pmid: "37158802"
title: "A Química e a Biologia da Hibridização do Colágeno"
authors: "Li X, Zhang Q, Yu SM, Li Y"
journal: "Journal of the American Chemical Society"
pubdate: "2023 May 24"
doi: "10.1021/jacs.3c00713"
source: "PMC Full Text"

A Química e a Biologia da Hibridização do Colágeno

Autores

Li X, Zhang Q, Yu SM, Li Y

Periodico

Journal of the American Chemical Society (2023 May 24)

Conteudo

A Química e a Biologia da Hibridização do Colágeno
O colágeno fornece suporte mecânico e biológico para praticamente todos os tecidos humanos na matriz extracelular (MEC). Sua estrutura molecular definidora, a tripla-hélice, pode ser danificada e desnaturada em doenças e lesões. Para investigar o dano ao colágeno, o conceito de hibridização do colágeno foi proposto, revisado e validado por meio de uma série de investigações relatadas já em 1973: uma fita peptídica mimética do colágeno pode formar uma tripla-hélice híbrida com as cadeias desnaturadas do colágeno natural, mas não com as proteínas de colágeno intactas em tripla-hélice, permitindo a avaliação da degradação proteolítica ou da ruptura mecânica do colágeno em um tecido de interesse. Aqui descrevemos o conceito e o desenvolvimento da hibridização do colágeno, resumimos décadas de investigações químicas sobre as regras subjacentes ao dobramento da tripla-hélice do colágeno e discutimos as crescentes evidências biomédicas sobre a desnaturação do colágeno como uma assinatura da MEC anteriormente negligenciada para uma série de condições envolvendo remodelação tecidual patológica e lesões mecânicas. Finalmente, propomos uma série de questões emergentes sobre a natureza química e biológica da desnaturação do colágeno e destacamos as oportunidades diagnósticas e terapêuticas decorrentes de sua segmentação.
Resumo Gráfico
Introdução
Como a proteína mais abundante e o componente predominante da matriz extracelular (MEC), o colágeno forma o ambiente vivo com suporte estrutural e biológico para adesão, migração, diferenciação e função celular em quase todos os órgãos humanos. Em muitas doenças e condições patológicas, o colágeno nas lesões pode sofrer danos substanciais, assim como edifícios desmoronados por desastres naturais. Por exemplo, a degradação do colágeno, comumente mediada por metaloproteinases da matriz (MMPs), está intrinsecamente envolvida na metástase do câncer. Na aterosclerose, o enfraquecimento proteolítico da capa fibrosa do colágeno torna as placas suscetíveis à ruptura, levando ao infarto do miocárdio e à morte cardíaca súbita. Além disso, à medida que muitos distúrbios fibróticos progridem, a síntese e a degradação do colágeno são frequentemente aumentadas simultaneamente. O colágeno também é o principal componente de suporte de carga dos tecidos conjuntivos, fornecendo resistência à tração para ossos, cartilagens, ligamentos, tendões, músculos, pele, córneas e vasos sanguíneos. Lesões nesses tecidos envolvem em grande parte a destruição mecânica das estruturas hierárquicas de colágeno em várias escalas. Por exemplo, a osteoartrite, uma condição incapacitante prevalente na população idosa, é considerada amplamente impulsionada pelo uso excessivo da cartilagem articular nas articulações, que é rica em colágeno tipo II.
Todos os 28 subtipos de colágeno compartilham um motivo estrutural icônico no qual três cadeias proteicas se entrelaçam em uma tripla hélice, formando pontes de hidrogênio estabilizadoras entre as cadeias. Essa estrutura de tripla hélice protege as moléculas de colágeno na MEC da degradação pela maioria das proteases, exceto certas colagenases, como MMP1, 3, 8, 13, 14 e Catepsina K. Após a clivagem inicial do colágeno I com MMP1, por exemplo, as triplas hélices de colágeno fragmentadas tornam-se termicamente instáveis e se desenrolam espontaneamente à temperatura corporal, deixando as cadeias de colágeno clivadas e desnaturadas reticuladas dentro da matriz parcialmente degradada.

Enquanto isso, estudos biomecânicos mostraram que as moléculas de colágeno em tecidos conjuntivos (por exemplo, tendão) podem se tornar suscetíveis à digestão por tripsina após sobrecarga tecidual ou fadiga cíclica, indicando que a ruptura mecânica também pode comprometer a estrutura da tripla hélice de colágeno nos tecidos. Além disso, as células podem reconhecer prontamente a desnaturação do colágeno: os receptores DDR1 e DDR2, bem como as integrinas α2β1, α1β1, α10β1 e α11β1, reconhecem seus domínios de colágeno alvo apenas na conformação de tripla hélice; no entanto, as cadeias simples de colágeno desnaturado podem expor sítios crípticos que de outra forma estariam inativos na forma de tripla hélice, incluindo numerosas sequências RGD que são reconhecidas por outro subconjunto de integrinas. Pode-se imaginar que a desnaturação do colágeno pode ser uma característica crucial de tecidos submetidos a remodelação patológica ou lesão mecânica, que pode ser explorada para fins diagnósticos e terapêuticos.

Nesse sentido, uma série de questões científicas sobre a estrutura, os efeitos celulares e as vias de degradação a jusante das matrizes de colágeno desnaturado precisa ser respondida tanto para objetivos fundamentais quanto biomédicos.
Embora técnicas microscópicas avançadas, como geração de segundo harmônico (SHG), microscopia de força atômica (AFM) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) possam indicar alteração estrutural do colágeno na escala de fibras (Fig. 1a), elas não conseguem revelar moléculas de colágeno desnaturadas in situ. Portanto, um agente de direcionamento que reconheça especificamente as moléculas de colágeno desnaturadas poderia ser o primeiro passo para abordar as questões mencionadas, identificando e localizando danos ao colágeno no corpo. Da mesma forma, enquanto as atividades proteolíticas a montante que levam à desnaturação do colágeno podem ser facilmente investigadas usando substratos de MMP baseados em fluorescência (por exemplo, MMPSense), o próprio colágeno desnaturado é tipicamente indetectável dentro do tecido de interesse (Fig. 1b). Isso ocorre porque a maioria dos corantes comuns de moléculas pequenas (Picrosirius red e tricrômico de Masson) e anticorpos se ligam ao colágeno independentemente de seu dobramento em tripla hélice. Para esse fim, pelo menos duas classes de anticorpos monoclonais (mAbs) contra colágenos desnaturados foram desenvolvidas. (i) A partir do final dos anos 1980, Poole e colaboradores desenvolveram uma série de mAbs para avaliar danos ao colágeno II. Usando colágeno II tratado com brometo de cianogênio como peptídeos imunizantes, eles produziram o mAb COL2–3/4m, que reage com o colágeno II desnaturado. O desenvolvimento posterior usando epítopos peptídicos nos locais de clivagem por MMP resultou nos mAbs C1,2C (epítopo: GGEGPOGPQG, O: hidroxiprolina) e C2C (epítopo: GPOGQG) contra o colágeno II clivado por MMP. As eficácias desses anticorpos foram bem demonstradas em ensaios de fluidos corporais e imuno-colorações de cartilagem articular humana para detecção da degradação do colágeno II tanto na osteoartrite quanto na artrite reumatoide. (ii) Por meio de imunização subtrativa usando colágenos desnaturados termicamente, Brooks e colaboradores desenvolveram mAbs direcionados aos epítopos crípticos dentro de colágenos proteolisados ou desnaturados nos anos 2000. Entre eles, o mAb HU177 reconhece o epítopo PGxPG (x: múltiplos resíduos de aminoácidos) nas cadeias desenroladas dos colágenos tipo I-V e demonstrou inibir a angiogênese e o crescimento tumoral ao interromper as interações celulares com o colágeno desnaturado. Um ensaio clínico de fase I para avaliar a atividade antitumoral da versão humanizada do HU177 produziu resultados encorajadores em 2010. Além disso, níveis elevados de epítopos solúveis de HU177 foram detectados no soro de pacientes com melanoma com piores prognósticos. Esses trabalhos demonstram bem as atividades biológicas distintas dos colágenos desnaturados, bem como seus potenciais diagnósticos e terapêuticos.
Nas últimas duas décadas, nós e outros desenvolvemos um peptídeo mimético do colágeno para alvejar fitas de colágeno desnaturadas de forma semelhante à hibridização de tripla hélice, o que permitiu a detecção in situ da desnaturação do colágeno em uma variedade de tecidos patológicos e investigações sobre sua natureza biológica nessas lesões. Nesta perspectiva, introduzimos o conceito e o desenvolvimento da hibridização do colágeno e resumimos as décadas de pesquisa química em andamento sobre os princípios estruturais subjacentes ao enovelamento da tripla hélice do colágeno. Também discutimos as descobertas biomédicas atuais sobre a desnaturação do colágeno em uma ampla gama de doenças e lesões, visando potenciais aplicações diagnósticas e terapêuticas.
Peptídeo de Hibridização do Colágeno
A tripla hélice é uma estrutura super-secundária virtualmente exclusiva dos colágenos. O Peptídeo de Hibridização do Colágeno (CHP) pode hibridizar especificamente com fitas de colágeno desnaturadas ao reformar a estrutura de tripla hélice, de forma semelhante a um iniciador se ligando a fitas de DNA derretidas durante a PCR (Fig. 1c). O empacotamento compacto de uma tripla hélice de colágeno exige que cada terceiro resíduo seja Gly, criando uma sequência de tripletos repetidos GlyXaaYaa. No projeto dos CHPs de primeira geração, há 6–10 unidades repetidas de glicina(G)–prolina(P)–hidroxiprolina(O). O tripleto GPO possui a maior propensão a formar tripla hélice entre todas as unidades GlyXaaYaa encontradas nos colágenos nativos, permitindo que os CHPs hibridizem firmemente com as fitas de colágeno desnaturadas. Presumivelmente, o híbrido é estabilizado por múltiplas pontes de hidrogênio formadas entre os esqueletos do CHP e das fitas de colágeno, semelhante a uma tripla hélice de colágeno nativa.
A hibridização CHP-colágeno envolve várias características principais (Fig. 1). (1) Seletividade estrutural: os CHPs mostraram ligar-se fortemente a cadeias de colágeno desnaturadas por calor, MMPs e danos mecânicos, mas têm afinidade muito menor ao colágeno intacto devido à ausência de sítios de ligação. (2) Tipos de colágeno: como a estrutura de tripla hélice é onipresente em todos os tipos de colágeno em mamíferos, os CHPs se ligam a cadeias de colágeno desenroladas entre espécies animais (por exemplo, humano, rato, camundongo) e tipos de colágeno (por exemplo, tipo I, II, III, IV). (3) Especificidade de ligação: sem aminoácidos carregados e hidrofóbicos nas sequências, os CHPs exibem virtualmente nenhuma ligação inespecífica a biomoléculas não colagenosas. Isso também ocorre porque a estrutura de tripla hélice é essencialmente exclusiva dos colágenos em mamíferos, exceto por um grupo de proteínas secretadas envolvidas na defesa do hospedeiro que contêm domínios de tripla hélice (por exemplo, C1q, proteína surfactante A e D). Enquanto isso, proteínas semelhantes ao colágeno com sequências repetitivas G-X-Y (por exemplo, proteínas semelhantes ao colágeno estreptocócicas) também estão amplamente presentes em bactérias, que também poderiam ser alvos potenciais dos CHPs. (4) Estabilidade sérica: os CHPs são altamente estáveis em soro contra um painel completo de enzimas, incluindo proteases e esterases, graças às suas sequências neutras, hidrofílicas, ricas em Pro e repetitivas. (5) Capacidade histopatológica e in vivo: os CHPs marcados fluorescentemente permitiram avaliação histológica do dano ao colágeno na osteoartrite e degeneração do disco intervertebral, bem como remodelação do colágeno na fibrose miocárdica, glomerular (Fig. 1d), hepática e pulmonar. Além disso, os CHPs administrados por via intravenosa mostraram direcionar a remodelação patológica do colágeno (por exemplo, xenoenxertos tumorais e lesões ósseas osteolíticas) e a destruição mecânica (por exemplo, disco intervertebral, Fig. 1f–g) in vivo.
Direcionar o colágeno desnaturado pela hibridização de tripla hélice é um conceito único na ligação estrutural, particularmente em comparação com abordagens convencionais baseadas em bibliotecas para descoberta de ligantes, como exibição de fagos e produção de anticorpos. Diferentemente do reconhecimento epítopo-anticorpo baseado em interações de cadeias laterais de aminoácidos hidrofóbicos e carregados, a tripla hélice de colágeno se forma predominantemente por ligações de hidrogênio entre as cadeias principais. As triplas hélices auto-montadas de CHP têm sido estudadas como um modelo estrutural para o colágeno desde a década de 1960, mas seu poder para sondar a estrutura molecular do colágeno não foi aproveitado até as últimas décadas.
Desenvolvimento dos Peptídeos de Hibridização de Colágeno
A formação híbrida entre cadeias α de colágeno bovino e polipeptídeos sintéticos [por exemplo, (ProAlaGly)n, (ProProGly)n] foi relatada pela primeira vez em 1973 por Heidemann, Harrap e Schiele. Após resfriar a mistura aquecida de colágeno-peptídeo, eles isolaram o híbrido por cromatografia de exclusão molecular e o identificaram por análise de aminoácidos. Dados de rotação óptica apoiaram que uma estrutura de tripla hélice comum foi adotada pelo híbrido.
O grupo de Yu relatou em 2005 que um peptídeo mimético de colágeno (CMP) com forte propensão tripla-helicoidal [por exemplo, (ProHypGly)10] pode aderir à proteína colágeno intacta, presumivelmente por meio de um processo de "troca de fita", formando uma tripla-hélice híbrida, especialmente nos domínios termicamente lábeis da sequência de colágeno, um processo análogo à invasão espontânea e ao deslocamento de fita da dupla hélice do DNA por um ácido nucleico peptídico. Noções semelhantes também foram propostas por outros pesquisadores, cujo foco era explorar os peptídeos de colágeno de fita simples para invadir miméticos de colágeno sintéticos, em vez da proteína colágeno real. Inicialmente, Yu e seus colegas testaram a hibridização adicionando diretamente soluções aquecidas de monômeros de CMP em filmes de colágeno e acreditavam que a desnaturação da proteína colágeno não era necessária para a ligação do CMP. Essa ideia motivou nossos primeiros esforços durante os anos 2000 para ancorar medicamentos terapêuticos (por exemplo, fatores de crescimento) em tecidos vivos e biomateriais colagenosos para aplicações em engenharia de tecidos.

Para dissociar o fator da desnaturação do colágeno da hibridização do CMP, projetamos um CMP monomérico em gaiola, cujo dobramento triplo-helicoidal pode ser foto-ativado, de modo que os experimentos de hibridização pudessem ser realizados sem aquecimento. Quando os ensaios de ligação foram realizados a 4 °C, expondo o CMP em gaiola à luz UV diretamente em filmes de colágeno e gelatina, Li descobriu que o peptídeo ativado por UV apresenta ligação quase insignificante no colágeno intacto, mas exibe um nível de adesão mais de uma ordem de grandeza maior para a gelatina, bem como para o colágeno desnaturado pela degradação por MMP1. Esses resultados mudaram decisivamente a hipótese original de que o CMP monomérico pode se hibridizar espontaneamente com moléculas de colágeno intactas por meio de invasão e deslocamento de fita, e redirecionaram a pesquisa para alvejar colágeno desnaturado em tecidos patológicos para detecção, imageamento e tratamento de condições associadas à remodelação do colágeno. Em 2016, cunhamos o termo "peptídeo de hibridização de colágeno" para esses peptídeos sintéticos racionalmente projetados que alvejam colágenos desnaturados via dobramento triplo-helicoidal, e começamos a usar a sigla CHP em relatos subsequentes. Comparado ao termo peptídeo mimético de colágeno (CMP), o termo CHP enfatiza a função de hibridização do peptídeo e implica sua estrutura de fita simples em ação. Logo descobrimos que, além do colágeno degradado por MMP, os CHPs também podem alvejar colágeno danificado mecanicamente em tecidos conjuntivos, bem como moléculas de colágeno desenroladas em arcabouços de ECM descelularizados com diferentes agentes. Essas descobertas ajudaram a expandir o conceito de hibridização de colágeno para os campos da biomecânica e da engenharia de tecidos.

Química da Hibridização de Colágeno
A base estrutural da hibridização do colágeno é a forte propensão do CHP em formar a tripla hélice de colágeno. Para um CHP típico baseado em GlyProHyp, essa propensão reside no esqueleto peptídico e é dominada por vários elementos estruturais, incluindo um resíduo de glicina pequeno o suficiente para caber dentro da tripla hélice apertada, uma rede de pontes de hidrogênio intercadeias, bem como resíduos abundantes de prolina e hidroxiprolina cujos anéis de pirrolidina impõem a conformação do esqueleto. Aqui resumimos os princípios orientadores do dobramento em tripla hélice a partir de décadas de pesquisa química baseada na unidade tripla GPO e focamos em como eles podem ser aplicados a novos designs de CHP para hibridização. Tópicos relacionados, como o dobramento em tripla hélice das sequências de CMP modificadas com aminoácidos naturais, bem como as automontagens heterotriméricas de CMP baseadas em pareamento de cargas, foram extensivamente revisados em outros lugares e, portanto, não são incluídos nesta perspectiva.
As amidas.
Como a maioria das proteínas dobradas, as pontes de hidrogênio intercadeias entre as amidas do esqueleto são diretamente responsáveis pela integridade estrutural do colágeno. Dentro da tripla hélice (GlyXaaYaa)n, as pontes de hidrogênio N-H(Gly)…O=C(Xaa) (na maioria das vezes Xaa: Pro) são formadas especificamente entre as cadeias (Fig. 2, painel i). Ao substituir a amida central Pro-Gly de (ProProGly)10 por um éster sem hidrogênio (1, Fig. 2a), Raines e colegas estimaram que uma ponte de hidrogênio intercadeia contribui com aproximadamente −2,0 kcal/mol para a estabilização da tripla hélice. Eles também descobriram que a tripla hélice é estabilizada quando a amida de ligação de hidrogênio na posição Pro-Gly é substituída por uma tioamida (2, Fig. 2a), um doador de ligação de hidrogênio mais forte que a oxoamida natural.
A ligação amida peptídica possui um caráter de ligação dupla parcial, resultando em duas conformações distintas: cis e trans (Fig. 2, painel ii). Na tripla hélice de colágeno dobrada, todas as amidas devem ser o isômero trans. Como a ligação amida que precede o resíduo de Pro dialquilado tem uma propensão maior à conformação cis do que os aminoácidos comuns, Etzkorn e colegas imaginaram que travar a amida Gly-Pro na conformação trans com um isóstero de alceno (3, Fig. 2a) promoveria o dobramento em tripla hélice ao reduzir o custo entrópico da isomerização cis-trans. No entanto, o isóstero trans-alceno resultante foi fortemente desestabilizante. Essa discrepância destaca a contribuição de fatores estruturais diferentes da isomerização da ligação amida, como as interações n→π* entre as amidas do esqueleto.
Análogos da glicina.
A cada 3º resíduo dentro de um domínio tripla-hélice de colágeno é ocupado por Gly, o único resíduo de aminoácido que pode ser acomodado estericamente dentro da hélice compacta. Substituir Gly por qualquer outro aminoácido canônico desestabilizaria substancialmente a tripla-hélice. Criativamente, o grupo de Chenoweth substituiu um resíduo de Gly em um peptídeo de colágeno por aza-glicina (azGly, 4, Fig. 2b): devido à possível ligação de hidrogênio extra entre o grupo NH da azGly e uma carbonila intercadeia, a estabilidade térmica da tripla-hélice aumentou em até 10 °C. Eles validaram ainda que a introdução de múltiplos resíduos de azGly estabiliza a estrutura sinergicamente, enquanto posicionar azGly próximo ao centro do peptídeo de colágeno tem um efeito estabilizador mais forte do que em ambas as extremidades. A equipe também relatou a primeira estrutura cristalina de um peptídeo modelo de colágeno tripla-hélice apresentando uma substituição por azGly. Juntos, seus estudos com azGly demonstraram uma base estrutural crítica para a formação da tripla-hélice com modificação de Gly: seja trazendo novas interações estabilizadoras, ela deve preservar os estritos requisitos estéricos e conformacionais para Gly na tripla-hélice.

Análogos de prolina.
A estabilidade térmica do colágeno tripla-hélice é dramaticamente aumentada através da hidroxilação de Pro, uma etapa de modificação pós-traducional antes que as cadeias se dobrem em uma tripla-hélice. A primeira estrutura cristalina da tripla-hélice de colágeno mostrou que o grupo OH no anel pirrolidínico não forma ligações de hidrogênio intercadeia diretas. Para entender a natureza química de seu efeito estabilizador, um trabalho seminal de Raines e colegas em 1998 demonstrou que substituir cada Hyp por um resíduo de 4(R)-fluoroprolina (Flp, 5, Fig. 2c) em (ProHypGly)10 aumentou drasticamente a estabilidade da tripla-hélice (Tm: 69 → 91 °C). Como o flúor não forma ligações de hidrogênio, esse resultado desenfatizou a contribuição das ligações de hidrogênio previamente propostas formadas entre os grupos OH da Hyp e moléculas de água de ponte. Uma série de estudos adicionais do grupo de Raines sugeriu que a estabilização de Flp ou Hyp vem do efeito indutivo do átomo eletronegativo de flúor ou oxigênio, que favorece a conformação de dobramento do anel Cγ-exo (Fig. 2, painel iii) do anel pirrolidínico e o isômero trans da ligação amida, ambos os quais promovem a conformação correta do esqueleto peptídico para a formação da tripla-hélice.
Os estudos de Raines sobre as propriedades estereoeletrônicas estabilizadoras da Hyp e da Flp abriram um caminho para o design de peptídeos miméticos de colágeno com derivados sintéticos de prolina contendo grupos retiradores de elétrons. Particularmente, o grupo de Wennemers substituiu a Hyp por (4R)azido-prolina (Azp, 6, Fig. 2c), demonstrando que a (4R)Azp tem um efeito estereoeletrônico estabilizador semelhante ao da Hyp, ao mesmo tempo que permite funcionalização facilitada via química "click". Eles também investigaram as montagens de tripla hélice comutáveis mediadas por resíduos de amino-prolina e γ-azaprolina (7, 8, Fig. 2c), cujas conformações de anel e formação/liberação de ligações de hidrogênio podem ser controladas por alterações de pH. Além disso, o grupo recentemente anexou porções hidrofóbicas, como ácidos graxos, através da N-acilação da amino-prolina (9, Fig. 2c), e descobriu que os lipídios pendentes promovem e aceleram a formação da tripla hélice, e ainda mais para ácidos graxos mais longos e flexíveis. Por fim, grupos retiradores de elétrons mais exóticos, como aminooxi (10, Fig. 2c) e porções de oxima, foram anexados à prolina, o que permitiu a reticulação quimiosseletiva dentro de triplas hélices de colágeno por ligação de oxima, bem como imagens direcionadas da reticulação de colágeno mediada pela lisil oxidase in vivo.

Um princípio fundamental de quase todos os estudos de derivatização de prolina é a pré-organização: se a propensão das cadeias peptídicas livres para adotar a conformação necessária (isto é, uma hélice do tipo poliprolina II, PPII) for aumentada, o custo entrópico para a formação da tripla hélice é reduzido, levando assim à estabilidade estrutural. Ao buscar novas estratégias de pré-organização diferentes da substituição na posição 4 da prolina, Baumann, Schmalz e colaboradores desenvolveram uma abordagem de "grampeamento de prolina", na qual dois anéis de prolina adjacentes são conectados covalentemente por meio de uma ponte C2 para congelar a conformação da hélice PPII (11, Fig. 2c), o que produziu triplas hélices com estabilidades próximas ao peptídeo modelo parental de colágeno.
O alto teor de prolina no colágeno humano (~22%) é crucial para sua estrutura de tripla hélice. Como o único aminoácido N-substituído codificado ribossomicamente, a prolina promove estruturas secundárias de proteínas distintas, devido ao seu anel pirrolidina único com os ângulos diedros da cadeia principal restritos e seu grupo amida terciário que não possui capacidade de doar uma ligação de hidrogênio. A substituição da Pro no tripleto GlyProHyp por qualquer um dos aminoácidos naturais desestabilizará a tripla hélice; portanto, por mais de cinco décadas, a prolina e seus derivados têm sido considerados obrigatórios para o projeto de miméticos sintéticos de colágeno. Para apreciar a singularidade do anel pirrolidina da prolina, o grupo de Wennemers explorou o efeito de análogos de prolina com anéis de quatro e seis membros na tripla hélice de colágeno (12, Fig. 2d): eles mostraram que ambos os análogos desestabilizam a estrutura devido à conformação trans/cis inadequada ou ângulos diedros. Além disso, o grupo de Raines descobriu que a conversão de Pro em N-metil-L-alanina (13, Fig. 2d, ou seja, removendo apenas o γ-carbono e abrindo a estrutura do anel) desestabiliza substancialmente a tripla hélice. Esses estudos destacaram a característica conformacional perfeitamente ajustada da Pro para a tripla hélice de colágeno.
Alternativamente, de uma perspectiva química, a prolina também pode ser considerada um aminoácido α N-substituído. Na tentativa de produzir triplas hélices de colágeno sem Pro, Goodman e colegas realizaram estudos pioneiros mostrando que a substituição de Pro por N-isobutilglicina (Nleu, 14, Fig. 2d), um resíduo peptoide sintético dentro de CMPs, resulta em triplas hélices estáveis. Eles atribuíram a estabilização às interações intercadeias entre as cadeias laterais hidrofóbicas de Nleu e a Pro adjacente. Recentemente, confirmamos que além de Nleu, muitos outros resíduos peptoides exibem uma propensão geral de tripla hélice semelhante ou maior que a Pro em CMPs (15, Fig. 2d). Apoiados por estruturas cristalinas de resolução atômica e análise computacional, raciocinamos que a estabilidade está menos envolvida com interações intercadeias hidrofóbicas, mas principalmente porque os resíduos peptoides podem pré-organizar estericamente cadeias individuais de CMP na conformação PPII necessária. Como existem centenas de resíduos peptoides sinteticamente disponíveis, antecipamos que esse princípio estrutural dos peptoides poderia permitir a síntese de CMPs estáveis de tripla hélice com extraordinária diversidade de cadeias laterais e abrir oportunidades para uma nova geração de terapêuticos e materiais inspirados em colágeno.
Designs supramoleculares para hibridização de colágeno
Monômeros de CHP não autotrimerizantes.
Para a hibridização CHP-colágeno, a forte propensão tripla-helicoidal de uma fita de CHP é tanto a força motriz quanto uma barreira ao mesmo tempo. Isso ocorre porque os CHPs de fita simples (monômeros) podem formar espontânea e gradualmente homotrímeros peptídicos em solução, perdendo assim sua propensão para a hibridização do colágeno. Consequentemente, uma solução de CHP precisa ser aquecida (por exemplo, a 80 °C) para dissociar o peptídeo em monômeros imediatamente antes de uma aplicação de hibridização (por exemplo, coloração de tecidos). Embora a solução pré-aquecida possa ser rapidamente resfriada até a temperatura ambiente para evitar danos térmicos aos tecidos, esse processo de pré-aquecimento complica as aplicações histológicas e in vivo dos CHPs e representa um desafio para a análise totalmente quantitativa dos resultados de imageamento, devido à incerteza sobre a concentração ativa dos monômeros de CHP. Por essas razões, várias estratégias foram exploradas para inibir a autotrimerização dos CHPs enquanto se mantém sua capacidade de hibridização com colágeno.

Uma estratégia ad hoc é introduzir interações desfavoráveis (por exemplo, eletrostáticas, estéricas) que enfraqueçam a autotrimerização mais do que a hibridização. Por exemplo, o grupo de Xiao anexou múltiplos resíduos de Asp ao (GPO)7 para desestabilizar o homotrímero peptídico por repulsão eletrostática, permitindo o reconhecimento histológico de colágeno desnaturado sem pré-aquecimento. No entanto, resta testar se essas cargas podem reduzir a especificidade de ligação do peptídeo. A equipe também criou um CHP monomérico anexando um corante fluoresceína a um resíduo de (2S,4S)-aminoprolina posicionado em Y no centro do peptídeo, para introduzir repulsão estérica entre as fitas a partir do corante fluoresceína volumoso (Fig. 3a). Utilizando derivados de prolina não naturais, o grupo de Raines descobriu que (flpFlpGly)7 [flp: (4S)-fluoroprolina, Flp: (4R)-fluoroprolina] não se autotrimeriza devido ao impedimento estérico entre os átomos de flúor de cadeias vizinhas, mas pode formar hélices heterotriméricas estáveis com (ProProGly)7. Similarmente, (flpHypGly)n ou (GlyflpHyp)n [(GfO)n] não devem se auto-montar em uma hélice homotrimérica estável porque flp é estericamente repelido por cada resíduo vizinho de Hyp (Fig. 3a). No entanto, Bennink et al. relataram que a sequência mantém a capacidade de hibridizar com colágeno desnaturado, provavelmente porque Hyp ocorre apenas em cerca de 34% dos tripletos Gly-X-Y dentro das cadeias de colágeno natural [comparado a 100% para (GfO)9]. Sem a necessidade de pré-aquecimento, essa sequência de CHP promoveu grandemente o imageamento in vivo do colágeno desnaturado.
Outra abordagem envolve precursores de CHP com modificações químicas projetadas que podem ser removidas quando a hibridização do colágeno é necessária. Um CHP engaiolado pode ser projetado anexando um grupo nitrobenzil (NB) fotoclivável ao resíduo central de Gly (Fig. 3a). Isso elimina o dobramento tripla-hélice do CHP, mas a gaiola NB pode ser liberada por exposição a UV para desencadear a hibridização do CHP. Essa hibridização fotoativada permite a fotopadronização de hidrogéis de gelatina, bem como o primeiro estudo in vivo de hibridização do colágeno. Recentemente, o grupo Koide desenvolveu um precursor monomérico de CHP com uma unidade O-acil isopeptídica central para interromper o dobramento tripla-hélice (Fig. 3a); ao mudar de pH ácido para fisiológico, a ligação éster inserida é convertida em uma ligação peptídica por meio de uma migração acílica O-para-N, permitindo que o peptídeo recupere seu dobramento e sua capacidade de ligação ao colágeno.

CHPs diméricos.

Como a hibridização do colágeno requer a formação de hélices heterotriméricas, inúmeras construções apresentando fitas paralelas de CHP covalentemente ligadas (CHPs diméricos) surgiram como novos projetos para direcionar cadeias únicas de colágeno. Koide e colaboradores sintetizaram tais CHPs diméricos usando uma unidade de ramificação Lys N-terminal e CHPs cíclicos combinando ligações Lys e Cys em ambos os terminais (Fig. 3b). Eles revelaram que o CHP cíclico poderia formar um produto hibridizado mais estável com o colágeno do que a fita simples. Surpreendentemente, até mesmo os CHPs cíclicos mostraram uma tendência a se automontarem em homotrímeros. Portanto, para evitar a etapa de pré-aquecimento e desmontagem na detecção de colágeno desnaturado, a equipe otimizou o projeto cíclico introduzindo resíduos carregados e incorporando duas cadeias CHP com diferentes comprimentos (Fig. 3b). Curiosamente, a construção cíclica de CHP apresentando duas fitas (ProProGly)10 feita pelo grupo de Raines mostrou-se monomérica em solução e foi utilizada como um modelo polipeptídico de colágeno danificado naturalmente para avaliar a hibridização do CHP no nível molecular (Fig. 3c). Enquanto isso, Yu e colaboradores relataram que os CHPs diméricos são particularmente eficazes na captura de níveis-traço de fragmentos de colágeno degradado de fluidos biológicos (por exemplo, urina de camundongos osteopênicos) e permitem análises peptidômicas para descoberta de biomarcadores e detecção de doenças. Como apenas uma cadeia de colágeno é necessária para formar uma tripla hélice com um CHP dimérico, pode-se inferir que sua hibridização com colágeno desnaturado pode ser mais rápida do que a de uma fita simples. No entanto, essa e outras vantagens dos CHPs diméricos ainda precisam ser verificadas em comparação direta com suas contrapartes de fita simples, especialmente em tecidos e in vivo.

Nanoestruturas automontadas.
Nanomaterials have also been created to target denatured collagen via assembling CHPs into precise structures that limit their triple-helical self-association. By conjugating an anti-parallel β-sheet peptide motif to a CHP strand, the Yu group fabricated a self-assembled, water-soluble nanofiber that displays CHP single-strands at a fixed distance (Fig. 3d), thereby preventing their trimerization. This fiber maintained a high affinity to denatured collagen and enabled direct in vivo targeting of collagen remodeling without any pre-injection treatment. Furthermore, the Kiick group produced a set of thermoresponsive conjugates of elastin-collagen-like peptides (ELP-CLP) (Fig. 3e), which self-assembled into nanoscale vesicles displaying CHPs at the surface and showed strong retention on a type II collagen film. By adjusting the composition and length of the ELP and CLP domains, various spherical or rectangular nanostructures were further assembled and exhibited. These nano-assemblies provide new opportunities for controlled drug delivery to the matrices in pathological tissues.

Biology of Collagen Hybridization

The collagen matrix is present in virtually all tissues (Table 1) and undergoes constant remodeling. Controlled collagen remodeling is essential to tissue morphogenesis during development, while its dysregulation can lead to pathological conditions, including fibrosis, inflammation, and cancer. The remodeling process mediated by specific proteases (e.g., metalloproteinases) may disrupt the collagen triple-helix. Besides, mechanical damages to connective tissues can also render the collagen triple-helix in a denatured state. Our understanding of the biological significance of collagen denaturation in disease and injury is still in its infancy, although evidence for the presence and disease-correlation of denatured collagen is emerging from dozens of recent studies enabled by the CHP-collagen hybridization (Table 1).

Collagen denaturation related to biomechanics
Em 2017, utilizando um CHP fluorescente, os grupos de Weiss e Yu relataram que a desnaturação das moléculas de colágeno pode ocorrer e se acumular durante um estiramento monotônico de um fascículo de tendão de cauda de rato, uma vez que a curva tensão-deformação se desvia da região linear. Este foi o primeiro relato de detecção visual de dano mecânico ao colágeno em nível molecular, o que demonstrou que o desenrolamento da tripla-hélice de colágeno é um mecanismo importante de dano mecânico aos tecidos conjuntivos. Pesquisas subsequentes sobre a biomecânica dos tendões não apenas descreveram as propriedades mecânicas dos tendões com diferentes funções anatômicas (ou seja, posicionais vs. armazenadoras de energia) a partir do nível molecular, mas também sugeriram que as triplas-hélices de colágeno desenroladas podem se acumular durante cargas de fadiga cíclica (Fig. 4a) e podem preceder alterações na mecânica tecidual local. Curiosamente, observou-se que há uma falta de correlação entre os níveis de enrugamento das fibras de colágeno e a desnaturação molecular, o que pareceu sugerir que as estruturas nas escalas fibrilar e molecular têm funções mecânicas diferentes.
Além dos estudos em tendões, Wagner e colaboradores descobriram que espécimes de cartilagem bovina desgastados com carga na direção ortogonal (transversal) à orientação das fibras de colágeno na superfície articular apresentaram dano ao colágeno estendido por uma maior profundidade do tecido do que aqueles desgastados nas direções paralela (longitudinal) às fibras de colágeno (Fig. 4b). Este estudo revelou um novo comportamento mecânico anisotrópico da cartilagem articular. Além disso, o grupo de Li relatou a imagem em animais vivos e a visualização 3D da destruição do colágeno nos tecidos moles da coluna vertebral de roedores com sondas CHP fluorescentes. O estudo revelou que a destruição do colágeno estava localizada nos componentes anatômicos de suporte de carga, incluindo o ânulo fibroso e as articulações facetárias em colunas normais, onde o envelhecimento, a força de tração e a degeneração do disco (por exemplo, Fig. 4c) podem aumentar o dano ao colágeno. Curiosamente, uma ligação proeminente do CHP foi observada no disco intervertebral (DIV) degenerado em regiões onde nenhuma atividade de MMP foi detectada (Fig. 4c), sugerindo aparentemente que a destruição do colágeno observada nos DIVs lesados neste modelo de punção com agulha em camundongos está mais provavelmente correlacionada com ruptura mecânica do que com proteólise patológica.
Mais interessante ainda, a desnaturação do colágeno causada por fatores mecânicos fora dos tecidos moles musculoesqueléticos também foi investigada recentemente. O grupo de Frangogiannis descobriu os distintos padrões espaçotemporais e mecanismos moleculares da desnaturação do colágeno ao longo do processo de infarto do miocárdio (Fig. 4e): enquanto as moléculas de colágeno desnaturado são encontradas perto dos macrófagos e miofibroblastos com MMP14 regulada positivamente durante as fases inflamatória inicial e proliferativa, na fase de maturação da cicatrização do infarto, observa-se extensa desnaturação das fibras de colágeno no infarto hipocelular, na zona de borda e no ânulo da valva mitral, onde a MMP14 está ausente. Eles, portanto, argumentaram que, em vez de proteólise, essa desnaturação do colágeno pode ser causada pela tensão mecânica da contração dos cardiomiócitos viáveis e pelo aumento da pressão intraventricular. Este é o primeiro estudo a propor um novo mecanismo biomecânico, não inflamatório, de dano ao colágeno na cicatrização miocárdica. Interessantemente, ao marcar o colágeno IV desestruturado no intestino médio do mosquito com um CHP marcado com fluorescência, Armstrong, Brackney e colegas descobriram que a disseminação de vírus nos mosquitos pode ser facilitada pela expansão e microperfurações na lâmina basal do intestino médio após aquisições sucessivas de sangue (Fig. 4f).
Desnaturação do colágeno relacionada à remodelação
A desnaturação do colágeno relacionada à remodelação do tecido biológico (por exemplo, devido à inflamação, Fig. 5) pode ser prevalente nos tecidos musculoesqueléticos ou conjuntivos, graças ao seu alto teor de colágeno. Por exemplo, ao estudar como a cicatrização de fraturas ósseas é retardada pela obesidade e hiperglicemia pré-diabética, Elbarbary e colegas descobriram que moléculas de colágeno desenroladas podem se acumular patologicamente em camundongos com obesidade induzida por dieta (DIO) e defeitos na cicatrização de fraturas durante a ossificação endocondral. Eles concluíram que as alterações relacionadas à DIO na estrutura do colágeno fibrilar podem ser parcialmente atribuídas ao acúmulo de produtos finais de glicação avançada (AGEs) que aumentam a reticulação das fibras de colágeno. Além disso, Haqqi e colegas mostraram que a disfunção mitocondrial em condrócitos e explantes de cartilagem de pacientes com OA aumentou a produção de superóxido mitocondrial, a expressão de fatores inflamatórios e a degradação do colágeno tipo II na matriz da cartilagem. A correlação da degeneração do disco intervertebral (IVD) com o envelhecimento, fatores inflamatórios, osmoadaptação desregulada, acúmulo de AGEs (Fig. 5a) e condições de cultivo mecânico ex vivo foi avaliada histologicamente com CHPs para mostrar o colágeno desnaturado no ânulo fibroso dos IVDs. A córnea e a esclera são tecidos conjuntivos formados por redes de fibrilas de colágeno. A degradação e ruptura do colágeno in vivo em córneas de camundongos causadas por uma resposta inflamatória à infecção viral foi facilmente visualizada por CHPs. Da mesma forma, outro estudo em camundongos mostrou que a estimulação inflamatória da interleucina 1-β (1L1-β) resulta em degradação significativa do colágeno escleral, que pode ser revertida por um tratamento com dexametasona (Fig. 5b).

A desnaturação do colágeno tem sido associada à remodelação tecidual durante o desenvolvimento e a cicatrização. A equipe de Yutzey mediu o nível de remodelação do colágeno em corações de camundongos pós-natais, revelando uma transição da ECM cardíaca de fibronectina para colágeno fibrilar durante a maturação do coração após o nascimento. O grupo de Molkentin mostrou que a injeção intracardíaca de células-tronco induz o acúmulo de macrófagos CX3CR1+ e CCR2+ na região de remodelação ativa do coração (Fig. 5c), o que pode reduzir a fibrose e melhorar as propriedades mecânicas da área lesionada ao regular a atividade dos fibroblastos locais. Em um artigo recente sobre cicatrização de tendões, Huang e colegas marcaram o dano persistente ao colágeno com CHPs no tendão de Aquiles seccionado e não cicatrizado de camundongos neonatos com ablação de células T reguladoras (Treg), sugerindo que as Tregs neonatais são críticas para promover a regeneração do tendão.
A desnaturação do colágeno também está implicada na resolução da fibrose de órgãos. A marca registrada da fibrose pulmonar, uma doença intersticial pulmonar progressiva e devastadora, é o depósito excessivo de proteínas da MEC, principalmente colágeno tipo I, por fibroblastos ativados. Ao sondar os tecidos pulmonares fibróticos do modelo murino de bleomicina com CHPs e um anticorpo anti-hidroxiprolina, Song et al. acompanharam a progressão da doença por períodos prolongados e localizaram grandes quantidades de fragmentos de colágeno desnaturado ricos em hidroxiprolina acumulando-se intracelularmente de 10 a 16 semanas após o tratamento com bleomicina. Este estudo apoiou fortemente que a condição fibrótica do modelo murino de bleomicina sofre resolução espontânea após o pico da fibrogênese (4 semanas pós-bleomicina), uma noção que estava em debate. Nos tecidos pulmonares de camundongos Col1α1-GFP+ com lesão induzida por bleomicina, Haak e colegas descobriram que aqueles fragmentos de colágeno intracelular marcados por CHP se colocalizam intensamente com os fibroblastos GFP+ quando os camundongos foram tratados com dihexedina, um agonista do receptor de dopamina D1 (DRD1). Este estudo indicou que o agonismo de DRD1 pode estimular uma reabsorção da fibrose mediada pela catepsina K nos fibroblastos pulmonares in vivo (Fig. 5d), sugerindo um potencial terapêutico para essa via.

Desnaturação do colágeno relacionada a outros fatores

A tripla-hélice de colágeno tem sido encontrada desenrolada por diferentes meios além da biomecânica e da remodelação tecidual. Ao desenvolver novas abordagens de laser para correção da visão, Huang et al. visualizaram a desnaturação fotoinduzida do colágeno no estroma corneano de coelhos causada pelo laser de femtossegundos através da marcação fluorescente com CHP. Inspiradoramente, Takeyari et al. revelaram que o colágeno depositado por fibroblastos derivados de pacientes com osteogênese imperfeita, uma doença óssea causada principalmente por mutações genéticas do colágeno I, contém triplas-hélices mal-enroladas em excesso, enquanto o tratamento com o chaperone químico ácido 4-fenilbutírico normaliza o mau-enrolamento do colágeno (Fig. 5e). Além disso, a técnica de hibridização de colágeno tornou-se um método de controle de qualidade amplamente adotado para medir a desnaturação do colágeno em arcabouços de MEC descelularizados preparados por diversos detergentes e métodos. Ela também tem sido utilizada criativamente em várias investigações sobre interações célula-matriz dentro de matrizes 3D de colágeno e na biologia de organismos não mamíferos.
Por décadas, as investigações científicas sobre as alterações patológicas da MEC focaram na abundância, composição e resistência mecânica (por exemplo, na fibrose), enquanto menos atenção foi dada às alterações estruturais mais sutis em nível molecular. À medida que a metodologia de hibridização de colágeno se torna amplamente adotada, há evidências crescentes da extensa desnaturação do colágeno como uma assinatura estrutural das MECs em uma ampla gama de doenças e lesões. Consequentemente, uma série de questões fundamentais sobre a natureza química e biológica da desnaturação do colágeno está começando a surgir. Por exemplo, quais são exatamente as proteases, fenótipos celulares e citocinas que medeiam a degradação e desnaturação do colágeno em cada evento de remodelação patológica? Quais são as diferenças no papel biológico entre colágeno intacto e desnaturado nos tecidos? Especificamente, como o colágeno desnaturado afeta os processos fisiológicos ou patológicos essenciais, como cicatrização de feridas, imunorregulação e resposta a estímulos mecânicos, por meio de vias de sinalização específicas mediadas por receptores? Quais são os sítios de reconhecimento para esses receptores celulares no colágeno desnaturado? Eles são diferentes daqueles encontrados no colágeno intacto? Qual é a estrutura do colágeno desnaturado e como ela difere da tripla-hélice intacta descrita pela cristalografia? Qual é o destino biológico do colágeno desnaturado na saúde e na doença? Como o colágeno desnaturado é catabolizado extracelularmente e intracelularmente? Os fragmentos de peptídeos de colágeno nos fluidos corporais exibem perfis distintivos sob várias condições patológicas?
À medida que nosso entendimento dos princípios que regem o enovelamento da tripla-hélice do colágeno avança, novos peptídeos e peptidomiméticos com fortes capacidades de hibridização com colágeno serão desenvolvidos para maior afinidade com limitada auto-trimerização. Além disso, bibliotecas de CHP podem ser construídas para rastrear candidatos que visam as cadeias desnaturadas de tipos específicos de colágeno ou tecidos (por exemplo, colágeno tipo II na cartilagem). Precisamos dessas novas ferramentas moleculares para responder às questões fundamentais mencionadas acima da biologia da matriz e para esclarecer ainda mais o significado biomédico das moléculas de colágeno danificadas como biomarcador. Essas explorações científicas e desenvolvimentos tecnológicos levarão a novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para necessidades médicas não atendidas. Por exemplo, uma nova classe de agentes de contraste e ensaios bioquímicos direcionados à remodelação do colágeno pode ser criada para a detecção não invasiva, monitoramento prognóstico e avaliação da eficácia terapêutica de fibrose e doenças degenerativas. Enquanto isso, a abordagem de hibridização do colágeno está agora sendo empregada para administrar agentes terapêuticos, incluindo pequenas moléculas, peptídeos e anticorpos, para lesões-alvo. Além disso, com a expansão do "alfabeto" das sequências de colágeno por resíduos não naturais, novos CHPs com atividades biológicas desejadas podem ser rastreados entre bilhões de sequências não apenas para se anelar ao colágeno danificado nas lesões, mas também para interagir com receptores celulares ou enzimas específicas para objetivos terapêuticos, incluindo tratamento de feridas, regeneração óssea e tratamento de fibrose. Portanto, antecipamos a tão esperada nova era dos colágenos como alvos para tecnologias biomédicas emergentes.
Conflito de interesses
S.M.Y. e Y.L. são fundadores da 3Helix Inc, que comercializa peptídeos de hibridização de colágeno.
Referência
Collagen structure and stability
The microenvironment of the tumour–host interface
Concept of vulnerable/unstable plaque
Longitudinal change in collagen degradation biomarkers in idiopathic pulmonary fibrosis: An analysis from the prospective, multicentre PROFILE study
Identifying nonalcoholic fatty liver disease patients with active fibrosis by measuring extracellular matrix remodeling rates in tissue and blood
Molecular level detection and localization of mechanical damage in collagen enabled by collagen hybridizing peptides
Crystal and molecular structure of a collagen-like peptide at 1.9 Å resolution
Remodelling the extracellular matrix in development and disease
Interstitial collagen catabolism
Thermal stability of human-fibroblast-collagenase-cleavage products of type-I and type-III collagens
Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis
Mechanisms of photoaging and chronological skin aging
Increased proteolysis of collagen in an in vitro tensile overload tendon model
Mechanically overloading collagen fibrils uncoils collagen molecules, placing them in a stable, denatured state
Tumour DDR1 promove o alinhamento das fibras de colágeno para instigar a exclusão imune
Um nicho de ECM rico em colágeno tipo III derivado de tumor regula a dormência de células tumorais
Interações do colágeno: Design e entrega de fármacos
Integrinas
Microscopia de geração de segundo harmônico para análise quantitativa da estrutura fibrilar do colágeno
Mapeamento espacial do conteúdo e estrutura do colágeno na degeneração do disco intervertebral humano
Avaliação do alvo molecular in vivo da inibição da metaloproteinase da matriz
Mecanismos de coloração do Sirius red e da fucsina ácida
As cores de polarização do colágeno corado com Picrosirius red são determinadas apenas pelo diâmetro das fibras?
Detecção imuno-histoquímica e análise imunoquímica da degradação do colágeno tipo II em cartilagens articulares humanas normais, reumatoides e osteoartríticas e em explantes de cartilagem articular bovina cultivados com interleucina 1
Aumento do dano ao colágeno tipo II na cartilagem articular osteoartrítica detectado por um novo imunoensaio
Clivagem aumentada do colágeno tipo II por colagenases na cartilagem articular osteoartrítica
A avaliação da degradação da cartilagem in vivo: Desenvolvimento de um imunoensaio para a medição em fluidos corporais do colágeno tipo II clivado por colagenases
O dano ao colágeno tipo II no envelhecimento e na osteoartrite começa na superfície articular, origina-se ao redor dos condrócitos e se estende para a cartilagem com a degeneração progressiva
Geração de anticorpos monoclonais para sítios crípticos de colágeno usando imunização subtrativa
Elementos crípticos de colágeno como centros de sinalização na regulação do crescimento tumoral e metástase
A interrupção das interações das células endoteliais com o novo epítopo críptico de colágeno HU177 inibe a angiogênese
Direcionamento do anticorpo humanizado D93 para sítios de angiogênese e crescimento tumoral por ligação a múltiplos epítopos em colágenos desnaturados
Inibição do crescimento tumoral ovariano pelo direcionamento do epítopo críptico de colágeno HU177
Resultados finais de um estudo de fase I do TRC093 (anticorpo humanizado anti-colágeno clivado) em pacientes com câncer sólido
Liberação de epítopo críptico de colágeno distinto (HU177) no soro de pacientes com melanoma
O aumento da liberação de HU177 correlaciona-se com pior prognóstico no melanoma primário
Direcionamento e imitação de colágenos via montagem de peptídeos de hélice tripla
Propensões de aminoácidos para a hélice tripla do colágeno
Direcionamento de cadeias de colágeno por hibridização de hélice tripla foto-ativada
Detecção direta de proteínas colagenosas por peptídeos miméticos de colágeno marcados com fluorescência
Imagem in situ de remodelação tecidual com peptídeos de hibridização de colágeno
Colágenos de defesa solúveis: Varrendo ameaças imunes
Proteínas semelhantes a colágeno de estreptococos patogênicos
Papel do colágeno de superfície celular do Streptococcus pyogenes em infecções
Alta estabilidade sérica de peptídeos de hibridização de colágeno e seus conjugados de fluoróforo
Impressão intracelular de hidroxiprolina após resolução da fibrose pulmonar induzida por bleomicina
Fibrose hepática quantitativa usando peptídeo hibridizante de colágeno para prever a sobrevida hepática nativa na atresia biliar: Um estudo piloto
Detecção molecular e avaliação da degeneração do disco intervertebral por meio de um peptídeo hibridizante de colágeno
Imagem molecular da destruição do colágeno da coluna vertebral
Visualização da proteólise do colágeno por hibridização de peptídeos: Da cultura celular 3D à imagem in vivo
Síntese de poli-(L-prolil-L-prolilglicil) de pesos moleculares definidos
Formação de híbridos entre colágeno e polipeptídeos sintéticos
Modificação fácil do colágeno direcionada por peptídeos miméticos de colágeno
Peptídeos miméticos de colágeno: Progresso em direção a aplicações funcionais
Reconhecimento sequencial do DNA por deslocamento de fita com uma poliamida substituída por timina
Peptídeos que se anelam ao colágeno natural in vitro e ex vivo
Uma sonda de peptídeo fluorescente de fita simples para direcionar colágeno em tecidos conjuntivos
Otimização estrutural de peptídeos cíclicos que detectam eficientemente colágeno desnaturado
Localização de conjugados terapêuticos Fab-CHP em locais de colágeno desnaturado para o tratamento da artrite reumatoide
Peptídeo bifuncional que se anela ao colágeno danificado e agrupa receptores de TGF-β melhora a cicatrização de feridas
Ancorar um fator citoativo no leito da ferida promove a cicatrização
Um peptídeo pendente confere resistência à água a um protetor solar
Nanofibras auto-montadas solúveis em água exibindo peptídeos hibridizantes de colágeno
Nanovesículas bioconjugadas termorresponsivas de elastina-b-peptídeo semelhante ao colágeno para liberação direcionada de medicamentos em matrizes contendo colágeno
Bacteriófago M13 projetado com peptídeo mimético de colágeno para direcionamento e imagem de colágeno em câncer
Montagem de nanopartículas e ligação à gelatina mediada por peptídeo mimético de colágeno de tripla hélice
Direcionamento do colágeno para imagem diagnóstica e liberação terapêutica
Detecção e caracterização de dano ao colágeno em nível molecular em artérias cerebrais hiperesticadas
O acúmulo de desdobramento molecular do colágeno é o mecanismo de dano por fadiga cíclica e falha em tecidos colagenosos
Avaliação molecular da desnaturação do colágeno em tecidos descelularizados usando um peptídeo hibridizante de colágeno
Avanços recentes na estrutura e design de peptídeos miméticos de colágeno
Isósteros de ligação peptídica: Éster ou (E)-alqueno na espinha dorsal da tripla hélice do colágeno
Tioamidas na tripla hélice do colágeno
O efeito de um isóstero de alqueno trans-bloqueado Gly-Pro na estabilidade da tripla hélice do colágeno
A interação n→π*
Incorporação de aza-glicina em peptídeos de colágeno
Aza-glicina induz hiperestabilidade do colágeno
Solução geral para estabilizar colágeno de tripla hélice
Base estrutural para a estabilização do colágeno por aza-glicina
A transição térmica de uma forma não hidroxilada de colágeno. Evidência para um papel da hidroxiprolina na estabilização da tripla hélice do colágeno
Código para a estabilidade do colágeno decifrado
Um mimético de colágeno hiperestável
Modelos de peptídeos de colágeno funcionalizáveis
Alquilação da γ-azaprolina cria derivados de prolina conformacionalmente adaptáveis para hélices triplas de colágeno responsivas a pH
γ-Azaprolina confere responsividade a pH e funcionalizabilidade a hélices triplas de colágeno
Derivados de prolina comutáveis: Ajustando a estabilidade conformacional da hélice tripla de colágeno por mudanças de pH
Porções hidrofóbicas conferem dobramento rápido e hiperestabilidade a hélices triplas de colágeno
Influência da lipidação no dobramento e estabilidade de hélices triplas de colágeno - um estudo experimental e teórico
Hélices triplas de colágeno reticuladas por ligação oxima
Imagem e direcionamento do remodelamento tecidual mediado por LOX com um peptídeo de colágeno reativo
Estrutura do colágeno: Novos truques de um cão muito velho
Efeitos estabilizadores da hélice tripla em peptídeos modelo de colágeno contendo módulos de diprolina pré-organizados em hélice PPII
Frequências de tripeptídeos Gly-X-Y no colágeno: Um contexto para peptídeos tripla-hélice hospedeiro-convidado
Por que prolina? Influência do tamanho do anel na hélice tripla de colágeno
Contribuição de amidas terciárias para a estabilidade conformacional de hélices triplas de colágeno
Hélices triplas semelhantes a colágeno incorporando resíduos de peptoide
Estruturas baseadas em colágeno contendo o resíduo peptoide N-isobutilglicina (Nleu): Síntese e estudos biofísicos de sequências Gly-Nleu-Pro por dicroísmo circular e rotação óptica
Estruturas baseadas em colágeno contendo o resíduo peptoide N-isobutilglicina (Nleu): Análise conformacional de sequências Gly-Nleu-Pro por 1H-RMN e modelagem molecular
Miméticos de colágeno
Miméticos de colágeno contendo peptoides com atividade de ligação celular
Resíduos de peptoide produzem hélices triplas de colágeno diversas e hiperestáveis
Imagem in situ de colágeno patológico por sondas peptídicas desestabilizadas por repulsão eletrostática
Efeitos estereoeletrônicos e estéricos na hélice tripla de colágeno: Rumo a um código para associação de fitas
4-Fluoroprolinas: Análise conformacional e efeitos na estabilidade e dobramento de peptídeos e proteínas
Um resíduo de (4R)- ou (4S)-fluoroprolina na posição Xaa da repetição (Xaa-Yaa-Gly) de colágeno afeta severamente a formação da hélice tripla
Padronização não covalente por foto de matrizes de gelatina usando peptídeos miméticos de colágeno engaiolados
Precursores peptídicos que adquirem capacidade de hibridização com colágeno desnaturado por migração acila O-para-N em pH fisiológico
"Hélices duplas" de colágeno modeladas mantêm sua estrutura
Pontes interfita ótimas para biomateriais semelhantes a colágeno
Peptídeos cíclicos para detecção eficiente de colágeno
Peptídeo cíclico mimético de colágeno danificado
Enriquecimento de fragmentos de colágeno usando peptídeo de hibridização de colágeno dimérico para colagenômica urinária
Ajuste estrutural fino da montagem de conjugados de peptídeos de ECM por meio de pequenas modificações na sequência
Liberação direcionada de fármacos pelo uso de materiais miméticos de ECM
Fibrilas de colágeno estruturalmente anormais em aneurisma de aorta abdominal resistem à adesão plaquetária
C1r regula positivamente a produção de metaloproteinase-13 da matriz e promove a invasão do carcinoma espinocelular cutâneo
Tratamento de longo prazo com medicamentos senolíticos Dasatinibe e Quercetina melhora a degeneração do disco intervertebral dependente da idade em camundongos
Efeitos de Smad7 sobre TGF-beta e ErbB2 inibem a ativação de miofibroblastos e protegem contra insuficiência cardíaca pós-infarto
Mecanismos de tenacificação para a fixação de materiais arquitetados: A mecânica da êntese tendínea
A desnaturação do colágeno é iniciada no momento do escoamento tecidual tanto em tendões posicionais quanto em tendões de armazenamento de energia
Em tendões, diferentes exigências fisiológicas levam a nanoestruturas funcionalmente distintas
Deformações heterogêneas no tecido suprimem a degradação do colágeno por colagenases
O carregamento de fadiga do tendão resulta em encurvamento e desnaturação do colágeno, mas não altera a mecânica tecidual local
Propriedades anisotrópicas da cartilagem articular em um teste de desgaste acelerado in vitro
A desnaturação do colágeno no miocárdio infartado envolve efeitos temporalmente distintos da proteólise dependente de MT1-MMP e da tensão mecânica
Refeições sanguíneas sucessivas melhoram a disseminação viral em mosquitos e aumentam o potencial de transmissão
Estrutura aberrante do colágeno fibrilar e níveis elevados de produtos finais de glicação avançada caracterizam a consolidação retardada de fraturas no modelo de obesidade induzida por dieta em camundongos
A disfunção mitocondrial desencadeia uma resposta catabólica em condrócitos via ativação mediada por ROS da via JNK/AP1
A inativação de Arp2/3 causa degeneração do disco intervertebral e da cartilagem com osmoadaptação desregulada mediada por TonEBP
Produtos finais de glicação avançada causam ruptura do colágeno do anel fibroso dependente de RAGE e perda, identificada por imagem de geração de segundo harmônico in situ no disco intervertebral de camundongos in vivo e em modelos de cultura de órgãos
O consumo de produtos finais de glicação avançada na dieta leva ao enrijecimento mecânico dos discos intervertebrais de camundongos
Um sistema de carregamento mecânico de múltipla vazão para o disco intervertebral de camundongos
A perda da expressão de osteopontina reduz a opacidade corneana induzida por HSV-1
Células esclerais que expressam escleráxis respondem à estimulação inflamatória
Células de Schwann que expressam Periostina e fibroblastos cardíacos endoneurais contribuem para a fasciculação do nervo simpático após o nascimento
Uma população especializada de fibroblastos cardíacos que expressam Periostina contribui para a maturação e inervação de cardiomiócitos pós-natais
Uma resposta imune aguda está subjacente ao benefício da terapia com células-tronco cardíacas
O receptor D1 de dopamina estimula a degradação dependente de catepsina K e a reabsorção de colágeno I em fibroblastos pulmonares
O Blue-LIRIC na córnea de coelho: Eficácia, efeitos teciduais e escalonamento da taxa de repetição
O ácido 4-fenilbutírico aumenta a mineralização de osteoblastos derivados de iPSC de osteogênese imperfeita
Grumos de complexos de células-tronco mesenquimais/matriz extracelular gerados em condições livres de xeno facilitam a regeneração óssea via osteogênese direta e indireta
Efeito da estrutura da superfície luminal da aorta descelularizada na formação de trombos e no comportamento celular
Interações dinâmicas entre células de haste endoteliais e matriz regulam o diâmetro dos brotos angiogênicos
Fabricação de construções 3D de tamanho centimétrico com células endoteliais padronizadas através da montagem de microesferas carregadas de células como um potencial enxerto ósseo
Impacto de um microambiente tumoral desmoplásico na sensibilidade a medicamentos para câncer de cólon: Um estudo com esferoides tumorais quiméricos 3D
A ativação pós-traducional da Mmp2 se correlaciona com padrões de degradação ativa de colágeno durante o desenvolvimento da cauda do peixe-zebra
A organização defeituosa do colágeno fibrilar por fibroblastos contribui para a remodelação das vias aéreas na asma
Anormalidades nas fibrilas de colágeno em aneurisma da aorta abdominal humano e de camundongos
A ruptura do ligamento cruzado anterior promove a expressão de miostatina no músculo esquelético, expansão de células fibrogênicas e declínio na qualidade muscular
O desbridamento enzimático eficaz de feridas de queimadura depende do status de desnaturação do colágeno
Papel de distintas linhagens de fibroblastos e células imunes na reparação dérmica após dano tecidual induzido por radiação UV
Direcionamento do colágeno desnaturado usando o conceito de hibridização do colágeno.
(a) Imagens de MET mostrando estruturas características de fibrilas de colágeno de grandes vias aéreas humanas normais e aorta abdominal de camundongos em comparação com fibrilas de colágeno desorganizadas e truncadas de vias aéreas asmáticas e aneurisma de aorta abdominal. Adaptado com permissão da ref (Copyright 2019 American Thoracic Society) e (Copyright 2020 Elsevier Ltd.). (b) A tripla-hélice, a estrutura característica da molécula de colágeno, pode ser desnaturada devido à degradação por proteases (por exemplo, por MMPs) ou ruptura mecânica das fibrilas de colágeno. (c) O Peptídeo de Hibridização de Colágeno (CHP), frequentemente conjugado com uma porção funcional (X, por exemplo, um fluoróforo) pode direcionar especificamente uma molécula de colágeno desnaturado através da formação de uma tripla-hélice híbrida. (d) O CHP marcado com fluorescência, mas não o anticorpo anti-Col IV, detecta a degradação do colágeno histologicamente nos glomérulos de ratos nefríticos. (c) e (d) adaptados com permissão da ref. Copyright 2017 American Chemical Society. (e) A fluorescência da coloração com CHP aumentou com níveis incrementais de tensão no centro esticado dos fascículos do tendão da cauda de rato, refletindo a desnaturação molecular do colágeno por dano mecânico. Adaptado com permissão sob uma Licença Creative Commons Atribuição 4.0 da ref. Copyright 2017 Springer Nature. (f) Ligação in vivo: o CHP tem como alvo o colágeno desnaturado dentro de discos intervertebrais normais de camundongos intercalados entre os corpos vertebrais marcados por OsteoSense e MMPSense. SCHP: peptídeo controle com sequência embaralhada. (g) Imagem de fluorescência 3D por microscopia de folha de luz mostrando colágeno desnaturado marcado por CHP administrado in vivo no disco intervertebral (ivd), articulações facetárias (fj), e ponto de fixação (ap) do ligamento supraespinhoso em um processo espinhoso da coluna lombar de rato. (f) e (g) adaptados com permissão da ref. Copyright 2021 American Chemical Society.
O modelo estrutural dos peptídeos de hibridização de colágeno, cujo enovelamento da tripla hélice é governado pela ligação de hidrogênio interfilamentar N-H(Gly)…O=C (i), pela conformação trans/cis da ligação Pro-amida (ii) e pela torção do anel pirrolidínico (iii). Para obter insights sobre a propensão do peptídeo em formar a tripla hélice de colágeno, modificações químicas extensas (em laranja) foram feitas em suas várias subunidades estruturais (azul) incluindo a ligação amida (a), os resíduos Gly e Hyp (b,c), bem como o anel pirrolidínico (d).
Desenhos supramoleculares de peptídeos de hibridização de colágeno.
(a) Desenhos de CHPs monoméricos que não se auto-trimerizam, mas podem inerentemente ou ser desencadeados para hibridizar com colágeno desnaturado. Adaptado com permissão da ref. Copyright 2018 Elsevier Ltd. (b) Conceitos dos desenhos de CHP diméricos para promover a afinidade de hibridização e limitar a auto-associação do peptídeo. Adaptado com permissão da ref (Copyright 2019 Royal Society of Chemistry) e (Copyright 2018 Wiley-VCH). (c) Um CMP dimérico cíclico foi desenhado para imitar as moléculas de colágeno danificadas para avaliar a hibridização da tripla hélice. Adaptado com permissão da ref. Copyright 2020 American Chemical Society. (d) Fios de CHP exibidos em nanofibras de folha β antiparalela a distância foram estericamente restritos de se auto-trimerizar, mas forneceram às nanofibras a capacidade de alvejar colágeno desnaturado in vivo. Adaptado com permissão da ref. Copyright 2017 American Chemical Society. (e) Desenho da nanovesícula conjugada de peptídeo semelhante a elastina e colágeno (ELP-CLP) auto-montada. Adaptado com permissão da ref. Copyright 2017 American Chemical Society.
Colágeno mecanicamente desnaturado revelado via hibridização de colágeno.
(a) O acúmulo de danos ao colágeno no tendão supraespinhal de camundongo, indicado pela fluorescência do CHP, aumentou com o número de ciclos de carga. A intensidade do CHP foi inicialmente concentrada em algumas fibras próximas à substância média do tendão e, por fim, propagou-se por todo o tendão em bandas concentradas. Adaptado com permissão da ref. Copyright 2021 American Association for the Advancement of Science.
(b) Amostras de cartilagem condilar bovina desgastadas na direção transversal apresentam maior coloração de CHP do que aquelas desgastadas na direção longitudinal, sugerindo mais danos ao colágeno. Adaptado com permissão da ref. Copyright 2020 Elsevier Ltd.
(c) Esquerda: Imagem de fluorescência de espécimes de coluna lombar coletados de um modelo de camundongo com punção por agulha de degeneração de disco intervertebral injetado por via intravenosa com CHP e MMPSense, mostrando ligação proeminente do CHP ao disco danificado, mas ausência de sinais de MMPSense (pontas de seta vermelhas). Direita: Varredura de fluorescência 3D da coluna lombar após clareamento do tecido mostrou fortes sinais de CHP no disco perfurado. Adaptado com permissão da ref. Copyright 2021 American Chemical Society.
(d) Configuração para hiperextensão axial de uma artéria cerebral média de ovelha (esquerda); a imagem de CHP e a análise quantitativa mostraram que as fibras de colágeno danificadas estavam principalmente alinhadas com a direção de carga na orientação axial (±90 graus, direita). Adaptado com permissão da ref. Copyright 2017 Acta Materialia.
(e) Durante a fase proliferativa da reparação cardíaca (7 dias após oclusão coronariana), o colágeno desnaturado foi concentrado pericelularmente nas áreas de infarto em cicatrização altamente celulares (setas). Durante a fase de maturação (infarto de 28 dias), embora a cicatriz tenha baixo conteúdo celular, exibiu um aumento acentuado na desnaturação do colágeno no zoom do infarto (setas), provavelmente refletindo tensão mecânica (vermelho: aglutinina do germe de trigo, verde: CHP, azul: DAPI; inferior: análise quantitativa de imagem, BZ: zona de borda, I: infarto, R: miocárdio remoto). Adaptado com permissão da ref. Copyright 2021 Elsevier.
(f) Esquerda: Intestinos médios ingurgitados de mosquitos A. aegypti com microperfurações na lâmina basal (seta amarela) com sinais claros de infecção epitelial (verde: antígeno do vírus Zika) após a refeição de sangue (pbm). Direita: altos graus de ligação do CHP aos intestinos médios dentro de 15 min e até 36 h pbm. Adaptado com permissão da ref. Copyright 2019 Springer Nature.
Desnaturação do colágeno associada à remodelação patológica revelada por hibridização do colágeno.
(a) Dietas ricas em produtos finais de glicação avançada (AGE) causaram degradação do colágeno no ânulo fibroso anterior central dos discos intervertebrais de camundongos, conforme demonstrado por uma diminuição acentuada na intensidade de SHG e um aumento na coloração CHP. Adaptado com permissão sob uma Licença Creative Commons Atribuição 4.0 da ref. Copyright 2020 Wiley Periodicals LLC. (b) A degradação do colágeno induzida por IL1-β em tecido escleral de camundongo cultivado de forma organotípica foi abolida com o tratamento com dexametasona. Adaptado com permissão da ref. Copyright 2021 Springer Nature. (c) Imagens histológicas de corações de camundongos lesionados por isquemia-reperfusão que receberam tratamento com células mononucleares da medula óssea mostraram localização de macrófagos CCR2+ e CX3CR1+ em áreas de remodelação ativa do colágeno (CHP: roxo) na zona de borda do infarto. Adaptado com permissão da ref. Copyright 2019 Springer Nature. (d) O tratamento com diidrexidina (DHX) promoveu a degradação do colágeno mediada por fibroblastos, evidenciada por um aumento na coloração CHP que se colocalizou com fibroblastos Col1α1-GFP+ em pulmões fibróticos de camundongos tratados com DHX além de bleomicina. Adaptado com permissão da ref. Copyright 2020 The Company of Biologists Ltd. (e) A MEC produzida por fibroblastos dérmicos cultivados isolados de pacientes com osteogênese imperfeita (OI) continha uma grande porção de colágeno I mal dobrado, estimada pela razão de fluorescência entre as colorações CHP e colágeno I. Adaptado com permissão sob uma Licença Creative Commons Atribuição 4.0 da ref. Copyright 2020 Elsevier Inc. (f) Um aumento na coloração CHP indicativo de maior renovação da MEC foi observado no músculo quadríceps do membro lesionado (I) em comparação com os não lesionados (NI). Adaptado com permissão da ref. Copyright 2019 SAGE Publications. (g) Desnaturação do colágeno avaliada pela coloração CHP em escara de queimadura humana após escaldadura ou queimadura por chama em diferentes dias pós-queimadura (DPQ). Adaptado com permissão da ref. Copyright 2020 Wound Healing Society.
Exemplos selecionados de desnaturação do colágeno relatados em várias doenças e condições.
Tecido Condições Fatores associados à desnaturação do colágeno ref Biomecânica Remodelação tecidual Outros fatores osso osteogênese imperfeita enovelamento incorreto devido a mutação cartilagem artrite reumatoide degradação por protease, inflamação osteoartrite coluna degeneração do disco intervertebral dano mecânico envelhecimento, inflamação, acúmulo de AGEs coração infarto do miocárdio tensão mecânica resposta imune, inflamação, degradação por protease tendão teste in vitro carga mecânica e dano por fadiga cíclica músculo atrofia do quadríceps fibrose olho esclerite degradação por protease, inflamação pele radiação ultravioleta crônica reparo e remodelação queimaduras queimaduras térmicas artéria teste in vitro alongamento mecânico fígado atresia biliar fibrose progressiva pulmão fibrose (lesão por bleomicina) degradação mediada por catepsina K