pmid: "20811644"
title: "Regulação transcricional do metabolismo lipídico hepático humano e de rato pelo flavonóide da toranja naringenina: papel do PPARalfa, PPARgama e LXRalfa."
authors: "Goldwasser J, Cohen PY, Yang E, Balaguer P, Yarmush ML, Nahmias Y"
journal: "PloS one"
pubdate: "2010 Aug 25"
doi: "10.1371/journal.pone.0012399"
source: "PMC Full Text"

Regulação transcricional do metabolismo lipídico hepático humano e de rato pelo flavonóide da toranja naringenina: papel do PPARalfa, PPARgama e LXRalfa.

Autores

Goldwasser J, Cohen PY, Yang E, Balaguer P, Yarmush ML, Nahmias Y

Periodico

PloS one (2010 Aug 25)

Conteudo

Regulação Transcricional do Metabolismo Lipídico Hepático Humano e de Rato pelo Flavonoide da Toranja Naringenina: Papel do PPARα, PPARγ e LXRα
A desregulação da homeostase lipídica e de carboidratos é um fator importante no desenvolvimento de doenças metabólicas prevalentes, como diabetes, obesidade e aterosclerose. Portanto, pequenas moléculas que possam reduzir a dependência de insulina e regular a dislipidemia poderiam ter um efeito dramático na saúde pública. O flavonoide da toranja naringenina demonstrou normalizar lipídios no diabetes e na hipercolesterolemia, bem como inibir a produção do VHC. Aqui, demonstramos que a naringenina regula a atividade dos receptores nucleares PPARα, PPARγ e LXRα. Mostramos que ela ativa o domínio de ligação ao ligante tanto do PPARα quanto do PPARγ, enquanto inibe o LXRα em repórteres de fusão GAL4. Usando TR-FRET, mostramos que a naringenina é um agonista parcial do LXRα, inibindo sua associação com o coativador Trap220 na presença de TO901317. Além disso, a naringenina induz a expressão do coativador do PPARα, PGC1α. O flavonoide ativa o elemento de resposta ao PPAR (PPRE) enquanto suprime o elemento de resposta ao LXRα (LXRE) em hepatócitos humanos, traduzindo-se na indução de genes de oxidação de ácidos graxos regulados pelo PPAR, como CYP4A11, ACOX, UCP1 e ApoAI, e na inibição de genes lipogênicos regulados pelo LXRα, como FAS, ABCA1, ABCG1 e HMGR. Esse efeito resulta na indução de um estado semelhante ao jejum em hepatócitos primários de rato, no qual a oxidação de ácidos graxos aumenta, enquanto a produção de colesterol e ácidos biliares diminui. Nossas descobertas explicam os inúmeros efeitos da naringenina e apoiam seu desenvolvimento clínico contínuo. Vale ressaltar que esta é a primeira descrição de um inibidor não tóxico e de ocorrência natural do LXRα.
Introdução
O fígado é o centro da homeostase lipídica e de carboidratos. A desregulação dessa homeostase tem sido implicada em processos patológicos, como aterogênese, resistência à insulina e hipermetabolismo. Condições metabólicas, como resistência à insulina, podem ser parcialmente atribuíveis a 'dietas do estilo ocidental' e estão associadas a gastos médicos e perda de produtividade que totalizam mais de US$ 130 bilhões anualmente. Portanto, medicamentos ou suplementos alimentares que possam potencialmente reduzir a dependência de insulina e regular a dislipidemia poderiam ter um efeito dramático nos gastos com saúde e na saúde pública.
Um grupo de compostos previamente demonstrado ter propriedades hipolipemiantes e anti-inflamatórias tanto in vivo quanto in vitro são os flavonoides cítricos. O abundante flavonoide aglicona naringenina, responsável pelo sabor amargo da toranja, tem sido extensivamente estudado nos últimos anos. Estudos in vivo demonstraram seu potencial como agente normolipemiante: em um ensaio clínico recente, a naringenina reduziu os níveis circulantes de lipoproteína de baixa densidade (LDL) em 17% em pacientes hipercolesterolêmicos. Da mesma forma, os efeitos redutores de colesterol da naringenina foram demonstrados em coelhos e ratos. Em células HepG2, a naringenina reduziu a secreção de VLDL através da inibição das enzimas ACAT2 e MTP, cruciais para a montagem da VLDL. A naringenina também induziu a transcrição de LDL-R através da ativação da PI3K a montante de SREBP-1a. Outros estudos demonstraram que a naringenina inibiu a HMG-CoA redutase (HMGR), enquanto ativava enzimas importantes na oxidação de ácidos graxos, como a CYP4A1. Os inúmeros efeitos da naringenina sugerem que o flavonoide pode estar visando a regulação transcricional do metabolismo através dos receptores nucleares (RNs), uma família de fatores de transcrição ativados por ligantes, que desempenham um papel crítico na regulação do metabolismo lipídico. Reforçando essa hipótese está o relato anedótico de que a naringenina se liga ao LXRα e, mais recentemente, de que o flavonoide induz a atividade de PPRE em células U-2OS.

Neste estudo, demonstramos que a naringenina é um agonista de PPARα e PPARγ, e um agonista parcial de LXRα. Mostramos que a naringenina induz a ativação do domínio de ligação ao ligante (LBD) de PPARα e PPARγ em repórteres de proteína de fusão GAL4 e induz a atividade de PPRE em células Huh7.5 de hepatoma humano. Usando um ensaio TR-FRET in vitro, demonstramos que essa interação não altera a ligação do peptídeo coativador PGC1α ao domínio de ligação ao ligante recombinante de PPARα.

Concomitantemente, a naringenina inibe a ativação do LBD de LXRα em um repórter de proteína de fusão GAL4 na presença do agonista de LXRα TO901317. Usando um ensaio TR-FRET in vitro, demonstramos que esse efeito é mediado pela inibição da ligação do peptídeo coativador Trap220/Drip-2 ao LBD recombinante de LXRα. Como esperado, a naringenina também inibe a atividade de LXRE em células Huh7.5. Mostramos que a indução de PPARα e a inibição de LXRα induzem as alterações transcricionais esperadas em hepatócitos, regulando positivamente genes importantes na oxidação de ácidos graxos e regulando negativamente a síntese de colesterol e ácidos graxos. Esses efeitos resultam na indução de um estado semelhante ao jejum em hepatócitos primários, no qual a produção de triglicerídeos e ácidos biliares é inibida e a geração de corpos cetônicos aumenta.

Resultados
A naringenina ativa PPARα e PPARγ
Os efeitos múltiplos da naringenina, incluindo a indução da β-oxidação e a anti-inflamação, sugerem um mecanismo subjacente semelhante às atividades dos agonistas de PPARα e PPARγ, como fibratos ou tiazolidinedionas (TZDs). Portanto, a ativação de PPARα e PPARγ pela naringenina foi investigada utilizando as linhagens de células repórter HeLa descritas anteriormente, HG5LN GAL4-PPARα e HG5LN GAL4-PPARγ. Nessas células, o LBD do PPAR é fusionado ao domínio de ligação ao DNA GAL4 e expresso constitutivamente. Ao se ligar a um agonista, a proteína de fusão PPAR-GAL4 ativa um repórter de luciferase. A naringenina ativou o PPARα de forma dose-dependente, atingindo 24%±0,2% de indução a 240 µM (P<0,001) em relação a 1 µM do agonista de PPARα GW7647 (Fig. 1a). Além disso, a naringenina ativou o PPARγ em até 57%±0,3% a 80 µM (P<0,005) em relação ao agonista de PPARγ 1 µM BRL49653 (Fig. 1b).

A naringenina induz a ativação dos domínios de ligação ao ligante de PPARα e PPARγ.

Células repórter HG5LN expressando os repórteres GAL4-PPARα (a) e GAL4-PPARγ (b) foram tratadas com concentrações crescentes de naringenina. A naringenina ativou o PPARα de forma dose-dependente, atingindo 24%±0,2% de indução a 240 µM (P<0,001); e ativou o PPARγ em até 57%±0,3% a 80 µM (P<0,005). Os dados são apresentados como percentual de ativação em relação a 1 µM dos agonistas clássicos GW7647 e BRL49653, respectivamente. (c) Ensaio LanthaScreen TR-FRET, demonstrando que a naringenina não afetou a ligação do peptídeo coativador PGC1α ao LBD recombinante de PPARα. (d) Em contraste, o agonista clássico de PPARα GW7647 induz uma ligação dose-dependente de PGC1α ao PPARα no mesmo ensaio.

Para caracterizar melhor a interação entre PPARα e naringenina, foi realizado um ensaio LanthaScreen de transferência de energia por ressonância de fluorescência resolvida no tempo (TR-FRET). Esse sistema livre de células mede a capacidade de um composto de aumentar a ligação de um LBD recombinante de PPARα a um peptídeo coativador PGC1α, medida por um aumento no sinal TR-FRET. Enquanto o GW7647 mostrou um claro aumento dose-dependente (EC50 = 2,5 nM) na ligação de PGC1α ao PPARα, como esperado (Fig. 1d), a ligação de PGC1α ao PPARα não aumentou na presença de naringenina (Fig. 1c), sugerindo que a capacidade da naringenina de ativar PPARα não envolve diretamente o aumento da ligação do LBD de PPARα ao PGC1α.

Uma possibilidade é que a naringenina induza a transcrição do próprio PGC1α, um efeito que não pode ser observado no ensaio TR-FRET livre de células. De fato, a estimulação de células Huh7 com 380 µM de naringenina por 24 horas aumentou a abundância do mRNA de PGC1α em 14 vezes (p = 0,001) em comparação com os controles tratados com DMSO.

A naringenina é um agonista parcial de LXRα
Nosso grupo e outros demonstraram que a naringenina inibe a HMGR, uma enzima controlada pelo SREBP1c e, por sua vez, pelo LXRα. De fato, há algumas indicações de que a naringenina se liga ao LXRα in vitro . Para testar a capacidade da naringenina de funcionar como antagonista do LXRα, células LXR-alpha-UAS-bla HEK 293T foram estimuladas com 4.7 nM de TO901317 (correspondente a TO901217 EC80) e, em seguida, tratadas com concentrações crescentes de naringenina. A naringenina inibiu a atividade do LXRα de forma dose-dependente, atingindo 28.4%±0.4% (p<0.01) e 39.1%±9.4% (p<0.05) nas concentrações de 126 µM e 400 µM, respectivamente ( Fig. 2a ).
A naringenina é um agonista parcial do domínio de ligação ao ligante do LXRα.
(a) Células LXR-alpha-UAS-bla HEK 293T foram estimuladas com 4.7 nM de TO901317 e expostas a concentrações crescentes de naringenina. A naringenina inibiu a atividade do LXRα de forma dose-dependente, atingindo 28.4%±0.4% (p<0.01) e 39.1%±9.4% (p<0.05) nas concentrações de 126 µM e 400 µM, respectivamente. (b-d) Ensaio Lanthascreen TR-FRET, demonstrando que a naringenina aumentou fracamente a ligação do peptídeo coativador Trap 220/Drip-2 ao LBD recombinante do LXRα, e inibiu essa ligação na presença de TO901317, agonista clássico do LXRα. (b) A naringenina é um agonista fraco, aumentando a ligação do LBD do LXRα ao coativador Trap 220/Drip-2 de forma moderada, porém significativa, de maneira dose-dependente, atingindo 38.0%±2.8% de ativação. (c) O agonista do LXRα TO901317 aumentou fortemente a ligação do coativador. (d) Quando tratadas com 250 nM de TO901317, concentrações crescentes de naringenina levaram a uma inibição do sinal TR-FRET, atingindo 15.0%±4.1% de inibição (p<0.01) a 133 µM.
A interação entre LXRα e naringenina foi caracterizada adicionalmente usando um ensaio Lanthascreen TR-FRET. A naringenina aumentou a ligação do LBD do LXRα ao coativador Trap 220/Drip-2 de forma moderada, porém significativa, de maneira dose-dependente, atingindo 38.0%±2.8% de ativação ( Fig. 2b ) em comparação com o agonista do LXRα bem estudado, TO901317 ( Fig. 2c ). Notavelmente, na presença de 1 µM de TO901317 (correspondente a TO901317 EC80), a naringenina inibiu de forma dose-dependente a ligação do coativador Trap 220/Drip-2 ao LBD do LXRα, atingindo 11.6%±3% de inibição (p<0.01) a 133 µM ( Fig. 3d ). Esses resultados sugerem que a naringenina é um ligante e um agonista parcial do LXRα.
A naringenina ativa a expressão gênica dirigida por PPRE e inibe a expressão gênica dirigida por LXRE em hepatócitos humanos.
(a) A naringenina aumentou a atividade do PPRE de forma dose-dependente em células Huh7 transfectadas transitoriamente com um repórter PPRE, atingindo 17%±7% (p<0,05) a 200 µM. A indução não foi diferente dos agonistas de PPAR WY14,643 e ciglitazona. (b) A naringenina induziu a expressão do coativador de PPARα PGC1α em 14 vezes (p=0,001), bem como dos genes de oxidação de ácidos graxos regulados por PPARα CYP4A11/22, ACOX, UCP1 e ApoAI. Células Huh7 foram tratadas com naringenina por 24 horas, e o mRNA foi isolado e analisado por qRT-PCR. (c) A naringenina suprimiu a atividade do LXRE de forma dose-dependente em células Huh7 transfectadas transitoriamente com um repórter LXRE, atingindo 50,3%±2,6% (p<0,001) de inibição a 150 µM. (d) A naringenina inibiu a expressão dos genes de lipogênese regulados por LXRα ABCA1, ABCG1, HMGR e FASN. A viabilidade celular em todas as condições foi superior a 95%.
A naringenina induz o PPRE e inibe a atividade do LXRE em hepatócitos
Para explorar o efeito da naringenina na ativação de PPAR em hepatócitos, quantificamos a ativação de um repórter do elemento de resposta a PPAR (PPRE) em células Huh7. O tratamento com naringenina aumentou significativamente e de forma dose-dependente a atividade do PPRE, atingindo 17%±4% (p<0,01) a 150 µM ( Fig. 3a ). Níveis semelhantes de ativação foram observados quando as células foram expostas aos agonistas conhecidos de PPAR, WY14.643 (10%±5%) e ciglitazona (24%±5%). Notavelmente, a indução do PPRE pela naringenina a 200 µM não foi significativamente diferente da indução por 10 µM de WY14.643 (p=0,25).
Para testar a capacidade da naringenina de inibir a atividade de LXRα em hepatócitos, quantificamos a ativação de um repórter do elemento de resposta a LXR (LXRE) em células Huh7. O tratamento com naringenina diminuiu significativa e dose-dependentemente a atividade do LXRE, atingindo 50,3%±2,6% de inibição a 150 µM (p<0,001; Fig 3c ). Em comparação, um antagonista específico de LXRα recentemente publicado, 5CPPSS-50, não conseguiu inibir a atividade do LXRE nas mesmas condições (Fig. Suplementar 1 ) e levou a toxicidade significativa em doses mais altas.
Alterações gênicas e metabólicas induzidas por naringenina em hepatócitos
Para avaliar se a ativação de PPARα pela naringenina leva à indução de genes regulados por PPARα, estimulamos células Huh7 com 200 µM de naringenina por 24 horas e quantificamos a abundância de mRNA por qRT-PCR. A naringenina induziu a expressão dos genes de oxidação de ácidos graxos CYP4A11, ACOX, UCP1 e ApoAI em 68%, 31%, 60% e 25%, respectivamente ( Fig. 3b ). Por outro lado, a naringenina reduziu a abundância de mRNA dos genes regulados por LXRα ABCA1, ABCG1, HMGR e FASN em 92%, 27%, 43% e 41%, respectivamente ( Fig. 3d ). Esses resultados sugerem uma mudança da lipogênese e síntese de colesterol para a lipólise.
Interessantemente, Huff e colaboradores demonstraram anteriormente que a naringenina ativava a expressão de LDLR dependente de SREBP1a. Como SREBP é regulado por LXRα, estudamos a expressão gênica dos promotores de LDLR e HMGCS regulados por SREBP1/2 em células Huh7 usando construções repórter. Mostramos que a naringenina aumenta a transcrição de LDLR em 26%±11%, mas diminui a transcrição de HMGCS em 13%±3% ( Fig. 4d ). HMGCS é regulado por SREBP2 em vez de SREBP1 e, como HMGR, desempenha um papel na síntese de colesterol.
A naringenina induziu um estado semelhante ao jejum no metabolismo lipídico hepático.
(a) Células Huh7 foram estimuladas por 24 horas com 200 µM de naringenina, 10 µM de WY14,643 ou 10 µM de ciglitazona. O tratamento com naringenina levou a uma redução de 73%±9% (p<0,001) na produção de ApoB, enquanto o WY14,643 levou a uma redução de 33%±12% (p<0,01). O tratamento com ciglitazona não levou a uma alteração significativa na produção de VLDL. (b) Hepatócitos primários de rato foram estimulados com 200 µM de naringenina ou 10 µM de WY14,643. O tratamento com naringenina levou a uma redução de 61% (p<0,001) na produção de triglicerídeos e a um aumento de 17% na formação de corpos cetônicos, não diferente do WY14,643. No entanto, o tratamento com naringenina levou a uma redução de 32%±11% (p = 0,005) na produção de sais biliares, enquanto o WY14,643 não o fez. O acúmulo de ureia no meio não mudou significativamente. (c) Níveis intracelulares de triglicerídeos em hepatócitos primários de rato estimulados com naringenina. Observa-se uma ligeira diminuição. (d) Efeito da naringenina na expressão gênica mediada por SRE. Mostramos que a naringenina induz a transcrição de LDLR em 26% (p = 0,02) enquanto inibe a transcrição de HMGCS em 13% (p = 0,001). Acredita-se que cada promotor seja regulado por uma isoforma diferente de SREBP.
A ApoB100 é a proteína estrutural da VLDL, cuja produção é bloqueada pela naringenina. Como nossos resultados sugerem que a naringenina atua através da indução de PPARα, examinamos se os agonistas de PPARα e PPARγ afetavam a secreção de ApoB100. Células Huh7 foram estimuladas com 200 µM de naringenina, 10 µM de WY14,643 ou 10 µM de ciglitazona por 24 horas. Previsivelmente, a naringenina levou a uma redução de 73%±9% (p<0,001) na produção de ApoB ( Fig. 4a ) em comparação com uma redução de 33%±12% (p<0,01) pelo agonista de PPARα WY14,643. A ciglitazona não levou a uma alteração significativa na produção de ApoB.
Por fim, caracterizamos as alterações metabólicas induzidas pela naringenina em hepatócitos primários. Hepatócitos primários de rato foram estimulados com 200 µM de naringenina ou 10 µM de WY14,643 por 24 horas e o meio de cultura foi analisado quanto a alterações na ureia, triglicerídeos, ácidos biliares e corpos cetônicos (Fig. 4b). Como esperado, os hepatócitos primários não apresentaram alteração na produção de ureia. No entanto, tanto a naringenina quanto o WY14,643 levaram a uma redução de 61% (p<0,001) e 41% (p<0,05) na produção de triglicerídeos, respectivamente (Fig. 4b). A produção de corpos cetônicos foi apenas ligeiramente elevada em 17% e 23%, respectivamente. Importante, não foi encontrado aumento nos níveis intracelulares de triglicerídeos (Fig. 4c), sugerindo que essa inibição foi resultado do aumento da oxidação de ácidos graxos em hepatócitos primários. Curiosamente, enquanto o agonista de PPARα WY14,643 não teve efeito sobre a produção hepática de ácidos biliares, a naringenina causou uma redução significativa de 32%±11% (p = 0,005) na produção de sais biliares (Fig. 4b), possivelmente devido à inibição da síntese de colesterol, por meio da supressão de LXRα.
Discussão
A desregulação da homeostase lipídica está associada a múltiplos estados patológicos, incluindo distúrbios metabólicos, inflamatórios e infecciosos. A regulação metabólica é alcançada em mamíferos por meio de um mecanismo transcricional intrincado que responde a sinais fisiológicos. Nos últimos anos, uma família de fatores de transcrição ativados por ligantes chamados receptores nucleares emergiu como reguladores-chave do metabolismo celular. Anteriormente definidos como receptores órfãos, demonstrou-se que metabólitos-chave são os ligantes naturais de muitos receptores nucleares, incluindo os receptores X do fígado (LXRs) que respondem a oxisteróis e glicose, o receptor X farnesóide (FXR) que responde a ácidos biliares, e os receptores ativados por proliferadores de peroxissomos (PPARs) que respondem a ácidos graxos.
A família PPAR inclui PPARα, PPARγ e PPARδ. A prevalência desses subtipos de receptores varia em diferentes tecidos, sendo o PPARα o subtipo mais prevalente no fígado e o PPARγ o mais abundante no tecido adiposo. O PPARα é ativado por ácidos graxos liberados em um estado fisiológico de jejum, levando ao aumento da β-oxidação e da gliconeogênese. Na prática clínica, agonistas de PPARα (fibratos) são usados para tratar hiperlipidemia, enquanto agonistas de PPARγ (TZDs) são usados para aumentar a sensibilidade à insulina no músculo e no tecido adiposo. A família LXR inclui LXRα e LXRβ. Este último é expresso ubiquitariamente, enquanto o primeiro é encontrado principalmente no fígado, tecido adiposo e macrófagos e é ativado por glicose e esteróis, típico de um estado fisiológico alimentado. No fígado, após ativação por seus ligantes, LXRα ativa genes lipogênicos e glicolíticos, em parte por meio da ativação de SREBP. A HMGR, alvo das estatinas, é regulada por essa via, controlando a disponibilidade de colesterol para a síntese de ácidos biliares nos hepatócitos.
Após um evento de ligação de ligante, tanto PPARs quanto LXRs são ativados e heterodimerizam com o receptor X retinóide (RXR). Esse heterodímero então se liga a elementos de resposta conservados, como PPRE ou LXRE, enquanto recruta outras moléculas corregulatórias, como os coativadores PGC1α e Trap220 para PPARα e LXRα, respectivamente. A necessidade de um parceiro de ligação RXR leva à inibição competitiva no nível da ativação do receptor, oferecendo uma camada transcricional de controle sobre a transição jejum-alimentado. A existência tanto de um elemento de resposta PPAR (PPRE) quanto de um elemento de resposta LXR (LXRE) na região regulatória do LXRα sugere níveis adicionais de regulação cruzada. Por fim, outros coativadores, correpressores e quinases, como PI3K e ERK, podem regular a atividade dos receptores nucleares por mecanismos não transcricionais.

A naringenina é uma aglicona do flavonóide naringina da toranja, responsável pelo sabor amargo da toranja. A naringenina tem sido relatada como um antioxidante com propriedades hipolipemiantes, anticarcinogênicas e anti-inflamatórias tanto in vivo quanto in vitro. O flavonóide demonstrou reduzir a secreção de VLDL através da inibição de ACAT2 e MTP, enzimas críticas para a montagem das VLDL. Allister et al. demonstraram que essa inibição é regulada pela via MAPK/ERK. Além disso, a naringenina demonstrou regular positivamente o LDLR dependente de SREBP através da ativação de PI3K. A naringenina também demonstrou inibir a HMGR dependente de SREBP, enquanto ativa enzimas importantes na oxidação de ácidos graxos, como a CYP4A1. Esses múltiplos efeitos sugerem que o alvo do flavonóide pode estar no nível do receptor nuclear. Reforçando essa hipótese, há o relato anedótico de que a naringenina se liga ao LXRα e, mais recentemente, de que induz a atividade de PPRE em células U-2OS.
Neste trabalho, demonstramos que a naringenina ativa o LBD de PPARα e PPARγ usando uma linhagem de células repórter que superexpressa proteínas de fusão GAL4 para o LBD de PPARα ou LBD de PPARγ. A ativação do LBD de PPAR libera o complexo e permite que ele se ligue ao elemento de resposta UASG, expressando luciferase. Esse sistema repórter demonstra que a naringenina atua no LBD de PPARα e PPARγ ( Fig. 1 ), sugerindo que serve como um ligante natural. No entanto, o ensaio TR-FRET sugere que a naringenina não induz uma mudança conformacional no LBD de PPARα como outros ligantes, como GW7647, não conseguindo aumentar sua ligação ao coativador PGC1α ( Fig. 1 ). Uma possibilidade é que a naringenina induza uma mudança conformacional diferente no LBD de PPARα que recruta outro coativador, não encontrado no ensaio TR-FRET livre de células. No entanto, um cenário mais provável é que a naringenina induza a fosforilação de PPARα ou, alternativamente, a expressão de PGC1α. De fato, nossos dados mostram que a estimulação com naringenina aumenta a abundância do mRNA de PGC1α em células Huh7 em 14 vezes. Independentemente da natureza exata da interação, a ativação de PPARα induzida pela naringenina leva ao aumento da atividade de PPRE em hepatócitos humanos ( Fig. 3a ) e à expressão de genes regulados por PPARα ( Fig. 3b ).

Concomitantemente à ativação de PPARα, mostramos que a naringenina inibe a atividade de LXRα. Usando uma linhagem de células repórter semelhante que superexpressa a proteína de fusão GAL4 com LBD de LXRα, mostramos uma inibição significativa do LBD de LXRα na presença de TO901317, um agonista clássico ( Fig. 2 ). Em contraste com os achados com PPARα, mostramos que a naringenina aumenta especificamente a interação do coativador Trap-220 com o LBD de LXRα no ensaio TR-FRET livre de células. Curiosamente, na presença do agonista de LXRα TO901317, a naringenina realmente diminuiu a interação de Trap-220 com o LBD de LXRα, demonstrando que é um agonista parcial de LXRα, levando naturalmente a uma inibição competitiva da atividade de LXRα. Essa conclusão é ainda mais apoiada pela diminuição na atividade de LXRE em hepatócitos humanos ( Fig 3c ) e pela regulação negativa dos genes alvo de LXRα ( Fig. 3d ).
O efeito metabólico da indução de PPARα e inibição de LXRα pela naringenina é mostrado na expressão gênica ( Fig. 3 ) e em níveis funcionais ( Fig. 4 ). A abundância de mRNA de genes alvo de PPARα que controlam a oxidação de ácidos graxos, como CYP4A11, ACOX e UCP1, aumenta significativamente em células de hepatoma humano. Como o metabolismo lipídico de linhagens celulares de hepatoma é drasticamente menor do que o de hepatócitos primários, estudamos os aspectos metabólicos da regulação de PPARα e LXRα em hepatócitos primários de rato. Como esperado, tanto a naringenina quanto o agonista de PPARα, WY14,643, levaram a uma diminuição semelhante na produção de triglicerídeos e a um aumento na secreção de corpos cetônicos ( Fig. 4b ). Os níveis intracelulares de triglicerídeos hepáticos também foram ligeiramente reduzidos ( Fig. 4c ). Curiosamente, a naringenina causou uma redução muito mais acentuada de 73% na secreção de VLDL em comparação com a redução de 33% causada por WY14,643 ( Fig. 4a ). Essa diferença foi significativa (p = 0,006) e poderia possivelmente ser devida à inibição da síntese de colesterol via LXRα.

De fato, a abundância de mRNA de genes alvo de LXRα que regulam a síntese de ácidos graxos e colesterol, como ABCA1, ABCG1, HMGR e FASN, diminui ( Fig. 3d ). Embora a produção de colesterol não pudesse ser detectada em nosso sistema (dados não mostrados), o colesterol serve como precursor dos ácidos biliares hepáticos. Curiosamente, a ativação de LXRα demonstrou impulsionar a síntese de bile em ratos. Portanto, a redução de 32% na produção de ácidos biliares após a estimulação com naringenina ( Fig. 4b ) serve como uma medida substituta da produção de colesterol. WY14,643, que regula positivamente PPARα sem afetar LXRα, não mostrou tal alteração. Infelizmente, nenhum inibidor confiável de LXRα está disponível comercialmente, e 5CPPSS-50 mostrou toxicidade significativa em nossas mãos (Fig. S1). Resultados preliminares usando siRNA para LXRα mostraram alguma inibição da produção de ácidos biliares e VLDL, embora os resultados não tenham sido conclusivos (dados não mostrados).

Observamos que os dados do repórter de fusão GAL4 sugerem que, apesar da conhecida regulação cruzada entre PPARα e LXRα, a naringenina parece agir independentemente em cada um desses receptores nucleares. Esta é outra indicação da promiscuidade da família de receptores nucleares e sugere que programas metabólicos complexos podem ser induzidos por relativamente poucos compostos. De fato, agonistas duplos de PPARα e PPARγ foram recentemente investigados como agentes normoglicêmicos e antiaterogênicos. A ativação de PPARα e PPARγ pela naringenina sugere uma capacidade semelhante de regular a sensibilidade à insulina e os níveis de LDL. No entanto, em contraste com outros agonistas duplos de PPAR, como o Aleglitazar, nosso trabalho mostra que a naringenina também é um inibidor de LXRα. O programa metabólico provocado pela naringenina parece ser uma transição do estado alimentado para o jejum no metabolismo lipídico de hepatócitos primários. A naringenina não apenas aumenta a oxidação de ácidos graxos, mas também inibe a síntese de ácidos graxos e colesterol.
O potencial de usar um suplemento dietético natural para regular o metabolismo lipídico é atraente, pois esse subproduto da indústria de suco de toranja é não tóxico, barato e demonstrou propriedades anti-inflamatórias. Isso é especialmente importante no contexto dos crescentes custos do cuidado cardiovascular, estimados pela AHA em mais de US$ 500 bilhões este ano. A capacidade da naringenina de inibir a HMGR, alvo das estatinas, enquanto regula positivamente o PPARα, alvo dos fibratos, sugere que ela pode naturalmente encontrar seu lugar no tratamento rotineiro da hiperlipidemia.

Finalmente, nosso grupo e outros mostraram que o Vírus da Hepatite C (HCV) é criticamente dependente do metabolismo lipídico do hospedeiro. Interações semelhantes foram demonstradas para o Vírus da Hepatite B (HBV). Portanto, compostos que modulam o metabolismo lipídico hepático podem ter um efeito antiviral significativo. E, de fato, nosso trabalho mostra que a naringenina bloqueia a produção de HCV em células Huh7.5.1/JFH1 infectadas. Essas descobertas formam a base de um ensaio clínico atualmente em andamento para explorar a inibição da produção de HCV pela naringenina em pacientes não respondedores. Curiosamente, as propriedades anti-inflamatórias da naringenina poderiam ser facilmente explicadas no contexto da ativação de PPAR. Tais propriedades poderiam ter um efeito significativo na inflamação hepática, prevenindo ou retardando o desenvolvimento de hepatosteatose e câncer.

Materiais e Métodos

Reagentes

Soro fetal bovino (SFB), solução salina tamponada com fosfato (PBS), meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), penicilina, estreptomicina, tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), meio basal OptiMEM e Lipofectamine 2000 foram obtidos da Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). A insulina foi obtida da Eli-Lilly (Indianapolis, IN). O kit de ensaio de luciferase dupla foi adquirido da Promega (Madison, WI). O antagonista de LXRα relatado, 5CPPSS-50, foi um gentil presente do Dr. Hashimoto (Universidade de Tóquio). Salvo indicação em contrário, todos os outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemicals (St. Louis, MO).

Cultura de células

As células Huh7 foram um gentil presente do Prof. Raymond Chung, Massachusetts General Hospital. As células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de SFB e 200 unidades/mL de penicilina e estreptomicina em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 a 37°C. As células Huh7 foram subcultivadas a cada 3 dias e utilizadas em passagem <15.
Ativação do LBD do PPAR foi quantificada usando a linhagem celular HGLN5 PPARα e PPARγ descrita anteriormente. Resumidamente, células HeLa foram estavelmente transfectadas com o plasmídeo p(GAL4RE)5-βGlob-Luc-SVNeo, codificando o gene da luciferase de vaga-lume sob controle de um pentâmero de sítios de ligação do ativador de levedura GAL4 na frente do promotor da β-globina. As células foram subsequentemente estavelmente transfectadas com pGAL4-PPARα-puro ou pGAL4-PPARγ-puro, codificando os aminoácidos 1–147 do GAL4, seguidos por um curto ligante e o LBD de PPARα ou PPARγ, respectivamente. Células HGLN5 foram plaqueadas a uma densidade de 100.000 células/cm2, os compostos teste foram adicionados 8 horas depois e incubados por 16 horas. Após o tratamento, as células foram lavadas com PBS e lisadas em tampão Tris 25 mM (pH 7,8). A concentração de proteína foi calculada usando o ensaio de Bradford e usada para normalizar a atividade da luciferase. Finalmente, a ativação dos repórteres de PPARα e PPARγ é apresentada como porcentagem da ativação máxima pelos agonistas conhecidos GW7647 e BRL49653, respectivamente.

A ativação de LXRα foi investigada usando a tecnologia de repórter Beta-lactamase GeneBLAzer (Invitrogen SelectScreen Cell-Based Nuclear Receptor Profiling Service, Madison, WI). Células LXR-alpha-UAS-bla HEK 293T foram descongeladas e ressuspendidas em Meio de Ensaio (DMEM sem vermelho de fenol, 2% de FBS tratado com CD, 0,1 mM de NEAA, 1 mM de piruvato de sódio, 100 unidades/mL de penicilina e estreptomicina) a uma concentração de 312.500 células/mL. O agonista controle TO901317 na concentração EC80 pré-determinada (5 nM) foi adicionado a poços contendo concentrações variáveis de naringenina. A placa foi incubada por 16–24 horas a 37°C e 5% de CO2 em uma incubadora umidificada. A solução de carregamento de substrato foi adicionada a cada poço e a placa foi incubada por 2 horas em temperatura ambiente. A placa é lida em um leitor de placa de fluorescência. Os resultados para cada concentração (n = 4) são reportados como porcentagem de ativação dos controles estimulados com TO901317, livres de naringenina.
Ensaios TR-FRET
Ensaios de Coativador TR-FRET LanthaScreen, adquiridos da Invitrogen (Madison, WI), foram utilizados para identificar agonistas e antagonistas de PPARα e de LXRα. Nestes ensaios livres de células, os ligantes são identificados por sua capacidade de se ligar ao LBD recombinante do respectivo receptor e induzir uma mudança conformacional que resulta no recrutamento de um peptídeo coativador marcado com fluoresceína. Um LBD de PPAR alfa ou LXRα purificado, marcado com glutationa S-transferase (GST), é indiretamente marcado usando um anticorpo anti-GST marcado com térbio. O recrutamento do peptídeo coativador marcado com fluoresceína – PGC1α para PPARα ou Trap220 para LXRα – é medido monitorando a transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) do anticorpo marcado com térbio para a fluoresceína no peptídeo, resultando em uma alta razão TR-FRET (emissão 520/490 nm). Os compostos teste foram diluídos em DMSO, e os ensaios foram realizados conforme as instruções do fabricante. Resumidamente, para testar a capacidade de uma molécula funcionar como agonista, concentrações crescentes de naringenina ou do agonista controle foram adicionadas às soluções de LBD e peptídeo coativador. Para testar a capacidade de uma molécula funcionar como antagonista, um protocolo semelhante foi seguido, mas 250 nM de TO901317 (EC80 do agonista, medido neste ensaio) foram adicionados a todos os poços. Tanto no modo agonista quanto antagonista, após 1 a 2 horas de incubação à temperatura ambiente, a razão TR-FRET 520/490 foi medida com um leitor de placas fluorescentes PerkinElmer Envision com excitação a laser TRF usando o seguinte conjunto de filtros: excitação 330 nm, emissão 495 nm e emissão 520 nm. Um atraso de 100 µseg seguido por um tempo de integração de 200 µseg foi utilizado para coletar o sinal resolvido no tempo. Os resultados são exibidos como porcentagem de ativação em comparação com a ativação máxima do controle positivo.
Ensaios de luciferase repórter do elemento de resposta de PPAR e LXRα
A ativação de PPRE e LXRE foi quantificada por transfecção transitória de células Huh7 com plasmídeos repórteres de luciferase de vaga-lume previamente descritos, pACOX(×2)luc e pDR4(×2)luc, respectivamente. O plasmídeo pRL-TK (Promega, Madison, WI), que expressa constitutivamente a luciferase de renila, foi co-transfectado como controle positivo. pACOX(×2)luc foi transfectado em células Huh7 cultivadas em OptiMEM. Após 22 horas de cultura, as células foram estimuladas com naringenina, WY14,643 ou ciglitazona por 24 horas em meio de cultura padrão. Para quantificar a atividade de LXRE, as células foram similarmente transfectadas e tratadas com naringenina, 5CPPSS-50 ou TO901317. A razão da luminescência da luciferase de vaga-lume para a de renila foi quantificada usando um kit de Ensaio de Luciferase Dupla (Promega) seguindo as instruções do fabricante. Os níveis de DMSO foram iguais em todas as amostras e nunca excederam 0,5%. Os resultados são reportados como porcentagem de ativação em comparação com controles apenas com DMSO.
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real Quantitativa (qRT-PCR)
Após estimulação por 24 horas, as células foram lisadas com tampão RLT Plus contendo β-mercaptoetanol e o RNA foi isolado utilizando o RNeasy Mini Kit em um dispositivo QIACube (Qiagen, Valencia, CA). O RNA total foi quantificado em um espectrofotômetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Rockland, Del.) e a abundância de transcritos de mRNA foi medida em um Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real MyiQ utilizando o iScript One-Step RT-PCR Kit com SYBR Green (Bio-Rad, Hercules, CA), de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores utilizados nessas reações (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) foram desenhados usando o programa PRIMER-BLAST e aparecem na Tabela 1 .
Primers de qRT-PCR em Tempo Real.
Gene Iniciadores PPARα ACG CTT TCA CCA GCT TCG AG GAA AGA AGC CCT TGC AGC CT CYP4A11/22 ACT GGC TCT TCG GGC ACA TC ACA CGA ACT TTG CCT CCC CA ACOX TGG CAC ATA CGT GAA ACC GC CGC TGT ATC GGA TGG CAA TG ApoAI AAA GCT GCG GTG CTG ACC TT CGC TGT CTT TGA GCA CAT CCA LXRα GCT CCT TTT CTG ACC GGC TT TGA ATT CCA CTT GCA GCC CT ABCA1 TCT GGA AAG CTC TGA AGC CG TGA GTT CCT CCC ACA TGC CT ABCG1 ACC GGG GAA AAG TCT GCA AT TCA CCA GCC GAC TGT TCT GA HMGR GAC CCC TTT GCT TAG ATG AA GGA CTG GAA ACG GAT ATA AA FASN TTG CAG GGA GAC CTG GTG AT GGT GAG GGT GCT CAC AAA GG PGC1α GGC AGA AGA GCC GTC TCT ACT TA TTT GCA TGG TTC TGG GTA CTG A
Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA) para ApoB Humana
A ApoB-100 secretada por Huh7 foi detectada usando o kit ELISA de ApoB-100 humana total da ALerCHEK, Inc. (Portland, ME). O meio foi diluído 1:10 com o diluente de amostra, e o ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante.
Análise de alterações metabólicas em hepatócitos primários de rato
Hepatócitos primários de rato foram isolados de ratos Lewis fêmeas adultas adquiridos da Charles River Laboratories, conforme descrito anteriormente. A viabilidade dos hepatócitos foi superior a 90% e a pureza acima de 95%.. Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes do National Research Council e aprovados pelo Subcommittee on Research Animal Care do Massachusetts General Hospital (IACUC #2005N000109). As células foram semeadas em placas revestidas com colágeno a uma densidade de 150.000 células/cm2 em condições livres de soro, usando 100 µL/mL de colágeno tipo I solúvel como fator de adesão. O meio de cultura de hepatócitos livre de soro foi adquirido da Lonza (Walkersville, MD). As células foram estimuladas com naringenina ou WY14,643 por 24 horas, e o meio de cultura celular foi coletado para análise metabólica. O sedimento celular foi coletado para determinação de triglicerídeos intracelulares e proteínas totais.
A concentração de ureia foi medida usando a metodologia da diacetilmonoxima com um kit comercial de Nitrogênio Ureico no Sangue (Stanbio Labs, Boerne, TX). Triglicerídeos, no meio de cultura e extratos celulares, foram quantificados usando um kit comercial (Sigma Chemical, St. Louis, MO) baseado na hidrólise enzimática por lipase a glicerol. Corpos cetônicos foram medidos com base no aparecimento de NADH na conversão a acetoacetato na presença de β-hidroxibutirato desidrogenase (Zupke et al., 1998). O colesterol total foi medido por um kit comercial (StandBio Labs) baseado na reação do colesterol livre e ésteres de colesterol com colesterol oxidase. Os ácidos biliares foram determinados através da formação de NADH na presença da enzima 3-α-hidroxiesteroide desidrogenase (Bio-Quant, San Diego, CA).

Estatística
Os dados são expressos como média ± desvio padrão. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student unicaudal. Um valor de P de 0,05 foi utilizado para significância estatística.

Informações de Apoio
Interesses Concorrentes: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.

Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (K01DK080241), uma bolsa inicial do Conselho Europeu de Pesquisa (TMIHCV 242699) e pelo Centro de Pesquisa em Nutrição Clínica de Harvard (P30-DK040561). Recursos foram fornecidos pelo Centro de Recursos BioMEMS (P41 EB-002503), pelo Shriners Burns Hospital e pelo Instituto Alexander Silberman de Ciências da Vida. Os financiadores não tiveram papel no delineamento do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Referências
Regulação da oxidação de ácidos graxos hepáticos e produção de corpos cetônicos.
O fígado gorduroso está associado à resistência à insulina, risco de doença coronariana e aterosclerose precoce em uma grande população europeia.
Nutrição e o Fígado.
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Propriedades antiaterogênicas da naringenina, um flavonoide cítrico.
Fenólicos dietéticos: química, biodisponibilidade e efeitos na saúde.
A suplementação com naringina reduz os lipídios plasmáticos e aumenta as atividades das enzimas antioxidantes eritrocitárias em indivíduos hipercolesterolêmicos.
Efeitos hipocolesterolêmicos de sucos cítricos dietéticos em coelhos.
Efeito antiaterogênico dos flavonoides cítricos, naringina e naringenina, associado à ACAT hepática e VCAM-1 e MCP-1 aórticos em coelhos alimentados com colesterol alto.
A naringina reduz de forma tempo-dependente a biossíntese de colesterol hepático e o colesterol plasmático em ratos alimentados com dieta rica em gordura e colesterol.
A secreção de apoB hepática é inibida pelos flavonoides, naringenina e hesperetina, através da redução da atividade e expressão de ACAT2 e MTP.
Modulação da Secreção de Apolipoproteína B Líquida em Células HepG2 pelo Polimetoxiflavonoide Cítrico, Tangeretina.
Inibição da secreção de apoB hepática pela naringenina: degradação intracelular rápida aumentada independente da redução dos ésteres de colesterol microssomais.
A inibição da secreção líquida de apolipoproteína B em células HepG2 pelo flavonoide cítrico naringenina envolve a ativação da fosfatidilinositol 3-quinase, independente da fosforilação do substrato-1 do receptor de insulina.
Atividade e níveis de mRNA de enzimas envolvidas na oxidação de ácidos graxos hepáticos em camundongos alimentados com flavonoides cítricos.
Naringenina e Hesperetina, dois flavonoides derivados de Citrus aurantium, regulam positivamente a transcrição de adiponectina.
A naringenina previne dislipidemia, superprodução de apoB e hiperinsulinemia em camundongos nulos para receptor de LDL com resistência à insulina induzida por dieta.
Minirrevisão: metabolismo lipídico, doenças metabólicas e receptores ativados por proliferadores peroxissomais.
Perspectiva sobre Fármacos: mecanismos de ação e aplicações terapêuticas de agonistas dos receptores ativados por proliferadores peroxissomais.
Respostas diferenciais de linhagens celulares repórteres de PPARalfa, PPARdelta e PPARgama a ligantes sintéticos seletivos de PPAR.
A secreção do vírus da hepatite C dependente de apolipoproteína B é inibida pelo flavonoide da toranja naringenina.
Atividade redutora de colesterol da naringenina por meio da inibição da 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A redutase e da acil coenzima A:colesterol aciltransferase em ratos.
A inibição da secreção líquida de apolipoproteína B em células HepG2 pelo flavonoide cítrico naringenina envolve a ativação da fosfatidilinositol 3-quinase, independente da fosforilação do substrato-1 do receptor de insulina.
LXR alfa é o regulador dominante da transcrição de CYP7A1.
Receptores nucleares ativados por lipídios: da transcrição gênica ao controle do metabolismo celular.
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Receptores X do fígado e o controle da homeostase do colesterol: potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da aterosclerose.
O receptor nuclear órfão LXRalfa é regulado positiva e negativamente por distintos produtos do metabolismo do mevalonato.
Identificação do receptor X do fígado-receptor X retinóide como ativador do promotor do gene da proteína de ligação ao elemento regulador de esterol 1c.
O Papel do Receptor X do Fígado-α na Regulação por Ácidos Graxos do Hepático.
O coativador PGC-1 coopera com o receptor alfa ativado por proliferador de peroxissomo no controle transcricional de genes nucleares que codificam enzimas mitocondriais de oxidação de ácidos graxos.
Determinantes moleculares das interações entre heterodímeros LXR/RXR e TRAP220.
Cross-talk entre o receptor alfa ativado por proliferador de peroxissomo (PPAR) e o receptor X do fígado (LXR) na regulação nutricional do metabolismo de ácidos graxos. II. Os LXRs suprimem promotores de genes de degradação lipídica através da inibição da sinalização de PPAR.
Cross-talk entre o receptor alfa ativado por proliferador de peroxissomo (PPAR) e o receptor X do fígado (LXR) na regulação nutricional do metabolismo de ácidos graxos. I. Os PPARs suprimem o promotor da proteína de ligação ao elemento regulador de esterol-1c através da inibição da sinalização de LXR.
O receptor nuclear órfão de hormônio LXR alfa interage com o receptor ativado por proliferador de peroxissomo e inibe a sinalização do proliferador de peroxissomo.
Autorregulação do promotor do receptor X do fígado alfa humano.
Cross-talk entre o metabolismo de ácidos graxos e colesterol mediado pelo receptor X do fígado alfa.
Os receptores X do fígado interagem com correpressores para regular a expressão gênica.
Receptores nucleares: integração de múltiplas vias de sinalização através da fosforilação.
Controle Combinatório da Expressão Gênica por Receptores Nucleares e Coreguladores.
A secreção de apoB de hepatócitos é inibida pelos flavonoides, naringenina e hesperetina, através da redução da atividade e expressão de ACAT2 e MTP.
Inibição da secreção de apoB de hepatócitos pela naringenina: degradação intracelular rápida aumentada independente da redução de ésteres de colesterol microssomais.
A inibição da expressão da proteína microssomal de transferência de triglicerídeos e da secreção de apolipoproteína B100 pelo flavonoide cítrico naringenina e pela insulina envolve a ativação da via da proteína quinase ativada por mitógeno em hepatócitos.
Efeitos hipocolesterolêmicos e antioxidantes da naringenina e seus dois metabólitos em ratos alimentados com dieta rica em colesterol.
Atividade e níveis de mRNA de enzimas envolvidas na oxidação hepática de ácidos graxos em camundongos alimentados com flavonoides cítricos.
Naringenina e hesperetina, dois flavonoides derivados de Citrus aurantium regulam positivamente a transcrição de adiponectina.
Evolução dos agonistas do receptor ativado por proliferador de peroxissomo.
Determinantes celulares da montagem, maturação, degradação e secreção do vírus da hepatite C.
A produção do vírus da hepatite C por hepatócitos humanos dependente da montagem e secreção de lipoproteínas de densidade muito baixa.
A proteína X do vírus da hepatite B induz o fator de transcrição lipogênico SREBP1 e a sintase de ácidos graxos através da ativação do receptor nuclear LXRalfa.
O receptor X do fígado medeia a lipogênese induzida pela proteína X do vírus da hepatite B no carcinoma hepatocelular associado ao vírus da hepatite B.
Uma Análise dos Fatores de Risco para o Desenvolvimento de Carcinoma Hepatocelular em um Grupo de Pacientes com Hepatite C com Fibrose Estágio 3 após Terapia com Interferon.
Desenvolvimento estrutural de antagonistas do receptor X do fígado (LXR) derivados de inibidores de glicosidase relacionados à talidomida.

Diversos receptores ativados por proliferadores de peroxissomos ligam-se aos elementos responsivos a proliferadores de peroxissomos dos genes de hidratase/desidrogenase e acil-CoA oxidase de ácidos graxos de rato, mas induzem expressão de forma diferencial.

Melhora mediada por oxigênio do metabolismo de hepatócitos primários, polarização funcional, expressão gênica e depuração de medicamentos.