pmid: "34770858"
title: "Combinação de Métodos Analíticos e Estatísticos para Otimizar a Atividade Antibacteriana de Extratos de Sálvia Esclareia por Fluido Supercrítico."
authors: "Bakó C, Balázs VL, Takács G, Pallos JP, Pál S, Kocsis B, Pethő DR, Horváth G"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2021 Oct 26"
doi: "10.3390/molecules26216449"
source: "PMC Full Text"

Combinação de Métodos Analíticos e Estatísticos para Otimizar a Atividade Antibacteriana de Extratos de Sálvia Esclareia por Fluido Supercrítico.

Autores

Bakó C, Balázs VL, Takács G, Pallos JP, Pál S, Kocsis B, Pethő DR, Horváth G

Periodico

Molecules (Basel, Switzerland) (2021 Oct 26)

Conteudo

Combinação de Métodos Analíticos e Estatísticos para Otimizar a Atividade Antibacteriana de Extratos de Sálvia Esclareia Obtidos por Fluido Supercrítico

A extração de sálvia esclareia (Salvia sclarea L.) utilizando dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2) foi sistematicamente estudada por meio de cromatografia em camada fina - bioautografia direta (TLC-DB) e metodologia de superfície de resposta (RSM). Os três parâmetros temperatura, pressão e proporção de cossolvente foram otimizados para a máxima atividade antibacteriana dos extratos de sálvia esclareia contra Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). O maior halo de inibição foi de 7,51 mm para P. aeruginosa e 7,57 mm para MRSA. De acordo com a análise de RSM, os parâmetros de extração ótimos previstos são pressão de 18,6 MPa, temperatura de 40 °C e proporção de 2% de etanol (EtOH). A combinação deste método analítico e estatístico permite economizar tempo, dinheiro e tempo de instrumento na otimização da composição do óleo essencial, que é adaptada a uma tarefa específica e pode ser útil em qualquer tipo de erva numa ampla gama de utilizações, desde a fabricação de perfumes até a indústria alimentícia.

1. Introdução

O rápido desenvolvimento tecnológico do nosso mundo moderno é difícil de ser acompanhado em escala humana. Além dos benefícios óbvios, os desafios que se avizinham se desdobram num ritmo semelhante. Alguns destes são tão urgentes para a humanidade que a sua solução se tornou a direção estratégica de vários países líderes. Estes incluem a proteção do meio ambiente, o combate à resistência aos antibióticos e a digitalização (por exemplo, modelos estatísticos tridimensionais para auxiliar o design).

Devido à composição variada dos óleos essenciais (OE), as bactérias têm dificuldade em desenvolver resistência. Portanto, eles podem servir como boas alternativas aos antibióticos para a indústria farmacêutica. No entanto, o seu uso é mais comum nas indústrias alimentícia e de perfumes. O OE é geralmente um constituinte minoritário de todas as substâncias numa espécie vegetal, correspondendo a até 5% da planta seca. A composição de um OE é altamente complexa e os componentes ativos são diversos. Eles consistem principalmente em monoterpenos, sesquiterpenos e diterpenos de hidrocarbonetos derivados do isopreno, bem como frações oxigenadas dessas moléculas, como aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos, álcoois, éteres, ésteres, etc.
Na família Lamiaceae, o maior e mais importante gênero herbáceo e aromático é Salvia (sálvia), que contém cerca de 900 espécies encontradas em todo o mundo. Das espécies de sálvia, foi escolhida a sálvia esclaréia (Salvia sclarea L.), que é uma planta com forte aroma devido ao óleo essencial encontrado em suas flores e folhas. É mais comumente usada como agente aromatizante e fragrante na preparação de alimentos e licores, na formulação de perfumes e na elaboração de agentes cosméticos. Os ingredientes básicos mais publicados do OE incluem acetato de linalila, linalol, esclareol e germacreno D. A versatilidade de seu óleo também pode contribuir para seu efeito antimicrobiano, que foi comprovado em vários estudos. O efeito antibacteriano de seus componentes ativos se deve à sua capacidade de aumentar a permeabilidade da membrana celular. Como resultado do vazamento, macromoléculas, ATP e DNA são secretados para o espaço extracelular. O modo de ação envolve um conjunto de mecanismos tanto na superfície celular quanto no citoplasma. No entanto, o processo não está completamente claro, e é evidente que mais pesquisas são necessárias para entender claramente o mecanismo de ação.

Deve-se mencionar que a extração de uma pequena quantidade de material vegetal valioso com composição tão diversa requer um método bem utilizado e facilmente reproduzível. Métodos de extração comumente utilizados para o isolamento da fração volátil de plantas medicinais incluem destilação a vapor, hidrodestilação ou extração com dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2). Na prática, observa-se uma alta prevalência de destilação a vapor (SD), que é um método barato e ecologicamente correto. No entanto, a hidrodestilação (HD) pode causar a oxidação de certos compostos, e também é esperada hidrólise e degradação terminal. Estas podem levar a alterações no odor do óleo e à eliminação de alguns componentes ativos. Embora a extração Soxhlet seja muito eficiente, a necessidade de uso de solventes orgânicos é perigosa para o meio ambiente e para a saúde humana. Em contraste, a extração com fluido supercrítico (SFE) pode ser uma tecnologia alternativa suave e verde aos métodos de extração tradicionais. Em termos de qualquer rendimento de extração, Soxhlet apresenta melhor desempenho em comparação com SFE, mas usar CO2 como solvente neste último método é barato, inofensivo ao meio ambiente e aos humanos. Pode desempenhar um papel na moldagem da economia circular ao reduzir a geração de resíduos de solventes orgânicos, e o CO2 utilizado na extração pode ser recirculado ou recuperado. Alta automação pode ser alcançada e a otimização de um grande número de parâmetros se encaixa bem na metodologia de planejamento experimental.

O delineamento de Box–Behnken (BBD) foi utilizado em nossos experimentos, que é um procedimento de modelagem comum para otimizar métodos de SFE.
A bioautografia direta (DB) é um dos métodos mais eficazes disponíveis atualmente para estudar o efeito antimicrobiano de extratos multicomponentes. Uma grande vantagem do método é que ele combina cromatografia em camada fina (TLC) e ensaios microbiológicos. As amostras podem ser colocadas em contato direto com os organismos-teste em uma placa de TLC. Para o teste de atividade antimicrobiana, a placa cromatográfica desenvolvida é imersa em uma solução de suspensão bacteriana e incubada por um tempo adequado. A bactéria cresce diretamente na placa de TLC, exceto nos pontos onde as amostras exercem um efeito antibacteriano e inibem seu crescimento. Em seguida, as placas são pulverizadas com sal de tetrazólio, a partir do qual as bactérias viáveis produzem um corante púrpura de formazana. Isso torna as zonas de inibição visíveis. Há poucos estudos na literatura onde patógenos respiratórios específicos foram estudados por TLC-DB, apesar do fato de que estudos sobre resistência a antibióticos estão se tornando mais comuns nessa área. De acordo com uma pesquisa da Organização Mundial da Saúde (OMS), pessoas com infecção por Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) têm 64% mais probabilidade de morrer da infecção do que aquelas infectadas por uma bactéria sensível à meticilina. A OMS recentemente listou a Pseudomonas aeruginosa resistente a carbapenêmicos entre as três espécies bacterianas para as quais há uma necessidade crítica no campo do desenvolvimento de antibióticos.

Pesquisas anteriores sobre a extração com dióxido de carbono supercrítico (SC-CO₂) de sálvia esclareia focaram nas proporções relativas dos componentes e na comparação com outros métodos de extração. O enriquecimento do teor de esclareol dos extratos também é uma importante direção de pesquisa, pois o esclareol pode ser um substituto natural do âmbar cinza para a indústria de perfumes. A presente pesquisa é uma abordagem abrangente para otimizar as condições de extração com SC-CO₂ de sálvia esclareia, a fim de alcançar o maior efeito biológico possível. Para estudos que exigem um grande número de experimentos com muitas variáveis, o tempo e o custo de material envolvidos tornam-se fatores críticos. A eficiência do nosso uso de recursos pode ser aumentada por um planejamento experimental adequado. A metodologia de superfície de resposta (RSM) é um conjunto de técnicas matemáticas e estatísticas que examinam a relação entre uma ou mais variáveis de resposta e várias variáveis explicativas. Os efeitos individuais e de interação dos parâmetros sobre a atividade antibacteriana podem ser modelados pelos cálculos. O uso de RSM na otimização de processos de extração está se tornando mais difundido.
O objetivo foi determinar o conjunto ideal de parâmetros (pressão, temperatura e proporção de cossolvente) para a recuperação do óleo essencial de sálvia esclareia utilizando RSM. Os extratos foram testados em bactérias modelo: patógenos do trato respiratório Gram-positivos (MRSA) e Gram-negativos (P. aeruginosa). O processo apresentado neste estudo pode encurtar e facilitar o desenvolvimento de produtos contra patógenos. Além disso, a RSM pode ajudar a entender e otimizar processos de fabricação subsequentes.
2. Resultados
2.1. Atividade Antibacteriana dos Extratos de Sálvia Esclareia
Utilizando o método TLC-DB, a atividade antibacteriana dos extratos sem separação foi testada contra P. aeruginosa e MRSA (Figura 1a,b). A atividade antibacteriana foi expressa em diâmetro da zona de inibição (mm) (Tabela 1, Figura 2 e Figura 3). Clorofórmio e etanol absoluto como controles negativos não inibiram o crescimento de nenhuma das bactérias. Gentamicina foi usada como controle positivo no caso de P. aeruginosa, que foi mais sensível a este antibiótico do que a qualquer um dos extratos vegetais. Em geral, as maiores zonas de inibição foram observadas para as amostras vegetais extraídas a 20 MPa. Temperaturas mais baixas também facilitaram a extração de componentes biologicamente ativos. Amostras que não inibiram o crescimento bacteriano foram preparadas a 10 MPa em cada caso.
No caso do MRSA, a vancomicina, usada como antibiótico controle positivo, inibiu o crescimento bacteriano de forma eficiente. Comparando os resultados obtidos com MRSA com os resultados de P. aeruginosa, regularidades semelhantes foram observadas para as zonas de inibição das amostras. No entanto, o crescimento de MRSA foi menos inibido pelos extratos. Os maiores valores de inibição foram observados para o terceiro extrato, sendo a zona de inibição de 7,51 ± 0,85 mm e 7,57 ± 0,62 mm para P. aeruginosa e MRSA, respectivamente (Tabela 1). Baixa temperatura (40 °C) e alta proporção de cossolvente (2%) foram utilizadas durante a preparação da amostra 3. Com base nessas observações, a atividade antibacteriana poderia ser aumentada pelas condições acima.
2.2. Resultados da Superfície de Resposta
Os modelos de superfície de resposta dos extratos foram plotados utilizando o programa Design Expert. A Figura 4 e a Figura 5 mostram como a atividade antibacteriana do extrato muda contra as cepas bacterianas de P. aeruginosa e MRSA, além da mudança constante de certos parâmetros. Pode-se observar que, no caso de P. aeruginosa, o diâmetro das zonas de inibição foi maior em média, portanto os extratos foram mais eficazes contra esse tipo de bactéria. A forma das superfícies de resposta é muito semelhante nos dois casos estudados. Conforme mostram as figuras, os melhores resultados foram obtidos em baixas temperaturas (40–45 °C) e pressões moderadamente mais altas (15–19 MPa). Os extratos menos eficazes podem ser preparados a 40–50 °C e 10–11 MPa. Durante a extração, o material vegetal deve ser protegido do calor excessivo. Em função da proporção de cossolvente, a forma das figuras é menos característica, do que se pode concluir que, dos três parâmetros de ajuste, a concentração de EtOH tem o menor efeito sobre a atividade antibacteriana. No caso de P. aeruginosa, a proporção ideal pode estar entre 1,6 e 1,7%, e um aumento adicional na proporção de EtOH não produzirá mais uma melhora significativa na atividade antibacteriana. No entanto, no caso de MRSA, os melhores resultados podem ser obtidos com uma proporção de cossolvente de 2%. Para ambas as cepas bacterianas, os piores resultados foram obtidos com uma proporção de 1,0–1,2% de EtOH.

Os resultados dos testes ANOVA das duas bactérias podem ser vistos na Tabela 2 e na Tabela 3. A ANOVA confirmou a precisão dos modelos para otimização. O valor F é 16,40 no caso de P. aeruginosa e 17,90 para MRSA; isso sugere que os modelos são significativos e pode haver apenas 0,01% de chance de que um valor F maior ocorra devido ao ruído. O R2 previsto para P. aeruginosa para 0,6662 e 0,6860 MRSA corresponde razoavelmente ao R2 ajustado para P. aeruginosa 0,8172 e 0,8308 para MRSA, porque a aberração é menor que 0,2. A Adeq Precision mede a relação sinal-ruído com precisão suficiente. Uma relação maior que 4 é desejável. Nossa relação é 15,3486 no caso de P. aeruginosa e para MRSA é 16,3278, indicando sinais adequados. As limitações mencionadas acima correspondem às limitações no software Design Expert. Os modelos podem ser usados para navegar no espaço de design.
As Figuras 6a,b demonstram a forte proximidade entre os valores medidos e os previstos pelo cálculo estatístico, conforme ilustrado pelo agrupamento próximo à linha reta. De fato, os coeficientes de determinação, P. aeruginosa R2 = 0,8703 e MRSA R2 = 0,8799, são valores adequados para determinar a relação entre os valores previstos e reais. As Figuras 7a,b mostram os valores reais versus previstos. A localização das execuções próximas à linha reta prova que a diferença entre os valores observados e previstos foi muito pequena. Os resultados mostram que os valores previstos e reais estão suficientemente próximos entre si, o que valida que os modelos são adequados para prever resultados e otimizar a extração.
Valores de p inferiores a 0,05 ilustram a significância dos termos do modelo. Todos os três parâmetros de configuração têm um efeito estatisticamente significativo na atividade antibacteriana contra P. aeruginosa. Os cálculos confirmaram as conclusões das figuras 3D. Para a P. aeruginosa Gram-negativa, dois parâmetros tiveram um efeito estatisticamente significativo na atividade antibacteriana (p < 0,0001). No entanto, a proporção de EtOH não teve efeito significativo na atividade antibacteriana (p = 0,3365). Para o MRSA Gram-positivo, todos os três parâmetros de configuração, incluindo a proporção de EtOH (p = 0,0434), tiveram um efeito estatisticamente significativo na eficácia biológica. Neste caso, o efeito mais significativo foi exercido pela temperatura e pressão sobre o resultado (p < 0,0001). Ao examinar as interações entre os parâmetros de configuração, apenas a interação entre pressão e temperatura mostrou um efeito estatisticamente significativo na atividade antibacteriana (p < 0,0002, 0,0001), enquanto as outras interações não mostraram nenhum efeito estatisticamente significativo. Com base nos diagramas 3D e nos cálculos, a escolha desses dois parâmetros (temperatura e pressão) é a mais crítica ao projetar a extração.
A otimização é um meio eficaz de controlar processos para produzir um produto com a qualidade adequada. Parâmetros de extração ótimos foram determinados levando em consideração a atividade antibacteriana para ambas as bactérias. O tratamento de múltiplas respostas e a seleção das condições ótimas foram baseados na função de desejabilidade D. Nesta pesquisa, a desejabilidade foi definida para calcular a melhor combinação de parâmetros de configuração para maximizar a eficácia biológica contra as bactérias P. aeruginosa e MRSA. Usando a função de desejabilidade, os seguintes parâmetros de configuração foram determinados: pressão 18,6 MPa, temperatura 40 °C e proporção de EtOH 2%. Usando esses parâmetros, o diâmetro da zona de inibição prevista foi de 7,95 mm e 7,57 mm para P. aeruginosa e MRSA, respectivamente.
3. Discussão
Há uma vasta literatura disponível sobre o efeito antimicrobiano dos OEs. A sálvia esclareia é uma planta medicinal tradicional amplamente utilizada que não causa efeitos colaterais significativos em humanos. O presente estudo demonstra que pequenas alterações nos parâmetros de extração têm um efeito significativo na eficiência biológica do extrato de sálvia esclareia isolado com a técnica de SC-CO2. Ao mesmo tempo, os resultados destacam a importância de um planejamento experimental minucioso. A RSM é adequada para uma melhor compreensão dos processos de extração e nos ajuda a determinar os parâmetros ideais do processo.

O monitoramento da eficiência biológica requer um método adequado para testar amostras complexas não solúveis em água. Existem vários métodos práticos na literatura que são utilizados para estudar o efeito antimicrobiano dos OEs (por exemplo, ensaio de diluição em ágar, ensaio de difusão em disco). No entanto, os resultados apresentam grande variabilidade mesmo durante medições repetidas de um determinado óleo. Os resultados tornam-se comparáveis apenas com medições padronizadas. A TLC-DB é uma sonda biológica que combina cromatografia planar com um ensaio biológico in situ. Em contraste com os métodos de difusão em ágar, os OEs entram em contato direto com as bactérias de teste, de modo que o uso de detergentes e as diferentes capacidades de difusão dos componentes não afetam o resultado final.

O método TLC-DB desenvolvido por Balázs et al. mostrou-se adequado para testar a atividade anti-Haemophilus de extratos contendo compostos não solúveis em água. Utilizando a experiência adquirida, o método foi otimizado para as cepas MRSA e P. aeruginosa, prestando especial atenção aos parâmetros anteriormente considerados críticos (por exemplo, tempo de incubação, composição do ágar para o crescimento da bactéria, etc.) que podem afetar significativamente a eficiência do método TLC-DB.
Até onde sabemos, o procedimento de extração de sálvia esclaréia foi otimizado pela primeira vez pelo nosso grupo usando RSM. A atividade antibacteriana foi escolhida inicialmente como alvo principal a ser aumentada. Estudos anteriores compararam principalmente a composição química dos extratos, dependendo se as amostras foram preparadas por hidrodestilação ou extração com CO2 supercrítico. No entanto, os resultados são contraditórios em muitos casos. Ronyai et al. descobriram que a quantidade de acetato de linalila, um dos principais componentes da sálvia esclaréia, era de 10,3% no óleo hidrodestilado, enquanto no extrato de SFE era de apenas 8,2%. A tendência oposta foi relatada por Simándi et al., com a quantidade de acetato de linalila sendo de 15,9% no óleo hidrodestilado, enquanto no extrato de SFE aumentou para 23,6%. A razão para a discrepância é que diferentes parâmetros de configuração foram usados durante a extração com CO2 supercrítico. Para controlar e comparar nossos processos de extração, os efeitos dos parâmetros de configuração no produto final precisam ser esclarecidos. Um grande número de parâmetros (pressão, temperatura, proporção de cossolvente, tamanho de partícula, taxa de fluxo, tempo de extração, formato do vaso, etc.) e uma ampla gama de opções de configuração resultariam em muitos experimentos. O uso de RSM no presente estudo permitiu modelar os efeitos de três parâmetros críticos contra os patógenos respiratórios estudados.
A forma das superfícies de resposta é muito semelhante nos dois casos estudados. Isso é uma grande vantagem na otimização, pois os parâmetros ideais de configuração para atividade antibacteriana são muito próximos entre si para as duas bactérias. Pode-se observar pelos nossos resultados que o aumento da pressão tem um efeito benéfico sobre a atividade antibacteriana. O limiar em que os componentes biologicamente ativos do extrato de sálvia esclaréia se tornam solúveis pode ser encontrado em torno de 10 MPa. A faixa de pressão mais alta também é mais favorável do ponto de vista do rendimento da extração, pois com o aumento da pressão, a densidade do líquido também aumenta, o que resulta em maior solubilidade dos componentes. Portanto, quanto maior a pressão de extração, menor o volume de fluido necessário para uma dada extração. No entanto, deve-se ter em mente que densidades mais altas podem aumentar a coextração de substâncias indesejáveis, o que poderia alterar a solubilidade dos componentes biologicamente ativos. No nosso caso, isso ainda não ocorreu a uma pressão de 20 MPa.
No entanto, uma imagem completa do efeito da pressão só pode ser obtida examinando-a em função da temperatura. Para ambas as bactérias testadas, a modelagem mostra que uma temperatura baixa em torno de 40 °C é preferida para a atividade antibacteriana. Isso provavelmente se deve ao fato de que a densidade do fluido diminui com o aumento da temperatura a pressão constante. À medida que a compressibilidade do fluido aumenta, o processo se torna mais pronunciado. A temperatura mais baixa também é muito mais vantajosa em termos de evitar a termodegradação, que é inevitável quando se utiliza hidrodestilação.
Um cossolvente foi utilizado devido à extrema apolaridade do extrato de CO2-SC. Sem o uso de cossolvente, foi observado um aumento na proporção de gorduras vegetais e ceras nos experimentos preliminares. Isso, por vezes, levou ao entupimento da válvula reguladora de contrapressão. A atividade antibacteriana das gorduras vegetais e ceras era relativamente baixa e, portanto, sua proporção foi reduzida utilizando um cossolvente. O etanol foi escolhido devido à sua baixa toxicidade e ao fato de dissolver bem os componentes ativos dos OEs, mesmo no estado normal. Embora este parâmetro tenha sido o menos importante em termos de atividade antibacteriana (dentro da faixa de 1%–2% de cossolvente examinada), por outro lado, foi de grande importância no ajuste fino da nossa extração. Um modificador polar é necessário para melhorar a solubilidade de moléculas de maior peso e mais polares. Além disso, o uso de modificadores diminui a temperatura necessária para o processo.
Com base em nossos resultados, a RSM é adequada para compreender e otimizar processos de extração supercrítica em termos de atividade antibacteriana (efeito antibacteriano), utilizando técnicas analíticas apropriadas. O procedimento de modelagem desenvolvido pode encurtar o desenvolvimento de produtos antibacterianos contra as cepas de P. aeruginosa e MRSA. À luz dos resultados, a sálvia esclaréia pode servir como uma excelente matéria-prima devido às suas excepcionais propriedades fitoquímicas.
4. Materiais e Métodos
4.1. Material Vegetal—Salvia Sclarea
O material vegetal foi encomendado da Naturix24 Ltd. (Dransfeld, Alemanha) em 2019, que adquire sálvia esclaréia da Itália e do sul da França dentro da Europa (Naturix24, 2019). O cultivo e a colheita das safras estão em conformidade com as recomendações de Boas Práticas Agrícolas. Após a colheita, a planta foi seca ao ar, triturada e enviada para a Alemanha. A planta inteira foi processada. De acordo com a declaração do comerciante, o teor de esclareol era relativamente alto, mas a proporção do composto no óleo essencial não era superior a 12%.
4.2. Extração por SFE
O CO2 utilizado para a SFE tinha pureza de 99,97% (m/m) (Messer, Gödöllő, Hungria). O composto padrão etanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi utilizado para a quantificação. Todos os solventes eram de grau analítico e adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
As SFEs foram realizadas em um instrumento SF2000 Able & Jasco (Jasco, Tóquio, Japão). Uma coluna de aço inoxidável de 30 cm × 20 mm com volume de 94,2 cm³ foi usada como vaso de extração. Cada vaso foi carregado com 22 g de plantas secas e trituradas. O peso exato foi registrado a cada vez. Como fase móvel, foi aplicado CO2 99,9% puro, e etanol absoluto foi usado como cossolvente. A proporção de etanol variou entre 1% e 2%. Cada corrida durou 120 min, pois experimentos preliminares mostraram que o rendimento da extração não aumentava significativamente com o aumento adicional do tempo. Os extratos foram coletados em tubos de centrífuga de 15 mL, cuja massa já havia sido pesada. As amostras foram armazenadas a −10 °C até processamento posterior.
Para encontrar o método mais eficaz para atingir o maior efeito antibacteriano, as extrações foram realizadas alterando sistematicamente os parâmetros de acordo com o plano experimental. Os parâmetros foram determinados após pesquisa bibliográfica preliminar. A temperatura variou de 40 a 80 °C, a pressão variou de 10 a 20 MPa, e a proporção de cossolvente variou de 1 a 2%. A cor dos extratos de SC-CO2 variou de amarelo pálido a marrom escuro. As frações insolúveis em etanol foram marcadamente separadas nos extratos. Seus aromas lembravam o material de partida.
4.3. Determinação do Teor de Etanol das Amostras por Cromatografia Gasosa (GC-FID)
As análises foram realizadas com um sistema Agilent 6890N GC-FID (Santa Clara, CA, EUA) equipado com uma coluna capilar TR-WAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) (30 m × 250 µm × 1,0 µm). A temperatura do forno do GC foi programada para aumentar de 60 (5 min isotérmico) para 240 °C a 30 °C/min (5 min isotérmico). Hidrogênio de alta pureza (5.0) foi usado como gás de arraste a 2,9 mL/min (29 cm/s) em modo de pressão constante. Os frascos foram crimpados para minimizar a perda de espécies voláteis. Etanol absoluto (p.a., Molar Chemicals Kft., Halásztelek, Hungria) foi usado como padrão para identificar o pico de etanol com base no tempo de retenção. Para quantificação por FID, foi utilizada a técnica de padrão externo. Em seguida, 100 mg de etanol absoluto foram diluídos com dimetilsulfóxido (p.a., Molar Chemicals Kft., Halásztelek, Hungria) para obter uma concentração final de 10 mg/mL como solução estoque. A curva de calibração cobriu a faixa de 0,5 a 2,0 mg/mL.
4.4. Cromatografia em Camada Delgada - Bioautografia Direta (TLC-DB)
4.4.1. Bioautografia Direta
O efeito antibacteriano dos extratos de sálvia esclaréia sobre P. aeruginosa (ATCC 27853) e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA 4262) foi avaliado no laboratório do Departamento de Microbiologia Médica e Imunologia (Faculdade de Medicina, Universidade de Pécs, Hungria). Para o ensaio bioautográfico, as bactérias foram cultivadas em 100 mL de Caldo de Infusão Cérebro-Coração (BHI) (Sigma Aldrich Ltd., Darmstadt, Alemanha) a 37 °C em incubadora com agitação a 60 rpm por 12 h. A suspensão bacteriana foi diluída com BHI nutriente fresco até uma DO600 de 0,4, que corresponde a aproximadamente 4 × 10⁷ unidades formadoras de colônias (UFC)/mL.
4.4.2. Cromatografia em Camada Fina sem Separação
A cromatografia foi realizada em placas de alumínio para CCD de sílica gel 60F254 de 5 × 10 cm (Merck, Darmstadt, Alemanha). O clorofórmio (p.a., Molar Chemicals Kft., Halásztelek, Hungria) foi escolhido como solvente por dissolver bem os extratos e apresentar alta tensão superficial. Devido a diferentes parâmetros de extração, cada amostra apresentou um teor de etanol diferente (Tabela S1). Durante o preparo das amostras, cada amostra foi corrigida quanto ao seu teor de etanol. Das soluções finais (concentração do extrato de sálvia esclaréia na solução final de cada amostra: 10 mg/mL), 3,0 μL foram aplicados na placa de CCD com pipetas Finnpipette (Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha); os controles do solvente foram clorofórmio e etanol absoluto (p.a., Molar Chemicals Kft., Halásztelek, Hungria), enquanto os controles positivos foram vancomicina (Vancocin, ANI Pharmaceuticals, Baudette, MN, EUA) contra MRSA (estoque: 50 mg/mL; 0,6 μL aplicados na CCD) e gentamicina (Sandoz, Holzkirchen, Alemanha) contra P. aeruginosa (estoque: 80 mg/2 mL; 0,75 μL aplicados na placa de CCD). A separação por CCD não foi realizada, pois o objetivo deste experimento foi examinar a atividade antibacteriana dos extratos (não de compostos separados).
4.4.3. Detecção Pós-Cromatográfica
Após a aplicação da amostra, as placas de CCD foram tratadas com a suspensão de P. aeruginosa ou MRSA. As camadas foram mergulhadas em 100 mL de suspensão bacteriana para garantir uma distribuição homogênea e adesão das bactérias à superfície das camadas. Após a imersão, as camadas foram transferidas para uma câmara horizontal de paredes baixas (com dimensões de 20 × 14,5 × 5 cm) e incubadas por 2 h a 37 °C. Em seguida, para a visualização das manchas antibacterianas, as placas de CCD foram imersas na solução aquosa de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT, 0,05 g/85 mL) (Sigma Aldrich Ltd., Darmstadt, Alemanha) por 5 s e então incubadas a 37 °C por 24 h. Na placa de CCD, as bactérias metabolicamente ativas convertem o sal de tetrazólio, MTT, em corante formazano. Manchas brancas (como zonas de inibição) contra o fundo azul-violeta indicaram a falta de atividade desidrogenase devido à atividade antibacteriana das amostras testadas. Todos os testes foram realizados 6 vezes em paralelo. As zonas de inibição (expressas em mm) dos extratos foram medidas com o programa Motic Images Plus 2.0 (Motic Deutschland GmbH, Wetzlar, Alemanha).
4.5. Delineamento Experimental
O software Design Expert (Versão 10, Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, EUA) foi aplicado para o delineamento experimental, análise de dados e construção do modelo. Os fatores utilizados no estudo foram selecionados com base na literatura preliminar. Fatores são parâmetros que influenciam grandemente o processo, e os níveis dos fatores são valores que podem ser assumidos pelos fatores. A pressão de extração foi a variável A, a temperatura de extração foi a variável B, e a proporção de cossolvente foi a variável C. Todas as variáveis foram examinadas em 3 níveis, e a variável dependente foi a atividade antibacteriana. Um total de 27 extrações foram realizadas. Os fatores investigados e os níveis testados estão reportados na Tabela 4. Uma equação quadrática completa ou a forma reduzida desta equação foi utilizada para este modelo: onde y é a resposta investigada (atividade antibacteriana), β0, βi, βii e βij são os coeficientes de regressão constantes, termos linear, quadrático e de interação, respectivamente; xi e xj são variáveis independentes codificadas, e ε é um vetor de erro constante desconhecido. A análise de variância (ANOVA) foi utilizada para determinar a qualidade do modelo ajustado. As análises estatísticas foram realizadas no nível de intervalo de confiança de 95%.
5. Conclusões
O desenvolvimento de produtos para o tratamento de patógenos requer o uso de um método analítico reproduzível. O método padronizado de TLC-DB apresentado neste estudo é adequado para o monitoramento quantitativo e reproduzível da atividade antibacteriana contra P. aeruginosa e MRSA. A escolha correta da combinação de parâmetros de configuração durante a extração com SC-CO2 é crítica. A atividade antibacteriana do extrato de sálvia esclareia pode ser sensivelmente variada dependendo das condições de extração. A pressão e a temperatura utilizadas durante a extração tiveram o maior efeito na qualidade do produto final. O RSM permite a otimização da extração com SC-CO2 e uma compreensão mais aprofundada do processo em base estatística. Experimentos adicionais (análise de microextração em fase sólida SPME-cromatografia gasosa-espectrometria de massas (SPME-GC-MS)) são necessários para associar a eficiência biológica à composição química e ao rendimento de extração adequado. As condições ideais, na faixa dos parâmetros de extração analisados, foram calculadas como sendo a uma pressão de 18,6 MPa, uma temperatura de 40 °C e uma proporção de EtOH de 2%. O extrato obtido de sálvia esclareia com esses parâmetros ideais ajustados de extração SCF é de boa qualidade e rico em OE; portanto, também é recomendado para uso cosmético e alimentício. Em resumo, este trabalho apresenta um exemplo usando extrato de sálvia esclareia em relação à saúde humana e à indústria farmacêutica, mas a combinação de métodos analíticos e estatísticos poderia ser útil em qualquer tipo de ervas em uma ampla gama de usos, desde a fabricação de perfumes até a indústria alimentícia.
Nota do Editor: A MDPI permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Materiais Complementares
O seguinte material complementar está disponível online. Tabela S1: O teor de etanol e o rendimento de extração dos extratos de SFE de sálvia esclareia.
Contribuições dos Autores
Conceituação, G.H., D.R.P., J.P.P. e C.B.; metodologia, G.H., V.L.B., C.B. e D.R.P.; software, V.L.B., S.P. e C.B.; validação, G.H. e D.R.P.; análise formal, C.B., G.H. e V.L.B.; investigação, G.T., C.B. e V.L.B.; recursos, G.H., B.K. e J.P.P.; curadoria de dados, S.P., C.B. e G.H.; preparação do rascunho original, C.B., D.R.P. e S.P.; redação — revisão e edição, G.H. e D.R.P.; visualização, V.L.B. e C.B.; supervisão, G.H., D.R.P. e S.P.; administração do projeto, G.H.; aquisição de financiamento, G.H. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Financiamento
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela bolsa NKFI (National Research, Development and Innovation Office) 18 K 128217 de Györgyi Horváth.
Declaração do Conselho de Revisão Institucional
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados que apoiam os resultados relatados estarão disponíveis pelos autores.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Disponibilidade de Amostras
Não disponível.
Propriedades antimicrobianas de óleos essenciais de plantas contra patógenos humanos e seu modo de ação: Uma revisão atualizada
Uma revisão abrangente do potencial antibacteriano, antifúngico e antiviral de óleos essenciais e seus constituintes químicos contra patógenos microbianos resistentes a medicamentos
Desvendando a atividade antibacteriana seletiva e a composição química de óleos essenciais cítricos
Óleos essenciais de flores comestíveis: Uma revisão das composições químicas, bioatividades, segurança e aplicações na conservação de alimentos
Preparação e caracterização de nanoperfumes à base de água
Extração com fluido supercrítico na análise de óleos essenciais e voláteis de plantas
Composição química e atividade anticancerígena de óleos essenciais de sálvia-mediterrânea (Salvia officinalis L.) cultivada em diferentes condições ambientais
Análise comparativa de voláteis do óleo de sálvia-esclareia (S. sclarea L.) por GC–FTIR e GC–MS
Atividade antimicrobiana e mecanismos do óleo essencial de Salvia sclarea
Extração de óleo essencial de Cupressus sempervirens: Comparação dos rendimentos globais, composição química e atividade antioxidante obtidos por hidrodestilação e extração supercrítica
Extração de sálvia (Salvia officinalis L.) por CO2 supercrítico: Dados cinéticos, composição química e seletividade de diterpenos
Aplicações de fluido supercrítico no design de novos materiais antimicrobianos
Extração online direta e determinação por extração com fluido supercrítico com cromatografia e espectrometria de massas de carotenoides-alvo de pimentas Habanero vermelhas (Capsicum chinense Jacq.)
Otimização da extração supercrítica de acetato de linalila de lavanda via delineamento Box-Behnken
Métodos para avaliação in vitro da atividade antimicrobiana: Uma revisão
Atividade anti-Haemophilus de óleos essenciais selecionados detectada por bioautografia direta em CCD e inibição de biofilme
Triagem de compostos antibacterianos em tintura de Salvia officinalis L. usando técnicas de cromatografia em camada delgada—Bioautografia direta e cromatografia líquida—Espectrometria de massas em tandem
Padrão de resistência a antibióticos de Staphylococcus aureus com referência a isolados de MRSA de pacientes pediátricos
Resistência a antibióticos em Pseudomonas aeruginosa: Mecanismos e estratégias terapêuticas alternativas
Extração com fluido supercrítico de plantas medicinais
Influência dos métodos de extração na composição de óleos essenciais
Avaliação fitoquímica de óleos essenciais, plantas medicinais e suas preparações
Óleos essenciais: Extração, bioatividades e seus usos para conservação de alimentos
Purificação de esclareol por processo de fracionamento com CO2 supercrítico
Comportamento de fase de três componentes do sistema esclareol–lactato de etila–dióxido de carbono para aplicações GAS
Aplicação da metodologia de superfície de resposta para otimização da degradação de matéria orgânica natural pelo processo de oxidação avançada UV/H2O2
Otimização da extração com CO2 supercrítico de folhas de Salvia officinalis L. focada em monoterpenos oxigenados, α-humuleno, viridiflorol e manool
Extração subcrítica de água de subprodutos de sálvia (Salvia officinalis L.) — Otimização do processo por metodologia de superfície de resposta
Otimização experimental e modelagem matemática da extração com fluido supercrítico de óleo essencial de Eryngium billardieri: Aplicação do algoritmo de recozimento simulado (SA)
Cinética de extração e simulação por ANN da extração com fluido supercrítico de pó de sálvia
Extração com fluido supercrítico de óleos essenciais
Aplicação de solventes eutéticos profundos para a extração de ácido carnósico e carnosol de sálvia (Salvia officinalis L.) com otimização por metodologia de superfície de resposta
Otimização de processos de cultura celular e ruptura celular para aumentar a produção de celulase termofílica FnCel5A em E. coli usando metodologia de superfície de resposta
Atividade antibacteriana de óleos essenciais e seus constituintes isolados contra bactérias cariogênicas: Uma revisão sistemática
Atividade antibacteriana de óleos essenciais de plantas do gênero Origanum
Bioatividade de óleos essenciais: Uma revisão sobre sua interação com componentes alimentares
Caracterização química de óleos essenciais e investigação de algumas atividades biológicas: Uma revisão crítica
Atividade antibacteriana e interações de combinações de óleos essenciais de plantas contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
Efeito antidepressivo de Salvia sclarea é explicado pela modulação das atividades da dopamina em ratos
Avaliação de métodos comuns de triagem antibacteriana utilizados em pesquisas de óleos essenciais
Bioautografia direta em CCD para determinação da atividade antibacteriana do óleo essencial de Artemisia adamsii
Comparação da composição volátil do óleo de sálvia esclareia obtido por hidrodestilação e extração com fluido supercrítico
Extração com dióxido de carbono supercrítico de óleo de semente de chia mexicana (Salvia hispanica L.): Caracterização e otimização do processo
Aumento da eficiência de extração na extração com fluido supercrítico de matrizes complexas: Predição da eficiência de extração de diuron e linuron na extração com fluido supercrítico usando retenção cromatográfica com fluido supercrítico
Extração com fluido supercrítico de matrizes vegetais: Aplicações, tendências e perspectivas futuras de uma tecnologia verde convincente
Extração com CO2 supercrítico de Salvia officinalis L.
Efeitos de modificadores no perfil de licopeno extraído de peles de tomate por CO2 supercrítico
Isolamento de óleo essencial de diferentes plantas e ervas por extração com fluido supercrítico
Revisão crítica da extração com fluido supercrítico de materiais selecionados de plantas condimentares
Uma revisão de técnicas modernas de preparo de amostras para extração e análise de plantas medicinais
Efeito da adição de cossolvente na extração com fluido supercrítico de compostos bioativos de Helianthus annuus L.
Extração e fracionamento com fluido supercrítico de matéria natural
Extração com fluido supercrítico e caracterização do óleo de folhas de Moringa oleifera
Extração com fluido supercrítico de óleo essencial de Leptocarpha rivularis usando CO2
Ativação e desnaturação de hidrolases em dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2) seco e úmido
Reatividade da água na fase líquida e supercrítica de CO2: Metade da história foi negligenciada?
Delineamentos estatísticos e técnicas de superfície de resposta para a otimização de sistemas cromatográficos
Extração de ácidos graxos de boletus edulis por dióxido de carbono subcrítico e supercrítico
Modelagem e otimização por delineamento de Box-Behnken de parâmetros fotocatalíticos para remoção eficiente de corante por TiO2 mesoporoso dopado com lantânio
(a) Detecção da atividade antibacteriana de extratos SC-CO2 de sálvia esclaréia, controle positivo (gentamicina) e solventes contra P. aeruginosa por TLC-DB. A numeração das amostras é a mesma mostrada na Tabela 1; (b) Detecção da atividade antibacteriana de extratos SC-CO2 de sálvia esclaréia, controle positivo (vancomicina) e solventes contra MRSA por TLC-DB. A numeração das amostras é a mesma mostrada na Tabela 1.
Atividade antibacteriana de cada extrato de sálvia esclaréia e gentamicina como controle positivo sobre P. aeruginosa. A numeração das amostras é a mesma mostrada na Tabela 1.
Atividade antibacteriana sobre MRSA de cada extrato de sálvia esclaréia e vancomicina como controle positivo. A numeração das amostras é a mesma mostrada na Tabela 1.
(a) Gráfico de superfície tridimensional para variação da atividade antibacteriana sobre P. aeruginosa com a variação da temperatura e pressão de extração. (b) Gráfico de superfície tridimensional para variação da atividade antibacteriana sobre P. aeruginosa com modificação da pressão de extração e proporção de etanol. A escala de cores mostra as zonas de inibição de azul (0.00 mm) a vermelho (7.51 mm).
(a) Gráfico de superfície tridimensional para variação da atividade antibacteriana sobre MRSA com a variação da temperatura e pressão de extração. (b) Gráfico de superfície tridimensional para variação da atividade antibacteriana sobre MRSA com pressão de extração e proporção de etanol. A escala de cores mostra as zonas de inibição de azul (0.00 mm) a vermelho (7.57 mm).
(a) Gráfico normal de resíduos para inibição de células de P. aeruginosa.; (b) Gráfico de valores previstos vs. reais para inibição de P. aeruginosa. A escala de cores mostra o valor de P. aeruginosa no modelo quadrático de azul (0.000) a vermelho (2.740).
(a) Gráfico normal de resíduos para inibição de células de MRSA.; (b) Gráfico de valores previstos vs. reais para inibição de MRSA. A escala de cores mostra o valor de MRSA no modelo quadrático de azul (0.00) a vermelho (2.752).
As zonas de inibição dos extratos de SFE de sálvia esclaréia após TLC-DB e os parâmetros de extração do procedimento SCF.
P. aeruginosa MRSA Amostra Diâmetro (mm) 1 DP Diâmetro (mm) 1 DP MPa °C EtOH (%) 1 5,86 0,72 5,46 0,50 20 40 2 2 5,50 0,56 4,85 0,78 15 40 2 3 7,51 0,85 7,57 0,62 10 40 2 4 6,18 0,64 4,69 0,46 20 60 2 5 5,43 0,42 4,80 0,38 15 60 2 6 0,00 0,00 0,00 0,00 10 60 2 7 4,29 0,71 4,66 0,39 20 80 2 8 4,83 0,29 4,32 0,59 15 80 2 9 0,00 0,00 0,00 0,00 10 80 2 10 6,50 0,42 4,59 0,65 20 40 1,5 11 6,91 0,20 4,77 0,69 15 40 1,5 12 6,27 0,33 3,29 0,42 10 40 1,5 13 5,41 0,47 3,41 0,36 20 60 1,5 14 5,71 0,80 4,25 0,35 15 60 1,5 15 0,00 0,00 0,00 0,00 10 60 1,5 16 6,37 0,78 3,50 0,40 20 80 1,5 17 6,56 0,55 3,29 0,46 15 80 1,5 18 0,00 0,00 0,00 0,00 10 80 1,5 19 5,96 0,15 4,44 0,53 20 40 1 20 6,34 0,82 3,58 0,82 15 40 1 21 5,32 0,41 3,72 0,40 10 40 1 22 5,61 0,47 3,72 0,40 20 60 1 23 4,98 0,61 3,07 0,36 15 60 1 24 0,00 0,00 0,00 0,00 10 60 1 25 3,02 0,23 3,40 0,58 20 80 1 26 2,75 0,48 3,25 0,68 15 80 1 27 0,00 0,00 0,00 0,00 10 80 1 clorofórmio 0,00 0,00 0,00 0,00 cl + EtOH 0,00 0,00 0,00 0,00 EtOH 0,00 0,00 0,00 0,00 Vancomicina - - 12,30 0,45 Gentamicina 8,26 0,81 - -
1 DP = desvio padrão; cl = clorofórmio.
Análise de variância (ANOVA) para P. aeruginosa com modelo quadrático.
Fonte Soma dos Quadrados gl Quadrado Médio Valor F Valor p Modelo 25,22 9 2,80 16,40 <0,0001 A-Pressão 9,94 1 9,94 58,15 <0,0001 B-Temp. 5,67 1 5,67 33,17 <0,0001 C-EtOH 0,1650 1 0,1650 0,9656 0,3365 AB 3,49 1 3,49 20,44 0,0002 AC 1,640 × 10−6 1 1,640 × 10−6 9,597 × 10−6 0,9976 BC 0,0046 1 0,0046 0,0269 0,8712 A2 4,90 1 4,90 28,66 <0,0001 B2 0,9233 1 0,9233 5,40 0,0297 C2 0,2831 1 0,2831 1,66 0,2114
R² = 0,8703, R² ajustado = 0,8172, R² previsto = 0,662, Significante ≤ 0,050.
Análise de variância (ANOVA) para MRSA com modelo quadrático.
Fonte Soma dos Quadrados gl Quadrado Médio Valor F Valor p Modelo 19,70 9 2,19 17,91 <0,0001 A-Pressão 7,88 1 7,88 64,47 <0,0001 B-Temp. 3,86 1 3,86 31,63 0,0001 C-EtOH 0,5615 1 0,5615 4,59 0,0434 AB 2,78 1 2,78 22,78 <0,0001 AC 0,0001 1 0,0001 0,0012 0,9724 BC 0,1450 1 0,1450 1,19 0,2878 A2 4,18 1 4,18 34,18 <0,0001 B2 0,7909 1 0,7909 6,47 0,0185 C2 0,0086 1 0,0086 0,0708 0,7927
R² = 0,8799, R² ajustado = 0,8308, R² previsto = 0,6860, Significante ≤ 0,050.
Níveis codificados e reais das variáveis independentes para o experimento planejado.
Variável Independente Símbolo Níveis Baixo (−1) Médio (0) Alto (+1) Pressão (MPa) A 10 15 20 Temperatura (°C) B 40 60 80 Cossolvente (%) C 1,0 1,5 2,0