pmid: "37008100"
title: "Bioatividade Aprimorada dos Óleos Essenciais de Alecrim, Sálvia, Lavanda e Camomila por Fracionamento, Combinação e Emulsificação."
authors: "Karaca N, Demirci B, Gavahian M, Demirci F"
journal: "ACS omega"
pubdate: "2023 Mar 28"
doi: "10.1021/acsomega.2c07508"
source: "PMC Full Text"
Bioatividade Aprimorada dos Óleos Essenciais de Alecrim, Sálvia, Lavanda e Camomila por Fracionamento, Combinação e Emulsificação.
Autores
Karaca N, Demirci B, Gavahian M, Demirci F
Periodico
ACS omega (2023 Mar 28)
Conteudo
Bioatividade Aumentada de Óleos Essenciais de Alecrim, Sálvia, Lavanda e Camomila por Fracionamento, Combinação e Emulsificação
Este estudo teve como objetivo aumentar a bioatividade de óleos essenciais por fracionamento, combinação e emulsificação. Nesse contexto, óleos essenciais de qualidade farmacêutica de Rosmarinus officinalis L. (alecrim), Salvia sclarea L. (sálvia esclareia), Lavandula latifolia Medik. (lavanda espicata) e Matricaria chamomilla L. (camomila) foram fracionados por cromatografia em coluna a vácuo. Os principais componentes dos óleos essenciais foram verificados, e suas frações foram caracterizadas por cromatografia de camada delgada, cromatografia gasosa com detector de ionização de chama e cromatografia gasosa/espectrometria de massas. Além disso, emulsões óleo-em-água (O/A) dos óleos essenciais e frações de éter dietílico foram obtidas pelo método de autoemulsificação, seguidas de medições de tamanho de gotícula, índice de polidispersão e potencial zeta. Os efeitos antibacterianos in vitro das emulsões e combinações binárias (10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, v:v) contra Staphylococcus aureus foram determinados por microdiluição. Além disso, os efeitos anti-biofilme, antioxidante e anti-inflamatório in vitro das formulações de emulsão foram avaliados. De acordo com os resultados experimentais, o fracionamento e a emulsificação aumentaram os efeitos antibacterianos, anti-inflamatórios e antioxidantes in vitro dos óleos essenciais devido ao aumento da solubilidade e gotículas em nanoescala. Entre 22 combinações diferentes de emulsão, 1584 concentrações testadas resultaram em 21 casos de efeitos sinérgicos. O mecanismo do aumento das atividades biológicas foi hipotetizado como sendo a maior solubilidade e estabilidade das frações de óleos essenciais. As indústrias alimentícia e farmacêutica podem se beneficiar do procedimento proposto neste estudo.
Introdução
Emulsões são sistemas nos quais um líquido é disperso em outro(s) líquido(s) e contém gotículas com um raio médio de 100 nm–100 mm.− Como é bem conhecido, existem duas emulsões comumente utilizadas: emulsões óleo-em-água (O/A) e água-em-óleo (A/O). Considerando a solubilidade, as nanoemulsões A/O e O/A são melhores para fármacos hidrofílicos e lipofílicos, respectivamente. Nos últimos anos, nanoemulsões O/A são utilizadas na saúde, cosméticos, alimentos, química agrícola, farmacêutica e biotecnologia, entre outros setores. Sabe-se que nanoemulsões estáveis com pequeno tamanho de gotícula podem ser produzidas por emulsificação espontânea através da mistura e adição gradual da fase aquosa à mistura óleo/surfactante a temperatura constante.
Como é conhecido há séculos, materiais vegetais e óleos essenciais são utilizados para a prevenção e o tratamento de diversas doenças. Além disso, seus produtos, como os óleos essenciais, possuem amplas atividades biológicas, como antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória, analgésica, mucolítica e estimulante. Eles têm aplicações em perfumes, preparações cosméticas, inseticidas, conservantes de alimentos, produtos farmacêuticos e aromaterapia. No entanto, sua aplicação em medicamentos é limitada devido à baixa solubilidade em água e instabilidade, alta volatilidade e efeitos colaterais. De acordo com a literatura, a emulsificação de substâncias ativas lipofílicas pode aumentar sua estabilidade, solubilidade e efeitos biológicos.− Embora vários óleos essenciais tenham sido fracionados, informações sobre o fracionamento para potencializar a atividade biológica constituem uma área de pesquisa inovadora.
Rosmarinus officinalis L. (alecrim, Lamiaceae) o alecrim contém substâncias bioativas antioxidantes, antimicrobianas e anti-inflamatórias. Os principais componentes do óleo essencial obtido por hidrodestilação são 1,8-cineol, cânfora e α-pineno. O óleo de alecrim pode tratar acne, calvície, dor reumática e obstrução circulatória. É utilizado por seus efeitos carminativo, diurético, expectorante e antiespasmódico. Além disso, o óleo de alecrim tem um impacto pronunciado no sistema nervoso central associado a estimulantes cerebrais e desenvolvimento da memória.
Os óleos essenciais de Lavandula são usados tanto em cosméticos quanto em terapia há séculos. As espécies comuns com propriedades antissépticas são L. angustifolia, L. latifolia, L. stoechas e L. x intermedia. O óleo de lavanda é frequentemente usado como relaxante, carminativo e sedativo na aromaterapia. Os óleos essenciais de lavanda são conhecidos por serem antibacterianos, antifúngicos, carminativos, sedativos e antidepressivos para queimaduras e eficazes contra picadas de insetos. Mais de 300 componentes foram identificados no óleo essencial de Lavandula latifolia Medik. (lavanda-espiga), onde os principais componentes incluem linalol, 1,8-cineol e cânfora.
Salvia sclarea L. (sálvia-esclareia, Lamiaceae) é uma das sálvias mais prevalentes. Preparações da parte herbácea desta planta são usadas como antidiarreico e sedativo na medicina popular turca. O óleo das flores e folhas é usado como sedativo para tratar dor de estômago, prisão de ventre e sudorese. A planta também é cultivada mundialmente, especialmente no Mediterrâneo e na Europa Central. Os óleos essenciais obtidos de S. sclarea são usados como antidepressivos, antissépticos, antiespasmódicos, carminativos e afrodisíacos. Efeitos antifúngicos, anti-inflamatórios e analgésicos, antibacterianos e antioxidantes estão entre os relatados.
Matricaria chamomilla L. (camomila, Asteraceae) é uma planta medicinal popular. As preparações de camomila são conhecidas e utilizadas como fitoterápicos há milhares de anos. O chá de camomila preparado com flores secas de M. chamomilla é amplamente consumido. O óleo essencial tem sido tradicionalmente usado como colagogo, carminativo, anti-inflamatório, analgésico e diurético. A camomila tem sido usada como fitoterápico desde a antiguidade e como agente anti-inflamatório e antisséptico, além de antiespasmódico, entre outras aplicações.
O presente estudo visa melhorar a bioatividade de óleos essenciais selecionados por fracionamento, combinação e emulsificação. Além disso, tem como objetivo determinar as propriedades antimicrobianas, anti-biofilme, anti-inflamatórias e antioxidantes in vitro de produtos à base de óleos essenciais em comparação com óleos extraídos recentemente. Até onde sabemos, este estudo é o primeiro relato sobre o uso de óleos essenciais de grau farmacopeico e suas frações, emulsões e combinações de alecrim, sálvia, lavanda e camomila para melhorar a bioatividade.
Resultados e Discussão
Rendimentos do Fracionamento e Análise Cromatográfica
Análises detalhadas de cromatografia gasosa (CG) e cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM) confirmaram a qualidade farmacêutica dos óleos essenciais do material de estudo. As quantidades e os rendimentos percentuais foram obtidos pelo fracionamento dos óleos essenciais com n-hexano, éter dietílico e metanol (Tabela 1). Até onde sabemos, este é o primeiro relato sobre o fracionamento de óleos essenciais antes da emulsificação para melhorar a solubilidade e a atividade.
Quantidades das Frações
e Rendimentos Percentuais Obtidos
dos Óleos Essenciaisa
essencial óleos solvente de fracionamento fração (g) % rendimento Lavandula latifolia n-hexano 0,5 100 éter dietílico 5,5 metanol 0 Rosmarinus officinalis n-hexano 1,2 91,2 éter dietílico 4,3 metanol - Salvia sclarea n-hexano 0,1 97,5 éter dietílico 5,6 metanol 0,1 Matricaria chamomilla n-hexano 0,9 100 éter dietílico 5,1 metanol -
g, grama; -, ≤0,001
g.
A composição química das frações de óleos essenciais separadas foi determinada por cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (CG-DIC) e métodos de CG/EM de acordo com sua polaridade. As avaliações por CCD foram comparadas com padrões, e os resultados estão listados nas Informações de Suporte. Os principais componentes dos óleos essenciais e frações foram determinados pelos resultados de CG-DIC e CG/EM.
As composições do óleo essencial de L. latifolia, das frações de n-hexano e éter dietílico estão listadas comparativamente na Tabela 2.
Composição Química do Óleo Essencial de L. latifolia, Frações de n-Hexano
e Éter Dietílicoa
% RRI composto L. óleo essencial de latifolia fração n-hexano éter dietílico fração
1014 tricicleno T 0.1
1032 α-pineno 2.4 20.4
1076 canfeno 0.5 4.0
1118 β-pineno 2.0 19.8
1132 sabineno T 0.3
1159 δ-3-careno 0.1
1174 mirceno 0.4 3.8
1188 α-terpineno 0.1
1203 limoneno 1.3 16.0
1213 1,8-cineol 25.6 27.0
1218 β-felandreno 0.3
1246 (Z)-β-ocimeno 0.1 1.1
1255 γ-terpineno T 0.4
1266 (E)-β-ocimeno 0.1 1.3
1280 p-cimeno 0.6 7.0
1290 terpinoleno t 0.4
1439 aldeído γ-canfolênico t 0.3
1450 óxido de trans-linalol (furanóide) t 0,1
1478 óxido de cis-linalol (furanóide) t t
1497 α-copaeno 0.2
1532 cânfora 12.2 14.0
1535 β-bourboneno 0.6
1549 β-cubebeno 0.1
1553 linalol 45.2 49.0
1565 acetato de linalila 2.3 1.8
1568 trans-α-bergamoteno 0.1
1572 α-bergamoteno 0.2
1611 terpinen-4-ol 0.2 0.2
1612 β-cariofileno 1.0 15.9
1617 acetato de lavandulila 0.1
1668 (Z)-β-farneseno 0.8
1669 sesquisabineno 0.1
1684 isoborneol 0.5 0.6
1687 α-humuleno t 1.7
1706 α-terpineol 1.5 1.6
1715 γ-terpineol 0.1
1719 borneol 0.9 1.0
1726 germacreno D t 0.4
1733 acetato de nerila 0.3 0.4
1741 β-bisaboleno 0.4
1748 (E–E)-α-farneseno t
1773 δ-cadineno 0.2
1776 γ-cadineno 0.4
1740 (Z)-α-bisaboleno t
1784 (E)-α-bisaboleno t 1.1
1795 acetato de geranila t
1808 nerol 0.2 0.3
1849 calameneno 0.2
1857 geraniol 0.4 0.4
1949 nonanoato de (Z)-3-hexenila t 0.1
2008 óxido de cariofileno 0.2 0.2
total 97.9 97.5 97.6
RRI, índices de retenção relativos
calculados contra n-alcanos.% calculado a partir de dados FID; t, traço.
O óleo essencial de R. officinalis e suas frações determinados por GC-FID e GC/MS estão listados na Tabela 3, onde os componentes majoritários 1,8-cineol (47.4%) e cânfora (15.2%) foram identificados.
Composição Química do Óleo Essencial de R. officinalis, Frações n-Hexano, Éter Dietílico e Metanola
% RRI composto R. óleo essencial de officinalis fração de n-hexano fração de éter dietílico fração de metanol fração 1014 tricicleno 0,4 0,8 1032 α-pineno 12,0 28,0 1035 α-tujeno t 1,2 1072 α-fenceno t 0,3 1076 canfeno 3,5 8,8 1118 β-pineno 7,1 20,2 1132 sabineno t 0,1 1135 tuja-2,4-(10)-dieno t 0,1 1159 δ-3-careno 0,1 1174 mirceno 1,2 4,0 1176 α-felandreno 0,2 1183 pseudolimoneno 0,1 1188 α-terpineno 0,3 0,8 1203 limoneno 2,3 8,3 1218 β-felandreno 0,7 1246 (Z)-β-ocimeno 0,1 1213 1,8-cineol 47,4 67,4 1255 γ-terpineno 0,4 1,3 1266 (E)-β-ocimeno 0,1 1280 p-cimeno 1,7 6,2 1290 terpinoleno t 0,6 1452 α-p-dimetil estireno t 0,1 1452 1-octen-3-ol t 0,2 1466 α-cubebeno t 0,1 1493 α-ilangeno 0,1 1497 α-copaeno t 0,5 1532 cânfora 15,2 23,5 1553 linalol 0,9 1,6 3,7 1562 isopinocanfona t t 1586 pinocarvona t t 1589 isocariofileno 0,1 1590 acetato de bornila 0,6 0,9 1598 hidrato de canfeno t 1611 terpinen-4-ol 0,3 0,4 1612 β-cariofileno 2,8 15,4 1617 acetato de lavandulila 5,0 1628 aromadendreno 0,1 1664 trans-pinocarveol 0,1 1682 δ-terpineol 0,1 4,5 1687 α-humuleno 0,2 1,2 1704 δ-muuroleno 0,3 1706 α-terpineol 1,6 2,6 1715 γ-terpineol 0,2 1719 borneol 1,6 2,7 2,3 1725 verbenona t t 1740 α-muuroleno 0,1 1744 α-selineno t 1751 carvona 2,6 1773 δ-cadineno t 0,3 1776 γ-cadineno 0,1 1799 cadina-1,4-dieno t 1849 calameneno 0,1 2008 óxido de cariofileno 44,6 2186 eugenol t 8,1 2239 carvacrol 0,3 total 99,9 100 99,6 70,8
RRI, índices de retenção relativa
calculados contra n-alcanos; a % foi calculada
a partir de dados de FID; t, traço.
Os componentes e frações do óleo essencial de S. sclarea estão listados na Tabela 4 com mais de 65 compostos identificados.
Composição
Química do Óleo Essencial de S. sclarea,
Frações de n-Hexano,
Éter Dietílico e Metanola
% RRI composto S. óleo essencial de sclarea fração n-hexano éter dietílico fração metanol fração 1032 α-pineno t 0.2 1035 α-tujeno t 1076 canfeno t 1118 β-pineno t 0.3 1132 sabineno 0.1 1174 mirceno 0.5 5.5 0.2 1176 α-felandreno 0.2 0.8 1188 α-terpineno t 0.1 1203 limoneno 0.4 6.3 t 1213 1,8-cineol 0.1 t 1218 β-felandreno 0.3 1220 óxido de cis-anidrolinalol t t 1222 2-hexanol t t 1246 (Z)-β-ocimeno 0.1 2.2 t 1253 óxido de trans-anidrolinalol t t 1255 γ-terpineno 0.2 1266 (E)-β-ocimeno 0.3 3.8 0.1 1280 p-cimeno 0.4 5.0 t 1290 terpinoleno 0.1 1.0 t 1413 furano rosa 0.1 1429 perileno 0.1 1466 α-cubebeno 0.3 1497 α-copaeno 0.3 5.6 1528 α-burboneno 0.1 0.2 1532 cânfora 0.3 0.4 1535 β-bourboneno 0.1 3.1 1553 linalol 20.3 20.6 18.6 1568 trans-α-bergamoteno t 1549 β-cubebeno t 1.6 1565 acetato de linalila 63.9 0.3 65.7 44.7 1579 óxido de acetoxilinalol 0.1 1589 β-ilangeno 0.5 1594 trans-β-bergamoteno t 1597 β-copaeno 0.6 1600 isobutirato de linalila t 0.1 1600 β-elemeno t 1.7 1611 terpinen-4-ol 0.1 0.1 1612 β-cariofileno 1.2 28.3 0.1 1617 acetato de lavandulila 6.7 1628 aromadendreno 0.2 1669 sesquisabineno 0.2 1687 α-humuleno t 1.4 1694 neral 0.1 1704 γ-muuroleno 0.3 1706 α-terpineol 4.0 4.2 9.9 1726 germacreno D 0.8 16.2 1733 acetato de nerila 1.1 1.3 1740 geranial t 0.2 1742 β-seleneno 1.1 1744 α-seleneno 0.2 1748 (E,E)-α-farneseno 0.8 1755 biciclogermacreno 0.5 1773 δ-cadineno t 1.4 1776 γ-cadineno 0.2 1795 acetato de geranila 2.0 2.4 1808 nerol 0.7 0.8 1849 calameneno 0.1 1857 geraniol 1.6 1.8 1864 p-cimen-8-ol t 0.1 1949 nonoato de (Z)-3-hexenila 0.1 8.5 1961 3,7-dimetil-1,5-octadieno-3,7-diol 0.2 0.2 2008 óxido de cariofileno 0.4 0.4 2144 espatulenol t 0.1 2257 β-eudesmol t 0.1 2312 9-geranil p-cimeno 0.1 2.3 t 2419 esclareol 0.9 total 99.8 93.1 99.1 88.4
RRI, índices de retenção relativa
calculados em relação a n-alcanos; a % foi calculada
a partir de dados de FID; t, traço.
A composição do óleo essencial de M. chamomilla e suas frações também foi determinada por métodos de GC-FID e GC/MS, conforme mostrado na Tabela 5.
Composição Química do Óleo Essencial de M. chamomilla, Frações de n-Hexano,
Éter Dietílico e Metanol a
% RRI composto M. óleo essencial de camomila fração de n-hexano fração de éter dietílico fração de metanol fração 1174 mirceno T T 1176 α-felandreno T T 1203 limoneno T 0,1 1244 2-pentil furano T T 1246 (Z)-β-ocimeno T 0,1 1255 γ-terpineno 0,1 0,2 1266 (E)-β-ocimeno 0,2 0,5 1280 p-cimeno 0,1 0,1 1358 cetona de artemísia 0,2 1400 nonanal T 1403 álcool de yomogi T 1495 bicicloelememo T 0,2 1497 α-copaeno T 0,2 1510 álcool de artemísia 0,1 0,1 1550 α-isocomeno 0,1 t 1565 acetato de linalila 0,2 1600 β-elemeno T 0,3 1612 β-cariofileno T 0,3 1628 aromadendreno T 0,2 1661 aloaromadendreno 0,1 0,3 1668 (E)-β-farneseno 17,0 69,6 0,1 1704 γ-muuroleno 0,1 0,6 1708 ledeno 0,1 0,4 1726 germacreno D 1,2 4,3 1594 trans-β-bergamoteno 0,1 0,4 1755 biciclogermacreno 0,3 2,8 1758 (E–E)-α-farneseno 0,7 3,1 1773 δ-cadineno 0,1 1,0 1776 γ-cadineno 0,1 0,6 1783 β-sesquifelandreno 0,1 1786 ar-curcumeno T 0,2 1799 cadina-1,4-dieno 0,1 1807 α-cadineno t t 1941 α-calacoreno 0,5 0,7 1946 dendrolasina 0,6 2050 (E)-nerolidol 0,1 0,1 2098 globulol t 0,1 2131 hexa-hidrofarnesil acetona 0,3 0,2 2144 espatulenol 0,4 0,8 2156 óxido de α-bisabolol B 5,2 7,1 2187 T-cadinol 0,5 0,9 2200 óxido de α-bisabolona A 5,0 5,9 2232 α-bisabolol 19,4 25,2 34,0 2298 ácido decanoico 0,5 t 2300 tricosano 0,1 0,9 2400 tetracosano 0,4 2430 camazuleno 1,6 6,8 2438 óxido de α-bisabolol A 41,6 56,6 66,0 2400 pentacosano 0,3 2,7 2500 heptacosano 0,7 2931 ácido hexadecanoico 0,4 t total 96,5 98,7 97,1 100
RRI, índices de retenção relativos calculados em relação a n-alcanos; a % foi calculada a partir de dados de FID; t, traço.
Estudos de Caracterização das Emulsões
Usando o método de titulação em água, emulsões de quatro óleos essenciais e suas frações de éter dietílico foram preparadas com sucesso, como mostrado na Figura 1. Os resultados dos estudos de caracterização, incluindo pH, índice de refração, turbidez, tamanho de gotícula, índice de polidispersão (PDI) e valores de potencial zeta, estão listados na Tabela 6.
(a) Emulsões de óleo essencial (da esquerda para a direita): R. officinalis,S. sclarea,L. latifolia e M. camomila. (b) Emulsões das frações de éter dietílico (da esquerda para a direita): R. officinalis,S. sclarea,L. latifolia e M. camomila.
Resultados da Caracterização das Emulsões de Óleo Essencial e Frações de Éter Dietílico
emulsão de óleo essencial tamanho da gotícula (nm ± dp) polidispersão ± dp potencial zeta ± dp índice de refração absorbância (600 nm) pH resistência centrífuga imagem
R. officinalis 40,83 ± 6,50 0,89 ± 0,10 –40,8 ± 2,31 1,3192 0,067 6,2 + turva
R. officinalis fração de éter dietílico 110,23 ± 27,5 0,69 ± 0,28 –19,4 ± 0,52 1,3192 0,084 5,8 + leitosa
S. sclarea 114,47 ± 1,19 0,12 ± 0,03 –11,47 ± 0,38 1,3192 0,264 4,08 + leitosa
S. sclarea fração de éter dietílico 116,97 ± 1,25 0,11 ± 0,005 –8,24 ± 0,37 1,3192 0,232 4,12 + leitosa
L. latifolia 151,87 ± 4,8 0,26 ± 0,01 –1,08 ± 1,30 1,3190 0,057 5,65 - leitosa
L. latifolia fração de éter dietílico 266,83 ± 4,2 0,59 ± 0,003 –10,57 ± 0,29 1,3192 0,095 5,43 - leitosa
M. chamomilla 223,3 ± 0,95 0,20 ± 0,004 –16,8 ± 0,56 1,3194 1,765 5,63 + leitosa azulada
M. chamomilla fração de éter dietílico 214,67 ± 2,4 0,12 ± 0,01 –16,17 ± 0,45 1,3192 0,948 5,52 + leitosa esverdeada
+, Sem alteração; -, separação de fases;
dp, desvio padrão.
De acordo com os resultados, não foram observadas separação de fases e cremação nas emulsões de óleo essencial avaliadas quanto à sua estabilidade centrífuga, onde o pH das emulsões variou entre 4,08 e 6,2. Os tamanhos das gotículas das emulsões obtidas a partir do óleo essencial de alecrim e da fração de éter dietílico foram medidos como 40,83 ± 6,50 e 110,23 ± 27,54 nm, respectivamente. Como observação experimental, a emulsão de óleo essencial de alecrim apresentou melhores resultados do que a emulsão da fração de éter dietílico. O tamanho das gotículas e o valor de PDI da emulsão de óleo essencial de S. sclarea foram determinados como 114,47 ± 1,19 nm e 0,12 ± 0,03, respectivamente, conforme visto na Tabela 6. O tamanho das gotículas da emulsão da fração de éter dietílico do óleo essencial de S. sclarea foi de 116,97 ± 1,25 nm, e o valor de PDI foi de 0,11 ± 0,005. Os tamanhos das gotículas da emulsão de óleo essencial de lavanda-espiga e da fração de éter dietílico foram de 151,87 ± 4,76 e 266,83 ± 4,19 nm, respectivamente. De acordo com os resultados observados, a emulsão de óleo essencial contém gotículas mais homogêneas e menores do que a emulsão da fração (ver Tabela 6). Conforme visto na Figura 1, o óleo essencial de camomila apresenta aparência leitosa azulada; sua fração é leitosa esverdeada devido à sua cor natural. Os valores de absorbância das diluições 1:100 são altos em comparação com outros óleos testados. Os tamanhos das gotículas (223,3 ± 0,95 e 214,67 ± 2,36 nm, respectivamente) e os valores de PDI (0,20 ± 0,004 e 0,12 ± 0,01, respectivamente) das emulsões preparadas a partir do óleo essencial de camomila e da fração de éter dietílico estavam na mesma faixa. As Informações de Apoio apresentam o espectro de distribuição do tamanho das gotículas das emulsões contendo gotículas heterogêneas.
Neste estudo comparativo, óleos essenciais de R. officinalis, S. sclarea, L. latifolia e M. chamomilla, suas emulsões e emulsões da fração éter dietílico são preparados pelo método de titulação em água, com tamanho de gotícula de 40,83 ± 6,50 a 266,83 ± 4,19 nm. No entanto, os valores de PDI das emulsões dos óleos essenciais de S. sclarea e M. chamomilla e da fração éter dietílico (0,11 ± 0,005–0,20 ± 0,004) foram menores quando comparados aos das emulsões de R. officinalis e M. chamomilla. Gotículas grandes e baixos valores de potencial zeta foram determinados; além disso, a separação de fases após centrifugação foi observada apenas nas emulsões do óleo essencial de lavanda-espiga e sua fração éter dietílico.
De modo geral, o índice de refração das emulsões preparadas na presença de óleo essencial variou entre 1,3190 e 1,3194, sugerindo não haver diferença significativa entre os valores de índice de refração das emulsões formadas.
Atividade Antimicrobiana
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 7, o melhor efeito inibitório foi observado na fração éter dietílico de S. sclarea e no óleo essencial de M. chamomilla na concentração de 1,25 mg/mL contra S. aureus.
Valores de CIM dos Óleos Essenciais, Frações n-Hexano
e Éter Dietílico, Componentes Ativos Selecionados
(mg/mL) e Antimicrobianos Padrão (μg/mL) Determinados pelo
Método de Microdiluição contra S. aureus
amostras CIMa óleo essencial de R. officinalis 2,5 fração n-hexano de R. officinalis >5 fração éter dietílico de R. officinalis >5 óleo essencial de S. sclarea >5 fração n-hexano de S. sclarea >5 fração éter dietílico de S. sclarea 1,25 óleo essencial de L. latifolia 5 fração n-hexano de L. latifolia >5 fração éter dietílico de L. latifolia >5 óleo essencial de M. chamomilla 1,25 fração n-hexano de M. chamomilla >5 fração éter dietílico de M. chamomilla 2,5 1,8-cineol >5 linalol >5 acetato de linalila 5 borneol 1,25 acetato de bornila 0,08 α-terpineol 2,5 (-)-bisabolol 0,16 isômeros de farneseno >5 amoxicilina/ácido clavulânico ácido 1 clavulanato de potássio 8 cefuroxima 16 cloranfenicol 4 % DMSO 12,5
CIM, concentração
inibitória mínima.
Neste estudo, os efeitos antimicrobianos in vitro dos óleos essenciais das folhas de R. officinalis [1,8-cineol (47,2–27,5%) e cânfora (12,9–27,9%)] coletados de diferentes regiões foram avaliados. Valores de CIM de 5–1,25 μL/mL foram obtidos contra S. aureus ATCC 6538. Em um estudo investigando o efeito antimicrobiano do óleo essencial de alecrim, foi observado um efeito contra isolado clínico de S. aureus na concentração de 0,03 v/v. Neste estudo, o 1,8-cineol (26,54%), principal componente do óleo essencial, foi eficaz a 0,3 v/v. Da mesma forma, em nosso estudo, o óleo essencial de alecrim (CIM: 2,5 mg/mL) foi mais eficaz do que o principal componente 1,8-cineol (CIM: >5) contra cepas padrão de S. aureus. Em outro estudo, o método de diluição em ágar avaliou a atividade antimicrobiana do óleo essencial de alecrim, e o óleo essencial foi considerado eficaz contra S. aureus ATCC 25923 a 6,40 mg/mL. No estudo de Mekonnen et al., os principais componentes do óleo essencial de R. officinalis foram determinados como 50,83% de α-pineno e 24,42% de 1,8-cineol. Neste estudo, o efeito antimicrobiano do óleo essencial (50 μL) contra a cepa de S. aureus foi avaliado pelo método de difusão em ágar, observou-se uma zona de inibição de 25 ± 1,23 mm, e o valor da CIM foi determinado como 23,25 mg/mL.
Em outro estudo, o método de diluição em ágar avaliou a atividade antimicrobiana do óleo essencial de S. sclarea. De acordo com isso, o óleo essencial foi eficaz a 0,29 mg/mL contra S. aureus ATCC 25923. O efeito antimicrobiano do óleo essencial contendo 12,7% de acetato de linalila, 21,1% de acetato de α-terpinila e 47,4% de α-terpineol foi avaliado contra S. aureus ATCC 25923. O óleo de S. sclarea apresentou efeito microbiostático (CIM: 1,5–2,0 mg/mL) contra cepas de S. aureus e S. epidermidis.
Foi relatado que 50 μL de óleo essencial de M. chamomilla, que continha óxido de α-bisabolol B (51,4%) e camazuleno/azuleno (17,7%), foi ineficaz contra S. aureus. O óleo essencial de camomila apresentou uma zona de inibição de 21 mm contra S. aureus ATCC 9244 no método de difusão em disco na concentração de 30 mg/mL. Os valores de CIM obtidos neste estudo foram de 2 μg/mL contra as mesmas cepas. No método de difusão em disco do óleo essencial (1 μg/mL) contendo 43,5% de trans-β-farnaceno, obteve-se um diâmetro de zona de inibição de 10 mm contra a cepa de S. aureus. Neste estudo, os valores de CIM obtidos contra a cepa de S. aureus pelo método de microdiluição foram de 8 μg/mL, respectivamente.
Um estudo anterior determinou o efeito antibacteriano do óleo essencial de L. latifolia contra cepas de S. aureus e L. monocytogenes na faixa de concentração de 0,5–2 μL/mL. Em nosso estudo anterior, o efeito do óleo essencial de L. latifolia contra a cepa S. aureus ATCC 25923 foi determinado como 2,5 mg/mL por microdiluição. Este estudo combinou o óleo essencial e a cânfora usando o método de checkerboard. Como resultado, foram determinadas combinações com efeitos sinérgicos e aditivos.
De acordo com a Tabela 8, o melhor efeito inibitório foi observado para a emulsão de óleo essencial de camomila e a emulsão da fração de éter dietílico na concentração de 0,098 mg/mL. Além disso, a emulsão de óleo essencial de alecrim apresentou um efeito antimicrobiano significativo na concentração de 0,78 mg/mL e a emulsão da fração de éter dietílico em 1,56 mg/mL, respectivamente. As emulsões preparadas com óleo essencial de sálvia esclareia e sua fração de éter dietílico apresentaram valor de CIM de 0,78 mg/mL. As emulsões preparadas com óleo essencial de lavanda espicata e fração de éter dietílico apresentaram valores de CIM de 0,39 e 0,78 mg/mL, respectivamente. Os resultados observados foram relativamente mais ativos em comparação com os efeitos antimicrobianos dos óleos essenciais testados. De acordo com os dados experimentais, pode-se concluir que o efeito antibacteriano foi aumentado com a emulsificação do óleo essencial de camomila.
Efeitos Antibacteriano (CIM) e Antibiofilme
(CIMB) das Emulsões de Óleos Essenciais contra a Cepa de S. aureus (mg/mL)a
amostras efeito antibacteriano (mg/mL) efeito antibiofilme (mg/mL) R. officinalis 0,78 0,78 S. sclarea 0,78 L. latifolia 0,39 M. chamomilla 0,098 0,02 L. latifolia éter dietílico fração 0,78 R. officinalis fração de éter dietílico 1,56 1,56 S. sclarea fração de éter dietílico 0,78 M. chamomilla fração de éter dietílico 0,098 0,05 amoxicilina/clavulanato (μg/mL) 1 2
CIM, concentração inibitória
mínima;
CIMB, concentração inibitória mínima do biofilme.
Este estudo determinou o efeito antibiofilme incubando a cepa de S. aureus em uma placa de fundo chato de 96 poços por 48 h para formar um biofilme. A Tabela 8 apresenta os resultados das emulsões testadas contra S. aureus. De acordo com isso, o efeito antibiofilme das emulsões obtidas com óleo essencial de sálvia e sua fração de éter dietílico, lavanda espicata e a fração de éter dietílico deste óleo não foi suscetível dentro das faixas de concentração de trabalho (0,01–10 mg/mL). Efeitos antibiofilme notáveis foram observados no óleo essencial de camomila e na fração de éter dietílico nas concentrações de 0,02 e 0,05 mg/mL, respectivamente.
Testes de atividade antibacteriana in vitro dos óleos essenciais e suas respectivas emulsões contra o patógeno S. aureus foram realizados. De acordo com os resultados, óleos essenciais, frações de n-hexano e de éter dietílico mostraram efeitos antimicrobianos na faixa de concentração de 1,25–5 < mg/mL, conforme relatado na Tabela 7. A faixa de concentração efetiva antimicrobiana das emulsões de óleo essencial e fração de éter dietílico foi de 0,098–1,56 mg/mL, cujos detalhes são fornecidos na Tabela 8. Os resultados cumulativos mostraram que o efeito antibacteriano foi aumentado pela emulsificação do óleo essencial de camomila.
Além disso, os resultados do efeito antibiofilme das emulsões de óleos essenciais e emulsões de frações contra S. aureus estavam na mesma faixa (Tabela 8). Assim, os óleos essenciais de alecrim e camomila e suas frações apresentaram um efeito antibiofilme. No entanto, esse efeito não foi observado na faixa de concentração estudada de 0,01–10 mg/mL nos óleos essenciais de sálvia esclareia e lavanda espiga.
Resultados do Efeito Antibacteriano Sinérgico das Combinações de Óleos Essenciais
Os efeitos antibacterianos sinérgicos das combinações binárias 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 e 90:10 (v:v) das emulsões foram determinados. Como resultado, os valores da concentração inibitória fracionada (CIF) foram determinados em uma ampla faixa de concentração, combinando as amostras em 72 concentrações diferentes. De acordo com os valores fornecidos na Tabela 9, 21 combinações diferentes de emulsões foram sinérgicas (CIF ≤ 0,5), enquanto outras combinações foram consideradas aditivas (0,5 < CIF ≤ 1) ou ineficazes (1 < CIF < 4).
CIFs das Combinações de Emulsões de Óleos Essenciaisa
combinações (v/v) amostras 10:90 20:80 30:70 40:60 50:50 60:40 70:30 80:20 90:10 R. officinalis + S. sclarea 0,95 0,45 0,42 0,40 0,36 0,35 0,65 0,60 1,11 R. officinalis + L. latifolia 1,11 0,3 0,33 0,35 0,36 0,40 0,42 0,45 0,47 R. officinalis + M. chamomilla - - - - - - - - - R. officinalis + fração de L. latifolia 1,11 0,6 0,65 0,70 0,37 0,4 0,42 0,45 0,47 R. officinalis + fração de R. officinalis - - - - - - - - - R. officinalis + fração de S. sclarea 1 1 1 1 1 1 1 1 1 R. officinalis + fração de M. chamomilla - - - - - - - - - S. sclarea + L. latifolia 1,10 0,60 0,65 0,70 0,73 0,80 0,85 0,90 0,99 S. sclarea + M. chamomilla 1,15 0,63 1,33 1,43 0,74 0,80 0,85 0,90 0,95 S. sclarea + fração de L. latifolia 1,31 0,81 0,94 1,10 0,61 0,70 0,77 0,85 0,92 S. sclarea + fração de R. officinalis 1,24 1,00 0,68 0,87 1,06 0,63 0,72 0,81 0,90 S. sclarea + fração de S. sclarea 1,10 1,20 0,65 0,70 0,73 0,80 0,85 0,90 0,95 S. sclarea + fração de M. chamomilla 1,15 1,25 1,33 1,43 1,51 1,62 0,85 1,80 0,95 L. latifolia + M. chamomilla 1 0,95 0,88 0,83 0,76 0,71 0,67 1,22 1,11 L. latifolia + fração de L. latifolia 1,11 1,20 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 L. latifolia + fração de R. officinalis 1 0,80 0,95 0,55 0,63 0,70 0,40 0,85 0,93 L. latifolia + fração de S. sclarea 1 1 0,5 1 1 1 1 1 1 L. latifolia + fração de M. chamomilla 1 0,94 0,88 0,83 0,76 0,71 0,67 0,61 0,55 M. chamomilla + fração de L. latifolia 0,66 0,82 0,98 1,14 0,63 0,73 0,81 0,89 0,97 M. chamomilla + fração de R. officinalis - - - - - - - - - M. chamomilla + fração de S. sclarea 1 1 1 1 1 2 1 1,05 1,05 M. chamomilla + fração de M. chamomilla 1 1 1 1 1 1 1 1 1
-, Não detectado.
Efeitos sinérgicos foram observados para a combinação de emulsões de óleos essenciais de alecrim e sálvia esclareia nas proporções de 20:80, 30:70, 40:60, 50:50 e 60:40. Efeitos sinérgicos foram observados em todas as combinações de emulsões de óleos essenciais de alecrim e alfazema exceto na proporção de 10:90. Além disso, foi observado um efeito sinérgico das emulsões das frações de éter dietílico dos óleos essenciais de alecrim e alfazema nas proporções de 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 e 90:10. Os resultados das combinações da emulsão de óleo essencial de alecrim com emulsão de óleo essencial de camomila, emulsões da fração de éter dietílico de camomila e emulsão da fração de éter dietílico de óleo essencial de alecrim, no entanto, não foram observados. As combinações da emulsão de óleo essencial de alecrim e emulsões da fração de éter dietílico de sálvia esclareia apresentaram resultados aditivos de forma interessante. Entre as emulsões de óleo essencial de sálvia esclareia, apenas as combinações com óleo essencial de alecrim mostraram efeitos sinérgicos. Concentrações sinérgicas foram observadas nas combinações de emulsões de óleo essencial de alfazema, óleo essencial de alecrim e fração de éter dietílico. Além disso, um efeito antibacteriano sinérgico foi alcançado pela combinação da emulsão de óleo essencial de alfazema e emulsão da fração de éter dietílico de sálvia esclareia na proporção de 30:70. Também, uma emulsão de óleo de alfazema e fração de éter dietílico de camomila na proporção de 90:10 mostrou efeitos inibitórios semelhantes. As combinações de emulsões do óleo de camomila e fração de éter dietílico de óleo essencial de alecrim não tiveram sucesso devido a problemas de solubilidade. O efeito sinérgico foi obtido a partir da combinação deste óleo com combinações de emulsões da fração de éter dietílico apenas pela emulsão de óleo essencial de alfazema. Em outras concentrações de combinação, combinações aditivas ou ineficazes foram classificadas (Tabela 9).
Estudos experimentais para o aprimoramento dos efeitos antimicrobianos direcionados pela combinação de vários óleos essenciais foram relatados em estudos anteriores.− Recentemente, foram realizados estudos em diferentes testes de atividade biológica usando nanoemulsões de óleos essenciais em vez de óleo puro. Neste estudo, 72 concentrações foram produzidas a partir de cada combinação, e os valores de FIC foram determinados em uma ampla faixa de concentração. Vinte e uma combinações de emulsões tiveram efeitos sinérgicos de acordo com os valores de FIC.
Embora existam numerosos relatos de avaliação antimicrobiana sobre óleos essenciais de sálvia, alfazema, alecrim e camomila,− até onde sabemos, este é o primeiro estudo experimental sobre as combinações antimicrobianas dos óleos essenciais, bem como de suas diferentes frações obtidas.
Resultados do Efeito Anti-inflamatório
O potencial anti-inflamatório dos mesmos quatro óleos essenciais, suas frações de n-hexano e éter dietílico, e suas emulsões foi avaliado utilizando o ensaio de inibição da 5-lipoxigenase (5-LOX) in vitro. De acordo com os resultados representados na Tabela 10, a maior porcentagem de inibição foi observada na fração de éter dietílico do óleo essencial de alecrim com um valor de 43,5 ± 2,9% e sua respectiva emulsão com 63,9 ± 0,6%. Como esperado, as porcentagens relativas de componentes ativos em cada fração do óleo essencial de alecrim aumentaram com o fracionamento. A principal razão para o aumento do efeito anti-inflamatório pelo fracionamento pode estar ligada à quantidade relativa de 47,4% de 1,8-cineol, enquanto a fração de éter dietílico continha um enriquecimento de 67,4%. O efeito anti-inflamatório do óleo essencial de sálvia esclareia na concentração de 50 μg/mL mostrou 23,2 ± 3,9% de inibição da LOX. As porcentagens dos componentes principais deste óleo nas frações de n-hexano e éter dietílico foram 63,9% de acetato de linalila, 28,3% de β-cariofileno e 65,7% de acetato de linalila, respectivamente. Os efeitos anti-inflamatórios do óleo essencial de sálvia esclareia e da fração de éter dietílico estavam na mesma faixa devido às semelhanças do componente principal e do teor relativo. As emulsões do óleo de sálvia esclareia (28,6 ± 1,5%) e da fração de éter dietílico (27,5 ± 0,2%) foram ligeiramente mais eficazes do que o óleo inicial.
Resultados dos Efeitos Anti-Inflamatórios
dos Óleos Essenciais, Frações e Emulsõesa
amostras (50 μg/mL) % inibição ± dp óleo essencial de alecrim 17,2 ± 3,4 óleo essencial de alecrim fração n-hexano 5,7 ± 1,8 alecrim óleo essencial de alecrim fração éter dietílico 43,5 ± 2,9 óleo essencial de alecrim emulsão 17,4 ± 1,3 óleo essencial de alecrim fração éter dietílico emulsão 63,9 ± 0,6 óleo essencial de sálvia esclareia 23,2 ± 3,9 óleo essencial de sálvia esclareia fração n-hexano 18,8 ± 3,1 sálvia esclareia óleo essencial fração éter dietílico 18,6 ± 1,5 óleo essencial de sálvia esclareia emulsão 28,6 ± 1,5 sálvia esclareia óleo essencial fração éter dietílico emulsão 27,5 ± 0,2 óleo essencial de lavanda 32,7 ± 2,5 óleo essencial de lavanda fração n-hexano 10,3 ± 1,4 lavanda óleo essencial de lavanda fração éter dietílico 15,5 ± 4,3 óleo essencial de lavanda emulsão 18,1 ± 2,4 óleo essencial de lavanda fração éter dietílico emulsão 21,1 ± 4,7 óleo essencial de camomila 16,3 ± 0,5 óleo essencial de camomila fração n-hexano 20,0 ± 3,1 camomila óleo essencial fração éter dietílico 22,9 ± 0,7 óleo essencial de camomila emulsão 10,2 ± 2,5 camomila óleo essencial fração éter dietílico emulsão 23,0 ± 0,6 NDGA (controle) 100 (IC50: 2,95 ± 0,21 μg/mL)
dp, desvio
padrão.
Os resultados do efeito anti-inflamatório do óleo essencial de lavanda spica, frações e suas respectivas emulsões estão listados comparativamente na Tabela 10. De acordo, a inibição da LOX do óleo essencial de lavanda spica, fração n-hexano, fração éter dietílico, emulsão do óleo essencial e emulsão da fração éter dietílico foi de 32,7 ± 2,5, 10,3 ± 1,4, 15 ± 4,3, 18,1 ± 2,4 e 21,1 ± 4,7%, respectivamente. No geral, os resultados do efeito inibitório das amostras de lavanda spica após emulsificações foram limitados.
A inibição da LOX do óleo essencial de camomila, fração n-hexano, fração éter dietílico, emulsão do óleo essencial e emulsão da fração éter dietílico a 50 μg/mL foi de 16,3 ± 0,5, 20 ± 3,1, 22,9 ± 0,7, 10,2 ± 2,5 e 23 ± 0,6%, respectivamente. O óleo de camomila analisado continha 19,4% de α-bisabolol e 41,6%, enquanto a fração éter dietílico continha 25,2% de α-bisabolol e 56,6% de óxido de α-bisabolol A, respectivamente. Os efeitos anti-inflamatórios da fração éter dietílico e da emulsão da fração éter dietílico também aumentaram relativamente em comparação ao óleo devido à composição química enriquecida.
No presente estudo, os efeitos anti-inflamatórios dos óleos essenciais, suas respectivas frações n-hexano, éter dietílico e suas emulsões foram determinados pela inibição da LOX in vitro, onde a emulsificação do óleo essencial resultou em efeitos anti-inflamatórios aumentados.
Resultados do Efeito Antioxidante
Neste estudo, três métodos diferentes foram utilizados para determinar o potencial e a capacidade antioxidante in vitro. Os resultados obtidos foram avaliados comparativamente, conforme ilustrado nas seções seguintes.
Efeito de Captura do Radical DPPH (1,1-Difenil-2-picrilhidrazil)
A porcentagem dos efeitos antioxidantes dos óleos essenciais, frações e suas respectivas emulsões determinada por este método a 0,5 mg/mL é apresentada na Tabela 11. Os efeitos antioxidantes das amostras de sálvia e lavanda spica em concentrações de 0,5–0,001 mg/mL foram insignificantes.
Captura do Radical DPPH, Captura do Ânion Radical ABTS
e Capacidade Antioxidante Redutora de Cobre (Teste
CUPRAC) de Óleos Essenciais, Frações e Emulsõesa
% inibição ± dp amostras DPPH (0,5 mg/mL) ABTS (0,4 mg/mL) CUPRAC (0,3 mg/mL) óleo essencial de alecrim 14,2 ± 0,7 - 7,8 ± 2,7 óleo essencial de alecrim fração n-hexano - - - óleo essencial de alecrim fração éter dietílico - - - emulsão de óleo essencial de alecrim 8,8 ± 2,8 10,0 ± 3,3 14,9 ± 4,6 emulsão da fração éter dietílico do óleo essencial de alecrim 21,5 ± 0,5 34,3 ± 4,4 27,2 ± 5,1 óleo essencial de sálvia esclaréia - - - óleo essencial de sálvia esclaréia fração n-hexano - - - óleo essencial de sálvia esclaréia fração éter dietílico - - - emulsão de óleo essencial de sálvia esclaréia - - - emulsão da fração éter dietílico do óleo essencial de sálvia esclaréia - - - óleo essencial de lavanda 6,3 ± 0,9 6,4 ± 2,3 - óleo essencial de lavanda fração n-hexano - - - óleo essencial de lavanda fração éter dietílico - - - emulsão de óleo essencial de lavanda 4,0 ± 1,2 5,8 ± 1,0 1,9 ± 0,4 emulsão da fração éter dietílico do óleo essencial de lavanda 3,5 ± 0,7 3,8 ± 0,3 - óleo essencial de camomila 56,4 ± 0,7 (EC50: 0,41 ± 0,00) 42,4 ± 1,0 10,4 ± 3,8 óleo essencial de camomila fração n-hexano 46,2 ± 2,0 35,4 ± 5,3 5,5 ± 1,9 óleo essencial de camomila fração éter dietílico 18,8 ± 1,7 12,9 ± 3,9 15,6 ± 4,4 emulsão de óleo essencial de camomila 53,7 ± 1,6 (EC50: 0,38 ± 0,01) 23,9 ± 6,3 42,8 ± 2,7 emulsão da fração éter dietílico do óleo essencial de camomila 15,3 ± 0,8 25,5 ± 2,6 26,3 ± 2,4 ácido ascórbico (0,02 mg/mL) 59,1 ± 0,8 (EC50: 0,008 ± 0,001) 83,8 ± 3,8 (EC50: 0,01 ± 0,001) EC50: 0,02 ± 0,00 ácido gálico (0,004 mg/mL) 58,0 ± 0,9 (EC50: 0,002 ± 0) EC50: 0,01 ± 0,00
-, não foram obtidos resultados devido
à turbidez/baixa atividade; dp, desvio padrão.
O efeito de sequestro do radical DPPH do óleo essencial de alecrim, emulsão e emulsão da fração éter dietílico foi determinado como 14,2 ± 0,7, 8,8 ± 2,8 e 21,5 ± 0,5%, respectivamente. Os resultados da fração n-hexano e da fração éter dietílico não puderam ser observados devido às condições experimentais. Propõe-se que, devido ao alto teor de 1,8-cineol na fração éter dietílico e à emulsificação, esta amostra pode ter um efeito antioxidante maior do que as outras. No estudo de Zaouali et al., o impacto antioxidante (EC50) do óleo essencial de alecrim esteve entre 6 e 28 μL/mL pelo método DPPH.
A Tabela 11 apresenta o efeito de sequestro do radical DPPH do óleo essencial de camomila, da fração n-hexano, da fração éter dietílico, da emulsão do óleo e da emulsão da fração éter dietílico. Na concentração de 0,5 mg/mL, o óleo essencial de camomila apresentou 56,4 ± 0,7% de inibição, e a emulsão deste óleo foi de 53,7 ± 1,6%, valor ligeiramente inferior. Além disso, a fração éter dietílico deste óleo apresentou um efeito de inibição de 18,8 ± 1,7%, e a emulsão da fração éter dietílico apresentou 15,3 ± 0,8%, respectivamente, seguindo o padrão. De acordo com este resultado, sugere-se que o efeito de sequestro de radicais não se altera pela emulsificação. Adicionalmente, a fração n-hexano do óleo essencial de camomila apresentou um efeito antioxidante de 46,2 ± 2,0%. Os resultados de GC/MS mostraram que o principal constituinte ativo da fração n-hexano foi 69,6% de (E)-β-farneseno. Este componente representa 17% no óleo essencial e 0,1% na fração éter dietílico deste óleo, sugerindo uma associação limitada. Em um estudo, o óleo essencial de M. chamomilla contendo 27,5% de camazuleno e 29,4% de α-bisabolol óxido A apresentou 75,6% de inibição no método DPPH na concentração de 400 μg/mL.
Efeito de Sequestro do Ânion Radical ABTS [2,2′-Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)]
A Tabela 11 apresenta o efeito antioxidante in vitro de óleos essenciais, frações e emulsões na concentração de 0,4 mg/mL. Os resultados experimentais mostraram que o óleo de alecrim e suas frações foram ineficazes, enquanto sua emulsão apresentou um fraco efeito antioxidante com 10,0 ± 3,3%, e a emulsão da fração éter dietílico aumentou para 34,3 ± 4,4%. Dessa forma, pode-se hipotetizar que o aumento da solubilidade do óleo de alecrim pela emulsificação pode ter contribuído para potencializar o efeito antioxidante.
Curiosamente, os resultados experimentais dos óleos essenciais de sálvia esclareia e lavanda aspic, frações e emulsões não foram notáveis quanto à atividade antioxidante.
O óleo essencial de camomila, a fração n-hexano e a fração éter dietílico apresentaram efeitos de sequestro do radical ABTS de 42,4 ± 1,0, 35,4 ± 5,3 e 12,9 ± 3,9%, respectivamente. A emulsão deste óleo apresentou um ligeiro aumento no efeito antioxidante com 23,9 ± 6,3%, e a emulsão da fração éter dietílico apresentou 25,5 ± 2,6% de inibição. Dessa forma, sugeriu-se que o efeito aumentou com a emulsificação da fração. No entanto, observou-se que o impacto não aumentou conforme o esperado com a emulsificação do óleo essencial. O efeito antioxidante relativamente alto da fração n-hexano foi proposto devido ao teor do componente principal (E)-β-farneseno, ou seja, 69,6%.
Resultados da Capacidade Antioxidante Redutora do Cobre (CUPRAC)
Os resultados obtidos com este método foram baseados na medição da absorbância a 450 nm da redução do complexo cobre(II)-neocuproína para cobre(I)-neocuproína, conforme mostrado na Tabela 11. Os resultados experimentais dos óleos essenciais de sálvia esclaréia e lavanda espicata, bem como suas frações a uma concentração de trabalho de 0,3 mg/mL, não foram notáveis.
O óleo essencial de alecrim, a emulsão e sua emulsão da fração de éter dietílico mostraram uma tendência de atividade aumentada com 7,8 ± 2,7, 14,9 ± 4,6 e 27,2 ± 5,1% de poder de redução de cobre, respectivamente. Em contraste, as frações de n-hexano e éter dietílico foram relativamente baixas. Como resultado, observou-se que o efeito aumentou aproximadamente 2 vezes pela emulsificação. Além disso, o aumento da solubilidade da fração de éter dietílico por emulsificação e a porcentagem relativamente alta de 1,8-cineol contribuíram para efeitos antioxidantes mais elevados do que outras amostras testadas.
As porcentagens de inibição do teste CUPRAC do óleo essencial de camomila estão listadas na Tabela 11. De acordo, o óleo, suas frações de n-hexano e éter dietílico mostraram 10,4 ± 3,8, 5,5 ± 1,9 e 15,6 ± 4,4% de efeitos antioxidantes in vitro, respectivamente. Os efeitos antioxidantes desta emulsão de óleo e emulsões de éter dietílico foram 42,8 ± 2,7 e 26,3 ± 2,4%, respectivamente. Como resultado, a consequência aumentou pela emulsificação do óleo essencial e suas frações com o auxílio deste método.
No geral, os resultados antioxidantes in vitro obtidos por três métodos diferentes mostraram que os óleos essenciais, frações e emulsões influenciaram a atividade. Assim, as variações do efeito antioxidante apresentaram diferenças de acordo com os métodos. O efeito antioxidante foi aumentado pelo fracionamento e emulsificação do óleo de alecrim. A atividade antioxidante do óleo de camomila aumentou pelo fracionamento e emulsificação, porém, apenas nos métodos ABTS e CUPRAC. Curiosamente, a fração de n-hexano do óleo essencial de camomila foi altamente eficaz nos métodos DPPH e ABTS, enquanto foi menos eficaz no método CUPRAC utilizado. Essas diferenças metodológicas são devidas a variações na polaridade das amostras individuais testadas, que eram incompatíveis com o respectivo método de teste. Além disso, problemas de solubilidade dos óleos essenciais e turbidez foram fatores limitantes em altas concentrações.
Os efeitos antioxidantes in vitro das amostras foram avaliados usando três métodos diferentes (DPPH, ABTS e CUPRAC), e os resultados foram avaliados comparativamente, onde o óleo essencial de camomila apresentou as melhores faixas de atividade. Observou-se que o efeito antioxidante foi aumentado pelo fracionamento e emulsificação. O mecanismo para tal observação poderia ser a solubilidade aprimorada de emulsões contendo gotículas de tamanho nanométrico.
Conclusões
Os achados deste estudo, pela primeira vez, destacaram a atividade antibacteriana e antibiofilme sinérgica in vitro, bem como a atividade antioxidante e anti-inflamatória de emulsões de óleos essenciais. Com base nas observações experimentais, as combinações de óleo essencial e fração aumentaram a solubilidade por meio de nanoemulsões, o que abriu novas perspectivas sobre atividades biológicas conhecidas. No entanto, estudos experimentais avançados mais detalhados, como testes de atividade biológica in vivo em modelos animais, ainda são necessários.
Materiais e Métodos
Óleos Essenciais e Fracionamento por Cromatografia em Coluna a Vácuo
Óleos essenciais de grau farmacêutico de Lavandula latifolia Medik. (Apoth. Bauer & Co., Alemanha), Matricaria chamomilla L. (da Caesar & Loretz), Rosmarinus officinalis L. (Caesar & Loretz, Alemanha) e Salvia sclarea L. (da Apoth. Bauer & Co., Alemanha) foram obtidos de fontes comerciais. As amostras também foram armazenadas no depósito da Universidade de Anadolu, Faculdade de Farmácia, Departamento de Farmacognosia, Turquia.
Para o fracionamento dos óleos essenciais, foi utilizada cromatografia em coluna a vácuo. Sílica gel 60 (Meck-7734, 0,06–0,2 mm) foi usada como adsorvente cromatográfico. 60 g de sílica gel foram ativadas por 2 h a 100 °C. A sílica gel foi misturada com n-hexano e introduzida na coluna (1,5 × 50 cm) à temperatura ambiente. 6 g de óleo essencial foram fracionados inicialmente usando n-hexano. Em seguida, usando éter dietílico, frações de metanol foram coletadas, respectivamente. O processo de fracionamento foi acompanhado e documentado por CCD. As quantidades das frações estão indicadas na Tabela 1. A composição química de três diferentes frações dos quatro óleos essenciais foi caracterizada por GC-FID e GC/MS, respectivamente (Tabelas 2345).
Análise Cromatográfica
Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
Para as separações, foram utilizadas placas revestidas de sílica de 0,2/0,25 mm (Merck, Alemanha) em suporte de alumínio, salvo indicação em contrário. 20 μL de óleos essenciais foram dissolvidos em 1 mL de tolueno e aplicados como 15 μL na placa. Um sistema de solvente tolueno-acetato de etila (95:5) foi desenvolvido, que separou as amostras, inicialmente visualizadas por UV, seguidas por um reagente de derivação (anisaldeído/ácido sulfúrico) após aplicação de calor a 100–105 °C na placa de CCD por 10 min. Os resultados foram comparados com padrões fornecidos nas Informações de Suporte.
Análise por GC/MS
As análises foram realizadas utilizando o sistema Agilent 5975 GC-MSD. Uma coluna de 60 m × 0,25 mm, espessura de filme de 0,25 mm (Innowax FSC) foi utilizada neste estudo. Hélio foi usado como gás de arraste com uma taxa de 0,8 mL/min. A temperatura do forno do GC foi mantida a 60 °C por 10 min e aumentada a uma taxa de 4 °C/min para atingir 220 °C. A temperatura foi mantida constante a 220 °C por 10 min e depois aumentada a uma taxa de 1 °C/min para atingir 240 °C. A razão de divisão e a temperatura do injetor foram de 40:1 e 250 °C, respectivamente. Os espectros de massa foram registrados a 70 eV, onde a faixa de massa foi de m/z 35–450.
Análise por GC-FID
As análises de GC foram realizadas utilizando um sistema Agilent 6890N GC. A temperatura do DIC (detector de ionização em chama) foi ajustada para 300 °C. A auto-injeção simultânea foi realizada na coluna duplicada sob as mesmas condições operacionais para obter a mesma ordem de eluição do sistema GC/MS. As porcentagens relativas (%) dos compostos separados foram avaliadas a partir dos respectivos cromatogramas do DIC.
Identificação dos Componentes
A identificação dos componentes do óleo essencial foi realizada avaliando os tempos de retenção relativos (TRs) com os de amostras autênticas ou comparando o índice de retenção relativo (IRR) com uma série de n-alcanos. Também foram realizadas buscas em bibliotecas computacionais (Wiley GC/MS Library, MassFinder Software 4.0) e na biblioteca interna "Baser Library of Essential Oil Constituents", desenvolvida com compostos genuínos e componentes conhecidos.
Preparação e Caracterização das Emulsões de Óleo Essencial
Uma alíquota de 10% (p/v) de óleo essencial e 10% (p/v) de Tween 80 foram agitadas a 840 rpm em um agitador magnético múltiplo por 15 min. Água destilada (80%) foi gotejada sobre a fase oleosa a uma taxa de 0,8 mL por minuto com uma bomba peristáltica, e a agitação foi continuada por mais 30 min. As emulsões resultantes contêm 100 mg/mL de óleo essencial.
As formulações foram avaliadas quanto à separação de fases, cremagem e turbidez e incubadas à temperatura ambiente por 48 h. Após isso, o teste de resistência mecânica foi realizado por centrifugação. Além disso, o tamanho das gotículas, o IPD e os valores de potencial zeta foram medidos. As emulsões foram diluídas com água destilada antes do uso nos estudos de caracterização e bioatividade.
Turbidez
As propriedades de turbidez das emulsões foram medidas a 600 nm usando um espectrofotômetro UV-visível (Shimadzu, UV-PharmaSpec 1700) contra o branco (água destilada), seguindo o método.
Centrifugação
Os sistemas de emulsão preparados foram centrifugados a 3000 rpm por 20 min em uma microcentrífuga (Labnet 24D, EUA). Após a centrifugação, as formulações foram avaliadas quanto à separação de fases. As emulsões submetidas ao teste de centrifugação foram diluídas 1/100 (v/v), e as seguintes alterações na aparência foram registradas, se houver.
pH
Um pHmetro digital (Heidolph, Alemanha) foi utilizado para medir os valores de pH das formulações após as respectivas calibrações.
Tamanho das Gotículas e Índice de Polidispersão
As emulsões preparadas foram diluídas 1:100 com água destilada para as análises de tamanho de gotículas, IPD e potencial zeta pelo instrumento Zeta sizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Reino Unido) à temperatura ambiente. O índice de refração das emulsões foi medido por um refratômetro (Krüss, Alemanha) para determinar o tamanho das gotículas. Os espectros das análises de tamanho zeta são fornecidos nas Informações de Suporte.
Avaliação da Atividade Antibacteriana Sinérgica pelo Método de Microdiluição
A cepa padrão S. aureus ATCC 11632 foi utilizada, empregando-se ágar Mueller–Hinton (MHA) e caldo Mueller–Hinton (MHB) para incubação a 37 °C por 24 h. A densidade bacteriana foi ajustada conforme McFarland nº 0,5 (aproximadamente 10⁸ UFC/mL) utilizando um turbidímetro.
100 μL dos óleos essenciais teste e de suas emulsões da fração éter dietílico foram transferidos para uma microplaca de 96 poços de fundo chato. Diluições seriadas (0,01–10 mg/mL) das amostras foram preparadas para obter as concentrações resultantes. Os microrganismos com densidade ajustada (100 μL de solução diluída a 1%) foram adicionados às placas. Após 24 h de incubação a 37 °C, 20 μL de solução de resazurina a 0,01% foram adicionados e incubados a 37 °C por 3 h. Todos os experimentos foram repetidos em triplicata, e as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) médias foram relatadas utilizando controles positivo e negativo, conforme Tabelas 7 e 8.
Conforme apresentado em trabalho anterior, os óleos essenciais e as emulsões da fração éter dietílico em uma concentração de pelo menos 4 vezes os valores de CIM foram combinados em combinações binárias e nove proporções diferentes: 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 e 90:10 (v/v), respectivamente. Os resultados são apresentados como concentração inibitória fracionada [CIF (A + B) = (CIM AB/CIM A) + (CIM AB/CIM B)], conforme mostrado na Tabela 9. Conforme definido na literatura, o cálculo de CIF ≤ 0,5 foi classificado como sinérgico, 0,5 < CIF ≤ 1 como aditivo, 1 < CIF < 4 como ineficaz e CIF ≥ 4 como antagônico.
Determinação do Efeito Antibiofilme
As bactérias cultivadas conforme descrito acima foram diluídas 1/10, e soluções de 200 μL foram adicionadas aos poços. Após 48 h de incubação a 37 °C, utilizando uma solução de NaCl, a lavagem foi realizada duas vezes. 100 μL do meio teste e das amostras teste foram adicionados à camada de biofilme resultante. Após 24 h de incubação a 37 °C, 20 μL de resazurina foram adicionados. As concentrações inibitórias mínimas do biofilme foram determinadas após experimentação em triplicata, e os valores médios resultantes estão listados na Tabela 8.
Atividade Anti-Inflamatória In Vitro: Inibição da Atividade Enzimática da LOX
Os níveis de inibição da atividade enzimática da LOX (1.13.11.12, 7,9 unidades/mg) foram determinados em uma placa especial de quartzo de 96 poços (Hellma), espectrofotometricamente (BioTek Synergy, EUA) de acordo com métodos anteriores. 1,94 mL de tampão fosfato de potássio (100 mM; pH: 8,80), 40 μL de diferentes concentrações das amostras teste e 20 μL de LOX foram misturados e incubados a 25 °C por 10 min, seguido pela adição de 300 μL desta mistura a cada poço. Subsequentemente, 7,5 μL de ácido linoleico foram adicionados e misturados por 30 s. O ácido nordiidroguaiarético (NDGA) foi utilizado como controle positivo. As alterações na absorbância foram medidas a 243 nm por 10 min em dez intervalos. Estes experimentos foram realizados em quatro repetições, e os resultados foram expressos como porcentagem de inibição (%I). E, Absorbância da enzima sem adição de amostra; S, Absorbância da enzima com adição de amostra.
Avaliações da Atividade Antioxidante In Vitro
Ensaio de Captura do Radical DPPH
As amostras foram preparadas de acordo com métodos previamente descritos na faixa de 0,5–0,001 mg/mL. Em conformidade, 100 μL de solução de DPPH a 80 μg/mL foram adicionados às amostras para iniciar a reação, que foi então incubada a temperatura ambiente no escuro por 60 min. Ao final do período de incubação, os valores de absorbância UV foram registrados a 517 nm. Ácido ascórbico e ácido gálico (0,125–0,0001 mg/mL) foram utilizados como controles positivos. Os experimentos foram realizados em triplicata, e as porcentagens de inibição (%I) são apresentadas na Tabela 11.
Ensaio de Captura do Ânion Radical ABTS
O ensaio foi realizado de acordo com trabalho anterior. As soluções de ABTS 7 mM preparadas com tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) e persulfato de sódio (Na2S2O8) 2,45 mM foram misturadas na proporção de 1:2 e incubadas no agitador por 12 h no escuro. A absorbância da solução de ABTS a 734 nm foi de 0,700 ± 0,025 nm. Em seguida, 150 μL da amostra foram adicionados a 30 μL de solução de ABTS e deixados incubar a temperatura ambiente no escuro por 30 min. Ácido ascórbico foi utilizado como padrão de comparação, onde os valores de absorbância foram lidos a 734 nm. Todos os experimentos foram repetidos em triplicata, e os resultados de porcentagem de inibição (%I) estão listados na Tabela 11.
Ensaio CUPRAC
Seguindo o procedimento relatado anteriormente, 50 μL de solução de CuCl2 (0,01 M), 50 μL de tampão acetato de amônio (pH: 7) e 50 μL de solução de neocuproína (7,5 × 10–3 M) foram adicionados a uma amostra teste de 27,5 μL. Esta mistura foi incubada no escuro e a temperatura ambiente por 30 min. Ácidos gálico e ascórbico foram utilizados como agentes antioxidantes padrão nos experimentos para comparação. Os valores de absorbância foram registrados a 450 nm, e os resultados foram calculados a partir de experimentos em triplicata, conforme Tabela 11.
Informações de Suporte Disponíveis
Preparação de padrões de óleos essenciais para CCD de acordo com a PhEur com modificações; imagem de CCD do óleo essencial de L. latifolia e suas frações; imagem de CCD do óleo essencial de R. officinalis e suas frações; imagem de CCD do óleo essencial de S. sclarea e frações; imagem de CCD do óleo essencial de M. chamomilla e suas frações; e distribuição do tamanho de gotículas das emulsões de óleos essenciais (PDF)
As Informações de Suporte estão disponíveis gratuitamente em https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsomega.2c07508.
Material Suplementar
Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.
Referências
Autoemulsificação em tecnologias químicas e farmacêuticas
Nanoemulsões: Uma tecnologia emergente na indústria alimentícia
Nanoemulsões para liberação de fármacos
Nanoemulsões: Métodos de formulação e aspectos de estabilidade
Contexto, limitações e perspectivas futuras em microemulsões e nanoemulsões de grau alimentício
Nanoemulsões de água em óleo preparadas por emulsificação espontânea: Novos insights sobre o processo de formulação
Atualizações recentes sobre a química, bioatividades, modo de ação e aplicações industriais de óleos essenciais vegetais
Óleos essenciais carregados em nanossistemas: Uma estratégia em desenvolvimento para uma abordagem terapêutica bem-sucedida
Sistemas nanoestruturados contendo um óleo essencial: Proteção contra volatilização
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Melhoria da estabilidade e solubilidade do extrato da vagem de Sompoi (Acacia concinna Linn.) por microemulsão tópica
Fracionamento do óleo essencial de capim-limão (Cymbopogon citratus) por destilação fracionada a vácuo
Espécies de alecrim: Uma revisão de fitoquímicos, bioatividades e aplicações industriais
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Um estudo sobre a ação anti-inflamatória e analgésica periférica do óleo de Salvia sclarea e seus principais componentes
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Potencial farmacológico de Matricaria recutita - Uma revisão
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Combinação antibacteriana sinérgica do óleo essencial de Lavandula latifolia Medik. com cânfora
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