pmid: "36145808"
title: "Impacto Combinado do Excesso de Zinco e Cádmio na Captação Elementar, Anatomia Foliar e Pigmentos, Capacidade Antioxidante e Função do Aparato Fotossintético em Sálvia Esclareia (Salvia sclarea L.)"
authors: "Dobrikova A, Apostolova E, Adamakis IS, Hanć A, Sperdouli I, Moustakas M"
journal: "Plants (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2022 Sep 15"
doi: "10.3390/plants11182407"
source: "PMC Full Text"
Impacto Combinado do Excesso de Zinco e Cádmio na Captação Elementar, Anatomia Foliar e Pigmentos, Capacidade Antioxidante e Função do Aparato Fotossintético em Sálvia Esclareia (Salvia sclarea L.)
Autores
Dobrikova A, Apostolova E, Adamakis IS, Hanć A, Sperdouli I, Moustakas M
Periodico
Plants (Basel, Switzerland) (2022 Sep 15)
Conteudo
Impacto Combinado do Excesso de Zinco e Cádmio na Absorção Elementar, Anatomia Foliar e Pigmentos, Capacidade Antioxidante e Função do Aparelho Fotossintético em Sálvia Esclaréia (Salvia sclarea L.)
A sálvia esclaréia (Salvia sclarea L.) é uma planta medicinal que tem potencial para ser utilizada na fitoextração de zinco (Zn) e cádmio (Cd) de solos contaminados, acumulando esses metais em seus tecidos. Além disso, descobriu-se que ela é mais tolerante ao excesso de Zn do que ao estresse isolado de Cd; no entanto, os efeitos interativos do tratamento combinado com Zn e Cd sobre essa erva medicinal, bem como as estratégias protetoras do Zn para aliviar a toxicidade do Cd, ainda não foram estabelecidos em detalhes. Neste estudo, plantas de sálvia esclaréia cultivadas hidroponicamente foram expostas simultaneamente a Zn (900 µM) e Cd (100 μM) por 8 dias para obter informações mais detalhadas sobre as respostas das plantas e o papel do excesso de Zn na mitigação dos sintomas de toxicidade do Cd. Foram investigadas a anatomia foliar, os pigmentos fotossintéticos, os teores totais de fenóis e antocianinas, a capacidade antioxidante (por análises DPPH e FRAP) e a absorção e distribuição de elementos essenciais. Os resultados mostraram que a co-exposição a Zn e Cd leva a um aumento no teor foliar de Fe e Mg em comparação com o controle, e a um aumento nos teores foliares de Ca, Mn e Cu em comparação com plantas tratadas apenas com Cd. Isso provavelmente está envolvido nos mecanismos de defesa do excesso de Zn contra a toxicidade do Cd para proteger o teor de clorofila e as funções de ambos os fotossistemas e do complexo de evolução do oxigênio. Os dados também revelaram que as folhas das plantas de sálvia esclaréia submetidas ao tratamento combinado apresentam uma capacidade antioxidante aumentada, atribuída ao maior teor de compostos polifenólicos. Além disso, a microscopia de luz indicou mais alterações na morfologia foliar após o tratamento apenas com Cd do que após o tratamento combinado. O presente estudo mostra que o excesso de Zn pode mitigar a toxicidade do Cd em plantas de sálvia esclaréia.
Introdução
A contaminação e o acúmulo de metais pesados no ambiente, onde sua biodisponibilidade pode ser alta, é um problema ambiental importante em todo o mundo. Alguns metais, como o cádmio (Cd), não têm função metabólica nas plantas e podem induzir sintomas de toxicidade dependendo das concentrações, espécies de plantas, etc. A presença de Cd em altas concentrações nas plantas pode reduzir o crescimento vegetal devido à diminuição do teor de clorofila e da taxa fotossintética. A toxicidade do Cd também pode causar alterações na composição lipídica das membranas dos tilacoides e na ultraestrutura dos cloroplastos. Além disso, pode causar distúrbios na anatomia, clorose ou necrose, e pode até causar a morte da planta. Adicionalmente, a toxicidade induzida pelo Cd e os danos celulares são causados pelo acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ERO). Portanto, é importante estudar os mecanismos regulatórios e as respostas das plantas à toxicidade do Cd, o que é essencial para minimizar o risco na cadeia alimentar e facilitar ainda mais as práticas de fitorremediação em solos contaminados com Cd.
Outros elementos, como zinco (Zn), cobre (Cu), ferro (Fe), manganês (Mn), cálcio (Ca) e magnésio (Mg), são considerados oligoelementos essenciais ou nutrientes minerais para diversas funções estruturais e bioquímicas, como crescimento vegetal, transporte de elétrons, reações de oxirredução e muitas outras atividades metabólicas nas plantas. Em particular, o Zn é um elemento importante, pois regula processos fisiológicos e metabólicos, ou seja, é um cofator de muitas enzimas envolvidas na respiração e fotossíntese, na biossíntese de hormônios de crescimento vegetal, etc. Além disso, em baixas concentrações (abaixo de 300 µg g−1 de peso seco), o Zn pode influenciar favoravelmente o crescimento, o desenvolvimento e o desempenho de ambos os fotossistemas nas plantas. No entanto, em altas concentrações, pode competir com outros metais nos sítios de absorção, reduzindo a área foliar, causando fitotoxicidade e estresse oxidativo, clorose e até necrose vegetal. Ademais, o Zn é considerado o principal micronutriente para amenizar o efeito tóxico do Cd nas plantas e limitar sua entrada na cadeia alimentar. A adição de Zn a solos ou soluções nutritivas contendo Cd tem sido proposta como bem-sucedida na redução do acúmulo de Cd em plantas cultivadas, mas as respostas das plantas variam conforme o genótipo e a dose e duração da exposição ao Zn e ao Cd.
A acumulação de metais pesados em algumas plantas medicinais, coletadas perto de locais industriais, de mineração e agrícolas, foi encontrada em níveis elevados. Além disso, as plantas aromáticas têm atraído recentemente muita atenção como uma excelente opção para recuperação e fitorremediação sustentável devido à sua maior resistência e ao baixo risco de toxicidade dos produtos finais, já que não há risco de acumulação de metais perigosos durante a extração de óleos essenciais dessas plantas. A planta medicinal e aromática sálvia esclaréia (Salvia sclarea L.) é intensivamente explorada devido às suas amplas propriedades medicinais. É nativa de muitos países mediterrâneos e é cultivada como fonte de óleos essenciais para aplicações na medicina humana ou em produtos de perfumaria. Nossas investigações anteriores sugeriram que a sálvia esclaréia pode ser introduzida como uma planta hiperacumuladora de Cd quando exposta a altas concentrações de Cd (100 µM) por 8 dias em uma solução nutritiva, mas sofre danos na organização da membrana do tilacóide e consequente comprometimento da cadeia de transporte de elétrons fotossintéticos. O tratamento com excesso (900 µM) de Zn revelou que a sálvia esclaréia tolera altos níveis tóxicos de Zn em seus tecidos e mantém a função fotossintética, chegando até a estimular as atividades do fotossistema I (PSI) e do fotossistema II (PSII). Outro estudo recente sobre a co-exposição da sálvia esclaréia a altas concentrações de Cd e Zn mostrou que a aplicação de excesso de Zn aliviou efetivamente a toxicidade induzida por Cd, reduzindo a absorção de Cd pela metade e diminuindo sua concentração nas folhas. Concomitantemente, também foi demonstrado que o excesso de Zn mitiga o estresse oxidativo induzido por Cd, retém parcialmente a ultraestrutura do cloroplasto da sálvia esclaréia e protege a fotoquímica do PSII à medida que reduz o excesso de energia de excitação no PSII (EXC). Clairvil et al. também mostraram que a co-exposição in vitro a Cd e Zn em plantas de Alternanthera tenella pode permitir a desintoxicação induzida por Cd e o funcionamento adequado do aparato fotossintético.
O potencial recentemente proposto da sálvia esclareia (S. sclarea) para a fitoextração de Cd e Zn de solos poluídos por metais pesados demonstra a necessidade de elucidar os mecanismos moleculares e as estratégias de tolerância desta erva medicinal quando exposta simultaneamente a altas concentrações de Cd e Zn, uma vez que os solos industriais e agrícolas geralmente são contaminados por vários metais pesados. Assim, o objetivo do presente estudo foi fornecer uma exploração detalhada da absorção de elementos nutrientes, do grau de dano à membrana e da fluidez da membrana, da anatomia foliar, da atividade antioxidante, dos teores totais de fenóis e pigmentos, e das funções dos dois fotossistemas e do complexo de evolução do oxigênio (CEO) na sálvia esclareia sob co-exposição a excesso de Zn e Cd em condições hidropônicas. Essas investigações fornecem conhecimento adicional sobre os mecanismos de defesa e o papel do excesso de Zn na redução da toxicidade do Cd nesta planta medicinal. Tendo em mente que a qualidade dos óleos essenciais não é afetada por metais pesados, a pesquisa neste estudo é importante para garantir a proteção e o cultivo sustentável desta valiosa planta de uso duplo para aplicações farmacêuticas e a fitorremediação de solos contaminados com metais pesados.Materiais e Métodos
2.1. Material Vegetal, Condições de Cultivo e Tratamentos com Metais Pesados
Sementes de sálvia esclareia (Salvia sclarea L.) gentilmente fornecidas pela Bio Cultures Ltd. (Karlovo, Bulgária) foram utilizadas para os experimentos. Após a germinação em solo por cerca de um mês, as mudas foram transferidas para recipientes de 1 L com aeração contínua e trocadas a cada 3 dias com uma solução nutritiva de Hoagland modificada a meia força (½) contendo o seguinte: 1,5 mM KNO3, 1,5 mM Ca(NO3)2, 0,5 mM NH4NO3, 0,5 mM MgSO4, 0,25 mM KH2PO4, 50 μM NaFe(III)EDTA, 23 μM H3BO3, 5 μM ZnSO4, 4,5 μM MnCl2, 0,2 μM Na2MoO4 e 0,2 μM CuSO4 (pH 6,0, CE = 1,03 dS m−1) conforme descrito anteriormente. As condições da sala de crescimento foram fotoperíodo de 14/10 h dia/noite e temperatura de 24/20 °C dia/noite, com densidade de fluxo de fótons de 200 ± 20 µmol fótons m−2 s−1. Após um mês em cultura hidropônica, os recipientes com plantas foram divididos em três grupos, e cada grupo foi submetido por 8 dias a: (1) solução nutritiva de Hoagland ½ (controle); (2) solução nutritiva de Hoagland ½ com 100 μM de Cd (fornecido como CdSO4) mais 900 μM de Zn (fornecido como ZnSO4) (tratamento combinado de Cd + Zn); ou (3) solução nutritiva de Hoagland ½ com 100 μM de Cd (tratamento apenas com Cd). As concentrações e a duração dos tratamentos com Cd e Zn foram baseadas em nossos estudos anteriores. Quando as plantas de S. sclarea foram expostas a 100 μM de Cd por 8 dias, observou-se uma inibição da funcionalidade do PSII, mas ocorreu uma funcionalidade aprimorada do PSII no mesmo período de exposição a 900 μM de Zn. Assim, neste estudo, utilizamos a exposição simultânea a 100 μM de Cd e 900 μM de Zn por 8 dias para observar qualquer efeito atenuador do Zn contra a toxicidade do Cd.
2.2. Determinação das Concentrações de Elementos Traço por Espectrometria de Massas com Plasma Indutivamente Acoplado (ICP-MS)
A determinação de elementos traço nos tecidos de sálvia esclaréia após os tratamentos de 8 dias (controle, apenas Cd, e Cd + Zn) foi realizada conforme descrito anteriormente. Amostras secas foram digeridas em um sistema de micro-ondas com vaso fechado (Ethos One, Milestone Srl, Sorisole, Itália). As amostras de tecido digeridas foram analisadas usando espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) modelo ELAN DRC II (PerkinElmer Sciex, Toronto, Canadá), e as condições, configurações instrumentais, soluções de calibração, validação de dados e parâmetros de validação foram conforme descrito em. A análise elementar foi realizada para os íons Fe, Ca, Mg, Cu e Mn.
O fator de translocação (FT) foi calculado como a razão entre a concentração elementar na parte aérea e a concentração nas raízes.
2.3. Microscopia de Luz e Espessura Foliar
Segmentos foliares de plantas submetidas a diferentes tratamentos foram fixados quimicamente, seccionados e corados, e as seções foram observadas conforme relatado em Dobrikova et al.. As medições da espessura foliar a partir de seções transversais de folhas, obtidas de cinco folhas individuais em cada tratamento, foram realizadas usando o software ZEN 2.0 (Carl Zeiss, Munique, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.
2.4. Determinação do Índice de Estabilidade da Membrana, Peroxidação Lipídica e Capacidade Antioxidante Total
O índice de estabilidade da membrana celular foliar (MSI) foi estimado a partir das medições de extravasamento de eletrólitos descritas anteriormente. Folhas completamente expandidas de diferentes plantas foram cortadas em pedaços (cerca de 3–4 cm²) e depois incubadas em tubos com 40 mL de água destilada por 24 h em um agitador à temperatura ambiente. Após isso, a condutividade elétrica das soluções (EC1) foi medida usando um condutivímetro (Hydromat LM302, Witten, Alemanha). Em seguida, as amostras foram fervidas por 30 min e resfriadas à temperatura ambiente para determinar a condutividade elétrica final (EC2). Os valores de MSI foram calculados usando a seguinte equação: MSI = [1 − (EC1/EC2)] × 100.
A determinação dos níveis de peroxidação lipídica (LP) foi realizada pela estimativa do conteúdo de MDA conforme descrito por Mostofa et al.. A capacidade antioxidante total foi avaliada pelos ensaios de DPPH• (atividade sequestradora de radicais livres) e FRAP (poder antioxidante redutor do ferro) de extratos metanólicos de folhas de plantas de sálvia esclareia tratadas de forma diferente, conforme descrito em. O radical DPPH é um radical estável com absorção máxima a 517 nm que pode prontamente sofrer redução por um antioxidante, e o grau de descoloração indica o potencial de sequestro dos antioxidantes. Os resultados foram expressos como inibição do radical livre DPPH em porcentagens usando a seguinte equação: I (%) = (Abranco − Aamostra/Abranco) × 100, onde Abranco é a absorbância da reação controle (contendo todos os reagentes exceto os extratos vegetais), e Aamostra é a absorbância do extrato teste. O método FRAP baseia-se na redução de um complexo férrico-tripiridil triazina à sua forma ferrosa colorida na presença de antioxidantes. Para a análise FRAP, as amostras foram medidas a 595 nm e o potencial antioxidante dos extratos foi determinado a partir de uma curva padrão, plotada usando a regressão linear de FeSO4, e os valores foram expressos como μmol Fe2+ por g de peso seco (PS). Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
2.5. Análise de Pigmentos Foliares e Conteúdo Fenólico Total
As medições de clorofila total (Chl a+b) e carotenoides (Car) foram realizadas conforme descrito anteriormente em detalhe, usando um espectrofotômetro (Specord 210 Plus, Ed. 2010, Analytik Jena AG, Alemanha). Para estimativa dos conteúdos de antocianinas e fenóis totais, as amostras de folhas congeladas (0,1 g) foram extraídas com 10 mL de metanol acidificado (HCl a 1%) no escuro a 0–4 °C por 2 dias. O conteúdo fenólico total foi determinado usando o método colorimétrico de Folin–Ciocalteu e medido espectrofotometricamente a 765 nm de acordo com o método de Sripakdee et al.. O conteúdo fenólico foi expresso como mg de equivalente de ácido gálico (EAG) por g de peso fresco (PF) de tecidos foliares. As antocianinas foram estimadas espectrofotometricamente a 535 e 657 nm conforme descrito em Dobrikova et al.. O conteúdo de antocianinas foi expresso como mg de equivalente de cianidina-3-glicosídeo por g de PF. Os valores médios (±DP) foram calculados a partir de três tratamentos independentes com três repetições para cada tratamento.
2.6. Análise de Fluorescência da Clorofila
Folhas adaptadas ao escuro (20 min) de plantas de S. sclarea controle, tratadas com 100 μM de Cd e com 100 μM de Cd + 900 μM de Zn foram utilizadas para a análise de fluorescência da clorofila utilizando um sistema Imaging PAM M-Series (Heinz Walz Instruments, Effeltrich, Alemanha), conforme descrito em detalhes anteriormente. Os parâmetros de fluorescência da clorofila calculados pelo software Imaging Win V2.41a (Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Alemanha) foram a eficiência máxima da fotoquímica do FSII (Fv/Fm), a taxa relativa de transporte de elétrons do FSII (ETR = ΦFSII × PAR × c × abs, onde PAR é a radiação fotossinteticamente ativa, c é 0,5 e abs é a absorção total de luz pela folha considerada como 0,84) e a eficiência do complexo evolutivo de oxigênio (OEC) no lado doador do FSII (Fv/Fo).
2.7. Medições da Evolução de Oxigênio
A evolução de oxigênio induzida por flash de membranas de tilacoides isoladas de folhas de sálvia esclaréia após 8 dias de tratamento das plantas (controle, apenas Cd e tratamento combinado (Cd + Zn)) foi medida utilizando um eletrodo polarográfico de taxa de oxigênio tipo Joliot construído em casa, sem um aceptor artificial de elétrons. As membranas dos tilacoides foram isoladas e os rendimentos de oxigênio induzidos por flash (Yi) foram medidos conforme descrito. De acordo com o modelo de Kok, o cluster Mn4Ca do OEC passa por cinco estados redox intermediários (S0–S4) no mesmo centro de reação do FSII para produzir uma molécula de oxigênio. No escuro, apenas os estados S0 e S1 são estáveis, portanto, a distribuição inicial dos estados S0/S1 e a porcentagem de falhas (α) foram calculadas a partir dos rendimentos de oxigênio induzidos por flash obtidos experimentalmente, utilizando um programa de computador do modelo de Kok. O parâmetro SB (correspondente à quantidade de centros FSII bloqueados) foi obtido usando uma versão cinética estendida do modelo de Kok (para detalhes, veja). O SB pode retornar ao estado S0 com liberação das moléculas de oxigênio aceitas: KA.SB → S0 + O2, onde KA é a constante de taxa de ativação.
2.8. Medições do Estado Redox do P700 e da Microviscosidade
A oxidação dos centros de reação do FSI (P700) a P700+ e a consequente redução no escuro do P700+, um indicador de mudanças redox do P700, foram medidas in vivo acompanhando os transientes de absorbância induzidos por luz vermelha distante (FR) a 830 nm (ΔA830) utilizando um fluorômetro PAM-101/103 (Walz, Effeltrich, Alemanha) equipado com um emissor-detector ED-800T. As medições foram realizadas em folhas adaptadas ao escuro utilizando luz FR fornecida por um fotodiodo (102-FR, Walz). A extensão da oxidação induzida por FR do P700 a P700+ foi estimada como a razão relativa ΔA/A830, onde ΔA foi a mudança de absorbância induzida por FR e A830 foi a absorbância no escuro. A capacidade do fluxo de elétrons cíclico ao redor do FSI foi estimada pela cinética da redução no escuro do P700+ após desligar a luz FR, conforme mostrado anteriormente.
A microviscosidade relativa (η) das membranas dos tilacoides foi investigada por meio da polarização de fluorescência da sonda lipofílica fluorescente 1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno (DPH), utilizando um espectrômetro de fluorescência (JASCO FP-8300, Tóquio, Japão) conforme descrito no trabalho de Dobrikova e Apostolova.
2.9. Estatística
Os valores médios (±DP) foram calculados a partir de três tratamentos independentes com três réplicas cada e as diferenças estatisticamente significativas entre as médias foram determinadas usando uma análise de ANOVA unifatorial. Os valores médios foram considerados estatisticamente diferentes após o teste post-hoc de diferença mínima significativa de Fisher, utilizando o software Origin 9.0 (OriginLab, Northampton, MA, EUA). Antes de realizar a ANOVA, os pressupostos de normalidade da distribuição dos dados (pelos testes de Shapiro–Wilk) e homogeneidade das variâncias (pelo teste de Levene) foram verificados conforme descrito anteriormente. A análise estatística para cada medição é relatada na legenda da figura e tabela correspondente.
- Resultados
3.1. Conteúdo de Elementos Traço em Tecidos Vegetais
Os efeitos do excesso (900 µM) de Zn fornecido à exposição a 100 µM de Cd na absorção de elementos nutrientes selecionados (Figura 1) e sua translocação (Figura 2) em S. sclarea foram estudados. Em comparação com as plantas controle, o tratamento combinado com Zn e Cd resultou em uma redução na acumulação de íons Ca tanto nas raízes quanto nas folhas (p < 0,01), enquanto a acumulação de Mg diminuiu nas raízes, mas aumentou nas folhas (p < 0,05, Figura 1a,b). Isso foi devido à translocação mais pronunciada de íons Mg para as folhas (cerca de duas vezes) do que a de íons Ca (cerca de 1,2 vezes) (Figura 2). Além disso, as translocações dos íons Ca e Mg (também seus conteúdos foliares) foram significativamente mais aumentadas após o tratamento combinado do que no controle e no tratamento apenas com Cd (Figura 2).
Além disso, os resultados demonstraram que a absorção dos outros elementos (Fe, Cu, Mn) aumentou nas raízes (Figura 1c), mas sua translocação para as folhas diminuiu após ambos os tratamentos combinado e apenas com Cd em comparação com o controle (Figura 2). Nas folhas, após o tratamento combinado, apenas um aumento na acumulação de íons Mg (em 8%, p < 0,05) e Fe (em 18%, p < 0,05) foi observado em comparação com o controle (Figura 1b,d). Os dados para o tratamento apenas com Cd são fornecidos na Tabela Suplementar S1.
3.2. Características Anatômicas Foliares
Os dados mostraram que o tratamento apenas com Cd afetou a anatomia foliar de S. sclarea, e uma redução notável nos espaços intercelulares e um acúmulo de grânulos osmiófilos nas células epidérmicas adaxiais estavam presentes (Figura 3c). O tratamento combinado (Cd + Zn) levou a um aumento no acúmulo de grânulos osmiófilos em ambas as epidermes foliares (Figura 3b2). Além disso, as folhas tratadas com Cd + Zn aumentaram em espessura (Figura 3d), enquanto não apresentaram nenhum dos sintomas de toxicidade do Cd no mesófilo paliçádico (compare a Figura 3c2 com a Figura 3b2), indicando que a aplicação de excesso de Zn amenizou a toxicidade do Cd em S. sclarea.
3.3. Danos na Membrana e Capacidade Antioxidante
Medições do índice de estabilidade da membrana celular (MSI) das folhas foram realizadas para avaliar a extensão dos danos na membrana nas folhas de S. sclarea em resposta à exposição ao Cd, com ou sem suprimento excessivo de Zn. Os resultados mostraram que o MSI foi reduzido em cerca de 33% após o tratamento apenas com Cd, enquanto o tratamento combinado com excesso de Zn e Cd causou apenas uma diminuição de 15,6% em comparação ao controle (Tabela 1). A capacidade antioxidante dos extratos foliares de S. sclarea após os diferentes tratamentos foi avaliada tanto pela atividade de captura de radicais livres (ensaio DPPH) quanto pela atividade antioxidante total (análise FRAP), e os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 1. Os dados revelaram que a capacidade antioxidante total (FRAP, capacidade redutora de antioxidantes contra o estresse oxidativo) dos extratos foliares de S. sclarea aumentou após a exposição aos metais pesados em comparação às condições de controle (Tabela 1). Além disso, entre os extratos estudados, após o tratamento combinado com excesso de Zn e Cd, observou-se uma maior atividade antioxidante (157% dos valores de controle), seguida pelos tratados apenas com Cd (134% dos valores de controle). Uma tendência semelhante foi observada para a atividade antioxidante avaliada pelo DPPH.
3.4. Evolução Fotossintética do Oxigênio
Os padrões de oscilação dos rendimentos de oxigênio induzidos por sequências de flashes saturados aplicados a membranas de tilacoides adaptadas ao escuro, isoladas das folhas de plantas controle, tratadas apenas com Cd e tratadas de forma combinada (Cd + Zn), são apresentados na Figura 4a.
Foi observado que a inibição dos rendimentos de oxigênio dos flashes foi menos perceptível após o tratamento combinado do que após o tratamento apenas com Cd. A partir da análise detalhada dos padrões de oscilação realizada utilizando a versão cinética estendida do modelo de Kok, foram obtidos valores para as quantidades de centros do PSII no estado S0 inicial adaptado ao escuro (S0 (%) = 100–S1), os centros do PSII bloqueados (SB) e as falhas (α) (Figura 4b). Os parâmetros mencionados acima são indicadores apropriados para mudanças no aglomerado de Mn do OEC. Os resultados revelaram que o tratamento apenas com Cd causou um aumento mais forte no número de centros do PSII no estado S0 inicial (em 22%), nos centros do PSII bloqueados (em 45%) e nas falhas (em 46%), enquanto a exposição combinada diminuiu essas mudanças. Medições do transporte de elétrons dependente do PSII das membranas tilacoides isoladas com um eletrodo tipo Clark mostraram uma tendência semelhante para o efeito do fornecimento de Zn na inibição induzida por Cd (dados não mostrados). A análise dos rendimentos de oxigênio dos flashes revelou sequências periódicas características com uma evolução máxima de oxigênio após o terceiro flash (Y3). Em comparação com as plantas controle, os rendimentos de oxigênio diminuíram ligeiramente após a exposição combinada e mostraram amortecimento mais pronunciado após a exposição apenas ao Cd (Figura 4a). Além disso, os dados demonstraram que o máximo observado após o 3º flash (Y3) nas plantas controle e de tratamento combinado mudou para o 4º flash após o tratamento apenas com Cd (Figura 4a).
3.5. Pigmentos Foliares e Conteúdo Fenólico Total
Em relação ao conteúdo total de clorofila (Chl a+b) e carotenoides (Car) nas folhas de sálvia esclareia, o tratamento apenas com Cd causou uma diminuição nesses pigmentos em comparação com as folhas controle, enquanto o tratamento combinado com Zn e Cd aliviou essa redução (Figura 5). Além disso, a exposição a metais pesados causou um aumento mais pronunciado nas antocianinas foliares e no conteúdo fenólico total (TPC), sendo que o tratamento apenas com Cd teve um efeito mais forte nas antocianinas, enquanto o TPC aumentou mais após o tratamento combinado (Cd + Zn).
3.6. Mudanças nos Parâmetros de Fluorescência da Clorofila
A eficiência máxima do PSII (Fv/Fm) e a eficiência do OEC (Fv/Fo) diminuíram 3% (p < 0,05) e 15%, respectivamente, nas plantas de S. sclarea tratadas apenas com Cd, mas o fornecimento excessivo de Zn na solução nutritiva aumentou ambos para o nível das plantas controle (Tabela 2). A taxa de transporte de elétrons relativa do PSII (ETR) também diminuiu sob tratamento com Cd, enquanto a suplementação de Zn na solução nutritiva resultou em uma ETR mais alta, mesmo para as plantas controle.
3.7. Cinética de Fotooxidação e Redução do P700
A análise das mudanças na oxidação em estado estacionário de P700 para P700+ e nas cinéticas de decaimento após desligar a luz FR foram utilizadas para caracterizar a atividade fotoquímica do PSI. As mudanças relativas em P700+ (ΔA/A830) para as plantas controle e tratadas são mostradas na Tabela 3. Os dados mostraram que o tratamento apenas com Cd causou uma diminuição na quantidade de P700+ (em 10,6%, p < 0,05), enquanto aumentou ligeiramente (em 9%, p < 0,05) após a exposição combinada (Cd + Zn) em comparação ao controle. As cinéticas de redução no escuro de P700+ foram ajustadas por dois componentes de decaimento exponencial, rápido (com constante de taxa k1) e lento (com constante de taxa k2), conforme mostrado anteriormente. Os resultados mostraram que o tratamento apenas com Cd causa um aumento significativo (p < 0,01) nas constantes de taxa rápida e lenta da redução no escuro de P700+ (ou seja, os tempos de redução no escuro diminuíram) em comparação às plantas controle, enquanto o suprimento excessivo de Zn atenuou essas alterações. Além disso, esse aumento foi mais pronunciado para a constante k1 do que para k2, indicando que o Cd teve mais influência sobre o componente rápido da cinética de decaimento.
Além disso, os valores de microviscosidade (η) das membranas dos tilacoides também foram estimados medindo-se a polarização da fluorescência (P) da sonda fluorescente hidrofóbica DPH em membranas de tilacoides isoladas. Os dados mostraram que, em comparação ao controle, a microviscosidade relativa da membrana aumentou gradualmente após o tratamento combinado com excesso de Zn e Cd, seguido pelo tratamento apenas com Cd (Tabela 3). Os resultados obtidos aqui demonstram que os metais pesados alteram a fluidez das membranas dos tilacoides, pois o estresse por Cd aumentou a microviscosidade (η) das membranas dos tilacoides (ou seja, diminuiu a fluidez das membranas) em maior extensão do que após o tratamento com Zn (Tabela 3).
4. Discussão
Presume-se que a tolerância de espécies de plantas a metais pesados seja determinada, entre outros fatores, pela regulação da distribuição e homeostase iônica. A capacidade de absorção de elementos-traço, sua translocação eficiente das raízes para a parte aérea e a pronunciada habilidade de sequestrar metais são algumas das características que distinguem plantas tolerantes a metais pesados das sensíveis. Nossas investigações anteriores mostraram que a exposição de S. sclarea a 100 µM de Cd por 8 dias resultou em alta acumulação de Cd nas raízes e hiperacumulação nas folhas, acompanhadas por aumento na absorção de Zn, Fe, Ca e Mn pelas raízes, e aumento no teor de Fe (em 25%) e diminuição no teor dos outros elementos nas folhas. Dados publicados recentemente também revelaram que um excesso (900 µM) de Zn na solução nutritiva (com 100 µM de Cd) diminuiu a absorção de Cd e reduziu a acumulação de Cd tanto nas raízes quanto nas folhas. Além disso, o tratamento apenas com excesso de Zn demonstrou que os íons de Zn podem interferir na absorção de outros elementos-traço, levando a um aumento significativo na acumulação de íons de Fe e Cu nas raízes, e a um aumento na acumulação de íons de Fe, Mn e Ca nas folhas de S. sclarea, o que se pensa estar envolvido na estratégia protetora das plantas de sálvia esclareia contra altas concentrações de Zn. De forma semelhante, outros estudos relataram que, sob estresse excessivo de Zn, as folhas de uva (Vitis vinifera) retêm altos níveis de Fe, enquanto o teor de Fe e Mg na parte aérea do feno-grego não se altera.
Os resultados atuais demonstram que a aplicação de Zn em excesso é capaz de aliviar o efeito negativo do estresse por Cd na acumulação de íons em plantas de S. sclarea, uma vez que a coexposição ao Zn e Cd é acompanhada por uma translocação fortemente aumentada de íons Ca e Mg para as folhas em comparação com o tratamento apenas com Cd e com as plantas controle (Figura 2), levando a um maior teor de Mg nas folhas em comparação ao controle (Figura 1b). Além disso, em comparação com as plantas controle, uma captação de Fe fortemente aumentada pelas raízes e um maior teor de Fe nas folhas também foram observados após o tratamento combinado (Figura 1c,d). Os dados obtidos também mostraram que, em comparação com as plantas tratadas apenas com Cd nas mesmas condições [Tabela S1], a coexposição ao Cd e Zn levou a maiores quantidades de Ca (cerca de 17%), Mg (52%), Cu (50%) e Mn (53%) nas folhas de S. sclarea (Figura 1b,d). O aumento desses elementos nutrientes essenciais nas folhas de sálvia esclaréia após o tratamento combinado está muito provavelmente associado aos efeitos protetores de um suprimento excessivo de Zn para minimizar a toxicidade do Cd, uma vez que os cátions Fe, Ca, Mg e Mn têm papéis importantes na regulação (direta ou indiretamente) da eficiência fotossintética e da atividade de evolução de oxigênio, e são usados como cofatores em muitas enzimas. O aumento observado no teor de Fe nas folhas após os tratamentos apenas com Cd e apenas com Zn, e após o tratamento combinado (Cd + Zn) (Figura 1d) está muito provavelmente envolvido na estratégia de tolerância das plantas de S. sclarea contra o estresse por metais pesados, pois o Fe é um oligoelemento essencial necessário para a respiração e fotossíntese, bem como para muitas reações redox biológicas fundamentais. Além disso, foi proposto que a presença de excesso de Fe e Mn alivia a toxicidade do Cd e a inibição induzida por Cd da fotossíntese em Oryza sativa. No metabolismo vegetal, o Mn é mais conhecido por sua função no OEC, onde as mudanças nos estados de oxidação de vários íons Mn (estados redox S0–S4) no cluster Mn4Ca medeiam a divisão da água em prótons e oxigênio. Por outro lado, os cátions Ca também são necessários para o funcionamento normal do OEC e para a regulação das enzimas do ciclo de Calvin. Também foi proposto que o Ca desempenha um papel imperativo no controle da estrutura e função da membrana, pois estabiliza as bicamadas lipídicas que, consequentemente, fornecem integridade estrutural às membranas celulares. Além disso, o Cu é necessário para várias reações redox nas células vegetais, e sua limitação tem consequências negativas em todo o metabolismo, levando à diminuição do desempenho fotossintético e à redução do fluxo de elétrons do PSII para o PSI. Tudo o que foi exposto pressupõe que concentrações aumentadas desses elementos essenciais nos tecidos vegetais sob suprimento excessivo de Zn podem aliviar a toxicidade do Cd e sugere uma maior tolerância de S. sclarea após exposição combinada ao Zn e Cd.
Geralmente considera-se que a superprodução de EROs (O2 e H2O2) sob estresse por metais pesados (especialmente estresse por Cd) pode promover estresse oxidativo, causando peroxidação lipídica das membranas e ruptura de sua integridade, ou seja, perda de permeabilidade da membrana e da ultraestrutura dos cloroplastos. Nosso estudo recente mostrou que a aplicação excessiva de Zn eliminou os efeitos adversos da toxicidade induzida por Cd, reduzindo as concentrações de H2O2 e MDA nas folhas, levando à proteção da ultraestrutura dos cloroplastos e da eficiência fotoquímica do PSII. Da mesma forma, o estresse oxidativo mostrou-se reduzido em C. demersum após tratamentos com Zn e Cd, e em feijão-mungo após aplicação de nanopartículas de óxido de zinco (ZnO NPs) sob estresse por Cd. Os dados atuais também revelaram que a co-exposição a Zn e Cd leva a menor peroxidação lipídica e aumento da estabilidade da membrana celular foliar (MSI), e a uma maior capacidade antioxidante em comparação com plantas expostas apenas a Cd (Tabela 1). Como componente de enzimas antioxidantes, o Zn é essencial para a captura de H2O2 e O2•-, e, portanto, para a redução do estresse oxidativo. Além disso, foi demonstrado que a co-exposição a excesso de Zn e Cd leva a um aumento de 10 vezes no teor de Zn nas folhas de sálvia-esclareia em comparação com o tratamento apenas com Cd. Um aumento nas atividades de todas as enzimas antioxidantes também foi observado em plantas de feijão-mungo após aplicação de ZnO NPs sob estresse por Cd.
Plantas medicinais e ervas contêm sequestradores de radicais livres, como compostos fenólicos, que são responsáveis (entre outros) por prevenir as consequências deletérias do estresse oxidativo, que causa peroxidação lipídica e danos à membrana. Salinitro et al. demonstraram que o estresse por metais pesados produz quantidades aumentadas de metabólitos secundários nas folhas, que possuem atividade antioxidante. Foi sugerido que polifenóis e flavonoides têm propriedades antioxidantes devido à sua capacidade de atuar como agentes doadores de elétrons ou de formar complexos insolúveis com cátions metálicos, reduzindo suas concentrações celulares. Nesse aspecto, nossos dados mostraram um acúmulo aumentado de fenóis totais (antioxidantes não enzimáticos) nas folhas de S. sclarea induzido pela aplicação de metais pesados (noção também confirmada pela presença de material escuro nas folhas; Figura 3), já que os aumentos no TPC foram mais pronunciados após o tratamento combinado (Cd + Zn) do que na exposição apenas a Cd (Figura 5). Similarmente, um aumento no TPC também foi relatado para S. sclarea sob exposição excessiva a Zn e para Stellaria media sob estresse por Zn e Ni. Além disso, foi sugerido que plantas que produzem altas quantidades de compostos fenólicos sob estresse por metais pesados podem ser boas candidatas para fitorremediação, o que confirma o potencial de S. sclarea para esse fim.
Além disso, as antocianinas também apresentam alta atividade antioxidante, atuando como sequestradoras de peróxido de hidrogênio e ânions superóxido nos vacúolos. Além disso, podem formar complexos antocianina–metal(n+) no tecido vegetal para aliviar a toxicidade de metais pesados, armazenando metais nas camadas celulares periféricas. Curiosamente, os resultados mostraram que os teores desses pigmentos protetores foram mais pronunciados na exposição apenas ao Cd do que no tratamento combinado (Figura 5), mas não conseguem proteger totalmente as folhas do estresse oxidativo e da lesão de membrana induzidos pelo Cd (Tabela 1). Isso sugere que, apesar do aumento no teor de antocianinas, a quantidade de ROS formada excede a barreira protetora e não é suficiente para prevenir a toxicidade do Cd.
O fornecimento excessivo de Zn juntamente com o tratamento com Cd aumentou o TPC nas folhas (Figura 5), provavelmente devido a um aumento na expressão gênica da biossíntese de polifenóis e/ou estimulação da atividade da enzima fenilalanina amônia-liase (PAL). Aqui, estimamos a capacidade antioxidante total da sálvia esclaréia determinada pelos ensaios FRAP e DPPH (Tabela 1). Está bem estabelecido que os compostos fenólicos totais possuem atividades antioxidantes significativas e podem doar átomos de hidrogênio ao DPPH• e sequestrá-lo. O radical DPPH• estável é considerado um modelo de radical lipofílico estável amplamente utilizado para avaliar a capacidade de extratos vegetais de atuar como sequestradores de radicais livres ou doadores de hidrogênio e, assim, avaliar sua atividade antioxidante. No presente estudo, os extratos foliares de sálvia esclaréia apresentaram atividade de sequestro de radicais (DPPH) e capacidade antioxidante total (FRAP) apreciavelmente altas, que foram mais pronunciadas após o tratamento combinado do que no tratamento apenas com Cd (Tabela 1). Um aumento na capacidade antioxidante de cerca de 41% também foi observado quando a sálvia esclaréia foi tratada apenas com 900 µM de Zn. Essas observações implicam que a maior capacidade antioxidante de S. sclarea após a exposição combinada (Cd + Zn) se deve provavelmente aos maiores teores fenólicos (TPC) nas folhas de S. sclarea (Figura 5). Diversas investigações também demonstraram uma correlação positiva entre a atividade antioxidante e o teor de fenóis foliares em diferentes espécies de Salvia e outras plantas. Assim, um estudo anterior descobriu que o sequestro de H2O2 em plantas de sálvia (S. officinalis) cultivadas em solo contaminado com metais pesados era mais um processo não enzimático do que enzimático, como foi observado nas fracas atividades das enzimas antioxidantes.
Geralmente, a aplicação de metais pesados afeta a estrutura e a anatomia foliar. Em particular, como consequência do tratamento com Cd, muitas plantas apresentaram defeitos em sua estrutura/anatomia foliar. Por exemplo, folhas de ervilha sob aplicação de Cd mostraram distúrbios celulares caracterizados por um aumento no tamanho das células do mesofilo e uma redução nos espaços intercelulares, enquanto em folhas de salgueiro, as substâncias fenólicas foram acumuladas nas células epidérmicas da folha. Da mesma forma, os resultados atuais confirmam que o Cd afeta a anatomia foliar de S. sclarea, que exibiu uma redução notável nos espaços intercelulares e um acúmulo de grânulos osmiofílicos nos vacúolos das células epidérmicas adaxiais (Figura 3c). Isso pode estar relacionado ao aumento na quantidade de antocianinas e fenóis totais, pois eles podem formar complexos com cátions metálicos, armazenando assim metais nas camadas celulares periféricas. A aplicação excessiva de Zn após a exposição ao Cd em S. sclarea também causou o acúmulo de material escuro na epiderme superior, o que pode estar relacionado ao aumento dos compostos fenólicos. A estrutura das células do mesofilo paliçádico foi comprometida nas plantas tratadas apenas com Cd, enquanto após a exposição combinada (Cd + Zn), foi semelhante à observada nas plantas controle (Figura 3). Em outras plantas hiperacumuladoras de Cd, também foi constatado que as células epidérmicas e do mesofilo foliar são locais de maior acúmulo/armazenamento de Cd.
Os carotenoides, conhecidos como um dos protetores do aparelho fotossintético contra fotodanos, aumentaram ligeiramente (não estatisticamente) nas folhas de sálvia esclaréia após o tratamento combinado (Figura 5). A redução no teor de Chl (a+b) nas folhas das plantas tratadas apenas com Cd foi diminuída após o tratamento combinado (Figura 5), o que corresponde ao aumento observado no teor de Mg foliar (Figura 1b). Efeitos semelhantes nos pigmentos fotossintéticos foram encontrados em genótipos de arroz sob tratamentos combinados de Zn e Cd e em feijão-mungo após aplicação de NPs de ZnO sob estresse de Cd. Nossas investigações anteriores mostraram um teor de Chl a ligeiramente reduzido em folhas de plantas de S. sclarea expostas a 900 μM de Zn por 8 dias. Além disso, o presente estudo mostra o aumento na produção de fenóis totais e antocianinas combinado com uma redução concomitante nos níveis de pigmentos fotossintéticos (Figura 4), que são considerados biomarcadores de estados de estresse por metais pesados. Tudo isso indica uma atenuação da toxicidade induzida por Cd nas plantas após a aplicação excessiva de Zn.
Foi sugerido que a diminuição na atividade fotossintética sob estresse por Cd poderia ser devida a muitos fatores, como uma diminuição na biossíntese de clorofila, uma inibição das atividades enzimáticas no ciclo de Calvin, a influência da fluorescência da clorofila a e uma inibição do transporte de elétrons fotossintéticos. A diminuição induzida pelo metal pesado no conteúdo de clorofila nas folhas é proposta como sendo devida a uma inibição de enzimas importantes associadas à biossíntese de clorofila e/ou um comprometimento do fornecimento de íons Mg e Fe. No entanto, ao contrário das plantas de sálvia esclareia tratadas apenas com Cd (Tabela S1), descobrimos que os teores foliares de Mg e Fe aumentaram após a co-exposição das plantas a Zn e Cd na solução nutritiva (Figura 1b,d), sugerindo que a ligeira diminuição observada no conteúdo de clorofila foi principalmente devida a uma diminuição nas atividades de enzimas relacionadas à biossíntese de clorofila. Como os pigmentos fotossintéticos são importantes para a captura ideal de energia luminosa nas reações fotossintéticas, o conteúdo de clorofila nas folhas é um importante índice fisiológico diretamente relacionado à fotossíntese nas plantas.
É bem estabelecido que o valor ideal da eficiência máxima da fotoquímica do PSII (Fv/Fm) é cerca de 0,830 para plantas vigorosas. Em nosso experimento, os valores observados de Fv/Fm para as plantas de sálvia esclareia do controle e tratadas com a combinação (Cd + Zn) foram 0,827 e 0,828, respectivamente, indicando que as plantas estavam saudáveis e não sofrendo estresse (Tabela 2). As plantas tratadas apenas com Cd apresentaram uma ligeira diminuição no valor de Fv/Fm, indicativa de uma fotoinibição leve. Os resultados atuais da análise de fluorescência da clorofila a mostraram que as plantas de sálvia esclareia co-expostas a excesso de Zn e Cd exibiram melhor atividade do PSII em termos de Fv/Fm, ETR e eficiência do OEC (Fv/Fo) em comparação com as plantas tratadas apenas com Cd (Tabela 2). Isso está de acordo com nossas descobertas recentes sobre os efeitos protetores do excesso (900 µM) de Zn na inibição induzida por Cd da fotoquímica do PSII (em alta intensidade de luz), pois reduz o excesso de energia de excitação no PSII. Além disso, verificou-se que o tratamento apenas com excesso de Zn manteve a função fotossintética e até estimulou as atividades do PSI e PSII.
Além disso, os resultados atuais mostram uma ligeira diminuição nos rendimentos de oxigênio induzidos por flash após o tratamento combinado com excesso de Zn e Cd e um amortecimento mais pronunciado após a exposição apenas ao Cd, em comparação com o controle (Figura 4a). A diminuição nos rendimentos de oxigênio por flash sugere uma redução nos centros ativos do PSIIα que evoluem oxigênio (localizados nos domínios granais), o que está de acordo com dados recentes sobre mudanças na ultraestrutura dos cloroplastos e no empilhamento dos grana, ou seja, foi mais severa após o tratamento apenas com Cd e menos acentuada após o tratamento combinado com excesso de Zn e Cd. Além disso, os resultados atuais também revelaram danos no lado doador do PSII ao redor do OEC, uma vez que o máximo observado após o 3º flash (Y3) no controle e nas plantas co-expostas a Zn e Cd deslocou-se para o 4º flash após o tratamento apenas com Cd (Figura 4a). Isso indica um aumento nos centros do PSII no estado S0 mais reduzido, relacionado ao estado de oxidação mais baixo do cluster de Mn no OEC (Figura 4b). Essa descoberta está de acordo com as observações de Schansker et al., sugerindo a modificação ou destruição do cluster de Mn do OEC. Alterações semelhantes no OEC foram observadas em plantas de trigo sob estresse por Cd. Portanto, nossos dados revelaram que o tratamento apenas com Cd leva a um aumento nos centros do PSII bloqueados, uma forte diminuição nos centros do PSIIα funcionalmente ativos nos domínios dos grana e a uma quantidade aumentada de centros do PSII no estado S0 mais reduzido, enquanto o suprimento excessivo de Zn mitiga esses efeitos. A proteção do cluster Mn4Ca após a aplicação excessiva de Zn também pode ser devida ao aumento do teor de íons Mn e Ca nas folhas de S. sclarea em comparação com as plantas tratadas apenas com Cd. Além disso, nenhuma alteração foi detectada no OEC após o tratamento apenas com 900 µM de Zn. A foto-oxidação de P700 a P700+ induzida por luz FR foi utilizada para caracterizar a atividade fotoquímica do PSI. Foi proposto que os dois componentes da cinética de redução no escuro do P700+ são devidos a uma redução em dois pools diferentes de PSI localizados em diferentes domínios das membranas dos tilacoides: o transporte linear de elétrons (com uma constante k2) ocorrendo nos domínios granais e o transporte cíclico de elétrons ao redor do PSI (com uma constante k1) ocorrendo nas lamelas do estroma. Além disso, a via de operação rápida poderia ser impulsionada por enzimas localizadas nas lamelas do estroma, enquanto as enzimas que medeiam a via lenta estão nos tilacoides dos grana.
As constantes de velocidade da redução no escuro mostraram um aumento nas folhas das plantas de sálvia tratadas apenas com Cd em comparação ao controle (Tabela 3), pois as mudanças em ambas as constantes (k1 e k2) após o tratamento com Cd, com e sem excesso de Zn, evidenciam uma influência em ambas as populações de PSI (nas lamelas do estroma e na margem dos grana). Além disso, esse aumento foi mais pronunciado para k1 do que para k2, indicando que a toxicidade do Cd tem maior influência no componente rápido da cinética de decaimento (ou seja, aumentando o transporte cíclico de elétrons ao redor do PSI nas lamelas do estroma). Uma razão para isso pode ser as mudanças estruturais na organização das membranas dos tilacoides, que foi observada recentemente para os mesmos tratamentos. Também foi demonstrado que, nas plantas tratadas apenas com Cd, a ultraestrutura do cloroplasto foi comprometida e as membranas dos tilacoides ficaram desordenadas/desempilhadas, enquanto um suprimento excessivo de Zn preveniu parcialmente esses efeitos.
As fortes mudanças observadas na microviscosidade das membranas dos tilacoides após exposição apenas ao Cd podem resultar de alterações nos conteúdos lipídicos e na composição de ácidos graxos. Estudos anteriores demonstraram uma diminuição no grau de insaturação dos ácidos graxos na membrana do cloroplasto causada pelo Cd e um aumento concomitante no conteúdo proteico. Supõe-se que as mudanças no grau de insaturação lipídica das membranas sejam devidas à peroxidação lipídica direta ou à influência da atividade das dessaturases.
5. Conclusões
O presente estudo demonstrou que a aplicação de excesso de Zn juntamente com a exposição ao Cd em condições hidropônicas aliviou a toxicidade do Cd em sálvia esclareia (S. sclarea) ao aumentar: (i) a capacidade antioxidante; (ii) o teor foliar de fenóis totais e clorofilas totais; (iii) a absorção e translocação de íons Fe, Ca, Mg, Cu e Mn, resultando em seu aumento no teor foliar, mitigando os efeitos adversos do Cd na função fotossintética e na atividade de evolução de oxigênio (Figura 6). Pode-se propor que esses mecanismos estejam envolvidos na desintoxicação do Zn e na proteção contra danos estruturais e funcionais induzidos pelo Cd nas membranas fotossintéticas. Em resumo, nossos resultados revelam que a co-exposição ao Zn e ao Cd alivia as alterações induzidas pelo Cd na anatomia foliar, lesão e fluidez das membranas, atividades fotoquímicas do PSI e PSII, e a função do complexo de evolução de oxigênio em plantas de sálvia esclareia.
O presente estudo destaca o potencial de S. sclarea tanto em aplicações farmacêuticas quanto na fitorremediação ou fitoextração de solos contaminados com Zn e Cd.
Nota do Editor: A MDPI permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Materiais Suplementares
As seguintes informações de suporte podem ser baixadas em: , Tabela S1: Conteúdo dos elementos traço nos tecidos de Salvia sclarea determinado após 8 dias de exposição apenas a 100 µM de Cd.
Contribuições dos Autores
Conceitualização, A.D. e M.M.; metodologia, A.D., E.A., I.S., I.-D.S.A., A.H. e M.M.; software, A.D., A.H. e M.M.; validação, A.D. e M.M.; análise formal, A.D., E.A., I.S., I.-D.S.A., A.H. e M.M.; investigação, A.D., I.S., I.-D.S.A. e A.H.; recursos, I.-D.S.A., A.D., E.A., A.H. e M.M.; curadoria de dados, I.S., I.-D.S.A., A.D., A.H. e M.M.; redação—preparação do rascunho original, A.D.; redação—revisão e edição, E.A., I.-D.S.A., A.H., A.D. e M.M.; supervisão, A.D. e M.M.; administração do projeto, A.D. e M.M. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados apresentados neste estudo estão disponíveis neste artigo.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Desvendando a toxicidade do cádmio em plântulas de Trifolium repens L.: Visão sobre mecanismos regulatórios usando transcriptômica comparativa combinada com análises fisiológicas
Danos e proteção do aparato fotossintético sob estresse por cádmio
Fitotoxicidade, Tolerância e Abordagens Avançadas de Remediação do Cádmio em Solos Agrícolas; Uma Revisão Abrangente
Alterações induzidas por cádmio no crescimento e metabolismo oxidativo de plantas de ervilha
Minimização de cádmio no trigo: Uma revisão crítica
O gene codificador de DELLA mutante do trigo (Rht-B1c) afeta as respostas fotossintéticas das plantas ao estresse por cádmio
Respostas horméticas rápidas da fotoquímica do fotossistema II da sálvia esclaréia à exposição ao cádmio
Alterações ultraestruturais e lipídicas induzidas por cádmio em membranas de cloroplastos de tomate (Lycopersicon esculentum)
Alterações induzidas por cádmio na composição lipídica da membrana de plantas de milho
Respostas fotossintéticas, antioxidativas, moleculares e ultraestruturais de plantas jovens de cacau à toxicidade do Cd no solo
Acumulação subcelular de O2.− e H2O2 induzida por Cd em folhas de ervilha
Fitoextração efetiva de cádmio (Cd) com concentração crescente de fenóis totais e prolina livre em plantas de Cannabis sativa (L) sob vários tratamentos de fertilizantes, reguladores de crescimento vegetal e sal de sódio
Zinco e cádmio como fatores moduladores das respostas morfofisiológicas de Alternanthera tenella Colla (Amaranthaceae) sob condições in vitro
Níveis de metais pesados e status de nutrientes minerais em diferentes partes de várias plantas medicinais coletadas na região do Mediterrâneo Oriental da Turquia
Introdução, definição e classificação de nutrientes
Zinco em plantas — Uma visão geral
A regeneração in vitro de plantas de Ocimum basilicum L. é acelerada pelo sulfato de zinco
Zinco, nanopartículas de zinco e plantas
Acumulação de cádmio-zinco e respostas do fotossistema II de Noccaea caerulescens à exposição a Cd e Zn
Demais é ruim — Uma avaliação da fitotoxicidade de íons de metais pesados benéficos para plantas em níveis elevados
Efeitos tóxicos de Cd e Zn no aparato fotossintético de pseudo-metalófitas Arabidopsis halleri e Arabidopsis arenosa
Interações zinco-cádmio: Impacto na fisiologia do trigo e na aquisição de minerais
Eficácia da aplicação de zinco para minimizar a toxicidade e acumulação de cádmio no trigo (Triticum aestivum L.)
Crescimento, partição de metais e atividades de enzimas antioxidantes de feijão-mungo influenciadas por nanopartículas de óxido de zinco sob estresse por cádmio
O zinco alivia a toxicidade do cádmio modulando a fotossíntese, a homeostase de EROs e a cinética do fluxo de cátions no arroz
Avaliação do potencial de fitorremediação de plantas aromáticas: Uma revisão sistemática
Atividades farmacológicas e aplicações dos óleos essenciais de Salvia sclarea e Salvia desoleana
Composição química e atividades biológicas do óleo essencial de plantas de Salvia sclarea regeneradas in vitro
Avaliação de algumas espécies turcas de Salvia por análise de componentes principais com base em sua vitamina B2, composição mineral e propriedades antioxidantes
Toxicidade do cádmio em Salvia sclarea L.: Uma resposta integrativa da absorção de elementos, marcadores de estresse oxidativo, estrutura foliar e fotossíntese
Mecanismos de tolerância da planta aromática e medicinal Salvia sclarea L. ao excesso de zinco
O excesso de zinco reduz a absorção de cádmio e mitiga os efeitos tóxicos do cádmio na estrutura dos cloroplastos, no estresse oxidativo e na eficiência fotoquímica do fotossistema II em plantas de Salvia sclarea
Potencial de Salvia sclarea L. para fitorremediação de solos contaminados com metais pesados
Mecanismos baseados na estabilidade da membrana celular foliar do nutriente zinco na mitigação do estresse salino em arroz
O ácido salicílico alivia a toxicidade do cobre em plântulas de arroz (Oryza sativa L.) regulando positivamente os sistemas antioxidante e de glioxalase
Determinação da capacidade antioxidante de espécimes de Sideritis scardica coletados em diferentes regiões, C.R.
Determinação de fenóis totais e ácido ascórbico relacionados à atividade antioxidante e estabilidade térmica do suco de fruta Mao
O alto acúmulo de antocianinas nas folhas de poinsétia é acompanhado pelo desempilhamento da membrana do tilacoide, atuando como mecanismo fotoprotetor para prevenir a formação de ROS
Fluorescência da clorofila como indicador não intrusivo para avaliação rápida da fotossíntese in vivo
A simbiose micorrízica arbuscular aumenta a fotossíntese na erva medicinal Salvia fruticosa ao melhorar a fotoquímica do fotossistema II
Mudanças na utilização da energia luminosa no fotossistema II e na geração de espécies reativas de oxigênio em folhas de batata pela traça Tuta absoluta
Um equipamento para investigações de reações de produção de oxigênio fotossintético
Oxidação da água no fotossistema II
Melhoria da defesa do aparato fotossintético do arroz sob estresse de cádmio modulado pelo fornecimento de ácido salicílico às raízes
Efeitos da 24-epibrassinolídeo exógeno nas membranas fotossintéticas sob condições de não estresse
Danos e proteção do aparato fotossintético contra radiação UV-B. II. Efeito da quercetina em diferentes pH
Tolerância a metais pesados em Arabidopsis thaliana
Metabolismo de metais traço em plantas
Estratégias de fitorremediação para solos contaminados com metais pesados: Modificações e perspectivas futuras
Respostas de crescimento e fisiológicas da uva (Vitis vinifera “Combier”) ao excesso de zinco
Efeito do aumento dos níveis de zinco no crescimento de Trigonella foenum-graecum e na atividade fotossintética
Impacto do transportoma iônico dos cloroplastos na otimização da fotossíntese
Remodelação da principal proteína antena captadora de luz do PSII protege as folhas jovens de cevada (Hordeum vulgare L.) da fotoinibição sob deficiência prolongada de ferro
Tolerância ao cádmio assistida por ferro e manganês em Oryza sativa L.: Redução da rizotoxicidade junto com fotossíntese funcional
Regulação dependente de cálcio da fotossíntese
Alívio da toxicidade do cádmio em Brassica juncea L. (Czern. & Coss.) pela aplicação de cálcio envolve várias estratégias fisiológicas e bioquímicas
O zinco alivia o estresse oxidativo induzido por cádmio em Ceratophyllum demersum L.: Uma macrófita aquática livre flutuante
Efeitos horméticos do zinco no crescimento e no sistema de defesa antioxidante de plantas de trigo
Avaliação da atividade antioxidante, fenóis totais e compostos fenólicos em extratos de tomilho (Thymus vulgaris L.), sálvia (Salvia officinalis L.) e manjerona (Origanum majorana L.)
Análise fitoquímica e avaliação antioxidante de folhas de capim-limão (Cymbopogon citratus DC.) Stapf
Identificação de compostos fenólicos e determinação da atividade antioxidante em extratos e infusões de folhas de Salvia
Produção de moléculas antioxidantes em Polygonum aviculare (L.) e Senecio vulgaris (L.) sob estresse metálico: Uma possível ferramenta na avaliação da tolerância de plantas a metais
Respostas antioxidantes de compostos fenólicos e imobilização de cobre em Imperata cylindrica, uma planta com potencial uso para biorremediação de ambientes contaminados com Cu
O envolvimento de polifenóis e atividades de peroxidase na acumulação de metais pesados por glândulas epidérmicas de nenúfar (Nymphaeaceae)
Respostas ao estresse e acumulação de níquel e zinco em diferentes acessos de Stellaria media (L.) Vill. em resposta à variação do pH da solução em cultura hidropônica
Danos oxidativos induzidos por metais pesados, reações de defesa e mecanismos de desintoxicação em plantas
Acumulação de antocianinas em folhas de poinsétia e seu papel funcional no estresse foto-oxidativo
Múltiplos papéis funcionais das antocianinas nas interações planta-ambiente
Modificação do estresse oxidativo através de mudanças em alguns indicadores relacionados ao metabolismo fenólico em Malva parviflora exposta ao cádmio
Atividades antioxidantes de polifenóis de sálvia (Salvia officinalis)
Análise cinética quantitativa de reações de transferência de hidrogênio de polifenóis dietéticos para o radical DPPH
Atividade antioxidante, compostos fenólicos totais de extratos da casca de pistache (Pistachia vera)
Atividades antioxidante e antimicrobiana do extrato e óleo essencial de korarima Aframomum corrorima (Braun) P.C.M. Jansen)
Conteúdo fenólico total e atividade antioxidante do extrato de kesum (Polygonum minus), gengibre (Zingiber officinale) e cúrcuma (Curcuma longa)
4Capacidade de sequestro de radicais livres e atividade antioxidante de espécies vegetais selecionadas das pradarias canadenses
Propriedades antioxidantes de extratos brutos e fracionados de rizomas de Alpinia mutica e seu conteúdo fenólico total
Capacidade antioxidante de sálvia cultivada em solo poluído por metais pesados
Uma revisão abrangente sobre a toxicidade e sequestro de metais pesados em plantas
Localização e efeitos do cádmio em folhas de salgueiro tolerante ao cádmio (Salix viminalis L.): Parte II Microlocalização e efeitos celulares do cádmio
Imagem de microfluorescência de raios X e microespectroscopia de absorção de raios X de planta hiperacumuladora de cádmio, Arabidopsis halleri ssp. gemmifera, usando radiação síncrotron de alta energia
Distribuição espacial de cádmio em folhas de Thlaspi praecox hiperacumuladora de metais usando micro-PIXE
Sequestro celular de cádmio na espécie de planta hiperacumuladora Sedum alfredii
O efeito da acumulação de Cu, Zn, Cd e Pb nos parâmetros bioquímicos (prolina, clorofila) na castanha-d'água (Trapa natans L.), Lago Skadar, Montenegro
Resposta da fotossíntese a diferentes concentrações de metais pesados em Davidia involucrata
Rendimento quântico da evolução de O2 e características de fluorescência da clorofila a 77 K em plantas vasculares de origens diversas
Efeito de diferentes intensidades luminosas na fisiologia, capacidade antioxidante e características fotossintéticas em plântulas de trigo sob alta concentração de CO2 em um ecossistema artificial fechado
Redução do aglomerado de Mn da enzima oxidante de água pelo óxido nítrico: Formação de um estado S-2
Fluxo de elétrons para o fotossistema I a partir de redutores estromais in vivo: O tamanho do pool de redutores estromais controla a taxa de doação de elétrons para unidades de fotossistema I que se reduzem rápida e lentamente
A estrutura e função da membrana fotossintética do cloroplasto — Um modelo para a organização de domínios
Mudanças no conteúdo e nos perfis de ácidos graxos dos lipídios totais de duas halófitas: Sesuvium portulacastrum e Mesembryanthemum crystallinum sob estresse por cádmio
As alterações induzidas por cádmio nas composições de lipídios polares e neutros sugerem o envolvimento do triacilglicerol na resposta de defesa no milho
Conteúdos de Ca, Mg (a,b) e Fe, Cu, Mn (c,d) em raízes e folhas de Salvia sclarea, respectivamente, após 8 dias de exposição a 100 µM de Cd com e sem 900 µM de Zn. Os valores médios (±DP, n = 3) foram comparados entre controle e tratamento para o mesmo elemento mineral usando uma ANOVA de uma via, e as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas com * p < 0,05 e ** p < 0,01.
Mudanças nos fatores de translocação dos elementos minerais em plantas de Salvia sclarea em resposta ao tratamento com 100 µM de Cd com e sem exposição excessiva (900 µM) de Zn por 8 dias. Os valores médios (±DP, n = 3) foram comparados entre os tratamentos para o mesmo elemento realizando análise de ANOVA de uma via. Letras diferentes indicam diferenças significativas entre os valores para o mesmo elemento a p < 0,05 usando o teste post-hoc de LSD de Fisher.
Cortes transversais de folhas (a1–c2) e medidas de espessura foliar (d) do controle (a1,a2), 100 μM Cd + 900 μΜ Ζn (b1,b2) e 100 μΜ Cd (c1,c2) de plantas de Salvia sclarea tratadas por 8 dias. Imagens com aumento de magnificação da epiderme adaxial e das células do mesofilo paliçádico são mostradas em (a2,b2,c2). Após a aplicação de 100 μΜ Cd, as células da epiderme adaxial foram preenchidas com grânulos osmiofílicos (setas em (c1,c2)), que no tratamento combinado (Cd + Ζn) também estavam presentes nas células epidérmicas abaxiais (setas em (b1)). Além disso, a estrutura das células do mesofilo paliçádico foi comprometida em plantas tratadas com 100 μΜ Cd (asteriscos em (c2)), enquanto após a exposição combinada, foi semelhante ao controle (asteriscos em (b2) e (a2)). O tratamento combinado também pareceu aumentar a espessura foliar (d). Barra de escala em (a1,b1,c1): 50 μm. Barra de escala em (a2,b2,c2): 10 μm. Letras diferentes em (d) indicam diferenças significativas (p < 0,05, n = 5).
Efeitos da exposição a 100 µM Cd por 8 dias com e sem excesso (900 µM) de Zn sobre: (a) padrões de oscilação dos rendimentos de flash de oxigênio (Yi) de membranas tilacoides isoladas de folhas de S. sclarea e (b) S0—a quantidade de centros do PSII no estado mais reduzido (S0 (%) = 100–S1), SB—as mudanças na quantidade de centros do PSII bloqueados apresentadas como % do controle (100% é 1,3 u.a.) e α–as falhas (%). Letras diferentes para o mesmo parâmetro indicam diferenças significativas entre os valores médios (±DP, n = 3) avaliadas por análise de ANOVA unidirecional após o teste LSD de Fisher (p < 0,05).
Efeitos do excesso (900 µM) de Zn nas alterações induzidas por Cd no conteúdo de pigmentos foliares: o conteúdo total de clorofila (Chl a+b, 100% = 2,04 ± 0,07 mg g—1 FW), carotenoides (Car, 100% = 0,48 ± 0,03 mg g—1 FW), antocianinas (Anth, 100% = 0,31 ± 0,02 mg g—1 FW) e conteúdo fenólico total (TPC, 100% = 6,64 ± 0,17 mg g—1 FW) de Salvia sclarea após 8 dias de exposição. Valores médios (±DP, n = 3) são expressos como % em relação aos respectivos controles. Asteriscos indicam diferenças significativas entre controle e tratamentos usando análise de ANOVA unidirecional com teste LSD de Fisher (* p < 0,05 e ** p < 0,01).
Resumo das alterações induzidas por Cd (p < 0,05) com e sem fornecimento excessivo de Zn em alguns parâmetros estudados de Salvia sclarea apresentados como % em relação aos respectivos valores de controle: o conteúdo foliar de Fe, Mg, Ca, Cu e Mn; o conteúdo foliar de clorofila total (Chl a+b), antocianinas (Anth) e fenóis totais (TPC); a atividade antioxidante total (FRAP); os rendimentos máximos de flash de oxigênio (Y3) e a razão Fv/Fo correspondente à atividade de evolução de oxigênio; a atividade fotoquímica do PSI (P700+).
Efeitos do excesso (900 µM) de Zn nas alterações induzidas por Cd no índice de estabilidade da membrana celular foliar (MSI) e na peroxidação lipídica (LP) das membranas (% do controle) das folhas de sálvia esclaréia (Salvia sclarea L.). Capacidade antioxidante dos extratos foliares após expor as plantas a diferentes tratamentos por 8 dias medida pelos ensaios FRAP e DPPH.
Tratamento (8 dias) MSI (%) LP (%) FRAP (μmol Fe2+ g−1 PS) DPPH (%) Controle 89.8 ± 0.5 a 100 c 61.87 ± 2.28 c 48.38 ± 2.26 c Cd + Zn 74.2 ± 1.7 b 124 ± 2 b 97.26 ± 2.35 a 67.03 ± 1.18 a Cd 56.9 ± 2.3 c 141 ± 3 a 83.15 ± 2.86 b 64.35 ± 1.04 b
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas entre os valores médios (±DP, n = 3) avaliados por análise de ANOVA de uma via usando o teste post-hoc de Fisher’s LSD (p < 0.05).
Efeitos do excesso de Zn nas alterações induzidas por Cd nos parâmetros de fluorescência da clorofila.
Tratamento (8 dias) Eficiência Máxima da Fotoquímica do PSII (Fv/Fm) Eficiência do Complexo Evolvedor de Oxigênio (Fv/Fo) Taxa Relativa de Transporte de Elétrons do PSII (ETR) Controle 0.827 ± 0.007 a 4.80 ± 0.25 a 57.57 ± 1.53 b Cd + Zn 0.828 ± 0.012 a 4.83 ± 0.41 a 59.11 ± 2.76 a Cd 0.803 ± 0.016 b 4.09 ± 0.39 b 55.09 ± 3.52 c
Letras diferentes entre os valores médios (±DP, n = 3) indicam diferença estatisticamente significativa (p < 0.05) entre os tratamentos para o mesmo parâmetro. A ANOVA de uma via de Welch foi realizada para comparar os tratamentos em cada um dos parâmetros de fluorescência da clorofila, seguida por análise post-hoc com o teste de Games–Howell.
Efeitos do excesso (900 µM) de Zn nas alterações induzidas por Cd na microviscosidade relativa da membrana (η) e na foto-oxidação do PSI (P700+) medidas pelas amplitudes relativas das mudanças de absorbância induzidas por luz FR (expressas como ΔA/A830 × 10−3) e pelas constantes de taxa de redução no escuro de P700+ (k1 e k2) em folhas de Salvia sclarea.
Tratamento (8 dias) P700+(ΔA/A830 × 10−3) k1(s−1) k2(s−1) η Controle 11.71 ± 0.38 b 0.55 ± 0.07 c 0.12 ± 0.02 c 2.946 ± 0.11 c Cd + Zn 12.78 ± 0.44 a 0.87 ± 0.09 b 0.16 ± 0.01 b 3.257 ± 0.15 b Cd 10.47 ± 0.27 c 1.29 ± 0.05 a 0.21 ± 0.01 a 3.680 ± 0.17 a
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças estatisticamente significativas (p < 0.05) entre os valores médios (±DP, n = 3) avaliados por análise de ANOVA de uma via usando o teste de LSD de Fisher.