---

pmid: "25296035"
title: "O consumo de suco de toranja clarificado melhora a resistência à insulina e o ganho de peso induzidos por dieta rica em gordura em camundongos."
authors: "Chudnovskiy R, Thompson A, Tharp K, Hellerstein M, Napoli JL, Stahl A"
journal: "PloS one"
pubdate: "2014"
doi: "10.1371/journal.pone.0108408"
source: "PMC Full Text"

O consumo de suco de toranja clarificado melhora a resistência à insulina e o ganho de peso induzidos por dieta rica em gordura em camundongos.

Autores

Chudnovskiy R, Thompson A, Tharp K, Hellerstein M, Napoli JL, Stahl A

Periodico

PloS one (2014)

Conteudo

Consumo de Suco de Toranja Clarificado Melhora a Resistência à Insulina Induzida por Dieta Rica em Gorduras e o Ganho de Peso em Camundongos

Para determinar os efeitos metabólicos do consumo de suco de toranja, estabelecemos um modelo no qual camundongos C57Bl/6 beberam 25–50% de GFJ adoçado, clarificado de partículas insolúveis maiores por centrifugação (cGFJ), ad libitum como sua única fonte de líquido ou água adoçada e isocalórica. Os grupos cGFJ e controle consumiram quantidades semelhantes de líquidos e calorias. Camundongos alimentados com dieta rica em gorduras e cGFJ apresentaram uma diminuição de 18,4% no peso, uma diminuição de 13–17% na glicemia de jejum, uma diminuição de três vezes na insulina sérica de jejum e uma diminuição de 38% nos valores de triacilglicerol hepático, em comparação com os controles. Camundongos alimentados com dieta pobre em gorduras que beberam cGFJ apresentaram uma diminuição de duas vezes na insulina de jejum, mas não nos outros resultados observados com a dieta rica em gorduras. O consumo de cGFJ diminuiu a glicemia em extensão semelhante à metformina, um medicamento antidiabético comumente usado. A introdução de cGFJ após o início da obesidade induzida pela dieta também reduziu o peso e a glicemia. Um composto bioativo no cGFJ, a naringina, reduziu a glicemia e melhorou a tolerância à insulina, mas não melhorou o ganho de peso. Esses dados de um estudo animal bem controlado indicam que o GFJ contém mais de um nutracêutico promotor da saúde e justificam mais estudos dos efeitos do GFJ no contexto da obesidade e/ou da dieta ocidental.

Introdução

O aumento ininterrupto na incidência de obesidade e distúrbios associados à obesidade, particularmente diabetes tipo 2, continua a apresentar desafios monumentais à saúde. A modificação dietética, incluindo o uso de nutracêuticos, oferece abordagens promissoras para melhorar a obesidade e seus efeitos, e aumentar a expectativa de saúde. O suco de toranja (GFJ) é relativamente rico em nutrientes, incluindo vitaminas e minerais, e tem menos calorias do que muitos outros sucos. Os supostos efeitos promotores da saúde e da perda de peso do consumo de toranja ou GFJ foram popularizados, mas principalmente no contexto de uma dieta hipocalórica, por exemplo, a “dieta de Hollywood”, que limita a ingestão calórica a até 3349 kJ por dia. Relativamente poucos estudos humanos examinaram os efeitos do consumo de toranja ou GFJ per se no metabolismo em experimentos bem controlados, e estes produziram resultados intrigantes, mas contraditórios. Fujioka et al. relataram que o consumo de GFJ, toranja inteira ou “pílulas de toranja” levou à perda de peso e melhora da sensibilidade à insulina. Em contraste, Silver et al. relataram que o consumo de toranja ou GFJ não teve efeitos significativos nas variáveis metabólicas, exceto por um aumento modesto no HDL, em participantes obesos alimentados com uma dieta hipocalórica.
Estudos em animais utilizaram suco de toranja (GFJ) administrado ad libitum ou focaram em um componente bioativo, como o flavonoide naringina, que contribui para o sabor amargo do GFJ, ou em sua aglicona, naringenina. Esses estudos não abordaram diferenças no consumo de água entre os grupos de tratamento e controle e produziram resultados variados. Camundongos são avessos ao sabor amargo do GFJ e da naringina, o que pode causar desidratação, relutância em comer e perda de peso independentemente dos efeitos metabólicos. Por exemplo, Jung et al. relataram que a naringina adicionada à comida reduz a glicemia em camundongos db/db, mas não tem efeito sobre o peso corporal. Kannappan e Anuradha relataram que a naringina afeta o metabolismo de nutrientes e energia, bem como a sensibilidade à insulina. Pu et al. relataram que a naringina adicionada à água de beber de camundongos alimentados com dieta rica em gordura (HFD) leva à perda de peso, redução da glicemia e melhora da sensibilidade à insulina. Estudos focados apenas na naringina ignoram a complexa composição fitoquímica do GFJ, com muitos compostos nutracêuticos potenciais, incluindo bergamotina — um inibidor do citocromo P450 com potenciais efeitos antitumorais.

Outras pesquisas focaram nas interações entre GFJ e/ou naringina com medicamentos. A naringina foi identificada como um inibidor da Cyp3A4 e da proteína de transporte de ânions orgânicos, que medeiam o catabolismo de fármacos e a exportação de enterócitos, respectivamente. Os efeitos combinados desses dois fatores foram revelados como um mecanismo pelo qual o GFJ pode alterar a depuração intestinal de primeira passagem de vários fármacos, como estatinas.

Relatamos um modelo no qual camundongos consumiram centrifugação clarificada de GFJ (cGFJ) ad libitum em taxas comparáveis ao consumo de líquidos dos grupos controle. O consumo de cGFJ não modificou a ingestão ou absorção de alimentos. Em camundongos alimentados com HFD, o cGFJ diminuiu a taxa de ganho de peso, o acúmulo hepático de triacilglicerol e a glicemia de jejum, além de melhorar a sensibilidade à insulina. Em camundongos alimentados com dieta com baixo teor de gordura (LFD), o consumo de cGFJ produziu uma redução de duas vezes na insulina de jejum. Esses dados baseiam-se em um modelo animal bem controlado para revelar que o consumo de GFJ tem efeitos promotores da saúde, e esses efeitos são mediados por compostos além da naringina.

Materiais e Métodos
Preparação do GFJ
O GFJ foi espremido de toranjas frescas California Ruby Red fornecidas pela California Grapefruit Growers Cooperative, centrifugado a 10.400×g por 10 min a 4°C para remover a polpa, corrigido com 0,15% de sacarina (p/v), dividido em alíquotas de 25 ml e armazenado a -20°C. O pH desta preparação clarificada (cGFJ) era 3,5, em comparação com 5,5 para a água adoçada usada como controle. Determinamos que o conteúdo calórico do cGFJ era de 1335 J/ml por calorimetria de bomba de uma amostra liofilizada conforme descrito anteriormente. Camundongos controle receberam água com 4% de glicose (p/v) e 0,15% de sacarina (daqui em diante chamada de controle ou água controle), de modo que todos os grupos consumissem líquidos isocalóricos com a mesma quantidade de sacarina.

Animais e dietas
Procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade da Califórnia-Berkeley e realizados de acordo com as diretrizes da AAALAC. Camundongos C57BL/6J machos com quatro semanas de idade foram adquiridos da Jackson Laboratories (catálogo # 000664). Os camundongos foram alojados individualmente e alimentados com dietas purificadas ao chegarem (salvo indicação em contrário) com 10% de gordura (LFD) (Research Diets Cat. # D12450B) ou 60% de gordura (HFD) (Research Diets Cat. # D12492). Qualquer estresse induzido pelo alojamento isolado dos camundongos foi normalizado pelo tratamento equivalente e simultâneo dos camundongos em cada experimento.

Os camundongos foram pesados três vezes por semana. O consumo de alimento foi monitorado duas vezes por semana. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em grupos de seis (salvo indicação em contrário): controles (água com 4% de glicose e 0,15% de sacarina); 50% cGFJ (50% cGFJ/água com 0,15% de sacarina); 25% cGFJ (25% cGFJ/água com 4% de glicose e 0,15% de sacarina); naringina (0,72 mg/dia em água com 4% de glicose e 0,15% de sacarina); metformina (7,5 mg/dia de metformina com 4% de glicose e 0,15% de sacarina); metformina + cGFJ (7,5 mg/dia de metformina com 0,15% de sacarina em 50% cGFJ). Os líquidos foram administrados em frascos volumétricos (Med Associates, cat # PHM-127-15) para quantificar o consumo e foram substituídos diariamente.

Glicemia
A glicose foi medida às segundas, quartas e sextas-feiras entre 9 e 11 horas da manhã com um monitor de glicemia NovaMax em sangue de uma picada na cauda (AmericanDiabetesWholesale). Os valores do glicosímetro foram corrigidos usando um kit de ensaio enzimático de glicose (Sigma, cat # GAHK20-1KT).

Testes de tolerância à glicose (TTG), insulina (TTI) e piruvato (TTP)
Para o TTG, os camundongos foram mantidos em jejum durante a noite e injetados i.p. com 0,2 ml de glicose em água estéril para administrar 2 g/kg de glicose. Para o TTI, os camundongos foram mantidos em jejum por 4 horas e injetados i.p. com 0,75 unidades de insulina/kg. Para o TTP, os camundongos foram mantidos em jejum durante a noite e injetados i.p. com 0,2 ml de piruvato em PBS estéril para administrar 2 g/kg.

ELISA de insulina
As concentrações de insulina foram determinadas com um kit ELISA de insulina de alta faixa (ALPCO cat# 80-INSMSH-E01, E10) em sangue coletado retro-orbitalmente após jejum noturno. Os camundongos tiveram acesso ao alimento por 4 horas e foram reamostrados.

Concentrações de proteína e triacilglicerol (TG) em lisados de órgãos
As concentrações de proteína foram determinadas com um kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific cat# 23227). As concentrações de TG foram determinadas com o kit Infinity TG (Thermo Scientific cat# TR2241).

Imuno-histoquímica
Fígados foram fixados por 1 h a 4°C com paraformaldeído a 4%, e incubados durante a noite a 4°C com um meio de criopreservação de sacarose a 30%, 20% de meio de Temperatura de Corte Ideal (VWR cat# 25608-930) e 50% de Superblock consistindo de Bloco mais 2% de soro normal de burro. O bloco consistiu em 50 ml de solução salina balanceada de Hanks 10×, 50 ml de soro fetal bovino, 5 g de albumina de soro bovino e 0,25 g de saponina em 500 ml. Os blocos foram seccionados em tiras de 8 µm a −23°C. As secções foram coradas por 1 h à temperatura ambiente com uma sonda BODIPY apolar (Molecular Probes cat# D-3922). As lâminas foram montadas com meio de montagem DAPI/glicerol (Life Technologies cat# S36938) e armazenadas a −20°C até a obtenção de imagens.
PCR em tempo real
A PCR em tempo real foi realizada usando o TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems). Os primers foram adquiridos da Integrated DNA Technologies (Tabela 1).
Sequências dos primers e sondas usados para PCR em tempo real.
Gene Primer 1 Primer 2 Probe OATP GATGCTTCAAAGTCCAGTGAC CACTCCCTCACTTCATCTCAG 56_FAM/CTATGACCA/ZEN/CAGCAGCTCCGACAA/3IABkFQ SHP CAAGGAGTATGCGTACCTGAAG TCCAAGACTTCACACAGTGC 56_FAM/ATCCTCTTC/ZEN/AACCCAGATGTGCCAG/3IABkFQ Cyp7A1 CACCATTCCTGCAACCTTCT TCTGTAATGCTCCATTCACTTCT 56_FAM/TGCTTTCAT/ZEN/TGCTTCAGGGCTCCT/3IABkFQ GCG GACTCCCTCTGTCTACACCT CACCAGCATTATAAGCAATCCAG 56_FAM/TTTCTGCCT/ZEN/TGTGAGCCTGAGCT/3IABkFQ GAPDH AATGGTGAAGGTCGGTGTG GTGGAGTCATACTGGAACATGTAG 56_FAM/TGCAAATGG/ZEN/CAGCCCTGGTG/3IABkFQ FAS AGTTTGTATTGCTGGTTGCTG GACTTCTACTGCGATTCTCCTG 56_FAM/TGCGCCTCG/ZEN/TGTGAACATGGA/3IABkFQ SREBP1C CGAGATGTGCGAACTGGAC GTCACTGTCTTGGTTGTTGATG 56_FAM/TGGAGCATG/ZEN/TCTTCGATGTCGTTCAA/3IABkFQ FGF15 TCTGAAGACGATTGCCATCAAG AGCCTAAACAGTCCATTTCCTC 56_FAM/ATCAGCCCG/ZEN/TATATCTTGCCGTCC/3IABkFQ FGF21 GGGATGGGTCAGGTTCAGA CAGCCTTAGTGTCTTCTCAGC 56_FAM/TCAACACAG/ZEN/GAGAAACAGCCATTCACT/3IABkFQ PGC1a CTGCATTCATTGTAGCTGAGC AGTCCTTCCTCCATGCCT 56_FAM/TGCCAGTAA/ZEN/GAGCTTCTTAAGTAGAGACGG/3IABkFQ PEPCK GGATGTCGGAAGAGGACTTTG GCGAGTCTGTCAGTTCAATACC 56_FAM/CATACATGG/ZEN/TGCGGCCTTTCATGC/3IABkFQ G6P GACACCGACTACTACAGCAAC GACCATAACATAGTATACACCTGCT 56_FAM/CTGTGAGAC/ZEN/CGGACCAGGAAGTC/3IABkFQ
Western blotting
Os fígados foram homogeneizados com um Polytron PT2100 em tampão de lise por radioimunoprecipitação contendo inibidores de protease e fosfatase (Sigma cat# P8340 e cat# P5726) e centrifugados por 5 min a 3220×g. Proteína (50 µg) foi carregada em um gel de Tris-glicina 4–20%. Os anticorpos foram adquiridos da Cell Signaling. Os sinais foram quantificados com um sistema de análise de gel LI-COR Odyssey e normalizados para β-tubulina.
Ensaios de absorção
Com 4 semanas de idade, camundongos (7 por grupo) foram alimentados com uma HFD por 2 semanas, enquanto bebiam 50% de cGFJ ou água de controle ad libitum. Os camundongos foram jejuados durante a noite e gavados com 740 kBq de [14C]oleato em 200 µL de azeite de oliva, ou 740 kBq de [3H]2-desoxi-D-glicose em 200 µL de PBS estéril contendo 2,5 g/kg de glicose, ou 740 kBq de [14C]ácido taurocólico em 500 µM de ácido taurocólico em água estéril. O sangue foi coletado retro-orbitalmente 15, 60, 120, 180 e 240 minutos após a administração. A radioatividade foi medida em 10 µL de soro.

Calorimetria indireta
Os camundongos foram analisados individualmente por calorimetria indireta (Columbus Instruments, Columbus, Ohio, EUA) durante um jejum ou após jejum de 7 horas e realimentação com 1,1 g de HFD, seguido de jejum noturno. As análises experimentais foram iniciadas entre 15h e 16h e continuaram por aproximadamente 23 horas. A atividade foi monitorada em intervalos de 10 minutos.

Concentrações e síntese de ácidos graxos
As concentrações totais de AG hepáticos (C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 e C18:2) foram determinadas por cromatografia gasosa com detecção por ionização em chama. A síntese de palmitato foi medida pela análise da incorporação de isótopos estáveis. No dia 0, os camundongos receberam injeção i.p. de 100% de D2O (Sigma cat # 151890) contendo 0,9% de NaCl (0,35 ml/g de peso corporal). Os camundongos receberam 8% de D2O em suas soluções de beber por 17 dias. A incorporação de deutério no soro e no fígado foi determinada por análise de GC/MS. A síntese de palmitato foi calculada como a fração de palmitato recém-sintetizado × mg total de palmitato.

Estatística
A análise estatística foi realizada conforme descrito nas legendas das figuras. Os dados são médias ± EP. A significância estatística foi determinada por testes t bicaudais não pareados.

Resultados
Administração isocalórica de cGFJ
Com base no consumo diário médio de líquidos, os camundongos mostraram aversão a beber 100% cGFJ sem açúcar, 100% cGFJ adoçado ou 50% cGFJ/água (v/v) adoçado com sacarina/ciclamato (Fig. 1A-C). Em contraste, o consumo de cGFJ foi comparável ao consumo de líquidos do grupo controle quando os camundongos receberam 50% de GFJ adoçado com 0,15% de sacarina (Fig. 1D).

Efeitos do cGFJ/adoçante no consumo de líquidos.
Os camundongos receberam 100% cGFJ, 100% cGFJ +0,15% sacarina, 50% cGFJ +0,15% sacarina +1,5% ciclamato ou 50% cGFJ +0,15% sacarina como únicos líquidos: A) consumo de líquidos, ***P = 0,0007; B) consumo de líquidos, ***P<0,0001; C) consumo de líquidos, *P<0,02; D) consumo de líquidos, P>0,6. A significância estatística foi determinada por testes t bicaudais não pareados.

Impacto do GFJ no consumo de alimentos, absorção e gasto energético
Camundongos foram alimentados com uma dieta LFD ou HFD por 100 dias com acesso a “água controle” (ver Materiais e Métodos) ou 50% de cGFJ como únicas fontes de líquidos. A ingestão de cGFJ não afetou o consumo alimentar médio diário nem cumulativo durante uma LFD (Fig. 2A, B). O líquido total consumido pelos camundongos alimentados com LFD foi de 141±1,1 ml de água vs. 135±0,5 ml de 50% cGFJ (P<0,05). Essa diferença de 6 ml no líquido consumido ao longo de 100 dias representa uma diferença na ingestão energética de <8 kJ ou ∼0,002% da ingestão calórica total. As calorias totais consumidas pelo grupo cGFJ foram de 4822±83 kJ vs. 5023±163 kJ para os controles (P>0,05). Não ocorreram diferenças no peso entre o grupo GFJ e o controle (Fig. 2C). Consistente com pesos semelhantes, não ocorreram diferenças nos coxins gordurosos epididimais para camundongos alimentados com LFD (Fig. 2D).
Efeitos do cGFJ na ingestão de líquidos e alimentos, e no peso.
Camundongos foram alimentados com LFD ou HFD e 50% de cGFJ por 100 dias, a partir do desmame (dia 0) com 4 semanas de idade. LFD: A) consumo cumulativo de líquidos; B) consumo cumulativo de alimentos; C) pesos corporais totais; D) peso do coxim gorduroso intra-abdominal. HFD: E) consumo cumulativo de líquidos; F) consumo cumulativo de alimentos, *P<0,05; G) pesos corporais totais, ***P = 0,0001; H) peso do coxim gorduroso intra-abdominal, P<0,05; I) conteúdo calórico das fezes de camundongos tratados com cGFJ e água controle alimentados com HFD por 100 dias, P>0,7 e peso fecal dos camundongos coletado em 24 h ao final de 106 dias de tratamento, P>0,03 para GFJ. Um teste t bicaudal não pareado foi usado para determinar a significância estatística.
A ingestão de cGFJ também não afetou o consumo médio diário nem cumulativo de líquidos e alimentos durante a alimentação com HFD (Fig. 2E, F). O grupo 50% GFJ consumiu 137±0,5 ml vs. 140±2,2 ml pelos controles (P>0,05). O consumo cumulativo de alimentos foi de 5580±193 kJ para o grupo GFJ vs. 5684±155 kJ para os controles (P>0,05). Em contraste com os camundongos alimentados com LFD, os camundongos alimentados com HFD com acesso a 50% GFJ pesaram 18,4% menos que os controles ao final dos 100 dias: 31,4±0,7 g vs. 38,5±2,8 g, P<0,05 (Fig. 2G). O peso corporal tendeu a diminuir dentro de 15 dias após o início do acesso ao GFJ e tornou-se estatisticamente significativo no dia 78. Os coxins gordurosos epididimais do grupo cGFJ pesaram 50% menos que os do grupo controle (Fig. 2H).
O valor calórico das fezes coletadas nas últimas 24 h do estudo de 100 dias do grupo cGFJ foi semelhante ao dos controles, medido por calorimetria de bomba, embora a massa fecal média diária fosse ∼23% menor no grupo cGFJ (Fig. 2I).
Após duas semanas de alimentação com HFD, os metabólitos radiomarcados no soro (AUC) de camundongos gavados com [3H]glicose, [14C]ácido oleico ou [14C]ácido taurocólico não diferiram entre cGFJ e controles durante um ensaio de 240 min (dados não mostrados).
A calorimetria indireta de camundongos em jejum não revelou diferenças significativas no gasto energético de 24 h (VO2 e VCO2), uso de substrato (quociente respiratório), produção de calor ou atividade entre os grupos GFJ alimentados com HFD e controle (dados não mostrados).
No final do estudo com LFD, não houve diferença significativa nos níveis de glicemia de jejum entre o grupo cGFJ e o controle (Fig. 3A). No estado alimentado, o cGFJ não teve efeito nos níveis de insulina sérica em camundongos alimentados com LFD (dados não mostrados). O cGFJ não produziu diferenças significativas no GTT ou no ITT em nenhum dos momentos (dados não mostrados). No entanto, mesmo sem um desafio de alto teor de gordura, os níveis de insulina sérica em jejum foram 2 vezes menores no grupo cGFJ em comparação ao grupo controle alimentado com LFD (Fig. 3B).
Efeitos do cGFJ na glicemia e sensibilidade à insulina.
Os camundongos foram tratados conforme descrito na legenda da Fig. 2. A, B) valores ao final de 100 d de LFD: A, glicemia de jejum; B) insulina sérica em jejum, *P<0,04; C, D) GTT e AUC de camundongos alimentados com HFD na semana 13, *P<0,04; E, F) ITT e AUC de camundongos alimentados com HFD na semana 11, ***P<0,001. G, H) Valores ao final de 100 d de HFD: G) glicemia de jejum, *P<0,02; H) insulina sérica em jejum, *P<0,03. Um teste t bicaudal não pareado foi usado para determinar significância estatística.
Na semana 7 da HFD, a área sob a curva (AUC) da glicemia no GTT foi 6% menor (P<0,05) para o grupo GFJ alimentado com HFD em comparação aos controles (dados não mostrados). Na semana 11, essa diferença aumentou para 11% (Fig. 3C, D). Em um ITT inicial realizado na semana 9, a AUC da glicemia foi ~17% menor (P<0,05) no grupo cGFJ em comparação aos controles (dados não mostrados). Essa diferença foi mantida na semana 13 (Fig. 3E, F). Ao final do estudo com HFD, os valores de glicemia de jejum foram 13% menores nos camundongos cGFJ em comparação aos controles (Fig. 3G). Os níveis de insulina sérica em jejum foram 72% menores no grupo cGFJ em comparação aos controles (Fig. 3H). Os níveis de insulina no estado alimentado não foram diferentes entre os dois grupos (dados não mostrados).
A melhora na sensibilidade à insulina como resultado da suplementação com cGFJ foi confirmada pela avaliação da ativação da AKT, a quinase downstream do receptor de insulina, em camundongos em jejum. O GFJ produziu um aumento de 3 vezes e 1,4 vez, respectivamente, nas razões p-AKT/AKT total no músculo quadríceps e no fígado, em comparação aos controles (Fig. 4A).
Impacto do cGFJ na atividade da AKT no fígado e músculo esquelético, conteúdo de TG e síntese de ácidos graxos.
Camundongos foram alimentados com HFD e 50% cGFJ por 100 d conforme descrito na legenda da Fig. 2. A) Razões pAKT/AKT total no músculo (***P = 0,0002) e fígado (*P<0,05); B) TG hepático, *P<0,05; I e II) Cortes representativos de animais tratados com água controle e GFJ, respectivamente; C) Síntese total de FFA e FFA individuais; D) GTT e AUC na semana 6, P<0,005. Um teste t bicaudal não pareado foi usado para determinar significância estatística.
O consumo de 50% de cGFJ reduziu a quantidade de TG no fígado de camundongos alimentados com HFD em 38% em comparação aos controles, e reduziu o número e o tamanho das gotículas lipídicas após dez dias (Fig. 4B).

Usando uma abordagem de marcação com água pesada in vivo, determinamos que a síntese total de novo de ácidos graxos no fígado não diferiu significativamente entre cGFJ e controles, e as taxas de síntese de ácidos graxos específicos foram semelhantes ao controle, exceto para o oleato (Fig. 4C).

Em contraste com a síntese de ácidos graxos, um PTT mostrou que a intervenção de 10 dias em camundongos alimentados com HFD produziu uma diminuição de 9% na gliconeogênese (Fig. 4D).

O GFJ melhora as variáveis metabólicas após o início da obesidade

Para determinar o impacto do cGFJ em camundongos com obesidade induzida por dieta, os animais foram alimentados com HFD por 10 semanas e, em seguida, tiveram acesso a 50% de GFJ, enquanto continuavam com a HFD. A introdução do cGFJ não alterou o consumo diário ou cumulativo de líquido ou calorias (Fig. 5A, B). Ao final deste experimento no dia 55, o grupo com 50% de cGFJ pesava ∼8% menos que os controles (GFJ, 33,4±1 g vs. controle, 36,4 g±1,9 g, P<0,05) (Fig. 5C). Os pesos corporais tornaram-se significativamente diferentes a partir do dia 9 (P<0,05). Uma diminuição de 13% na glicemia ocorreu já no dia 10 após a intervenção (Fig. 5D). Os níveis finais de glicose sérica em repouso no grupo cGFJ foram de 110±1 mg/dL (96,1±1 mM) em comparação ao valor controle de 119±1 mg/dL (6,6±1 mM) (P<0,5). Um GTT na semana 6 após a intervenção revelou uma diminuição de 12,5% (P<0,05) na AUC, consistente com aumento da tolerância à glicose (Fig. 5E). Essa observação foi reforçada por um ITT na semana 7, que mostrou uma AUC para o grupo cGFJ 9,5% menor que o controle (Fig. 5F).

Impacto do cGFJ na obesidade estabelecida induzida por dieta.
Camundongos foram alimentados com HFD por 6 semanas a partir de 4 semanas de idade. Os animais foram então divididos aleatoriamente nos grupos controle e GFJ (dia 0) e a alimentação com HFD foi continuada por mais 56 dias: A) consumo cumulativo de líquido; B) consumo cumulativo de alimento; C) pesos corporais totais; D) glicemia; E) GTT e AUC na semana 6, P<0,002; F) ITT e AUC na semana 7, P<0,03. Um teste t não pareado bicaudal foi usado para determinar a significância estatística.

Efeitos metabólicos únicos do GFJ
We compared the metabolic effects of GFJ with those of naringin, a bioactive compound in cGFJ, and metformin, a drug used widely to treat type 2 diabetes and nonalcoholic steatohepatosis during 106-day of feeding a HFD. Liquid and calorie consumption was comparable among all four groups (Fig. 6A, B). Body weights of the 50% cGFJ group, but not of the metformin- or naringin-supplemented groups, were significantly lower compared to controls at the end of the study (control, 32.9±0.5 vs. cGFJ, 28.2±g, P<0.05) (Fig. 6C). All three intervention groups had a statistically significant drop in blood glucose compared to controls by day 8 (113 to 110 mg/dL or 6.3 to 6.1 mM), which continued on days 10 (119 to 114 mg/dL or 6.6 to 6.3 mM) and 17 (117 to 111 mg/dL or 6.5 to 6.2 mM) (Fig. 6D). Blood glucose at the end of the study was ∼20% lower in the three treatment groups compared to the control.
Comparison of metabolic effects of cGFJ, naringin, and metformin.
Mice fed a HFD were given cGFJ, water containing naringin or metformin, or control water for 106 d: A) cumulative liquid consumption and rates based on linear regression. Slopes did not differ significantly; B) cumulative food consumption and rates based on linear regression. Slopes did not differ significantly; C) total body weights. 2way ANOVA with Bonferroni posttests showed that treatment and time had a significant effect (p<0.0001) on body weight. Bonferroni posttests only showed significant differences in body weight between the control and cGFJ group form 92 onward but not for any of the other groups; D) blood glucose. 2way ANOVA with Bonferroni posttests showed that treatment and time had a significant effect (p<0.0001) on blood glucose levels. Bonferroni posttests comparisons to the water control group showed significant differences for cGFJ and naringin starting day 27 and metformin starting day 8. Differences between cGFJ, naringin, and metformin were non-significant at all time points.
The AUC of a GTT at week 7 was not significantly lower for the cGFJ, naringin, or metformin groups than the control group (data not shown). By week 13, however, the AUC values for the cGFJ, naringin, and metformin groups were 8, 7 and 12% lower than the control group, respectively (P<0.05 for all) (data not shown). An ITT at week 14 revealed AUC values 9, 8 and 15% lower for the GFJ, naringin, and metformin groups, respectively, relative to the control group (P<0.05 for all) (data not shown).
Para determinar a possibilidade de efeitos sinérgicos ou aditivos na glicemia, camundongos alimentados com uma HFD tiveram acesso à metformina em uma solução de 50% de cGFJ por 17 d. No mesmo experimento, um segundo grupo de camundongos teve acesso a 25% de GFJ. A combinação de metformina e 50% de cGFJ não produziu efeito significativamente diferente na glicemia em relação a cada um isoladamente (Fig. 7A). A glicemia no grupo de 25% de cGFJ diminuiu de forma comparável aos grupos de 50% de cGFJ, metformina e metformina mais 50% de GFJ. O valor final de glicemia de cada grupo de tratamento foi 11–14% menor que o controle (P<0.05).

Efeitos do cGFJ nos níveis de glicose sérica e na fosforilação de AMPK e ACC no músculo e fígado.
Camundongos foram alimentados com uma HFD. A) Níveis de glicemia durante 17 d de acesso a 50% de cGFJ, 25% de cGFJ, metformina, metformina e 50% de cGFJ, ou água. B-E) Camundongos tiveram acesso a 50% de GFJ, naringina ou metformina em água de controle por 106 d a partir do desmame: B) pAMPK/AMPK no fígado, *P<0.04, ***P = 0.0002; C) pACC/ACC no fígado, *P<0.03; D) pAMPK/AMPK no músculo, *P<0.03; E) pACC/ACC no músculo, P<0.03. A fosfo- e proteína total foram determinadas por western blot e normalizadas para tubulina. Um teste t bicaudal não pareado foi usado para determinar a significância estatística.

cGFJ atua através de um mecanismo independente de AMPK
Comparamos os efeitos da metformina, naringina e 50% de cGFK nos níveis de p-AMPK no fígado e músculo de camundongos alimentados com uma HFD por 15 semanas. cGFJ diminuiu a razão p-AMPK/AMPK no fígado em 25%, em comparação com uma diminuição de 52% em resposta à naringina, e a um aumento de 1.6 vezes em resposta à metformina (Fig. 7B). Analisamos a p-acetil-CoA-carboxilase (ACC), porque AMPK desativa a ACC através da fosforilação. p-ACC não foi alterada nos grupos GFJ e naringina, mas a metformina aumentou p-ACC no fígado em 2 vezes (Fig. 7C). No músculo, apenas a metformina aumentou p-AMPK (2.7 vezes) (Fig. 7D) e p-ACC/AC (2.6 vezes) (Fig. 7E).

Em uma tentativa adicional de determinar o(s) mecanismo(s) dos efeitos do cGFJ, avaliamos alterações na expressão de genes metabólicos selecionados no fígado e intestino delgado de camundongos alimentados com uma HFD por 17 dias (Fig. 8A, B) ou após 100 d (Fig. 8C, D). No experimento de curto prazo, a única alteração significativa nos fígados de camundongos tratados com cGFJ foi uma diminuição de 50% em SHP, e a única alteração significativa no intestino foi um aumento de 9.5 vezes em CYP7A1. No experimento de longo prazo, o fígado mostrou uma diminuição de 52% em CYP7a1, uma diminuição de 41% em FAS, uma diminuição de 37% em SREBP1c e uma diminuição de 35% em PGC1α. No intestino delgado, a única alteração significativa foi uma diminuição de 46% em SHP.

Alterações na expressão gênica causadas pelo cGFJ.
Camundongos foram autorizados a beber 50% de cGFJ ou água de controle por 17 ou 100 d, conforme descrito na legenda da Fig. 2. A) fígado, curto prazo; B) intestino delgado, curto prazo; C) fígado, longo prazo; D) intestino delgado, longo prazo. Os valores foram normalizados para os valores de controle definidos como 1: *P<0.05.

Discussão
Desenvolvemos um modelo animal bem controlado, que mostrou que, independentemente da quantidade de gordura na dieta, o consumo de cGFJ reduziu acentuadamente a insulina sérica em jejum. Além disso, o consumo de 25% ou 50% de cGFJ reduziu a glicose em jejum em camundongos alimentados com HFD, e 50% de cGFJ reduziu a taxa de ganho de peso em camundongos alimentados com HFD. Esses resultados não dependeram da redução da ingestão calórica entre os grupos de cGFJ e controle. O efeito antiglicêmico do cGFJ ocorreu dentro de cinco dias e foi tão pronunciado quanto o efeito da metformina, um dos medicamentos antidiabéticos mais potentes e amplamente utilizados. Embora não tenham sido observados efeitos sinérgicos entre GFJ e metformina, os dois parecem agir por mecanismos diferentes, pois a metformina ativou a AMPK e as vias de sinalização canônicas a jusante no fígado e músculo (p-ACC), enquanto o cGFJ diminuiu a fosforilação da AMPK (fígado) ou não teve efeito significativo (músculo) — resultado refletido em níveis inalterados de p-ACC. Independentemente disso, beber GFJ centrifugado (sem polpa) correspondente a ∼3,5–4 xícaras (830–950 ml) por dia para um adulto humano médio de 70 kg teve efeitos hipoglicêmicos robustos em camundongos alimentados com HFD, justificando estudos adicionais sobre seus efeitos promotores de saúde, identificação de componentes bioativos e mecanismos de ação.

O cGFJ comportou-se de forma semelhante, mas não idêntica, a um de seus compostos bioativos, a naringina, que reduziu os níveis de glicose no sangue de animais alimentados com HFD sem alterar a atividade da AMPK ou da ACC. Este último achado difere dos resultados de Pu et al., que relataram ativação robusta da AMPK e inativação da ACC em fígados de camundongos C57Bl/6J alimentados com HFD em resposta à naringina, com doses comparáveis de naringina, embora apresentadas na dieta, em vez de no meio de consumo líquido. Não constatamos que a naringina causasse perda de peso ou suprimisse a expressão das enzimas hepáticas gluconeogênicas PEPCK e G6Pase, conforme relatado por Pu. A composição da HFD utilizada aqui diferiu da de Pu (% de energia proveniente de gordura/carboidrato/proteína, 60/20/20 vs. 37/43/20, respectivamente). No entanto, nossos resultados são consistentes com relatos de que a naringina tem efeitos hipoglicêmicos, mas não de redução de peso. Deve-se notar que, por razões práticas, utilizamos cGFJ ao longo do estudo para evitar entupimento dos monitores de ingestão de líquidos. Se o GFJ contendo polpa teria efeitos metabólicos aumentados ou reduzidos ainda precisa ser determinado, mas o fato é que o GFJ contém um ou mais compostos além da naringina com propriedades promotoras de saúde.
Não conseguimos identificar o(s) mecanismo(s) proximal(is) dos efeitos do cGFJ. Possivelmente, diferenças sutis, porém cumulativas, na absorção calórica, nas taxas respiratórias ou nas propriedades anti-inflamatórias contribuem para o fenótipo. Essa possibilidade é apoiada pela necessidade de 78 dias de uma HFD antes que as diferenças de peso induzidas pelo cGFJ se tornassem estatisticamente significativas. Tanto o controle de água adoçada quanto o cGFJ eram ácidos, mas o cGFJ apresentava um pH mais baixo, de 3,5. Todos os líquidos ingeridos precisavam passar por uma série de gradientes intraluminares robustos de pH, desde o estômago (pH 1–3) até o intestino delgado (pH 6–7,4), e é improvável que o consumo de cGFJ alterasse o pH duodenal a ponto de impactar a função das enzimas pancreáticas ou a absorção de nutrientes. Essa conclusão é apoiada pela semelhança no valor calórico das fezes coletadas nas últimas 24 horas do estudo de 100 dias dos grupos cGFJ e controle, e pela ausência de diferenças na absorção de glicose, ácido oleico ou ácido taurocólico entre o cGFJ e os camundongos controle.

Interessantemente, o cGFJ diminuiu a expressão do small heterodimer partner (SHP), que antagoniza a função de múltiplos receptores hormonais nucleares que regulam o metabolismo intermediário, como LXRα, RARα e PPARγ . A regulação negativa de Cyp7a1, FAS, SREBP1c e PGC1α também é consistente com múltiplas alterações na homeostase lipídica. Esses dados implicam que o cGFJ altera a regulação da síntese e do armazenamento de gordura.

Os benefícios potenciais devem ser avaliados no contexto de relatos de que componentes da GF e do GFJ interagem com diversas proteínas que catalisam o metabolismo e a absorção de medicamentos, podendo causar problemas de saúde ao modificar a potência dos medicamentos. Muitos estudos mostraram que a GF ou o GFJ, ou seus componentes, alteram a farmacocinética de medicamentos, mas a alteração da farmacocinética não altera necessariamente a farmacodinâmica. Nos ∼24 anos desde que o potencial do consumo de GFJ/GF para alterar a potência dos medicamentos foi proposto, menos de uma dúzia de relatos de casos correlacionaram o consumo de GF ou GFJ com resultados clínicos adversos. Na maioria, senão em todos, a quantidade de GFJ consumida não refletia o consumo normal, as associações entre GFJ e manifestações clínicas eram correlacionais, e os pacientes apresentavam doenças pré-existentes graves e/ou fatores de confusão. A possibilidade de que o consumo excessivo de GFJ possa causar problemas de saúde em uma população selecionada que toma medicamentos específicos não deve ser descartada, mas também não é apropriado extrapolar essas observações limitadas para a população em geral. Uma avaliação crítica e baseada em evidências dos potenciais efeitos benéficos versus prejudiciais do consumo de GF e GFJ parece prudente.

Fornecemos novas evidências para potenciais propriedades promotoras de saúde do GFJ em modelos murinos de obesidade induzida por HFD e não obesidade. Esses resultados justificam estudos adicionais em modelos animais e humanos para avaliar os mecanismos e o escopo da ação do GFJ.

Referências
Custos econômicos do diabetes nos EUA em 2012
Nutrientes em laranjas e toranjas frescas descascadas da Califórnia e Arizona
Uma comparação de escores de densidade nutricional para sucos de frutas 100%
Os efeitos da toranja no peso e na resistência à insulina: relação com a síndrome metabólica
Efeitos de pré-cargas de toranja, suco de toranja e água no balanço energético, perda de peso, composição corporal e risco cardiometabólico em adultos obesos de vida livre
Os efeitos hipoglicêmicos da hesperidina e naringina são parcialmente mediados por enzimas reguladoras da glicose hepática em camundongos C57BL/KsJ-db/db
A naringenina aumenta a fosforilação de tirosina estimulada por insulina e melhora as ações celulares da insulina em um modelo dietético de síndrome metabólica
A naringina melhora a síndrome metabólica ao ativar a proteína quinase ativada por AMP em camundongos alimentados com dieta rica em gordura
Supressão da invasão de células tumorais induzida por forbol-12-miristato-13-acetato pela bergamotina através da inibição da proteína quinase Cdelta/p38 proteína quinase ativada por mitógeno e da expressão de metaloproteinase-9 da matriz dependente de JNK/fator nuclear kappaB
Interações toranja-medicação: fruta proibida ou consequências evitáveis?
Principais componentes ativos em sucos de toranja, laranja e maçã responsáveis por interações medicamentosas mediadas por OATP2B1
Interações alimento-medicamento: suco de toranja
Condicionamento de sabor e aquisição de aversão condicionada ao gosto por drogas de abuso em camundongos DBA/2J
Camundongos não desenvolvem aversão condicionada ao gosto devido à perda de imunidade
Mfge8 promove a obesidade ao mediar a captação de gorduras dietéticas e ácidos graxos séricos
Renovação de triglicerídeos no tecido adiposo, lipogênese de novo e proliferação celular em humanos medidos com 2H2O
Melhorias na distribuição de gordura corporal e adiponectina circulante por jejum em dias alternados versus restrição calórica
A restrição calórica aumenta a síntese de ácidos graxos e as taxas de oxidação de gordura corporal total
Vias da metformina: farmacocinética e farmacodinâmica
O papel da metformina no manejo da DHGNA
AMPK como um interruptor metabólico no músculo, fígado e tecido adiposo de ratos após exercício
Malonil-CoA e proteína quinase ativada por AMP: uma parceria em expansão
Diabetes mellitus tipo 2 em 2012: O manejo ideal do DM2 permanece elusivo
A naringina melhora a disfunção cardiovascular induzida pela dieta e a obesidade em ratos alimentados com dieta rica em carboidratos e gorduras
pH intraluminal do trato gastrointestinal humano
Regulação transcricional coordenada do transporte e metabolismo
Integração transcricional do metabolismo pelos receptores nucleares ativados por esteróis LXR e FXR
SREBPs: integradores metabólicos na fisiologia e metabolismo
Receptores nucleares órfãos e a regulação do metabolismo de nutrientes: entendendo a obesidade
O efeito do suco de toranja na disposição de medicamentos
Interações toranja-medicamento: as interações com medicamentos podem ser evitadas?
Um suco de fruta perigoso
Toranja e tônico: uma combinação mortal em um paciente com síndrome do QT longo
Causas incomuns de rabdomiólise
Atenção—toranja! Lancet