pulverizam constantemente para controlar pragas e doenças. A concentração de Mg em folhas saudáveis atingiu a faixa ótima indicada por Morgan et al., enquanto as plantas HLB+ ainda estavam na faixa baixa.

A interação entre o estado da doença e os pHs do substrato influenciou a concentração foliar de Ca, Cu e Zn (Figura 4, p ≤ 0,05). A concentração de Ca em folhas saudáveis e HLB+ de plantas 'Ray Ruby' cultivadas sob pHs 6, 7 e 9 não foi diferente (Figura 4, letras minúsculas), enquanto plantas saudáveis acumularam mais Ca nas folhas do que plantas HLB+. Ao examinar o efeito dos diferentes pHs na concentração de Ca, as plantas HLB+ apresentaram a maior concentração de Ca sob pH 6 (Figura 4, barras laranja, letras maiúsculas), em comparação com o pH 4 muito ácido. No entanto, os tratamentos apresentaram níveis foliares de Ca abaixo das faixas ótimas. Ao contrário, a concentração foliar de Cu de plantas HLB+ cultivadas sob substrato pH 6 foi muito maior do que o mínimo indicado por Fitts et al. e Colombo et al. (Figura 4, letras minúsculas). Dentro das plantas saudáveis, todos os pHs do substrato resultaram em concentração foliar de Cu na faixa de excesso, sem efeito do pH do substrato (Figura 4, barras verdes, letras maiúsculas). Plantas saudáveis 'Ray Ruby' cultivadas em substrato pH 5 foram o único tratamento a atingir a concentração ótima de Zn (25 ppm), de acordo com Morgan et al. (Figura 4, barras verdes, letras maiúsculas). Todas as outras 11 interações foram classificadas como baixa concentração foliar de Zn, e as respostas das plantas HLB+ ao acúmulo de Zn em relação aos pHs do substrato não foram diferentes (Figura 4, barras laranja, letras maiúsculas). A presença de CLas influenciou o acúmulo de Zn nas folhas apenas em plantas cultivadas sob pH 7, pois as plantas HLB+ apresentaram maior concentração foliar de Zn do que as folhas HLB– de 'Ray Ruby' (Figura 4, letras minúsculas).
Interações nas concentrações de Ca, Cu e Zn em folhas de toranja "Ray Ruby" (C. paradisi) em porta-enxerto de laranja azeda (C. aurantium) expostas a diferentes status de doença HLB [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] sob uma faixa crescente de pH do substrato (4–9). Médias ± erro padrão (n = 4) seguidas pelas mesmas letras não diferem pelo teste de Tukey (HSD, α = 0,05). Médias com as mesmas letras maiúsculas não diferem em cada pH do substrato dentro do status da doença e médias com as mesmas letras minúsculas não diferem dentro do status da doença por pH do substrato. As linhas tracejadas representam a faixa ideal do elemento, de acordo com Morgan et al.

Troca Gasosa Foliar

A taxa fotossintética, a condutância estomática e a taxa de transpiração não diferiram com base nos status da doença e nos pHs do substrato (Tabela 3, p > 0,05). No entanto, a concentração interna de CO2 respondeu à interação do status da doença e dos pHs do substrato (Tabela 3, p = 0,02). Plantas HLB+ sob pH 9 apresentaram maior concentração de CO2 interno em comparação ao pH 6 (Figura 5, pH, letras maiúsculas). O CO2 interno foi maior em plantas saudáveis sob pH 4 e 6 do que em plantas HLB+ nas mesmas condições (Figura 5, pH, letras minúsculas).

Troca gasosa foliar de toranja "Ray Ruby" (C. paradisi) em porta-enxerto de laranja azeda (C. aurantium) expostas a diferentes status de doença HLB [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] sob uma faixa crescente de pH do substrato (4–9).
Fotossíntese líquida, A (μmol−2 s−1) Condutância estomática, gs (mol m−2 s−1) Concentração interna de CO2, Ci (μmol mol−1) Taxa de transpiração, E (mmol m−2 s−1) Status da doença HLB– 5,7 ± 0,5 0,4 ± 0,004 158 ± 14a 1,0 ± 0,1 HLB+ 6,9 ± 0,4 0,04 ± 0,005 68 ± 20b 1,1 ± 0,1 pH 4 6,0 ± 1,0 0,4 ± 0,007 138 ± 53 1,1 ± 0,2 5 6,5 ± 0,9 0,04 ± 0,008 107 ± 29 1,1 ± 0,2 6 6,4 ± 0,4 0,04 ± 0,006 88 ± 36 1 ± 0,1 7 7,1 ± 0,9 0,04 ± 0,007 105 ± 22 1,1 ± 0,2 8 5,4 ± 0,9 0,03 ± 0,007 92 ± 37 0,8 ± 0,2 9 6,4 ± 0,7 0,05 ± 0,011 147 ± 20 1,2 ± 0,3 p-valor Status da doença 0,0600 0,9000 0,0002** 0,8000 pH 0,8000 0,8000 0,5000 0,7000 Status da doença × pH 0,5000 0,4000 0,0200* 0,6000

Médias ± erro padrão (n = 4) seguidas pelas mesmas letras não diferem pelo teste de Tukey (HSD, α = 0,05). Códigos de significância:
0,01;
0,05.
Interação da concentração de CO2 intercelular foliar de toranja “Ray Ruby” (C. paradisi) em porta-enxerto de laranja azeda (C. aurantium) exposta a diferentes status da doença HLB [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] sob uma faixa crescente de pHs do substrato (4–9). Médias ± erro padrão (n = 4) seguidas pelas mesmas letras não diferem pela diferença honestamente significativa de Tukey (HSD, α = 0,05). Médias com as mesmas letras maiúsculas não diferem em cada pH do substrato dentro do status da doença, e médias com as mesmas letras minúsculas não diferem dentro do status da doença por pH do substrato.
Tamanho da Planta
O crescimento da toranja “Ray Ruby” foi influenciado pelo status da doença e pelos pHs do substrato (Tabela 4). O status da doença influenciou a altura da planta aos 90 DAT (Tabela 4, p = 0,03) e, como esperado, plantas saudáveis eram mais altas do que plantas HLB+ ao final do estudo.
Tamanho da planta e biomassa de toranja “Ray Ruby” (C. paradisi) em porta-enxerto de laranja azeda (C. aurantium) exposta a diferentes status da doença HLB [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] sob uma faixa crescente de pHs do substrato (4–9) aos 0, 30 e 90 DAT.
Altura (m) Diâmetro do caule (mm) Volume da copa (m3) Peso seco da parte aérea (g) Peso seco da raiz (g) Relação raiz-parte aérea 0 DAT 30 DAT 90 DAT 0 DAT 30 DAT 90 DAT 0 DAT 30 DAT 90 DAT 90 DAT 90 DAT 90 DAT Status da doença HLB– 136 ± 4 145 ± 4 153 ± 5a 16,8 ± 0,3a 17,6 ± 0,4a 17,9 ± 0,3a 2,2 ± 0,1a 3,0 ± 0,2a 3,7 ± 0,2a 204 ± 10a 156 ± 9a 0,77 ± 0,02a HLB+ 129 ± 4 134 ± 4 139 ± 4b 14,8 ± 0,4b 15,4 ± 0,4b 15,8 ± 0,4b 1,6 ± 0,2b 2,1 ± 0,3b 2,4 ± 0,3b 161,02 ± 10b 78 ± 8b 0,51 ± 0,03b pH 4 131 ± 8 137 ± 8 140 ± 8 16,1 ± 0,8 16,4 ± 0,8 16,7 ± 0,7 1,8 ± 0,3 2,3 ± 0,4 2,6 ± 0,5 172 ± 12 107 ± 16 0,67 ± 0,07ab 5 138 ± 5 146 ± 3 152 ± 3 15,1 ± 0,4 16 ± 0,5 16,3 ± 0,5 1,9 ± 0,2 2,7 ± 0,3 3,4 ± 0,3 192 ± 9 99 ± 12 0,51 ± 0,05b 6 132 ± 6 136 ± 6 146 ± 8 16,1 ± 0,8 17,1 ± 0,7 17,4 ± 0,7 1,9 ± 0,3 2,4 ± 0,4 3,1 ± 0,5 196 ± 21 119 ± 19 0,59 ± 0,05ab 7 124 ± 4 131 ± 6 137 ± 6 15,4 ± 1,1 16,4 ± 1,1 16,5 ± 1,1 1,6 ± 0,4 2,3 ± 0,6 3,1 ± 0,8 178 ± 27 112 ± 25 0,65 ± 0,05ab 8 138 ± 10 150 ± 11 160 ± 11 16,5 ± 0,7 17 ± 0,8 17,5 ± 0,8 2,2 ± 0,3 3,1 ± 0,5 3,7 ± 0,5 206 ± 17 153 ± 28 0,71 ± 0,08a 9 132 ± 7 136 ± 7 141 ± 8 15,6 ± 0,6 16,2 ± 0,7 16,6 ± 0,7 1,9 ± 0,3 2,2 ± 0,3 2,5 ± 0,4 153 ± 19 112 ± 18 0,71 ± 0,05a valor-p Status da doença 0,2 0,06 0,0300** 0,0001** 0,0002** 0,0003** 0,0080** 0,0040** 0,0003** 0,0019* <0,0001** <0,0001** pH 0,7 0,42 0,26 0,53 0,76 0,65 0,67 0,43 0,28 0,17 0,13 0,0030** Status da doença × pH 0,4 0,42 0,22 0,0040** 0,0400* 0,05 0,0400* 0,0100* 0,0040** 0,08 0,39 0,57
Médias ± erro padrão (n = 4) seguidas pelas mesmas letras não diferem pela diferença honestamente significativa de Tukey (HSD, α = 0,05). Códigos de significância:
0,01;
0,05.
O diâmetro do caule foi afetado pela interação entre o status da doença e o pH do substrato aos 0 e 30 DAT (Tabela 4, p < 0,05, e Figura 6). Aos 0 e 30 DAT, as plantas HLB+ cultivadas nos pHs do substrato 5, 7 e 8 foram mais finas do que as plantas saudáveis. Aos 90 DAT, apenas o status da doença influenciou o diâmetro do caule (Tabela 4, p = 0,0003), e as plantas saudáveis foram mais grossas do que as plantas HLB+.
Interações do diâmetro do caule de toranja “Ray Ruby” (C. paradisi) em porta-enxerto de laranja azeda (C. aurantium) expostas a diferentes status da doença HLB [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] sob uma faixa crescente de pHs do substrato (4–9) aos 0, 30 e 90 DAT. Médias ± erro padrão (n = 4) seguidas pelas mesmas letras não diferem pelo teste de Tukey (HSD, α = 0,05). Médias com as mesmas letras maiúsculas não diferem em cada pH do substrato dentro do status da doença e médias com as mesmas letras minúsculas não diferem dentro do status da doença por pH do substrato.
O volume da copa foi afetado pela interação entre o status da doença e o pH do substrato (Tabela 4, p < 0,05, e Figura 7). As plantas HLB+ cultivadas sob pH do substrato 8 tiveram maior volume de copa do que os pHs 4 e 7 ao longo do estudo (Figura 7, barras laranjas, letras maiúsculas)—embora o volume da copa das plantas saudáveis cultivadas sob pH 7 tenha diferido apenas do pH do substrato 9 aos 90 DAT (Figura 7, barras verdes, letras maiúsculas).
Interações do volume da copa de toranja “Ray Ruby” (C. paradisi) em porta-enxerto de laranja azeda (C. aurantium) expostas a diferentes status da doença HLB [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] sob uma faixa crescente de pHs do substrato (4–9) aos 0, 30 e 90 DAT. Médias ± erro padrão (n = 4) seguidas pelas mesmas letras não diferem pelo teste de Tukey (HSD, α = 0,05). Médias com as mesmas letras maiúsculas não diferem em cada pH do substrato dentro do status da doença e médias com as mesmas letras minúsculas não diferem dentro do status da doença por pH do substrato.
Biomassa Vegetal
A massa seca da parte aérea e da raiz foi influenciada apenas pelo status da doença (Tabela 4, p < 0,01), enquanto a relação raiz/parte aérea foi influenciada por ambos os fatores principais (Tabela 4, p < 0,001). Como esperado, plantas saudáveis acumularam mais raízes e massa seca da parte aérea do que plantas HLB+ (Tabela 4), e a relação raiz/parte aérea em plantas saudáveis foi 39% maior do que em plantas HLB+. pHs elevados do substrato resultaram em uma relação raiz/parte aérea maior do que pH 5 (Tabela 4).
Identificação do 16S rRNA
Uma análise de identificação de rRNA 16S foi conduzida em diferentes pHs de substrato usados para cultivar plantas por 3 meses. O objetivo principal desta análise foi identificar os diferentes tipos de espécies de bactérias microbianas rizosféricas e sua abundância relativa em relação ao pH do substrato de plantas saudáveis e com HLB+. As amostras foram coletadas e preparadas conforme indicado anteriormente para sequenciamento Illumina. Os diferentes pHs do substrato geraram sequências de rizobactérias não cultivadas do rRNA 16S com classificação taxonômica de reino semelhante. Bactérias foram o reino mais detectado em amostras de substrato de plantas saudáveis e com HLB+ (Figuras Suplementares S1–S6). Os pHs do substrato influenciaram os táxons de filos, e uma notável maior abundância relativa de presença de Proteobacteria foi detectada para todas as amostras de substrato testadas.

As sequências de rizobactérias não cultivadas da análise de identificação do rRNA 16S foram usadas metodicamente para construir árvores filogenéticas para cada um dos tratamentos de pH, conforme descrito. Uma média de 19–25 sequências de rizobactérias foi gerada por amostras de substrato saudáveis e com HLB+ (Figuras Suplementares S1–S6). À medida que os tratamentos de pH mudaram de condições ácidas para alcalinas, a diversidade microbiana aumentou.

As condições de substrato ácido produziram mais filos de Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Firmicutes e Verrucomicrobia em plantas saudáveis, e o grupo de filo Planctomycetes e uma presença relativamente baixa de Acidobacteria em amostras com HLB+ (Tabela 5). Proteobacteria foi o filo mais abundante observado em plantas cultivadas em condições de substrato com pH ácido 4 em ambos os status de doença.

Porcentagens de classificação dos oito principais filos da Illumina de "Ray Ruby" grapefruit (C. paradisi) em porta-enxerto de laranja azeda (C. aurantium) expostos a diferentes status de doença HLB [livre de HLB ou saudável (negativo, HLB–) e afetado por HLB (positivo, HLB+)] sob uma faixa crescente de pH do substrato (4–9).

Filos/pH do substrato HLB+ HLB– 4 5 6 7 8 9 4 5 6 7 8 9 % Proteobacteria 35,3 41,51 40,97 42,84 41,14 41,99 40,82 42,66 40,97 45,56 40,20 43,45 Firmicutes 13,5 12,21 10,81 9,51 14,31 18,64 10,76 9,70 9,85 9,93 14,30 15,20 Verrucomicrobia 11,72 8,84 5,29 5,42 7,68 4,74 10,37 10,99 4,38 5,51 6,46 5,76 Outros 10 6,05 8,13 9,71 8,69 8,28 10,76 7,79 6,75 8,85 7,06 8,25 Actinobacteria 8,24 7,04 5,92 7,44 5,83 5,10 8,54 7,18 7,43 8,48 7,49 5,58 Acidobacteria 7,71 5,08 4,16 2,44 N/A N/A 5,39 5,28 4,26 2,30 N/A N/A Não classificado 7 7,16 10,07 11,62 9,71 9,39 6,14 6,98 7,36 8,75 9,71 9,95 Bacteroidetes 6 7,92 10,41 7,71 8,74 7,59 6,93 5,75 8,55 8,51 7,95 7,98 Planctomycetes 3 4,18 4,24 5,77 3,90 4,27 3,28 3,67 4,4 4,41 4,43 3,83
Proteobacteria, Acidobacteria, Planctomycetes, Firmicutes e Verrucomicrobia foram os filos majoritários detectados em plantas saudáveis e HLB+ cultivadas sob substrato pH 5 (Tabela 5). Cerca de um quinto das amostras saudáveis e HLB+ em pH 5 indicaram presença de bactérias acidófilas, influenciadas pelas condições ácidas. Em contraste, um quarto das classificações de famílias saudáveis e HLB+ foram agrupadas e aglomeradas como "outras".

A presença de filos mudou de acordo com o status da doença em um substrato ligeiramente ácido. Proteobacteria, Firmicutes e Bacteroidetes foram os filos mais detectados em amostras saudáveis cultivadas em substrato com pH 6 (Tabela 5). Quanto às amostras HLB+, Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes e Planctomycetes foram as quatro classificações de filos mais abundantes. Os três principais filos detectados em plantas saudáveis cultivadas em pH 7 incluíram Proteobacteria, Actinobacteria e Bacteroidetes (Tabela 5). Para amostras HLB+, Proteobacteria, Firmicutes e Bacteroidetes foram os três filos mais abundantes detectados.

Amostras de plantas saudáveis cultivadas em substrato ligeiramente alcalino (pH 8) apresentaram Proteobacteria, Firmicutes e Bacteroidetes como os filos mais detectados (Tabela 5). Além disso, Proteobacteria foi a classe de maior representatividade para pH 8 em amostras saudáveis e HLB+, seguida por Rhizobiales, Baccillales e Sphingobacteriales. Proteobacteria também foi o principal filo detectado no substrato alcalino pH 9 em condições saudáveis e HLB+, seguido por Firmicutes e Bacteroidetes (Tabela 5).

Discussão

Valores de Ct e Título de CLas

As condições do solo e ambientais afetam o vigor, a produtividade e a resistência a doenças das plantas (Larkin,). Relatos anteriores mostraram que múltiplas doenças de plantas causadas por agentes fúngicos, bacterianos, virais e oomicetos estão intimamente relacionadas a más condições do solo e influenciadas por variações no pH do solo (Holland et al.,; Bennett e Klironomos,). A regulação da acidificação do solo pela adição de calcário e aumento do pH do solo é benéfica para a multiplicação de CLas em plantas HLB+ ao longo de meses de infecção e para inibir a propagação da doença HLB para árvores saudáveis (Li et al.,). Neste estudo, o pH influenciou o número de cópias de CLas no tecido foliar no início do experimento (p < 0.05), pois os pHs do substrato 5 e 9 apresentaram títulos de CLas mais altos do que os outros pHs de substrato testados. No entanto, após 90 dias, não houve diferença entre os pHs de substrato testados (p = 0.842).
Geralmente, menos íons metálicos podem se ligar aos coloides do solo em pH baixo, estando mais disponíveis para a absorção pelas plantas (Jones e Jacobsen,). Em nosso estudo, pHs mais baixos do substrato (4 e 5) aumentaram a concentração de N, S e Mn nas folhas, enquanto K+ apresentou maior concentração sob substrato ligeiramente alcalino. O NO é melhor absorvido pelas plantas em condições ácidas, e seu processo de absorção está intimamente relacionado a H+ e OH−. Em ambientes ácidos, a concentração de S aumenta quando o solo contém óxidos de alumínio e ferro hidratado (Alam et al.,), mas também devido à substituição do OH− nos coloides do solo neutralizados pela presença de H+ originado da hidrólise do Al, causada pela substituição pelos cátions adicionados com o sulfato no solo. A presença de Mn nas folhas sob pH neutro/alcalino é coerente com outros estudos com soja, pois a disponibilidade de Mn é inversamente relacionada ao pH do solo (Monk,). Um aumento para pH 7 ou 8 acelera a oxidação de Mn2+ para formas menos solúveis. Conforme confirmado neste estudo, um ambiente ligeiramente ácido (pH 5 a 5,5) aumentou a absorção de Mn. As concentrações de S foram maiores sob pH baixo, como esperado, já que o pH do substrato foi reduzido com enxofre elementar.
A presença de K+ em pHs mais baixos do substrato é rara, pois H+ e Al3+ substituem o cátion, de acordo com nossos achados. Da mesma forma, Fe3+ é altamente disponível em condições ácidas, promovendo a mobilização de minerais de Fe (Colombo et al.,). O pH alcalino do substrato/solo aumenta o pH do apoplasto radicular, no qual o bicarbonato neutraliza os prótons bombeados para fora do citosol por um transportador de Fe, dificultando e até bloqueando a redução de Fe3+ (Mengel,).
As concentrações foliares de N, Mg, S e B diferiram entre plantas saudáveis e HLB+ independentemente dos pHs testados. Um estudo mostrou que árvores HLB+ apresentaram maiores concentrações de N e Zn do que árvores saudáveis (Razi et al.,), corroborando os achados deste estudo, já que o N foliar em plantas HLB+ foi maior do que em plantas saudáveis de toranja “Ray Ruby” (Tabela 2). O Mg é o elemento mineral central na composição da molécula de clorofila e é fundamental para vários outros mecanismos de defesa nas plantas (Verbruggen e Hermans,). Como o processo de carregamento e descarregamento do floema é reduzido pela deposição de calose e proteína P nos poros das plantas HLB+ (Koh et al,.), espera-se uma redução na síntese de clorofila; portanto, reduzindo a absorção de Mg por plantas HLB+.
Embora fornecidas com solução de fertirrigação padrão, as concentrações foliares de B em plantas saudáveis e HLB+ excederam o máximo de 100 ppm estabelecido por Morgan et al. para a produção de citros. Isso é consequência das práticas de manejo de nutrientes do viveiro, pois eles constantemente pulverizam fertilizantes foliares contendo B em sua formulação. Os poucos estudos que compararam a concentração foliar de B entre plantas saudáveis e HLB+ não mostraram diferença para o status da doença, com tendência de maior eficiência de absorção de nutrientes em plantas HLB+ (Cimò et al.,; Shahzad et al.,).
As concentrações de Ca, Cu e Zn nas folhas responderam ao estado da doença e aos pHs do substrato. Embora nenhum tratamento tenha atingido valores mínimos para a concentração ideal de Ca nas folhas, as plantas HLB+ apresentaram menor concentração de Ca nas folhas em comparação com folhas saudáveis sob pH 4, 5 e 8. Ghimire et al. descobriram que árvores HLB+ sob pH 8 apresentavam deficiência de Ca e Zn, corroborando os resultados deste estudo. Além disso, Shahzad et al. mostraram que a concentração de Ca nas folhas era maior em árvores cítricas saudáveis do que em folhas sintomáticas de HLB sob o mesmo meio neutro de pH 7, enquanto a concentração de Fe nas folhas era maior em plantas HLB+ sob meios de pH 6 e pH 8. Nosso estudo mostra a mesma resposta da toranja "Ray Ruby" em termos de concentração de Ca e Fe nas folhas, pois plantas saudáveis apresentaram a maior concentração de Ca sob substrato de pH 8 em comparação com plantas HLB+ sob a mesma condição de pH (Figura 4), e plantas cultivadas sob pH 6 apresentaram quantidades excessivas de Fe nas folhas (Tabela 2). O Ca é crucial para o crescimento das plantas, como parte dos constituintes da parede celular e, além disso, como sinal para a defesa da planta (Hepler,). Sabe-se que árvores HLB+ têm crescimento atrofiado e recuperação lenta da alimentação pelo ACP, e isso se deve em parte à baixa aquisição e mobilização de Ca através das raízes finas para fornecer estabilidade de membrana (Spann and Schumann,).

Ghimire et al. mostraram que as concentrações de Cu nas folhas eram maiores em árvores HLB+ sob pH 6 em comparação com pHs 7 e 8. É amplamente conhecido que árvores HLB+ têm concentrações de Cu mais baixas devido à atividade fotossintética limitada e à formação de clorofila (Nwugo et al.,; Inoue et al.,). No entanto, a aplicação de Cu como pulverização foliar pelo viveiro antes do ensaio torna difícil a comparação entre os achados deste estudo e a literatura.

O papel do Zn em árvores HLB+ é bem documentado, pois os sintomas de HLB frequentemente se assemelham à deficiência de Zn (Bové,; Nwugo et al.,). Curiosamente, plantas saudáveis de "Ray Ruby" cultivadas em substrato de pH 7 acumularam mais Zn nas folhas em comparação com HLB+ (p < 0,05) devido à melhoria na nutrição das plantas e promoção do crescimento radicular (Shahzad et al.,). No entanto, apenas plantas saudáveis sob pH 5 atingiram níveis ótimos de Zn nas folhas, já que o pH alcalino pode levar a concentrações reduzidas de Zn e outros micronutrientes (Boswell et al.,).
Estudos anteriores focaram no efeito de estresses abióticos e nutrição de plantas cítricas afetadas pelo HLB (Romero-Conde et al.,; Aparicio-Durán et al.,), mas pouco se sabe sobre a resposta de trocas gasosas de plantas HLB+ a diferentes pHs de substrato. Neste estudo, nem o status da doença nem os pHs do substrato afetaram a fotossíntese líquida de “Ray Ruby” (Tabela 3). Plantas sadias não apresentaram maior fotossíntese nos pHs de substrato testados (Figura 4, p > 0,05); no entanto, condições ácidas resultaram na maior concentração intercelular de CO2, conforme observado por Long et al. Nosso estudo mostra que o pH alcalino influenciou o aumento da concentração intercelular de CO2 em plantas HLB+ “Ray Ruby” em comparação com condições de pH do substrato ácido/neutro, o que é incomum (Liu e Shi,; Yang et al.,; Ghimire et al.,). As mudanças no CO2 intercelular são causadas pela salinidade do solo/substrato e sua relação com as respostas fisiológicas dos citros (Aparicio-Durán et al.,). Neste estudo, o pH afetou a disponibilidade de nutrientes e possivelmente sua solubilidade no solo. Os íons Na+ e Cl− não foram quantificados, e não está claro se a salinidade ou a falta dela causou o aumento do CO2 intercelular em plantas HLB+ sob pH de substrato alcalino.
Tamanho da Planta e Biomassa
O status da doença influenciou o crescimento e a biomassa das plantas de toranja “Ray Ruby”. Isso é esperado, uma vez que o fornecimento de carboidratos é reduzido pelo bloqueio do floema quando a bactéria infecta a planta, e a partição e o uso de carboidratos em novas folhas/brotos são prejudicados (Cimò et al.,). A altura da planta foi influenciada pela presença do CLas ao final do experimento (Tabela 4). Em contraste, o diâmetro do caule foi influenciado pela interação entre o status da doença e os pHs do substrato aos 30 DAT (Figura 6). Plantas HLB+ apresentaram tronco mais fino do que plantas sadias. No entanto, esses dados diferem de Ghimire et al., em que diferentes pHs de água de irrigação não afetaram o diâmetro do tronco da laranjeira doce.
O volume da copa foi menor em plantas HLB+ sob pH 4 (ácido) e pHs 6 e 7 (neutro), conforme mostrado na Figura 7. Morgan e Graham; Ghimire et al., e Yang et al. indicaram que plantas de laranjeira doce com HLB estabelecidas em campo podem necessitar de um substrato com pH levemente ácido para o crescimento adequado da copa. No entanto, neste estudo, plantas HLB+ sob pH 5 apresentaram volume de copa semelhante ao de plantas sadias. Este resultado foi uma surpresa, uma vez que a acidificação do substrato por S não influenciou o volume da copa das plantas de toranja “Ray Ruby”.
Como esperado, o crescimento radicular e o acúmulo de biomassa foram maiores em plantas saudáveis em comparação com plantas HLB+. A perda de raízes em árvores HLB+ é bem conhecida (Johnson et al.,), explicando a redução na absorção de água e nutrientes para sustentar o desenvolvimento da parte aérea. A relação raiz-parte aérea reflete o crescimento e o acúmulo de matéria seca entre raízes e parte aérea (Lloret et al.,), uma vez que o crescimento radicular depende fortemente do metabolismo e do acúmulo de matéria seca na parte aérea. Assim, a relação raiz-parte aérea tende a diminuir com o aumento do tamanho da planta (Monk,). Uma relação raiz-parte aérea baixa também indica crescimento radicular deficiente (Zhang,), como observado na toranja 'Ray Ruby' HLB+ testada neste estudo. Diferenças genéticas entre variedades de laranja-doce e toranja podem justificar os valores opostos da relação raiz-parte aérea. Diferentemente das laranjas-doces 'Valencia' e 'Midsweet' (Morgan and Graham,; Ghimire et al.,), as condições alcalinas do substrato aumentaram a relação raiz-parte aérea na toranja 'Ray Ruby'. Além disso, revela qual pH do substrato é adequado para o crescimento radicular ideal sob infecção por CLas.
16S rRNA Identification and Phylogenetic Analysis
Foram identificadas 119 espécies de rizobactérias pelo sequenciamento do gene 16S rRNA em amostras HLB– e 123 em amostras HLB+. Os filos selecionados representados (Planctomycetes para pHs baixos e Bacteroidetes para pHs altos) são críticos para suas funções biológicas.
A análise de cluster do microbioma radicular de plantas HLB+ resultou em diferenças relevantes em comparação com plantas saudáveis (Tabela 5). A análise de sequenciamento do gene 16S rRNA para os diferentes valores de pH forneceu as populações rizobacterianas em condições de substrato ácido, neutro e básico, destacando a viabilidade, proliferação e potenciais reações bioquímicas dos microrganismos necessárias para a disponibilidade de nutrientes. Amostras de substrato de plantas saudáveis e HLB+ apresentaram o filo Acidobacteria em plantas cultivadas sob condições ácidas de pHs 4 e 5. O filo Planctomycetes é proeminente em todos os substratos amostrados de HLB– e HLB+. Espécies de Planctomycetacae são bactérias gram-negativas primitivas com características morfológicas e reprodutivas distintas, como a ausência de uma camada de peptidoglicano na membrana celular e processos mitóticos específicos, dividindo-se por brotamento polar em vez de fusão binária (Fuerst e Sagulenko,). Este filo é comumente conhecido por seu papel no crescimento das plantas, por exemplo, oxidando amônio para fixação de N, já que o processo de desnitrificação é uma função crítica de crescimento na rizosfera e permite maior disponibilidade de nutrientes (Henry et al.,). No entanto, a análise filogenética para substratos com pHs 4 e 5 em plantas HLB+ (ver Gráficos suplementares) resultou na ausência de Planctopirius limnophila, uma espécie do filo Planctomycetes (Fuerst e Sagulenko,). Além disso, a análise metagenômica de comunidades mistas em biorreatores de Candidatus Kuenemia stuttgartiensis, uma espécie de Planctomycetes identificada por genes que codificam oxidorredutases. Oxidorredutases são aceptores de elétrons que podem reduzir Fe e Mn, dois elementos comuns em plantas cítricas. Vale ressaltar também que Planctomycetes, Verrucomicrobia e Chlamydia (PVC) são um clado de superfilo intimamente relacionado. Esses filos Verrucomicrobia estão presentes em todas as amostras de substrato HLB– e HLB+ com pH > 6 (Fuerst e Sagulenko,).
As amostras de substrato neutro e básico apresentaram maior abundância do filo Bacteroidetes. Bacteroidetes são bactérias gram-negativas, em forma de bacilo, anaeróbias. A presença do filo Bacteroidetes na análise de sequenciamento do gene 16S rRNA apoia/correlaciona-se com estudos anteriores que identificaram este filo em solos de estufa e não explorados (Kim et al.,) com pH relativamente neutro a básico (Lauber et al.,). A funcionalidade mais estudada dos Bacteroidetes é a degradação de moléculas grandes e complexas, como polissacarídeos e proteínas, provavelmente indicando que mais bactérias desse filo podem resultar em maior disponibilidade de nutrientes para absorção pelas plantas. As espécies de Bacteroidetes são abundantes em árvores cítricas (Xu et al.,), conforme indicado nos gráficos de classificação de filos. Além disso, Bacteroidetes se correlacionam positivamente com quantidades maiores em substratos neutros a alcalinos, o que é mostrado nos gráficos de classificação de filos, exceto por um valor percentual maior para o substrato pH 4 de plantas HLB+ (Thomas et al.,). Plantas saudáveis e HLB+ em pHs de substrato neutro e básico (6, 7, 8 e 9) exibiram mais diversidade microbiana do que pHs de substrato ácido (4 e 5) (Figuras Suplementares S1–S6). Embora as sequências de 16S rRNA forneçam a diferença entre o microbioma rizobacteriano em vários tratamentos de pH, pouco conhecimento está disponível sobre o papel ou funções exatas do microbioma rizobacteriano e suas interações com a disponibilidade de nutrientes e função de transporte. Essa informação pode ser usada para identificar microrganismos que podem melhorar a saúde e a produtividade dos citros.
Conclusões
Este estudo investigou o efeito de uma ampla gama de valores de pH no tamanho e biomassa das plantas, concentração de nutrientes, trocas gasosas foliares e microbioma rizobacteriano da toranja 'Ray Ruby' afetada pelo HLB. Os pHs do substrato influenciaram fortemente o tamanho e a biomassa das plantas HLB+. O pH elevado afetou a disponibilidade de nutrientes para absorção radicular, alterando o equilíbrio nutricional em todo o sistema da planta. Como a fotossíntese das plantas não foi afetada pelos pHs do substrato, podemos indicar que o pH não recupera as plantas HLB+ para os níveis fotossintéticos de plantas saudáveis—embora pHs elevados do substrato tenham influenciado positivamente o CO2 interno. Nenhum efeito do pH do substrato no estado de doença das plantas foi induzido pelo aumento da absorção de nutrientes. Por outro lado, a análise filogenética indicou que o HLB aumenta a população rizobacteriana na toranja. A análise de sequenciamento do gene 16S rRNA para baixos pHs do substrato também revelou uma ausência do filo Planctomycetes nas amostras HLB+. A falta de bactérias fixadoras de N pode potencialmente afetar negativamente o aumento das concentrações foliares de N. Mais estudos são necessários para descobrir como grupos específicos de bactérias, como Planctomycetes e Bacteroidetes, influenciam as reações bioquímicas rizosféricas na rizosfera em relação às interações planta-doença.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados apresentados no estudo estão depositados no repositório GenBank, números de acesso OM836202 - OM836404.
Contribuições dos Autores
RF e XL desenharam e realizaram os experimentos. FT, XL, AG, HH, XW, J-HH e GF analisaram os dados. RF forneceu reagentes e equipamentos. RF, FT e XL escreveram a maior parte do manuscrito, com contribuições significativas de AG, HH, XW, J-HH e GF. Todos os autores contribuíram para o artigo e aprovaram a versão submetida.
Financiamento
O financiamento para este estudo foi fornecido por UF/IFAS, Fujian Special Fund for Scientific Research Institutes in the Public Interest (2020R10280017), Collaborative Innovation Project from PGFP & CAAS (XTCXGC2021006), the Science and Technology Innovation Team of FAAS (CXTD2021003-3), e Research Project of FAAS (A2017-1).
Conflito de Interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Nota do Editor
Todas as afirmações expressas neste artigo são exclusivamente dos autores e não representam necessariamente aquelas de suas organizações afiliadas, ou aquelas do editor, dos editores e dos revisores. Qualquer produto que possa ser avaliado neste artigo, ou alegação que possa ser feita por seu fabricante, não é garantido ou endossado pelo editor.
Material Suplementar
O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.856937/full#supplementary-material
Referências
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