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pmid: "38658535"
title: "Inibidores de TANGO1 reduzem a secreção de colágeno e limitam a cicatrização tecidual."
authors: "Raote I, Rosendahl AH, Häkkinen HM, Vibe C, Küçükaylak I, Sawant M, Keufgens L, Frommelt P, Halwas K, Broadbent K, Cunquero M, Castro G, Villemeur M, Nüchel J, Bornikoel A, Dam B, Zirmire RK, Kiran R, Carolis C, Andilla J, Loza-Alvarez P, Ruprecht V, Jamora C, Campelo F, Krüger M, Hammerschmidt M, Eckes B, Neundorf I, Krieg T, Malhotra V"
journal: "Nature communications"
pubdate: "2024 Apr 24"
doi: "10.1038/s41467-024-47004-1"
source: "PMC Full Text"

Inibidores de TANGO1 reduzem a secreção de colágeno e limitam a cicatrização tecidual.

Autores

Raote I, Rosendahl AH, Häkkinen HM, Vibe C, Küçükaylak I, Sawant M, Keufgens L, Frommelt P, Halwas K, Broadbent K, Cunquero M, Castro G, Villemeur M, Nüchel J, Bornikoel A, Dam B, Zirmire RK, Kiran R, Carolis C, Andilla J, Loza-Alvarez P, Ruprecht V, Jamora C, Campelo F, Krüger M, Hammerschmidt M, Eckes B, Neundorf I, Krieg T, Malhotra V

Periodico

Nature communications (2024 Apr 24)

Conteudo

Inibidores de TANGO1 reduzem a secreção de colágeno e limitam a cicatriz tecidual

A secreção descontrolada de proteínas da MEC, como o colágeno, pode levar à formação excessiva de cicatrizes e fibrose, comprometendo a função tecidual. Apesar da ocorrência generalizada de doenças fibróticas e cicatrizes, faltam terapias eficazes. Uma abordagem promissora seria limitar a quantidade de colágeno liberado por fibroblastos hiperativos. Projetamos inibidores peptídicos permeáveis à membrana que visam especificamente a interface primária entre TANGO1 e cTAGE5, uma interação necessária para a exportação de colágeno dos sítios de saída do retículo endoplasmático (ERES). A aplicação dos inibidores peptídicos leva à redução dos níveis proteicos de TANGO1 e cTAGE5 e a uma inibição correspondente na secreção de vários componentes da MEC, incluindo colágenos. O tratamento com inibidores peptídicos em zebrafish resulta em alteração da arquitetura tecidual e redução da formação de tecido de granulação durante a cicatrização cutânea de feridas. Os inibidores reduzem a secreção de várias proteínas da MEC, incluindo colágenos, fibrilina e fibronectina, em fibroblastos dérmicos humanos e em células obtidas de pacientes com uma doença fibrótica generalizada (esclerodermia). Em conjunto, a interferência direcionada na interface de ligação TANGO1-cTAGE5 poderia permitir a modulação terapêutica da função dos ERES na hipersecreção de MEC, durante a cicatrização de feridas e processos fibróticos.

A secreção descontrolada de proteínas da MEC, como o colágeno, pode levar à formação excessiva de cicatrizes. Aqui os autores descrevem peptídeos permeáveis à membrana que visam a interface de TANGO1 e cTAGE5, inibem a secreção de componentes da MEC e poderiam ser de benefício terapêutico durante a cicatrização de feridas e processos fibróticos.

Introdução

Um grande desafio na medicina regenerativa é otimizar a regeneração tecidual por meio da modulação terapêutica de sua capacidade natural de formar uma cicatriz após uma lesão mecânica ou durante processos patológicos. Após lesão tecidual, plaquetas, células endoteliais e células inflamatórias induzem os fibroblastos a iniciar a deposição de matriz extracelular (MEC). O tecido de granulação inicial é abundante em fibronectina e outros constituintes da MEC. Os colágenos fibrilares formam o principal componente da MEC final e do tecido cicatricial. A cicatrização patológica pode se desenvolver na maioria dos tecidos e representa uma das principais causas de morte, comprometimento da qualidade de vida e ônus econômico, especialmente em sociedades envelhecidas. Ainda não existe terapia disponível e há uma necessidade urgente de descobrir novos alvos para tratar cicatrizes e fibrose.

A esclerodermia (esclerose sistêmica), uma doença complexa autoimune que leva à fibrose extensa de muitos órgãos, incluindo a pele, é frequentemente usada como modelo para estudar mecanismos principais de fibrose. As causas iniciais ainda são desconhecidas, mas a doença reflete características gerais dos processos fibróticos que levam à ativação de fibroblastos e deposição excessiva de uma MEC rica em colágeno.
Apesar do progresso significativo na compreensão da fisiopatologia dos processos subjacentes da fibrose e na identificação do papel de várias citocinas fibrogênicas, poucas estratégias terapêuticas específicas estão disponíveis para reduzir ou controlar a formação de tecido conjuntivo durante a cicatrização de feridas e a fibrose. A presença de várias vias de sinalização fibrogênicas concorrentes pode explicar por que os testes de inibidores específicos das vias da interleucina 4 (IL-4) ou TGFβ isoladamente produziram resultados decepcionantes como alvos antifibróticos. No entanto, todas essas cascatas de transdução de sinal fibrótico convergem para produzir pelo menos uma característica consistente de uma ampla gama de patologias — há sempre secreção excessiva de proteínas da MEC, como o colágeno. A modulação desse excesso de deposição de MEC poderia, portanto, oferecer uma abordagem terapêutica promissora modificadora da doença.

O controle direcionado da deposição de colágeno requer uma compreensão detalhada dos mecanismos que governam a secreção dessas grandes proteínas. De particular importância é sua exportação do retículo endoplasmático (RE), um processo que só recentemente se tornou passível de análise molecular após a descoberta da família de proteínas TANGO1, incluindo TANGO1 e seu parálogo cTAGE5. TANGO1 está presente na maioria dos metazoários e é necessária para a exportação de colágeno do RE em todos os animais testados até agora, incluindo mamíferos (humanos, caninos, camundongos), Drosophila e zebrafish.

As proteínas da família TANGO1 surgiram como organizadoras mestras da maquinaria do sítio de saída do RE (ERES), construindo túneis inter-organelas transitórios RE-ERGIC-Golgi para aumentar a capacidade secretora para cargas volumosas como o colágeno. Dado o papel essencial das proteínas da família TANGO1 na secreção de colágeno, a inibição de sua função fornece uma abordagem provável para controlar a hipersecreção patológica de colágeno. TANGO1 é uma proteína transmembrana residente no ERES onde, por meio de um domínio luminal do RE semelhante a SH3, TANGO1 recruta colágeno. Por meio de interações citoplasmáticas, TANGO1 organiza o ERES e a interface ERES-ERGIC. Cada uma dessas interações é necessária para a função de TANGO1 e a secreção de colágeno; controlar qualquer uma delas deve fornecer uma alavanca para regular a secreção de colágeno.

Para alcançar esse controle, desenvolvemos inibidores peptídicos permeáveis à membrana de TANGO1, equivalentes a regiões dos domínios CC2 de TANGO1 e cTAGE5, conjugados a dodecapeptídeos que permitem sua entrega citoplasmática. Tais peptídeos penetrantes celulares (CPPs) surgiram como ferramentas poderosas para a entrega intracelular direcionada.
Os biólogos tradicionalmente consideram a exportação do RE como não-drogável, pois sua maquinaria é essencial para a viabilidade celular e atua constitutivamente, de modo que atingir qualquer componente poderia produzir efeitos pleiotrópicos e fora do alvo na secreção. No entanto, estudos recentes que identificam interações específicas entre a maquinaria dos sítios de exportação do RE (ERES) e cargas secretoras sugeriram o potencial para intervenções direcionadas. Aqui, nosso direcionamento preciso da interface das proteínas dos ERES, TANGO1 e cTAGE5, controla sua atividade especificamente, mostrando que é possível controlar a exportação do RE de proteínas específicas da MEC, sem toxicidade significativa fora do alvo.
Mostramos que os inibidores peptídicos reduzem a secreção de colágeno em fibroblastos humanos normais, em fibroblastos ativados e em fibroblastos obtidos de pacientes com esclerodermia. Como as principais etapas da cicatrização cutânea de feridas são conservadas em peixe-zebra, também utilizamos um modelo de peixe-zebra de reparo de feridas, onde um laser é usado para introduzir feridas de forma rápida e reprodutível e demonstramos redução da formação de cicatrizes após o tratamento com inibidores peptídicos.
Nossos resultados sugerem uma via promissora para intervenção terapêutica por meio da inibição direcionada da exportação do RE, para distúrbios fibróticos atualmente intratáveis caracterizados pela produção excessiva de MEC.

Resultados

Peptídeos desestabilizaram tanto TANGO1 quanto cTAGE5

Desenho de peptídeos para inibir a heterodimerização de TANGO1-cTAGE5.

A A organização e os domínios de TANGO1 e cTAGE5. Cada uma dessas proteínas contém dois domínios de coiled-coil citoplasmáticos. O coiled-coil 2 de TANGO1 (T1-CC2) está destacado em verde. O cTAGE5 CC2 em magenta. B Predição do Alphafold2 da estrutura do heterodímero de TANGO1 (verde) e cTAGE5 (magenta). C Esquema indicando onde as sequências de peptídeos se mapeiam em TANGO1 e cTAGE5. D Dois peptídeos foram sintetizados, de 30 (P2) e 31 (P5) aminoácidos respectivamente, conjugados a um motivo de escape lisossomal C-terminal de 12 aminoácidos (mostrado em texto preto). E Alinhamento das sequências humana, de camundongo e de peixe-zebra. F Western blot representativo de lisados de células U2OS tratadas com P2, P5 ou P2 + P5, testado para cTAGE5. β-tubulina foi usada como controle de carga. G Western blot representativo de lisados de células U2OS tratadas com P2, P5 ou P2 + P5, testado para TANGO1. Calnexina foi usada como controle de carga. H Quantificação dos blots mostrando os níveis de TANGO1 (verde) e cTAGE5 (magenta) (média +/- DP) em células controle ou tratadas com peptídeos (normalizadas para o controle) *p < 0,05, teste t de Student comparando cTAGE5 (linha magenta) ou TANGO1 (linha verde) no controle vs tratado. N = 3 (TANGO1), N = 5 (cTAGE5).
Estudos anteriores revelaram que a heterodimerização do TANGO1 com seu parálogo cTAGE5 é mediada por uma região de coiled-coil (mostrada como CC2 nas duas proteínas, Fig. 1A). Utilizamos o AlphaFold2 para prever a estrutura da interface TANGO1–cTAGE5 (T1-CC2–c5-CC2, Fig. 1B). A sequência primária usada nas previsões é indicada pela numeração dos aminoácidos, correspondente aos números no Uniprot (IDs Uniprot, TANGO1: Q5JRA6, cTAGE5: Q96PC5-7). De acordo com as previsões, as regiões de coiled-coil dimerizam ao longo de todo o seu comprimento (Fig. 1B e Fig. Suplementar 1).

Com base nessas estruturas, projetamos polipeptídeos curtos correspondentes às sequências primárias dessas regiões de coiled-coil do TANGO1 e cTAGE5, que devem inibir competitivamente a função TANGO1-cTAGE5 (Fig. 1C). Projetamos dois peptídeos, denominados P2 e P5, de 30 ou 31 aminoácidos, respectivamente, conjugados a um dodecapeptídeo penetrante de células (GLRKRLRKFRNK) para translocar os peptídeos anexados para o citoplasma (Fig. 1D). P2: LRQKVEILNELYQQKEMALQKKLSQEEYERGLRKRLRKFRNK e P5: LEKEEKLSKVDEKISHATEELETYRKRAKDLGLRKRLRKFRNK. Essa sequência de aminoácidos no TANGO1 e cTAGE5 é bem conservada, mostrando alta identidade até mesmo no cTAGE5 de peixe-zebra (Fig. 1E). Como controles, os aminoácidos de P2 e P5 foram embaralhados para gerar scrP2: VEEAKLYQRQSRMENLLEKEKQELLQKQIYGLRKRLRKFRNK e scrP5: KLRKHELERLKSELEEIEATETKDYVADKKSGLRKRLRKFRNK.

Quantificamos os níveis de TANGO1 e cTAGE5 por western blotting em células controle e naquelas tratadas com os peptídeos P2 (100 μM), P5 (100 μM) e P2 + P5 (100 μM cada). Os níveis das proteínas TANGO1 e cTAGE5 foram reduzidos na presença de P2 e P5 (Fig. 1F, G, quantificados em H), sugerindo que o direcionamento da interface de heterodimerização TANGO1/cTAGE5 leva a monômeros instáveis.

Peptídeos inibem TANGO1/cTAGE5 em peixe-zebra

Peptídeos induzem alterações fenotípicas em peixe-zebra consistentes com a inibição de TANGO1/cTAGE5.
Larvas de zebrafish com 3 dpf. Os peixes foram tratados com P2 + P5 (4 μM), ou deixados sem tratamento em E3 (controle). Imagens ampliadas da cauda e do vitelo à direita. Barras de escala 1 mm. B Quantificação do comprimento da larva da cabeça à cauda (boxplot com mediana e intervalo interquartil N = 21, 19, 23 no controle, 2 μM e 4 μM, respectivamente). Os bigodes conectam o máximo e o mínimo. C Quantificação dos fenótipos observados nos peixes para n = 21, 19, 23 réplicas no controle, 2 μM e 4 μM, respectivamente, de três experimentos independentes. D Projeção máxima de toda a pilha Z de imagens SHG de três diferentes regiões da nadadeira caudal (Áreas #1, 2, 3) conforme indicado nas imagens de campo claro. As imagens foram adquiridas de três peixes controle e três tratados, com regiões aproximadamente semelhantes da cauda escolhidas como Área #1, 2 e 3. Barras de escala 100 μm. E Quantificação da direção das fibras de colágeno obtida a partir do sinal SHG nas três áreas segmentadas aproximadamente representadas em (D) Linha superior: Histogramas de direção das fibras de colágeno de um peixe controle ou tratado representativo. Linha inferior: Gráficos de distribuição da dispersão das fibras de colágeno de um peixe controle ou tratado representativo. Essa medida representa a dispersão da orientação preferencial das fibras de colágeno na imagem. As medidas do controle são representadas em preto e o tratamento com P2 + 5 (4 μM) é representado em laranja. Teste de Kolmogorov–Smirnov *** p < 0,001.

Para testar se os peptídeos inibem TANGO1/cTAGE5 in vivo, tratamos embriões de zebrafish a partir do estágio de 2 células com uma combinação de P2 e P5 (2 μM ou 4 μM, cada). Os embriões foram continuamente tratados com os peptídeos até 3 dias pós-fertilização (dpf), quando foram imageados. Aos 3 dpf, as larvas tratadas com peptídeos apresentaram um eixo corporal mais curto (Fig. 2A, B), um fenótipo também observado em knockouts de zebrafish para TANGO1/cTAGE5. Alguns peixes também apresentaram fenótipos adicionais reminiscentes de defeitos associados a knockouts de TANGO1/cTAGE5, incluindo sangue coagulado/acumulado, saco vitelino expandido e escurecido e pele com bolhas (Fig. 2A–C). As alterações fenotípicas apareceram com mais frequência em larvas tratadas com P2 + P5 a 4 μM, apoiando um efeito dose-dependente do tratamento (Fig. 2C).
TANGO1 e cTAGE5 são bem estabelecidos como essenciais para a secreção de colágeno em vários tipos celulares e in vivo, incluindo em zebrafish. Para avaliar mudanças na arquitetura do colágeno extracelular após o tratamento com peptídeos, utilizamos microscopia de segunda harmônica (SHG) para visualizar as fibras de colágeno na cauda larval. Zebrafish foram fixados, desvitelados e imageados por microscopia SHG na lâmina da cauda, uma região com alta densidade de fibras de colágeno organizadas. Imagens de segunda harmônica foram adquiridas de três áreas da cauda (quadrados destacados na Fig. 2D, campo claro). Imagens de fibras de colágeno das três áreas (Fig. 2D) sugeriram que os animais controle apresentavam uma distribuição homogênea em comprimento e orientação, de modo que a maioria das fibras estava bem alinhada em relação às fibras vizinhas. Por outro lado, as fibras nas caudas tratadas com peptídeos eram consideravelmente mais heterogêneas em tamanho e em seu alinhamento relativo (quantificado como "dispersão" na Fig. 2E).
A MEC alterada e as mudanças na arquitetura tecidual em larvas de zebrafish tratadas com peptídeos são consistentes com uma inibição de cTAGE5 e TANGO1 in vivo.
Peptídeos causam retenção de colágeno no RE
Se os peptídeos inibem TANGO1 ou cTAGE5, eles devem reduzir a exportação de colágeno do RE. Os peptídeos foram testados em duas linhagens celulares: células U2OS (colágeno I) e fibroblastos RDEB/FB/C7 (colágeno VII). As células foram incubadas em meio livre de soro contendo ácido ascórbico (250 μM) e ascorbato de sódio (1 mM) por 20 h para promover a exportação de pró-colágeno do RE.
Células U2OS controle ou células tratadas com inibidores peptídicos (P2, P5 e P2 + P5 a 100 μM cada) foram fixadas e processadas para microscopia de imunofluorescência para visualizar o colágeno intracelular (Fig. Suplementar 2A). Observamos aumento de colágeno I (verde) nas células tratadas com peptídeos, que colocalizou com a proteína residente do RE, Calnexina (magenta), consistente com os peptídeos inibindo a exportação de colágenos dependente de TANGO1 do RE. Em células RDEB/FB/C7 também (Fig. Suplementar 2B), a incubação com peptídeos resultou em retenção de colágeno VII (verde) no RE, marcado por Calnexina (magenta).
Células RDEB/FB/C7 tratadas com peptídeos mostram recrutamento de TANGO1 para acúmulos de colágeno. Pontos de TANGO1 colocalizam com marcadores de ERES, Sec31A (Fig. Suplementar 3), confirmando que os inibidores peptídicos não afetam a localização de TANGO1 nos ERES nem seu recrutamento de colágeno.
Peptídeos inibem a secreção de colágeno em fibroblastos primários
Captação de peptídeos fluorescentemente marcados em fibroblastos dérmicos humanos primários e inibição da secreção de pró-colágeno I.
A Micrografias confocais de fibroblastos dérmicos humanos primários mostrando captação de P2 + P5 fornecidos a 40 μM por 20 h em condições livres de soro. Co-marcação com um marcador de RE em vermelho. Barra: 10 μm.
B Quantificação da captação de peptídeos fluorescentes (N = 4, média +/- DP da intensidade fluorescente intracelular).
C, D Western blot representativo (C) e quantificação de lisados de fibroblastos tratados ou não (Controle) com P2 + P5 a 40 μM por 20 h. N = 6 (D).
E, F Western blot representativo de sobrenadantes; a coloração Ponceau reflete o controle de carga nos lisados celulares correspondentes (E). Quantificação de sobrenadantes de fibroblastos humanos tratados por 20 h em condições livres de soro com P2 ou P5 na concentração indicada. N = 6 (F).
G, H Western blot representativo de sobrenadantes; a coloração Ponceau reflete o controle de carga nos lisados celulares correspondentes (G). Quantificação de sobrenadantes de fibroblastos de pele não tratados e tratados com P2 + P5. N = 24; teste U de Mann–Whitney, bicaudal, **** p < 0,0001 (H).
I Concentração de proteína de lisados celulares não tratados e tratados com P2 + P5. N = 9.
J Duração, em horas, do efeito inibitório após remoção de P2 + P5. Os níveis dos não tratados (Controle) foram definidos como 100%. N = 3 por ponto temporal, ANOVA de duas vias com teste de comparações múltiplas de Sidak. *** p < 0,0001.
K Western blot de colágeno I de sobrenadantes de controles e fibroblastos controle tratados com peptídeo scrambled (scr) e western blot de β actina dos lisados celulares correspondentes.
L Determinação da citotoxicidade de fibroblastos controle tratados com diferentes peptídeos (medida pela liberação de lactato desidrogenase (L, D, H)). N = 17 (Controle)/7 (P2)/7 (P5)/9 (P2 + P5)/8 (P2 scr + P5 scr). N = amostras independentes. Dados apresentados como média ± DP.
Para testar se os peptídeos reduzem eficientemente a secreção de colágeno também em células primárias derivadas de indivíduos humanos, tratamos fibroblastos de pele humana normal, os principais produtores de colágeno nos tecidos conjuntivos, com P2 e P5 e com os controles scrambled, scrP2 e scrP5 (compostos pelos mesmos aminoácidos que P2 e P5, mas em uma ordem diferente). Os peptídeos marcados fluorescentemente P2 e P5 entraram prontamente nas células, individualmente ou em combinação, localizando-se por toda a célula (Fig. 3A, B). Apenas um leve acúmulo intracelular de procolágeno I foi observado, o qual, no entanto, não atingiu significância estatística (Fig. 3C, D). A microscopia de imunofluorescência de fibroblastos corados para colágeno I mostrou um acúmulo intracelular de colágeno significativo, porém leve, após o tratamento com P2 e P5 (Fig. Suplementar 4). A adição de P2 ou P5 isoladamente não alterou significativamente a secreção de colágeno I (Fig. 3E, F). No entanto, a adição de P2 + P5 resultou em uma redução de mais de 60% nos níveis secretados de procolágeno I (Fig. 3G, quantificado em H e I). Em seguida, perguntamos se o efeito exercido por P2 + P5 em fibroblastos primários de pele humana é reversível e por quanto tempo ele dura. Os fibroblastos foram primeiro tratados (ou não, servindo como controles) com P2 + P5 como anteriormente, e então suplementados com meio de crescimento contendo soro por 24, 48 ou 72 h na ausência dos peptídeos. Os sobrenadantes mostraram uma forte redução nos níveis de colágeno I por P2 + P5 após 24 h (Fig. 3J). Os níveis de colágeno I secretado após 48 h foram apenas ligeiramente menores do que os controles não tratados, e após 72 h, a redução não era mais detectável. Esses resultados indicam que P2 + P5 inibe a secreção de colágeno por pelo menos 24 h após sua remoção e, em seguida, seu efeito diminui. Os peptídeos controle scrambled não revelaram qualquer efeito sobre a secreção de colágeno em concentrações de até 40 μM (Fig. 3K). Nenhum dos peptídeos (P2, P5, P2 + P5 e scrP2+scrP5) exerceu efeitos citotóxicos significativos, conforme determinado por ensaios de citotoxicidade de liberação de LDH (Fig. 3L) e as células mostraram morfologia semelhante (Fig. Suplementar 5) e taxas de proliferação. Em conjunto, os dados sugerem que o tratamento com peptídeos inibe efetivamente a secreção de colágeno. Além disso, eles também sugerem que as células primárias podem eliminar a maior parte do colágeno intracelular acumulado melhor do que as linhagens celulares estabelecidas.
A inibição de TANGO1/cTAGE5 reduz a secreção de múltiplas proteínas da ECM
Efeitos do tratamento com peptídeos no secretoma de fibroblastos humanos.
A Volcano plot ilustrando proteínas significativamente reguladas para baixo (símbolos azuis) e para cima (símbolos laranja), pelo tratamento de fibroblastos dérmicos humanos primários com 40 μM de P2 + P5 por 20 h em condições sem soro em comparação com amostras controle. Teste t de Student bilateral não pareado, S0 = 0,1, N = 3 amostras independentes. B Termos de ontologia genética (GO) das proteínas afetadas pelo tratamento com peptídeos. O gráfico de caixa representa a mediana, os percentis 25 e 75, máx. e mín. são conectados por bigodes. Valores atípicos são definidos como Q1−1,8 intervalo interquartil (IQR) e Q3 + 1,8 IQR. Foi realizado um teste t de Student bilateral não pareado.

Considerando que os fibroblastos produzem vários tipos de colágeno, incluindo colágeno I, III e V, todos os quais contribuem para a formação de fibrilas heterotípicas de colágeno I/III/V presentes na grande rede fibrilar que caracteriza a MEC dérmica, analisamos os sobrenadantes de fibroblastos controle e tratados com P2 + P5. A quantificação por espectrometria de massas dos carregamentos secretores (o secretoma) confirma a redução significativa das cadeias α1 e α2 do colágeno I (COL1A1 e COL1A2), reproduzindo nossos resultados anteriores de imunotransferência. Observamos uma redução significativa na secreção de colágeno III (COL3A1), colágeno V (COL5A1), colágeno XII (COL12A1), este último frequentemente encontrado decorando a superfície das fibrilas de colágeno I/III/V, e colágeno VI (COL6A2 e COL6A3), o componente estrutural dos filamentos perolados pericelulares (Fig. 4A e Fig. Suplementar 6). Curiosamente, a interferência na atividade de TANGO1 também prejudicou a secreção de algumas proteínas da MEC não colágenas que não eram conhecidas anteriormente como carregamentos de TANGO1, como a proteína central do proteoglicano versican (VCAN), fibrilina-1 (FBN1), um componente estrutural das microfibrilas de fibrilina, fibronectina ou subunidade α4 da laminina (LAMA4), um componente das membranas basais. Não foram detectadas proteínas da MEC hipersecretadas após o tratamento com P2 + P5. No geral, houve menos proteínas hipersecretadas (representadas por símbolos laranja na Fig. 4A) do que hipossecretadas (símbolos azuis) (Tabela Suplementar 1). O maior aumento aparente foi o próprio MIA3 (TANGO1), que é meramente a detecção dos peptídeos adicionados derivados de TANGO1. A análise de ontologia genética (GO) mostrou que as proteínas primariamente afetadas pelo tratamento com peptídeos incluem componentes estruturais da MEC, particularmente colágeno (Fig. 4B). Vários carregamentos não mostraram alteração significativa na secreção após o tratamento das células com os peptídeos (Tabela Suplementar 2), destacando a especificidade/seletividade da atividade dos peptídeos.
Inibição controlada da cicatrização de feridas em zebrafish
Peptídeos limitam a formação de tecido de granulação em feridas de zebrafish.
A Coloração H&E de cortes longitudinais de pele em 4 dpp de peixes controle tratados com PBS (esquerda) ou tratados com P2 + P5 (direita). A área de tecido de granulação (tg) foi medida (linhas tracejadas amarelas). B Quantificação da área de tecido de granulação em animais controle ou tratados com peptídeos. * p = 0,0369. C Análise imuno-histoquímica da deposição de colágeno durante a cicatrização de feridas no tecido de granulação em animais controle (esquerda) ou tratados com peptídeos (direita). D Quantificação da área de colágeno no tecido de granulação. *** p = 0,0006. E Maior ampliação da análise imuno-histoquímica da deposição de colágeno e núcleos (caixas magenta em C). F Quantificação total de núcleos dentro do tecido de granulação. G Quantificação do total de núcleos dividido pela área do tecido de granulação. * p = 0,0198. H Coloração TUNEL de feridas em 4 dpp no tecido de granulação em animais controle (esquerda) ou tratados com peptídeos (direita). I Quantificação de células TUNEL-positivas divididas pelo total de células DAPI-positivas no tecido de granulação. Barras de escala: A, C = 200 μm; E, H = 50 µm. ep: epiderme. N = 5 peixes por tratamento, teste t de Student, bicaudal. Não significativo (NS). Os dados são apresentados como média ± DP.
Um teste importante dos inibidores é se eles mostram eficácia no controle da deposição de colágeno no tecido de granulação durante o processo de cicatrização de feridas in vivo. Portanto, estudamos o efeito dos peptídeos na cicatrização de feridas cutâneas de espessura total induzidas por laser em peixes-zebra adultos. Nessas feridas, o tecido de granulação é formado a partir de dois dias pós-ferimento (2 dpp) e atinge tamanhos máximos em 4 dpp. As feridas dos peixes foram microinjetadas tanto em 2 quanto em 3 dpp com PBS (controle) ou peptídeo (4 µM P2 + P5 em PBS). Em 4 dpp, a histologia (Fig. 5A, B) e a imunofluorescência anti-colágeno tipo I com contracoloração DAPI dos núcleos celulares (Fig. 5C, G) revelaram que o tratamento com peptídeos resultou em redução da formação de tecido de granulação e redução da deposição de colágeno dentro do tecido de granulação, enquanto a densidade de células/fibroblastos aumentou ligeiramente. Além disso, a coloração TUNEL de células em morte não revelou diferenças entre as amostras controle e tratadas com peptídeos (Fig. 5H, I).
Peptídeos inibem a secreção de colágeno em fibroblastos primários ativados saudáveis e derivados de pacientes
Peptídeos inibem a secreção de proteínas da MEC por fibroblastos saudáveis e de esclerodermia ativados por TGFβ.
A Western blot de sobrenadantes de fibroblastos incubados por 20 h na ausência de soro sem (Ctrl) ou com 40 μM cada de P2 + P5 e sem ou com 10 ng/ml de TGFβ. O tratamento com peptídeos reduziu fortemente as quantidades de (pro)colágeno I secretado (topo), fibrilina1 (meio) e fibronectina (base) em fibroblastos de doadores saudáveis e pacientes com esclerodermia antes e particularmente após a estimulação da produção de MEC por TGFβ. B Quantificação de (A). N = 3 amostras independentes. Os dados são apresentados como média ± DP.
Em seguida, nosso objetivo foi avaliar se os peptídeos identificados podem reduzir a secreção patologicamente aumentada de colágeno, como a observada em fibroblastos ativados e em fibroblastos derivados de pacientes com esclerodermia. A ativação foi realizada pelo tratamento de fibroblastos com TGFβ, que aumenta proeminentemente a produção de colágeno I. A incubação de fibroblastos cutâneos ativados por TGFβ de indivíduos saudáveis com P2 + P5 mostrou uma clara inibição da secreção de colágeno pela combinação de P2 + P5 (Fig. 6A, painel esquerdo e B). Os efeitos inibitórios também foram claramente visíveis em fibroblastos de esclerodermia, especialmente após ativação por TGFβ (Fig. 6A, painel direito e B). De forma mais promissora, tanto fibroblastos saudáveis quanto de esclerodermia apresentaram redução na secreção de outros componentes abundantes da matriz extracelular fibrótica, fibrilina1 e fibronectina (Fig. 6A, painéis centrais e B), reforçando ainda mais a importância do TANGO1 no controle da secreção fisiopatológica de cargas secretoras volumosas da matriz extracelular.

Discussão

Aqui mostramos que peptídeos permeáveis à membrana que inibem a função de TANGO1 e cTAGE5 controlam a secreção de proteínas fibróticas da matriz extracelular na cicatrização e fibrose, desde zebrafish até fibroblastos humanos primários de pacientes com esclerodermia.

Apesar do considerável desenvolvimento pré-clínico de potenciais terapêuticas antifibróticas, apenas algumas entraram em validação clínica, provavelmente devido às várias vias redundantes e concomitantes envolvidas no desenvolvimento da fibrose. Há uma necessidade urgente de antifibróticos que impactem positivamente a morbidade e mortalidade. Os peptídeos que apresentamos fornecem uma prova de princípio de que a inibição de TANGO1 e cTAGE5 no ERES poderia produzir reagentes antifibróticos valiosos.
TANGO1 e cTAGE5 se ligam constitutivamente, e a depleção de TANGO1 resulta em uma perda concomitante de cTAGE5. O mapeamento global e quantitativo do número de cópias de proteínas em células de mamíferos revelou que existem cerca de 173.000 moléculas de TANGO1 e cTAGE5 cada por célula. Em um ERES, TANGO1 e cTAGE5 têm funções complementares. Enquanto TANGO1 recruta colágeno competente para exportação no lúmen do RE, TANGO1 e cTAGE5 juntos constroem uma rota de exportação ao servir de arcabouço para várias interações citoplasmáticas, incluindo o recrutamento de Sec12 por cTAGE5. TANGO1 e cTAGE5 interagem de forma robusta e podem ser considerados uma única unidade, levantando a possibilidade de que seu estado dimérico seja mais estável. Especulamos que esse equilíbrio estequiométrico 1:1 na abundância de proteínas é mantido pela estabilização de um complexo TANGO1-cTAGE5, mediado pela interface de ligação de suas regiões de bobinas enroladas em interação. Proteínas individuais podem ser instáveis a menos que estejam em complexo com seu parceiro de ligação. É possível que o tratamento com peptídeos iniba a heterodimerização de TANGO1-cTAGE5, diminuindo assim sua estabilidade. Nesse caso, o tratamento com peptídeos garantiria que um efeito antifibrótico pudesse continuar mesmo após os peptídeos serem eliminados de dentro da célula, pelo menos até que os níveis de TANGO1 e cTAGE5 sejam reabastecidos. A medição da interação e qualquer perda dela após o tratamento com peptídeos não foi possível devido a razões técnicas, mas o efeito observado nos níveis de proteína é consistente com tal ruptura da heterodimerização.
O modelo de zebrafish tem se mostrado um sistema in vivo útil para uma variedade de mecanismos biológicos, desde o desenvolvimento de tecidos até a cicatrização de feridas e a descoberta de medicamentos. Ao testar os peptídeos em larvas de zebrafish, confirmamos que eles recapitulam fenótipos publicados observados em animais knockout para TANGO1. Descobrimos que os inibidores afetam o tamanho das larvas, consistente com observações de peixes mutantes para TANGO1 ou cTAGE5, um knockout global de TANGO1 em embriões de camundongos, ou knockouts condicionais de cTAGE5 em camundongos. Um vitelo aumentado e mais escuro nas larvas tratadas é indicativo de interrupções no tráfego de lipoproteínas para o embrião de zebrafish durante o desenvolvimento, consistente com estudos anteriores. A visualização da arquitetura da MEC na cauda revelou uma alteração na deposição de fibras de colágeno e na organização estrutural, de acordo com o papel central do TANGO1/cTAGE5 na secreção de colágeno. Além disso, utilizamos o zebrafish como modelo para estudar a deposição de colágeno no tecido recém-formado após lesão induzida por laser. A inibição de TANGO1/cTAGE5 pelos peptídeos retardou a formação de tecido de granulação sem demonstrar evidências de toxicidade. Esses estudos demonstram que modular a atividade de TANGO1/cTAGE5 é uma ferramenta valiosa para dissecar e compreender os processos complexos necessários para a reparação tecidual adequada e, ao mesmo tempo, pode também fornecer uma nova abordagem terapêutica para interferir nos mecanismos fisiopatológicos que impulsionam a deposição excessiva de MEC na cicatrização aberrante de feridas e na fibrose, incluindo cicatrizes hipertróficas. A pele como órgão-alvo na esclerodermia e outras doenças esclerosantes da pele oferece o uso de aplicação de peptídeos como injeções locais infiltrando o tecido envolvido. Em algumas situações, por exemplo, para reduzir a formação excessiva de cicatrizes após lesão, até mesmo aplicações tópicas permitindo a penetração direta no compartimento dérmico podem reduzir possíveis efeitos colaterais.
Fibroblastos durante a cicatrização de feridas e em processos fibróticos são ativados por citocinas pró-fibróticas e fatores de crescimento, que são liberados por células inflamatórias e/ou endoteliais. Esses fibroblastos ativados têm as características de miofibroblastos e estão envolvidos no reparo tecidual e na formação de cicatrizes. A potente citocina pró-fibrótica, TGFβ, tem se mostrado crucial para esses processos e desempenha um papel importante na formação de miofibroblastos. Em fibroblastos humanos de indivíduos saudáveis, o TGFβ induz a síntese de colágeno e o aumento da secreção para o meio. É promissor que os inibidores peptídicos foram particularmente eficazes na redução da secreção de múltiplas proteínas da MEC em fibroblastos primários e fibroblastos controle ativados por TGFβ (Figs. 4 e 6) sem exercer atividade citotóxica. Os miofibroblastos na esclerodermia provavelmente permanecem em um estado ativado, causando uma deposição descontrolada de proteínas da MEC e montando uma MEC perturbada, característica de uma estrutura tecidual rígida e fibrótica. In vitro, essas células são particularmente responsivas ao tratamento com TGFβ (Fig. 6). Inibir TANGO1/cTAGE5 resultou em uma redução severa da secreção de colágeno também nessas células, sugerindo que os miofibroblastos em pacientes com esclerodermia podem ser alvo dos peptídeos inibidores.

A inibição de TANGO1/cTAGE5 prenderia os colágenos no RE, de onde eles provavelmente são eliminados por uma combinação de autofagia, ER-fagia e degradação proteossomal, levando à nossa observação de que fibroblastos humanos mostraram apenas um acúmulo menor de colágeno intracelular quando a secreção foi inibida.

Além das potenciais implicações para o desenvolvimento terapêutico antifibrótico, é empolgante que esses inibidores peptídicos foram ativos em zebrafish, pois fornecem um instrumento experimental para controlar a secreção da MEC de forma seletiva, aguda e reversível, em quase qualquer sistema metazoário sem os confundimentos de células ou tecidos se adaptando à perda genética de TANGO1. Os peptídeos atuarão apenas de forma localizada, pois só podem penetrar na camada mais externa das células às quais são expostos.

Vemos um papel claro para TANGO1 na secreção de várias proteínas grandes da MEC, incluindo muitos colágenos, fibrilina 1 e fibronectina, entre outras. Nossos dados apoiam a ideia de que as proteínas da MEC são as cargas secretoras mais sensíveis à perturbação da função de TANGO1. Isso pode ser uma indicação da enorme carga secretora durante a secreção da matriz, já que as proteínas da família TANGO1 são provavelmente necessárias para a exportação do RE de cargas volumosas e/ou secretadas em alto volume. Esse efeito pode surgir de como as proteínas da família TANGO1 (re)organizam ou estruturam a via secretora inicial para acomodar essas cargas. Uma possibilidade intrigante adicional que merece mais estudos é que várias dessas proteínas da MEC e/ou suas enzimas modificadoras saem do RE de forma concertada, talvez já interagindo entre si em uma 'mini-MEC' rudimentar.
O mecanismo exato ainda não é completamente compreendido, e uma investigação detalhada é crucial para um melhor entendimento da formação da MEC, rigidamente equilibrada e controlada, e de sua organização no desenvolvimento e na homeostase tecidual.
Métodos
Síntese de peptídeos
Os peptídeos foram sintetizados por síntese automatizada de peptídeos em fase sólida (SPPS) (sintetizador de peptídeos da MultiSynTech, Syro I) utilizando a estratégia Fmoc (fluorenilmetoxicarbonil)/t-Bu (terc-butila) em resina Rinkamida (carga de 0,48 mmol, escala de 0,015 mmol). Os aminoácidos foram acoplados usando 8 equivalentes (eq) de N,N′-diisopropilcarbodiimida (DIC) e cianohidroxiiminoacetato de etila (Oxyma) em dimetilformamida (DMF) como reagentes ativadores. O Fmoc foi clivado usando 20% de piperidina em DMF. Finalmente, a resina foi lavada com diclorometano (DCM), metanol (MeOH) e éter dietílico (Et2O), respectivamente.
Para estudos de captação celular e microscopia de fluorescência, também foram sintetizados peptídeos marcados com 5,6-carboxifluoresceína (CF). Para isso, foram aplicados 5 eq de CF, Oxyma e DIC e os peptídeos foram marcados na extremidade N-terminal enquanto ainda estavam ligados à resina.
Após a síntese completa, os peptídeos foram clivados tratando a resina por 3 h à temperatura ambiente com uma mistura de ácido trifluoroacético (TFA) concentrado (conc.)/triisopropilsilano (TIS)/H2O (95:2,5:2,5, v/v/v). Subsequentemente, os peptídeos foram precipitados em éter dietílico gelado. A cromatografia líquida de alta pressão em fase reversa (RP-HPLC) (coluna: CC 125/4,6 Nucleodur 100-5 C18e (Macherey-Nagel) usando um gradiente de 10–60% de acetonitrila (ACN) em H2O com 0,1% de ácido fórmico para separação da amostra, seguida por espectrometria de massas por ionização por electrospray (ESI-MS, Thermo Scientific LTQ-XL) foi utilizada para identificação. A purificação foi alcançada por RP-HPLC semipreparativa (Hitachi Elite LaChrom) em uma coluna VP 250/8 Nucleodur 100-5 C18e (Macherey-Nagel) usando gradientes lineares de 10–60% de B em A (A = 0,1% de TFA conc. em água; B = 0,1% de TFA conc. em ACN) por 45 min e uma taxa de fluxo de 1,5 ml/min. A pureza final de todos os compostos foi >50%. Finalmente, para trocar o TFA restante por cloreto, os peptídeos foram diluídos em 3 mL de solução de HCl 80 mM, incubados por 2 h sob agitação e liofilizados durante a noite. Este procedimento foi repetido duas vezes.
Imagem de colágeno intracelular em cultura de células
A visualização do colágeno foi realizada como anteriormente. Resumidamente, células RDEB/FB/C7 cultivadas em placas de seis poços foram lavadas com PBS para remover o meio e substituídas por DMEM fresco suplementado com 10% de FCS. Os peptídeos permeáveis a células (P2, P5) foram então adicionados na concentração final de 10 μM por 20 h, com ascorbato (250 μM de ácido ascórbico, 1 mM de fosfo-ascorbato) em meio completo.
Células U2OS cultivadas em placas de Petri foram lavadas para remover o meio e substituídas por meio fresco. Os peptídeos permeáveis a células (P2, P5) foram então adicionados na concentração final de 10 μM por 4 h, com ascorbato (250 μM de ácido ascórbico, 1 mM de fosfo-ascorbato) em OptiMEM. O controle não teve nada adicionado.
Células foram fixadas e processadas para microscopia de imunofluorescência.

Experimentos com zebrafish
Manutenção de zebrafish

Para os experimentos de incubação com peptídeos, foram utilizados zebrafish selvagens AB. Os zebrafish foram mantidos no Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona (PRBB) de acordo com os procedimentos padrão da instalação aquática. Todos os protocolos seguiram as diretrizes nacionais e europeias e foram aprovados pelo Comitê de Ética de Cuidado e Uso Animal Institucional (PRBB–IACUEC). Os princípios dos 3Rs foram aplicados em todos os experimentos com zebrafish.

Os experimentos de cicatrização de feridas em zebrafish foram aprovados pelos comitês locais e federais de cuidado animal (Cidade de Colônia: 8.87-50.10.31.08.129; LANUV Nordrhein-Westfalen: 81-02.04.2018.A097).

Incubação

Embriões de zebrafish foram mantidos em meio E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) antes do experimento. Embriões de zebrafish foram manualmente descorionados entre os estágios de 2 e 4 células para garantir que todos os ovos utilizados no experimento fossem viáveis. Um total de 20 embriões por condição foram imediatamente transferidos para uma placa de quatro poços com 5 embriões por poço (Nunc delta, Thermo Fisher 176740) pré-preenchida com 500 μl de meio E3 com inibidores peptídicos (2 μM ou 4 μM de ambos P2 e P5). Embriões controle foram mantidos apenas em E3, e trocas de meio foram realizadas em 1 dpf e 3 dpf para todas as condições de tratamento. Embriões e larvas foram continuamente tratados durante a duração do experimento e mantidos a 28°C. Para evitar pigmentação nas larvas de zebrafish, 0,1% de PTU foi adicionado ao meio a partir de 24 hpf. Embriões foram monitorados nos estágios de esfera, escudo, 75% epibolia, 1, 2 e 3 dpf quanto à sobrevivência e desenvolvimento. Em 3 dpf, um grupo representativo de larvas foi fotografado para fenotipagem e medições de comprimento. O experimento foi realizado três vezes. Para imagem de fibras de colágeno com microscopia de geração de segundo harmônico, as larvas foram fixadas em PFA 4% a 4°C durante a noite, seguidas de lavagem com PBS.

Cicatrização de feridas em zebrafish

Zebrafish adultos da linhagem selvagem TL/Ekwill com idade de 8 meses foram utilizados para experimentos de ferimento. Feridas de espessura total em peixes adultos com diâmetro de ∼2 mm foram introduzidas com um laser Dermablate, conforme descrito anteriormente. Em resumo, os peixes adultos foram anestesiados em 0,13% de Tricaina (p/v) e colocados em posição lateral sobre papel Whatman umedecido com água do sistema. Feridas de espessura total foram introduzidas no flanco esquerdo, diretamente anterior às nadadeiras anal e dorsal. Um laser dermatológico Erbium:YAG MCL29 Dermablate (Asclepion, Jena, Alemanha) foi configurado para uma frequência de 1 Hz e 5 pulsos com uma potência de 500 mJ foram aplicados.
Para o tratamento local de feridas com peptídeos, as feridas foram microinjetadas tanto 2 quanto 3 dias após a lesão (dpw), utilizando uma agulha de vidro com diâmetro de ponta inferior a 50 µm, um micromanipulador e uma Pneumatic PicoPump (PV820, World Precision Instruments). As feridas foram injetadas em cinco locais: um local interno diretamente no centro da ferida e quatro locais externos a aproximadamente 0,3 mm da borda da ferida e com distâncias máximas entre si, formando assim um padrão semelhante aos cinco pontos de um dado. Por ferida, um total de 80 nl de uma solução estoque de peptídeo a 50 µM em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4 (Sigma) foi injetado. Assumindo um volume de tecido de granulação de ~1 mm³ (µl), conforme calculado a partir de suas dimensões em nossas seções histológicas, isso deve resultar em uma concentração final de peptídeo dentro do tecido de granulação de ~4 µM. Como controle, PBS puro foi injetado. Para análises histológicas, peixes feridos e injetados foram sacrificados aos 4 dpw e fixados em paraformaldeído a 4% / PBS durante a noite em temperatura ambiente, descalcificados em EDTA 0,5 M (pH 7,4) em temperatura ambiente por 5 dias, desidratados em uma série graduada de álcoois, clarificados em Roti-Histol (Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) e embebidos em parafina. Seções de 10 µm de espessura foram coradas com hematoxilina e eosina usando protocolos padrão. Para quantificação dos tamanhos do tecido de granulação, seções consecutivas das feridas foram coradas com hematoxilina e eosina. Seções compreendendo o centro da ferida foram selecionadas, as áreas do tecido de granulação foram medidas usando ImageJ, e o teste t de Student foi usado para calcular a significância.
Para análise imuno-histoquímica, seções consecutivas de parafina foram aquecidas em micro-ondas em tampão citrato 10 mM pré-aquecido (pH 6,0, Tween 20 a 0,05%) por 15 minutos após a reidratação. As lâminas foram então deixadas esfriar em temperatura ambiente por 20 minutos e lavadas com PBS-Tween 20 (0,1%) três vezes por 10 minutos cada. O bloqueio (10% FBS + 1% DMSO em PBST) foi realizado por 3 horas em temperatura ambiente. O anticorpo primário Anti-col1 (1:200, ab23730, Abcam, Cambridge, MA, EUA) em tampão de bloqueio foi adicionado às lâminas para incubação durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, as lâminas foram lavadas com PBST quatro vezes por 10 minutos cada e o anticorpo secundário goat anti-rabbit Cy3 (1:750, RRIDAB AB_2534029, cat. no. A10520) em tampão de bloqueio foi adicionado às lâminas para incubação em temperatura ambiente por 90 minutos. As lâminas foram então lavadas novamente com PBST quatro vezes por 10 minutos cada e montadas com Mowiol incluindo DAPI. As lâminas foram armazenadas a 4 °C até a obtenção de imagens subsequente. As imagens foram capturadas em um microscópio Zeiss Apotome e a área corada para colágeno-I no tecido de granulação foi medida usando ImageJ e o teste t de Student foi usado para calcular a significância.
A produção de MEC foi analisada aos 4 dpw, uma vez que o acúmulo de colágeno no tecido de granulação de feridas cutâneas de peixe-zebra atinge seu máximo nesta fase.
Coloração TUNEL
TUNEL staining on paraffin sections of the same individuals, also used for the Col2 immunofluorescence analysis, was performed using the DeadEndTM Fluorometric TUNEL System (Promega, G3250) and following the manufacturer’s protocol, except prolonging the Proteinase K (provided in the kit) treatment to 30 min and adding 2 PBS-TritonTM-X-100 0,1% wash steps following the rTdT enzyme reaction. Specificity of the assay was confirmed via negative and positive (DNAse treatment) controls. Images were taken on a Zeiss Axio Imager Z.1 microscope with an apotome function. Images were processed using the mpl-inferno LUT application of the ImageJ software (Version 1.54 f). For quantification, five individual fish and two individual sections per fish were analyzed.
Second Harmonic Generation (SHG) microscopy of Zebrafish fin collagen fibers
To visualize collagen fibers, the yolk of the fixed larvae was removed manually to improve imaging. PFA-fixed and de-yolked zebrafish were mounted in 1% low melting point agarose (Invitrogen 16520050) on 50 mm bottom-glass dishes (P50G-0-14-F, MatTek Corporation) sandwiched with a round cover glass (30 mm diameter #1, Menzel Gläser) and sealed with nail polish, to allow imaging in forward and backward direction. The experiment was carried out three times and a total of three control and three peptide-treated fish were imaged using second harmonic generation microscopy. The optical setup consists of a confocal microscope (Eclipse Ti-U, Nikon) adapted to perform nonlinear microscopy. The system was pumped with a femtosecond-pulsed laser beam (Halite, Fluence) operating at a central wavelength of 1030 nm. The laser was transversally scanned with a pair of two galvanometric mirrors in tandem configuration (Cambridge Technology). The beam was expanded with a telescope arrangement to fill the microscope objective pupil and directed with a dichroic mirror (DMS1000R, Thorlabs) to a 20x NA 0.75 air objective (Plan Apo λ, Nikon) to focus the beam on the sample. The signal was detected in forward direction with a 25x NA 1.10 water objective (Apo LWD, Nikon). The SHG signal is collected with a photomultiplier tube (H7422-40, Hamamatsu) using a dichroic mirror (FF665-Di01), an IR filter (FGB37-A, Thorlabs) and a bandpass filter centered at 515 nm (FF01-515/30-25, Semrock). The transmitted light from the femtosecond-pulsed laser was collected with a silicon photodiode for sample reference. Image acquisition was obtained with an in-house implemented LabVIEW-based software. Z-stacks of 512 × 512 pixel images were reconstructed with FIJI (ImageJ, version 1.50i).
We quantified the preferred orientation of the collagen fibers from Control and P2 + 5 (4 μM)-treated fishes using the Directionality plugin from FIJI (ImageJ, version 1.50i). Data normalization and plotting were performed using GraphPad Prism version 9.3.1 for Windows, GraphPad Software.
Biópsias de pele foram obtidas de indivíduos saudáveis do sexo feminino e masculino ou de pacientes com esclerodermia (esclerose sistêmica) após consentimento por escrito e com aprovação do comitê de ética local (Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Colônia, 21-1072). O estudo foi conduzido de acordo com os critérios estabelecidos pela Declaração de Helsinque. Fibroblastos dérmicos primários foram cultivados por crescimento a partir de explantes em DMEM (Gibco Invitrogen, 41965-039) com 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina (Sigma, P0781), 2 mM de L-glutamina (Biozym, 882027), 50 μg/ml de ascorbato de sódio (Sigma-Aldrich, A4034) e 10% de soro fetal bovino (Gibco, 10270-106) na atmosfera úmida de uma incubadora de CO2. As células foram utilizadas nas passagens 2–5.

Captação de peptídeos em fibroblastos cutâneos primários
Para visualização da captação de peptídeos, fibroblastos foram semeados a 1,4 × 10⁴ em uma lamínula de oito poços com câmara (Ibidi) e cultivados até confluência durante a noite. Para visualizar o RE, as células foram tratadas com CellLight™ ER-RFP (Invitrogen) por 24 h. Em seguida, soluções de peptídeos em meio isento de soro contendo 40 µM de P2 marcado com CF ou P5, ou ambos os peptídeos combinados, foram adicionadas. Após 20 h, os núcleos celulares foram corados com corante nuclear Hoechst 33.342 (Thermo Fisher) por 10 min. Imagens de microscopia de fluorescência ao vivo foram capturadas usando o microscópio Keyence BZ-X800 e, posteriormente, as imagens foram processadas usando ImageJ.

Ensaios de secreção em fibroblastos de doadores humanos
Para avaliar a secreção, fibroblastos foram semeados em alta densidade (3 × 10⁵ por poço de placa de 6 poços) e cultivados até confluência durante a noite, lavados extensivamente e tratados em meio isento de soro com P2 ou P5 ou a combinação de ambos os peptídeos ou os peptídeos scrambled scrP2, scrP5 ou a combinação destes nas concentrações indicadas por 20 h. Para alguns experimentos, os fibroblastos foram pré-tratados com TGFβ1 (10 ng/ml; R&D systems, 240-B) por 12 h na presença de 10% de soro fetal bovino, lavados extensivamente, e meios isentos de soro com TGFβ1 e peptídeos foram adicionados por 20 h.
Para avaliar a duração do efeito dos peptídeos, as células foram tratadas sem (Ctrl) ou com 40 μM de cada um dos P2 + P5 por 20 h na ausência de soro, e os sobrenadantes foram removidos. Em seguida, meio de crescimento contendo 10% de soro, mas sem peptídeos, foi fornecido às culturas controle e tratadas com peptídeos por 24, 48 ou 72 h.
Volumes iguais de sobrenadantes foram analisados por SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF (Immobilon, Merck, 0,45 µm, IPVH00010). Isso foi possível porque as concentrações totais de proteína nos lisados correspondentes eram comparáveis, conforme garantido pela determinação de BCA do conteúdo total de proteína (Pierce™ BCA Protein Assay Kits (Thermo Scientific, 23225)) e coloração de Ponceau (Sigma-Aldrich, P7170) das membranas com proteínas dos lisados celulares. Os anticorpos primários utilizados foram: anticorpo de cabra anti-colágeno tipo I (SouthernBiotech, 1310-01; 1:2000; reduzido); anticorpo de coelho anti-fibrilina-1 (doação gentil de G. Sengle, Colônia; 1:2000 não reduzido); anticorpo de coelho anti-fibronectina (abcam, ab23750; 1:500, não reduzido); e anticorpo de coelho anti-GAPDH (abcam, ab9485; 1:2500; reduzido), seguido por anticorpos secundários apropriados conjugados com peroxidase de rábano e detecção usando quimioluminescência aumentada (Thermo Scientific 34087). A retenção intracelular de colágeno I foi analisada em lisados de fibroblastos (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% SDS, 0,5% NP-40, 2 mM EDTA) e normalizada para GAPDH (abcam, ab9485; 1:2500; reduzido). As intensidades das bandas foram medidas usando a ferramenta Gel Analysis no software ImageJ.
Os efeitos citotóxicos induzidos pelo tratamento com peptídeo foram determinados pelos níveis de lactato desidrogenase (LDH) em sobrenadantes de fibroblastos usando o ensaio de citotoxicidade (Promega G1780) de acordo com as instruções do fabricante.
Análise do secretoma
Preparação da amostra. Sobrenadantes de fibroblastos tratados e controles também foram usados para análise proteômica para determinar o secretoma. Os sobrenadantes foram removidos das culturas, filtrados e clarificados por centrifugação. Um inibidor de protease foi adicionado, e as amostras foram congeladas a −80 °C até processamento posterior. As proteínas dos sobrenadantes foram precipitadas com acetona e ressuspensas em 6 M ureia/2 M tioureia. A redução de dissulfetos e alquilação foram realizadas usando 20 mM TCEP (Sigma-Aldrich) e 25 mM CAA (Merck) à TA por 1 h. As proteínas foram digeridas com endoproteinase Lys-C (Wako) (proporção enzima:substrato de 1:100) por 3 h à TA. Em seguida, a concentração de ureia foi diluída quatro vezes com tampão ABC 50 mM e digerida com tripsina (Promega/Sigma) (proporção enzima:substrato de 1:100) durante a noite à TA. A digestão foi interrompida pela adição de ácido fórmico a uma concentração final de 1%. As amostras foram dessalinizadas por extração Stop-and-Go usando StageTips SDB-RPS.
Análise por LC-MS/MS e processamento de dados. As análises do secretoma foram realizadas usando um sistema Easy nLC 1000 de cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UHPLC) acoplado a um espectrômetro de massas QExactive Plus (Thermo Fisher Science) com as mesmas configurações descritas anteriormente. Os espectros de MS adquiridos foram correlacionados com o banco de dados FASTA humano usando o MaxQuant (V. 1.5.38) com seu mecanismo de busca Andromeda implementado. Todos os parâmetros foram definidos como padrão. A acetilação N-terminal e a oxidação da metionina foram definidas como modificações variáveis e a carbamidometilação da cisteína foi definida como modificação fixa. As análises estatísticas e anotações GO foram realizadas no Perseus (V. 1.6.2.3.58) e os dados foram visualizados usando o InstantClue. O ponto de corte de significância foi definido como FDR < 0,05.

Análises estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o GraphPad Prism versão 6. Os testes aplicados estão indicados nas legendas das figuras individuais. *  = p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

Resumo de relatório
Mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Resumo de Relatório do Nature Portfolio vinculado a este artigo.

Informações suplementares

Dados de origem

Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.

Informações suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41467-024-47004-1.

Contribuições dos autores
Conceitualização: I.R., V.M., T.K., I.N. e B.E. Experimentação: I.R., A.-H.R., I.K., M.S., L.K., P.F., K.H., J.N., A.B., H.-M.H., C.V., K.B., M.C., G.C., M.V., B.D., R.K.Z. e R.K. Análise de dados: todos os autores. Redação do manuscrito e aprovação: todos os autores. Recursos e supervisão: C.C., F.C., J.A., P.L.-A., V.R., C.J., M.K., M.H., B.E., I.N. e T.K. Obtenção de financiamento: I.R., T.K., V.M., V.R., M.C., G.C., F.C., J.A. e P.L.-A.

Revisão por pares

Informações da revisão por pares
A Nature Communications agradece aos revisores anônimos por sua contribuição para a revisão por pares deste trabalho. Um arquivo de revisão por pares está disponível.

Disponibilidade de dados
Os dados de proteômica por espectrometria de massas foram depositados no Consórcio ProteomeXchange através do repositório parceiro PRIDE com o identificador de conjunto de dados PXD041678. Todos os materiais exclusivos gerados estão prontamente disponíveis com os autores. Os dados de origem são fornecidos neste artigo.

Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Referências
Reparo e regeneração de feridas: mecanismos, sinalização e tradução
Reparo e regeneração de feridas
Doença fibrótica e o paradigma T(H)1/T(H)2
Novos medicamentos promissores para o tratamento da esclerose sistêmica: considerações patogênicas, classificações aprimoradas e medicina personalizada
Mecanismos compartilhados e distintos da fibrose
Esclerodermia
Direcionamento da via de sinalização TGFβ em doenças
Fibrose tecidual mediada por citocinas
TANGO1 facilita o carregamento de carga nos sítios de saída do retículo endoplasmático
cTAGE5 medeia a secreção de colágeno através da interação com TANGO1 nos sítios de saída do retículo endoplasmático
Genômica funcional revela genes envolvidos na secreção de proteínas e organização do Golgi
Defeitos globais na secreção de colágeno em um camundongo knockout Mia3/TANGO1
Um rastreamento de RNAi específico de células de tendão revela novos candidatos essenciais para a interação músculo-tendão
O transdutor de UPR BBF2H7 permite a exportação de colágeno tipo II de maneira específica para carga e estágio de desenvolvimento
Mutações bialélicas causam uma nova doença sindrômica devido à secreção celular de colágeno prejudicada
Funções complementares e divergentes de Tango1 e Ctage5 de zebrafish no desenvolvimento e homeostase tecidual
Defeito de splicing em cães cane corso com anomalia dental-esquelética-retiniana (DSRA)
A perda de TANGO1 leva à ausência de mineralização óssea
Túneis para exportação de proteínas do retículo endoplasmático
Transporte de proteínas por vesículas e túneis
TANGO1 constrói uma máquina para exportação de colágeno ao recrutar e organizar espacialmente COPII, ancoradores e membranas
TANGO1 recruta Sec16 para organizar coordenadamente locais de saída do RE para secreção eficiente
Arnolds, O. & Stoll, R. Caracterização de uma dobra no TANGO1 evoluída a partir de domínios SH3 para a exportação de cargas volumosas. Nat. Commun.14, 2273 (2023).
Mecanismos intracelulares de reconhecimento molecular e classificação para o transporte de grandes moléculas da matriz extracelular
A resposta de proteína não dobrada medeia a fibrogênese e a secreção de colágeno I através da regulação de TANGO1 em camundongos
Desenho de um novo peptídeo quimérico permeável a células para promover a cicatrização de feridas
Dissecção funcional do inibidor de tráfego retrógrado da toxina Shiga Retro-2
Inibição seletiva da secreção de proteínas ao abolir interações receptor-revestimento durante a exportação do RE
Zebrafish adulto como sistema modelo para pesquisa de cicatrização de feridas cutâneas
Predição de estrutura de proteínas altamente precisa com AlphaFold
Peptídeos CaaX permeáveis a células afetam a sinalização downstream de K-Ras e promovem morte celular em células cancerígenas
A matriz extracelular da derme: Estruturas flexíveis com funções dinâmicas
O arcabouço de microfibrilas de fibrilina: um nicho para fatores de crescimento e mecanossensação?
Interações célula-matriz extracelular na pele normal e doente
Complexos distintos específicos de isoforma de TANGO1 facilitam cooperativamente a secreção de colágeno do retículo endoplasmático
Um papel geral para TANGO1, codificado por MIA3, na organização e função da via secretora
Mapeamento global, quantitativo e dinâmico da localização subcelular de proteínas
A concentração de Sec12 nos locais de saída do RE via interação com cTAGE5 é necessária para a exportação de colágeno
TANGO1 se monta em anéis ao redor de revestimentos COPII nos locais de saída do RE
Mea6 controla o transporte de VLDL através da regulação coordenada da montagem de COPII
cTAGE5/MEA6 desempenha um papel crítico no tráfego de componentes celulares neuronais e no desenvolvimento do cérebro
TANGO1 e Mia2/cTAGE5 (TALI) cooperam para exportar pré-quilomícrons/VLDLs volumosos do retículo endoplasmático
Colesterol e triglicerídeos reduzidos em camundongos com uma mutação em Mia2, uma proteína hepática que se localiza no RE
Thierer, J. H. et al. Pla2g12b impulsiona a expansão de lipoproteínas ricas em triglicerídeos. Nat. Commun.15, 2095 (2024).
Axotomia por laser de femtossegundo em Caenorhabditis elegans e avaliação de danos colaterais usando uma combinação de técnicas de imagem lineares e não lineares
Fibroblastos em redes de colágeno mecanicamente estressadas assumem um fenótipo 'sintético'
Protocolo para micropurificação, enriquecimento, pré-fracionamento e armazenamento de peptídeos para proteômica usando StageTips
Avaliação da dinâmica de proteínas séricas por inundação SILAC nativa (SILflood)
Andromeda: um mecanismo de busca de peptídeos integrado ao ambiente MaxQuant
Instant clue: um conjunto de software para visualização e análise interativa de dados
O banco de dados PRIDE e ferramentas e recursos relacionados em 2019: melhorando o suporte para dados de quantificação