pmid: "39463408"
title: "Preparação e análise de estrutura tecidual do peptídeo de colágeno de osso de cavalo."
authors: "Wu J, Na H, Bai F, Li S, Gao H, Sha R"
journal: "Scientific reports"
pubdate: "2024 Oct 28"
doi: "10.1038/s41598-024-75960-7"
source: "PMC Full Text"
Preparação e análise de estrutura tecidual do peptídeo de colágeno de osso de cavalo.
Autores
Wu J, Na H, Bai F, Li S, Gao H, Sha R
Periodico
Scientific reports (2024 Oct 28)
Conteudo
Preparação e análise da estrutura tecidual do peptídeo de colágeno de osso de cavalo
O osso de cavalo é rico em colágeno, com composição semelhante à do colágeno humano. Os peptídeos de colágeno fornecem nutrientes necessários para o crescimento humano, que atuam como antioxidantes e reduzem a pressão arterial. Este estudo explorou a extração de colágeno e a preparação de peptídeos curtos de colágeno a partir de ossos de cavalos da raça Mongol. Ossos foram coletados de cavalos de diferentes idades, e o teor de colágeno, juntamente com a distribuição de sais de cálcio, foram observados por meio de análises de coloração e imagem. Em seguida, os ossos foram processados em pó e submetidos a processamento de ultra-alta pressão para desengorduramento. As condições de desengorduramento foram otimizadas por testes de fator único e ortogonais. Na sequência, o colágeno foi extraído utilizando um método ácido-enzimático, e suas características estruturais e estabilidade térmica foram avaliadas. Os peptídeos curtos de colágeno foram extraídos das amostras de colágeno, e os efeitos do tempo de hidrólise enzimática, temperatura, pH e quantidade de enzima na taxa de extração foram avaliados. Finalmente, os peptídeos de colágeno resultantes foram analisados quanto à atividade antioxidante. Em resumo, este experimento otimizou as condições de extração do colágeno de osso de cavalo, demonstrando que o método de ultra-alta pressão afeta minimamente a estrutura do colágeno, e a taxa de extração foi alta. Portanto, nosso método tem potencial de desenvolvimento significativo.
Introdução
O processamento de ultra-alta pressão (UHP), também conhecido como tecnologia de pressão hidrostática, é uma tecnologia de processamento de alimentos que tem atraído atenção na indústria alimentícia chinesa, com esforços e investimentos substanciais dedicados à sua pesquisa e desenvolvimento. A UHP envolve moldar ou dimensionar alimentos através de embalagem a vácuo. Nesse processo, o alimento é colocado em equipamentos de tratamento de ultra-alta pressão de acordo com os princípios básicos de Le Chatelier e Pascal. Água destilada é então empregada como meio para transmitir pressão para esterilizar o alimento sob pressões superiores a 100 MPa, eliminando efetivamente enzimas e modificando as características do alimento. Este método físico de processamento de alimentos prolonga a vida útil do alimento. Em essência, o tratamento de ultra-alta pressão rompe ligações não covalentes em substâncias alimentares, incluindo ligações de hidrogênio, ligações moleculares, efeitos hidrofóbicos e efeitos eletrostáticos, bem como as complexas estruturas terciárias organizacionais das biomoléculas no alimento. Notavelmente, as ligações covalentes de moléculas pequenas, como vitaminas e aminoácidos, permanecem inalteradas. Consequentemente, o sabor, a nutrição e a cor do alimento são preservados. Atualmente, a UHP é o método de esterilização preferido na indústria alimentícia, pois retém a composição original do alimento. Além disso, a frescura do alimento não é afetada e pode até ser estendida. Como resultado, a UHP demonstra considerável potencial de desenvolvimento.
Dong et al. estudaram os efeitos das enzimas de sabor na hidrólise de ossos de frango ao longo do tempo, descobrindo que a proporção de peptídeos de baixo peso molecular (400–1000 Da) em produtos hidrolisados por 8 h era 74 vezes maior do que naqueles hidrolisados por 1 h. Kim et al. investigaram as propriedades físico-químicas do colágeno tipo I de osso bovino e estudaram a atividade antioxidante de peptídeos de baixo peso molecular do osso da perna de cavalos Jeju. León-López et al. exploraram como o tempo de hidrólise afetou a extração de colágeno e a enzimólise da pele de ovelha, bem como sua estrutura e atividade antioxidante. Além disso, Miroslava et al. separaram o peptídeo de colágeno de lula usando membranas de ultrafiltração, descobrindo que o hidrolisado com peso molecular inferior a 5 kDa apresentava forte atividade antioxidante. Finalmente, Hou et al. descobriram que os componentes no hidrolisado de colagenase (com peso molecular de 1–5 kDa) da pele de esturjão tinham uma forte capacidade de eliminação de ânions superóxido.
O osso de cavalo, frequentemente utilizado na medicina tradicional para tratar doenças ósseas, fraturas e artrite, possui uma proporção de nutrientes maior do que o osso de outros animais domésticos e é rico em colágeno e cálcio de alta qualidade. No entanto, estudos limitados exploraram os ossos como fonte de colágeno. Recentemente, esforços têm sido feitos para industrializar a indústria equina chinesa. Ao mesmo tempo, a indústria equina do tipo produto também está se desenvolvendo, formando carne de cavalo, iogurte de cavalo, vinho de leite de cavalo, pele de cavalo, farinha de osso de cavalo, soro de égua prenhe e outros produtos com alto valor nutricional e funções medicinais únicas. O progresso tem sido lento devido à falta de atenção e à falha em enfatizar seus benefícios sociais e econômicos. Consequentemente, a indústria permanece nos estágios iniciais de industrialização.
Dados os benefícios do colágeno e os ricos nutrientes derivados do osso, este estudo explorou a extração e preparação de peptídeos curtos de colágeno a partir de ossos de cavalo da Mongólia, visando expandir o uso de ossos de cavalo na indústria.
Materiais e métodos
Materiais
Os materiais para este experimento foram as costelas e a tíbia de cavalos de 2, 8 e 13 anos de idade, fornecidos pela Shandong Dezhou Demu Meat Processing Co., LTD. Ossos de ovelha e ossos de gado foram fornecidos pela Zhongke Wanxin Selenium-Enriched Halal Food Co., LTD., Cidade de Ordos, Mongólia Interior.
Reagentes
Os seguintes produtos químicos, reagentes e outros materiais foram utilizados neste estudo: acetato de etila (Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China); éter de petróleo, álcool etílico absoluto, meio de montagem Permount TM e xileno (Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd., Xangai, China); EDTA, kit de detecção de conteúdo de hidroxiprolina (HYP), saco de diálise MD34, pepsinum e protease alcalina (Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., Pequim, China); albumina de soro bovino, azul brilhante de Coomassie G-250 e ferricianeto de potássio (Tianjin Yongda Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China); ácido acético glacial (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory, Tianjin, China); corante vermelho Sirius e solução de corante vermelho de alizarina (Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, China); acetato de éter dietílico de glicol (Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Xangai, China).
Análise dos componentes básicos da farinha de osso de cavalo
Teor de umidade (GB/T5009.3-2016); teor de proteína (GB/T5009.5-2016); determinação do teor de gordura (GB/T5009.6-2016); teor de cinzas (GB/T5009.4-2016).
Preparação e coloração de cortes de tecido duro
Tíbias equinas frescas de várias idades foram selecionadas, e o tecido ósseo foi fixado com solução de paraformaldeído a 4% (PFA) por 48 h. Em seguida, os tecidos foram submetidos à desidratação pela adição sucessiva de diferentes concentrações de etanol, e cada gradiente foi mantido por 24–72 h. A tíbia fatiada do cavalo foi colocada em um frasco de inclusão, com quantidade adequada de solução de inclusão adicionada. O sistema foi selado a vácuo por 5 h, e um banho-maria foi ajustado a 37°C. O tecido ósseo foi fatiado em aproximadamente 10 μm usando um micrótomo, e essas fatias foram secas em estufa a 60°C durante a noite. Os cortes foram desidratados com acetato de éter dietílico de glicol e etanol em diferentes gradientes. Os tecidos tratados foram corados com vermelho de alizarina e vermelho Sirius, respectivamente.
Tratamento por ultra-alta pressão
Fluxo do processo de desengorduramento
O osso de cavalo triturado foi embalado a vácuo e colocado dentro do equipamento de ultra-alta pressão. Água destilada foi usada como meio para o tratamento de ultra-alta pressão (HHP-600, Baotou Kefa high pressure technology Co., LTD). Após o processamento, misture uniformemente com acetato de etila na proporção de 1:15 g/mL. Em seguida, a amostra foi agitada a 4°C por 24 h, com a solução sendo substituída a cada 8 h. Uma vez concluído o processo de desengorduramento, a amostra foi seca em ambiente ventilado a 60°C por 24 h e pesada para uso posterior. (Grupo controle: ossos de cavalo desengordurados sem tratamento de ultra-alta pressão)
Um experimento de fator único foi conduzido para extrair gordura das costelas de um cavalo de 8 anos de idade usando acetato de etila assistido por ultra-alta pressão. As condições de gradiente selecionadas são: Razão líquido-sólido (1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 g/mL); Ultra-alta pressão (100, 200, 300, 400, 500 MPa); Tempo de manutenção da pressão (5, 7, 9, 11, 13 min). Cada fator foi repetido 3 vezes, e os resultados medidos foram considerados como o valor médio. A fórmula para calcular a taxa de desengorduramento (R, %) da farinha de osso de cavalo é a seguinte:
Onde Ml: peso do papel de filtro antes do desengorduramento (g); M2: Peso do papel de filtro após o desengorduramento (g); M0: Peso da gordura contida na amostra de osso de cavalo (g).
De acordo com os resultados do experimento de fator único, um experimento de otimização ortogonal L9(34) foi conduzido. Otimizar o processo de desengorduramento do pó de osso de cavalo ajustando a ultra-alta pressão, o tempo de manutenção e a razão líquido-sólido (Tabela 1).
Tabela de fatores e níveis do experimento ortogonal.
Nível Factor Ultra-alta pressão/MPa Tempo de manutenção da pressão/min Razão líquido-sólido(g/mL) 1 200 7 1:10 2 300 9 1:15 3 400 11 1:20
Extração de colágeno da farinha de osso de cavalo
Processo de extração
A farinha de osso de cavalo foi misturada com solução de acetato de etila na proporção de 1:15 g/mL, e a solução foi agitada e desengordurada a 4°C por 24 h. Após o desengorduramento, a amostra foi centrifugada por 20 min a 11.200 x g a 4°C. Após a centrifugação, decante o sobrenadante e retenha o precipitado. Lave completamente o precipitado com água destilada. Pese uma quantidade específica de pó de osso de cavalo desengordurado e adicione-o a uma solução de EDTA 0,5 mol/L na proporção de 1:10 (g/mL). Descalcifique a mistura agitando a 4°C com agitação contínua. Substitua a solução a cada 8 h e interrompa quando as bordas das partículas de osso se tornarem lisas, sem pontas. Centrifugue o precipitado a 11.200 x g por 20 min a 4°C, seguido de lavagem com água destilada três vezes ou mais. A farinha de osso de cavalo descalcificada foi adicionada a uma solução de NaOH 0,1 mol/L na proporção de 1:10 g/mL, e a proteína de impureza foi removida por agitação contínua a 4°C por 24 h. Após a remoção das impurezas, a amostra foi centrifugada a 11.200 x g a 4°C por 20 min, e o precipitado foi retido. Em seguida, a amostra foi lavada com água destilada pelo menos três vezes. Posteriormente, uma proporção de volume de 1:15 de ácido acético 0,5 mol/L e pepsina a 6% (3000 U/g) foi introduzida, e a mistura foi continuamente agitada a 4°C por 24 h para facilitar a extração de colágeno dos ossos de cavalo. Após a extração do colágeno de osso de cavalo, a mistura foi centrifugada a 11.200 x g por 20 min a 4°C para manter o sobrenadante. O precipitado continua a sofrer enzimólise, e esse processo é repetido duas vezes para recombinar o sobrenadante adquirido da mistura. O sobrenadante foi ajustado para um valor de pH de 7,4 com solução de NaOH 3 mol/L. Em seguida, o pó sólido de NaCl foi adicionado lentamente à solução de extração de colágeno até que a concentração atingisse 0,9 mol/L. A mistura acima foi colocada em um tanque de cromatografia a 4°C por 24 h para salga e centrifugada a 11.200 x g por 20 min para reter o precipitado. Os precipitados resultantes foram dissolvidos com ácido acético glacial 0,5 mol/L e colocados em um saco de diálise pré-tratado. A 4°C, foram dialisados com solução de ácido acético glacial 5 mmol/L por 48 h e depois com água destilada por 24 h. O colágeno obtido após a diálise foi injetado em uma placa de vidro, congelado durante a noite em um refrigerador a −80°C e, em seguida, seco em um liofilizador a vácuo por aproximadamente 24 h para obter colágeno cristalino em pó branco, que foi refrigerado a −20°C para uso (Fig. 1).
Processo de extração de colágeno de osso de cavalo.
Teste de fator único e ortogonal
Um experimento de fator único foi conduzido para extrair colágeno das costelas de um cavalo de 8 anos. Ao experimentar mudanças na dosagem de enzima, tempo de extração e relação sólido-líquido, etc., usando a taxa de extração de colágeno como índice de detecção, o processo ideal pode ser determinado. Os gradientes de cada fator são: quantidade de dosagem de enzima (2, 4, 6, 8, 10%); relação sólido-líquido (1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 g/mL); tempo de extração (12, 24, 36, 48, 60 h). Para cada fator único, o experimento foi conduzido alterando um fator de cada vez e repetindo três vezes para cada fator. Os resultados foram então calculados em média.
Com base nos resultados do experimento de fator único, o tempo de extração, a dosagem de enzima e a relação líquido-sólido foram selecionados como fatores de influência, e a taxa de extração de colágeno foi usada como índice de teste. Um experimento ortogonal L9(34) foi usado para determinar o processo otimizado para extrair colágeno de ossos de cavalo (Tabela 2).
Fatores experimentais ortogonais e tabela de níveis.
Nível Fator Dosagem de enzima/% Tempo de extração/h Relação líquido-sólido(g/ mL) 1 4 12 1:10 2 6 24 1:15 3 8 36 1:20
Medição do indicador de colágeno
Dilua a solução padrão de hidroxiprolina para concentrações de 0,23 µg/mL, 0,46 µg/mL, 0,93 µg/mL, 1,87 µg/mL, 3,75 µg/mL, 7,5 µg/mL, 15 µg/mL e 30 µg/mL.Tome 60 µL da solução acima e adicione 60 µL de cloramina T em tubos de ensaio de 2 mL, misture bem e deixe por 20 min à temperatura ambiente (cerca de 24℃ ).Adicione 60 µL de reagente cromogênico e 120 µL de água destilada novamente, agite bem e, em seguida, banhe em água a 60℃ por 20 min. Em seguida, resfrie rapidamente à temperatura ambiente em uma mistura de água gelada, e 200 µL foram transferidos para a placa de 96 poços. O valor de absorção foi medido no comprimento de onda de 560 nm e a curva padrão foi traçada (Fig. 2).
Curva padrão de hidroxiprolina.
Cálculo da taxa de extração de colágeno
Pese 0,2 g de amostra de colágeno, adicione 2 mL de extrato de ácido clorídrico concentrado 6 mol/L, digira em forno a 110℃ por 2 a 6 h e ajuste o valor do pH para a faixa de 6–8 após resfriamento.Em seguida, dilua para um volume final de 4 mL com água destilada, centrifugue a 11.200 x g por 20 min e meça a absorbância a 560 nm do sobrenadante. A taxa de extração de colágeno de osso de cavalo é a seguinte:
X: qualidade do colágeno no extrato; Y: massa de proteína na matéria-prima; 7,1 é o coeficiente para converter hidroxiprolina em colágeno.
Análise das propriedades estruturais do colágeno equino
Aproximadamente 3 mg de amostras de colágeno de osso de cavalo de diferentes idades foram pesadas em um cadinho de alumínio, prensadas e seladas, e um cadinho vazio foi usado como referência para determinação usando calorímetro diferencial de varredura (DSC; Q20, TA-Instruments). A temperatura foi aumentada de 25°C para 100°C a 2°C/min. A análise do espectro infravermelho por FTIR (Nicolet iS20 FTIR, Thermo Fisher Scientific) foi realizada seguindo o método de Rozi et al. As amostras de colágeno das costelas e tíbia de cavalos de diferentes idades foram misturadas com cristais de brometo de potássio na proporção de 1:100, e o colágeno liofilizado foi extrudado em folhas por um dispositivo de extrusão mecânica manual. O número de onda empregado foi na faixa de 400–4000 cm⁻¹, o número de varreduras utilizado foi 64, a velocidade foi de 0,2 cm/s e a resolução foi de 4 cm⁻¹.
Preparação do peptídeo de colágeno de osso de cavalo
Preparação do peptídeo de colágeno de osso de cavalo
Os 10 g de colágeno de osso de cavalo liofilizado foram dissolvidos em 100 mL de ácido acético glacial com concentração de 0,5 mol/L, e a concentração do substrato foi de 10%. O valor de pH ideal da protease alcalina (Cat: B8360, Solarbio, Pequim, China) foi ajustado para 9,0 com NaOH, e a enzimólise do colágeno foi realizada. Após a conclusão, a mistura foi colocada em banho-maria para inativar as enzimas a 100°C por 15 min, seguido de resfriamento à temperatura ambiente (aproximadamente 24°C). A solução foi então centrifugada a 11.200 x g a 4°C por 20 min, permitindo a remoção do precipitado e coleta do sobrenadante. Após congelamento durante a noite a -80°C, foi realizada liofilização a vácuo. Após a pesagem, o produto final deve ser armazenado em refrigerador a -20°C para uso futuro.
Teste de fator único e ortogonal
Selecionando a dosagem da enzima, valor de pH, temperatura de hidrólise enzimática e tempo de hidrólise enzimática como quatro fatores, as condições ótimas de fator único foram determinadas com base no rendimento de peptídeos curtos como índice de avaliação. As condições de gradiente para extração de peptídeos de colágeno são: dosagem da enzima (1, 2, 3, 4, 5%); valor de pH (8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0); temperatura de hidrólise enzimática (35, 40, 45, 50, 55°C); tempo de hidrólise enzimática (2, 3, 4, 5, 6 h). O pó de costela de cavalo de 8 anos foi selecionado para preparar o peptídeo de colágeno, e os resultados do teste foram repetidos 3 vezes para cada fator para obter o valor médio.
Ao mesmo tempo, os parâmetros de processo ideais para preparar peptídeos de colágeno a partir de pó de osso de cavalo foram otimizados usando o delineamento experimental ortogonal L9 (34) (Tabela 3).
Fatores e níveis do experimento ortogonal.
Nível Fator Dosagem da enzima/% Tempo de hidrólise/h pH Temperatura de hidrólise/°C 1 2 3 8,5 45°C 2 3 4 9,0 50°C 3 4 5 9,5 55°C
Determinação do índice do peptídeo de colágeno de osso de cavalo
Coomassie Brilliant Blue G-250 é um método de ligação de corante usado para detectar o teor de proteínas. Em seu estado livre, a solução do corante aparece vermelha, mas fica azul quando se liga às regiões hidrofóbicas das proteínas em solução ácida.
Uma pipeta foi usada para absorver 0,0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 mL de solução padrão de albumina sérica bovina no tubo de ensaio, e NaCl 0,15 mol/L foi adicionado até o volume de 1,0 mL. Finalmente, 3 mL de solução de Coomash bright blue foram adicionados a cada tubo de ensaio e misturados completamente. Após repouso à temperatura ambiente por 6 min, a absorbância foi medida a 595 nm usando tubos brancos sem o padrão de albumina sérica bovina como grupo controle. Cada amostra foi repetida 3 vezes e a média foi calculada. A equação de regressão linear é: y = 5,266x + 0,4354 (R² = 0,9803).
O rendimento de peptídeo curto foi determinado pelo método de nitrogênio solúvel do ácido tricloroacético (método TCA). Misture ácido tricloroacético a 15% com a solução do hidrolisado enzimático em uma proporção volumétrica de 1:1 e misture completamente. Deixe repousar por 10 min. Centrifugue a 560 x g por 15 min. Determine o teor de nitrogênio solúvel no sobrenadante usando o método de Coomassie brilliant blue. O rendimento de peptídeo curto foi calculado da seguinte forma:
TCA-NSI: rendimento de nitrogênio solúvel do ácido tricloroacético (%); N1: teor de nitrogênio solúvel em TCA 15% (mg); N2: teor de nitrogênio total na matéria-prima, determinado pelo método Kjeldahl.
Estudo da atividade antioxidante do peptídeo de colágeno de osso de cavalo
Isolamento e purificação do peptídeo de colágeno de osso de cavalo
O hidrolisado enzimático obtido foi fracionado usando tubos de centrífuga de ultrafiltração com cortes de peso molecular de 10, 5, 3 e 1 kDa, respectivamente. As condições de ultrafiltração foram: 25°C, força centrífuga de 503 x g e 30 min. Subsequentemente, o filtrado extracelular coletado foi submetido à liofilização a vácuo.
Determinação da atividade de sequestro de radicais livres ânion superóxido
Pegue 1 mL da amostra e coloque em um tubo de ensaio. Adicione 4,5 mL de solução tampão Tris-HCl 0,05 mol/L (pH 8,2), 2 mL de água destilada e 0,5 mL de solução de ácido pirogálico 0,003 mol/L, misture bem. Após o banho-maria a 25°C ser pré-aquecido por 20 min, a absorbância foi medida a 320 nm. Água destilada é usada como grupo controle branco no lugar da solução amostra. A fórmula de cálculo é a seguinte:
△AS=A2-A1, A1: △A0: Absorbância do grupo branco; A1: Absorbância aos 30s; A2: Absorbância aos 300s.
Determinação da capacidade de sequestro de radicais hidroxila
O método do ácido salicílico foi utilizado para a determinação. 1 mL da amostra foi colocado em um tubo de ensaio, e misturado com solução de ácido salicílico-etanol 9 mmol/L e 1 mL de FeSO4 9 mmol/L respectivamente, então 1 mL de H2O2 8,8 mmol/L foi adicionado para iniciar a reação, e mantido a 37°C por 30 min. Enquanto isso, água destilada foi usada para substituir o mesmo volume de solução hidrolisada enzimaticamente como grupo controle, e a absorbância a 510 nm foi medida. A fórmula de cálculo é a seguinte:
A0: Absorbância da solução controle em branco; AX: Absorbância após adição da solução amostra; △AX0: Absorbância de fundo da solução de enzimólise.
Determinação do potencial redox
Em tubos de ensaio, 1 mL de amostras foi misturado com 2,5 mL de tampão fosfato (0,2 mol/L, pH 6,6) e 2,5 mL de solução de ferricianeto de potássio a 1%. A mistura foi então homogeneizada e colocada em banho-maria a 50°C por 20 min. Após isso e resfriamento rápido, foram adicionados 2,5 mL de solução de ácido tricloroacético a 10% e centrifugados a 335 x g por 10 min. Após a centrifugação, 2,5 mL do sobrenadante foram retidos, e 0,5 mL de solução de tricloreto de ferro a 0,1% e 2,5 mL de água destilada foram adicionados sequencialmente. A absorbância foi medida a 700 nm após um período de repouso de 10 min à temperatura ambiente (aproximadamente 24°C).
Análise estatística
O software SPSS 26.0 foi utilizado para análise dos dados (P < 0,05); O software de mapeamento Origin 2021 e o software de processamento de imagens ImageJ foram utilizados para mapear os dados do teste.
Resultados e discussão
Composição óssea do cavalo
O teor de proteína nos ossos dos cavalos variou com a idade e apresentou uma tendência perceptível. Inicialmente aumentou e depois diminuiu com o aumento da idade, conforme mostrado na Fig. 3.
Composição óssea básica de cavalos mongóis de diferentes idades.
Composição do tecido ósseo
As Figuras 4 e 5; A Tabela 4 descreve as composições do tecido ósseo. Em cada corte de tecido, a área com mais fibras colágenas foi selecionada como campo de visão e utilizada na análise com Image J. A coloração com ácido pícrico-escarlate (Fig. 4) revelou fibras colágenas com fundo amarelo, e a coloração com escarlate Sirius (Fig. 5) revelou depósitos de sais de cálcio vermelho-escuros e um fundo vermelho-claro ou quase incolor.
Coloração com ácido pícrico-escarlate do tecido ósseo coletado de cavalos mongóis, bois e cabras (aumento de 20×).
Coloração com escarlate Sirius do tecido ósseo coletado de cavalos mongóis, bois e cabras (aumento de 20×).
Teor de fibras colágenas no tecido ósseo.
Osso de cavalo de 2 anos Osso de cavalo de 8 anos Osso de cavalo de 13 anos Osso de ovelha de 6 anos Osso de vaca de 8 anos Área de fibra colágena(%) 71,88 ± 0,87ab 79,99 ± 3,43a 48,63 ± 2,10d 79,39 ± 3,26a 65,21 ± 2,40c
As fibras colágenas fibrilares do tecido ósseo do cavalo de 13 anos estavam em feixes soltos, desorganizadas e com distribuição de densidade irregular. Além disso, a área de fibras colágenas era de 48,63%, diferindo significativamente da dos cavalos de 2 e 8 anos (P < 0,05). Em contraste, as fibras fibrilares do tecido ósseo dos cavalos de 2 e 8 anos eram faixas encaracoladas com densidade fibrosa uniforme. Os resultados da biópsia óssea indicaram que as fibras fibrilares do osso do cavalo primeiro aumentaram e depois diminuíram com a idade, sugerindo que o osso cresce e amadurece rapidamente durante a juventude; no entanto, as fibras colágenas não mudam muito durante a idade adulta. À medida que os cavalos envelhecem, os ossos se tornam mais soltos e as fibras colágenas se desorganizam. Além disso, as fibras colágenas do osso do cavalo eram compactas, com formato regular e formadas por mais lâminas, consistente com os resultados de Zedda et al.. Ademais, as fibrilas ósseas do cavalo eram normais, com densidade uniforme e arranjo ordenado. Notavelmente, a área de fibras colágenas dos ossos de cavalos adultos diferiu significativamente da dos ossos de bois da mesma idade (P < 0,05); ossos de cabra, contrastantemente, apresentaram estrutura óssea mais frouxa.
À medida que o osso se desenvolve com a idade, sua densidade aumenta, assim como a calcificação, devido à deposição e maturação dos minerais de fosfato de cálcio e ao aumento da distribuição de sais de cálcio. As distribuições de sais de cálcio foram maiores nos ossos dos cavalos de 2 e 8 anos do que nos dos cavalos de 13 anos (Fig. 5). Os tamanhos da distribuição de sais de cálcio foram comparados entre espécies da mesma idade, com o tamanho da distribuição ligeiramente menor no osso do cavalo do que no osso do boi; no entanto, a área de fibras colágenas no osso do cavalo foi aproximadamente 15% maior do que no osso do boi. Portanto, o osso do cavalo mongol é altamente denso e rico em nutrientes, contendo cálcio, proteína e gordura mínima.
Desengorduramento da farinha de osso de cavalo
Os parâmetros ideais para o desengorduramento da farinha de osso de cavalo usando ultra-alta pressão foram explorados. Primeiro, várias pressões foram testadas (tempo: 9 min; relação sólido-líquido: 1:15 g/mL), e a taxa de desengorduramento atingiu o pico a 300 MPa (Fig. 6A). Em seguida, vários tempos foram testados (pressão: 300 MPa; relação sólido-líquido: 1:15 g/mL), e a taxa de desengorduramento aumentou significativamente de 5 para 9 min (P < 0,05), atingindo o pico aos 9 min sob pressão (Fig. 6B). Finalmente, várias relações sólido-líquido foram testadas (tempo: 9 min; pressão: 300 MPa). A taxa de desengorduramento aumentou significativamente das relações sólido-líquido de 1:5 para 1:15 g/mL (P < 0,05), atingindo o pico numa relação de 1:15 g/mL (Fig. 6C). Provavelmente, 1:15 g/mL foi a relação ideal porque o óleo na farinha de osso de cavalo se dissolveu após adicionar solvente desengordurante suficiente. No geral, a maior taxa de desengorduramento foi de 73,56%, alcançada com 300 MPa de pressão por 9 min, com uma relação sólido-líquido de 1:15 g/mL. A maior taxa de desengorduramento com acetato de etila foi de 70,24%, sugerindo que o desengorduramento da farinha de osso de cavalo é mais eficaz com ultra-alta pressão do que com acetato de etila.
Otimização da taxa de desengorduramento do pó de osso de cavalo. Efeitos de (A) ultra-alta pressão (tempo: 9 min; relação sólido-líquido: 1:15 g/mL); (B) tempo sob pressão (pressão: 300 MPa; relação sólido-líquido: 1:15 g/mL); e (C) a relação sólido/líquido (tempo: 9 min; pressão: 300 MPa). a: P < 0,001; b: P < 0,01; c: P < 0,05.
Resultados do experimento de otimização ortogonal do processo de desengorduramento da farinha de osso
Com base nos resultados do experimento de fator único, o experimento ortogonal L9(34) foi conduzido para otimizar o processo de desengorduramento do pó de osso de cavalo, tendo a taxa de desengorduramento do pó de osso de cavalo como índice de teste (Tabela 5).
Projeto e resultado do experimento ortogonal.
Nº A Pressão (MPa) B Tempo de manutenção da pressão (min) C Relação sólido-líquido (g/mL) Taxa de desengorduramento (%) 1 1 1 1 67,40 2 1 2 3 68,04 3 1 3 2 66,78 4 2 1 3 65,19 5 2 2 2 73,56 6 2 3 1 71,93 7 3 1 2 69,67 8 3 2 1 68,35 9 3 3 3 65,82 Taxa de extração de colágeno (%) k1 67,41 67,42 69,23 k2 70,23 69,98 70,00 k3 67,95 68,18 66,35 R 2,82 2,56 3,65 Combinação ideal A2B2C2
A ordem de influência de vários fatores na taxa de desengorduramento do pó de osso de cavalo é C > A > B, ou seja, relação sólido-líquido > pressão ultra-alta > tempo de manutenção. A combinação experimental ideal para a taxa de desengorduramento do pó de osso de cavalo é A2B2C2. Isto é, a pressão ultra-alta é de 300 MPa, o tempo de manutenção é de 9 min e a relação sólido-líquido é de 1:15 g/mL. Neste nível, a taxa de desengorduramento é de 73,56%. A taxa de desengorduramento do pó de osso de cavalo que não foi submetido à pressão ultra-alta é de 60,28%, indicando que a taxa de desengorduramento por pressão ultra-alta é melhor do que a taxa de desengorduramento por acetato de etila, sendo um método de tratamento de desengorduramento que vale a pena.
Análise de otimização do processo de extração de colágeno de osso de cavalo
Os parâmetros ideais para a extração enzimática de colágeno de ossos de cavalo foram explorados. Primeiro, os tempos de extração foram testados com uma dose de 6% de pepsina (Cat: P8390, Solarbio, Pequim, China) e uma relação sólido/líquido de 1:15 g/mL. A taxa de extração de colágeno atingiu o pico (23,03%) após 24 h (Fig. 7A). Em seguida, várias doses de pepsina foram testadas com um tempo de extração de 24 h e relação sólido/líquido de 1:15 g/mL, e a taxa de extração atingiu o pico com 6% de pepsina (Fig. 7B). Finalmente, várias relações sólido/líquido foram testadas com um tempo de extração de 24 h e dose de 6% de pepsina; a taxa de extração atingiu o pico (21,57%) em 1:15 g/mL (Fig. 7C). No geral, a maior taxa de extração de colágeno foi de 26,65%, alcançada com uma dosagem enzimática de 6%, tempo de extração de 24 h e relação sólido/líquido de 1:15 g/mL.
Otimização da taxa de extração de colágeno de ossos de cavalo. Efeitos de (A) o tempo de extração (dose de enzima [pepsina]: 6%; relação sólido-líquido: 1:15 g/mL); (B) a dose de enzima (tempo: 24 h; relação sólido-líquido: 1:15 g/mL); e (C) a relação sólido-líquido (tempo: 24 h; dose de enzima: 6%). a: P < 0,001; b: P < 0,01; c: P < 0,05.
A dissolução do colágeno é a transição do estado sólido para soluto, durante a qual a pepsina promove a liberação de colágeno na solução de extração. Assim, a taxa de extração aumenta gradualmente à medida que o tempo de extração aumenta. Altas concentrações de enzima também aumentam a taxa de extração; no entanto, ela eventualmente diminui, como em nosso estudo (a 6% de pepsina), talvez devido à quantidade insuficiente de substrato para continuar a reação. Nesse ponto, um aumento adicional na quantidade de protease causa hidrólise enzimática excessiva, quebrando fragmentos de proteínas de pequena massa molecular em aminoácidos livres, sem aumentar a taxa de extração de colágeno (Lee et al. 2022). Além disso, descobrimos que razões sólido-líquido maiores que 1:15 g/mL diminuíram a taxa de extração. O excesso de solvente pode enfraquecer a estabilidade do colágeno, quebrando a cadeia peptídica e resultando em muitos fragmentos de cadeia peptídica, reduzindo assim a taxa de extração. Vidal et al. investigaram a extração de colágeno de ossos de iaque, descobrindo que a taxa de extração inicialmente aumentava e depois diminuía à medida que a razão sólido-líquido aumentava; a taxa de extração também atingiu o pico em uma razão sólido-líquido de 1:15 g/mL. Assim, um volume muito grande de solvente não é favorável à extração de colágeno.
Resultados do experimento ortogonal da extração de colágeno de ossos de cavalo
Com base nos resultados dos experimentos de fator único, a taxa de extração de colágeno foi usada como índice de detecção, e o tempo de extração (A), a dosagem de enzima (B) e a razão líquido-sólido (C) foram selecionados como fatores influenciadores. O processo de extração de colágeno de ossos de cavalo foi otimizado por meio de um experimento ortogonal L9(34) (Tabela 6).
Termoestabilidade do colágeno extraído de ossos de cavalo.
Nº A Tempo de extração (h) B Dosagem de enzima (%) C Razão sólido-sólido (g/mL) Taxa de extração (%) 1 1 1 1 16,28 2 1 2 3 18,56 3 1 3 2 21,25 4 2 1 3 22,23 5 2 2 2 26,65 6 2 3 1 19,83 7 3 1 2 17,05 8 3 2 1 15,74 9 3 3 3 11,31 Taxa de extração (%) k1 18,70 18,52 17,28 k2 22,90 20,32 21,65 k3 14,70 17,46 17,37 R 8,20 2,85 4,37 Combinação ótima A2B2C2
A ordem de influência de vários fatores sobre a taxa de extração de colágeno de ossos de cavalo é A > C > B, ou seja, tempo de extração > razão sólido-líquido > dosagem de enzima. A combinação ótima é A2B2C2, ou seja, dosagem de enzima de 6%, tempo de extração de 24 h e razão líquido-sólido de 1:15 g/mL. Nesse nível, a taxa de extração de colágeno de ossos de cavalo atinge seu valor mais alto de 26,65%.
Caracterização estrutural e resolução do colágeno de ossos de cavalo
A espectroscopia no infravermelho pode detectar quase todos os espectros infravermelhos de materiais biológicos sob várias condições, tornando-se um dos métodos mais eficazes para estudar as ligações de hidrogênio em proteínas. A Figura 6 apresenta os resultados da análise do espectro infravermelho do colágeno extraído de pó de osso de cavalo na faixa de 400 a 4000 cm−1. As intensidades das bandas amida A, I, II e III nas amostras de colágeno tratadas com ultra-alta pressão das costelas de um cavalo de 8 anos foram ligeiramente menores do que as dos ossos não tratados (Fig. 8A). Além disso, os picos de absorção da costela e da tíbia diminuíram ligeiramente na zona das amidas com a idade (Fig. 8B, C). Também medimos a temperatura de desnaturação das amostras de colágeno usando calorimetria exploratória diferencial e descobrimos que a temperatura de desnaturação aumentou ligeiramente com a idade (Tabela 7). Além disso, as temperaturas de desnaturação do colágeno extraído da costela e da tíbia de cavalos de 8 anos tratados com ultra-alta pressão foram de 30,54 ℃ e 32,40 ℃, respectivamente, enquanto a temperatura para o colágeno não tratado foi de 36,52 ℃.
Análise do espectro infravermelho (400–4000 cm−1) do colágeno extraído de pó de osso de cavalo. (A) Colágeno extraído do osso da costela de cavalo de 8 anos (a) sem e (b) com tratamento de ultra-alta pressão. (B) Colágeno extraído das costelas de cavalos de diferentes idades: (a, preto) 2 anos, (b, vermelho) 8 anos e (c, azul) 13 anos. (C) Colágeno extraído da tíbia de cavalos de diferentes idades: (a, preto) 2 anos, (b, vermelho) 8 anos e (c, azul) 13 anos.
Termoestabilidade do colágeno extraído de ossos de cavalo.
Idade Temperatura de desnaturação (T/℃) Sem tratamento de ultra-alta pressão Costela de cavalo Tíbia de cavalo 2 32.05 ± 0.12c 28.25 ± 0.21c 29.35 ± 0.37c 8 36.52 ± 0.25b 30.54 ± 0.20b 32.40 ± 0.27b 13 43.23 ± 0.17a 35.37 ± 0.47a 36.74 ± 0.08a
Nota: A significância é indicada por letras minúsculas diferentes na mesma coluna (P < 0.05)
Descobrimos que o tratamento com pressão ultra-alta teve pouco efeito sobre a estrutura do colágeno extraído da farinha de osso de cavalo, consistente com os resultados de Nan et al. (2018). A absorção da banda amida A está relacionada à vibração de estiramento N-H, e o pico de absorção geralmente aparece na região de 3400–3440 cm⁻¹. No entanto, quando a vibração de estiramento N-H se combina com uma ligação de hidrogênio, pode deslocar-se para uma frequência mais baixa, movendo-se em direção a 3300 cm⁻¹. As bandas amida A nas amostras de colágeno não tratado e tratado estavam em 3439,07 cm⁻¹ e 3435,22 cm⁻¹, respectivamente, indicando que o colágeno extraído da farinha de osso de cavalo contém uma estrutura de ligação de hidrogênio. Além disso, os picos da banda amida B nas amostras não tratada e tratada estavam em 2928,57 cm⁻¹ e 2947,23 cm⁻¹, respectivamente, causados pela vibração de estiramento assimétrica do CH₂ na molécula. A faixa de frequência característica da banda amida I é de 1600–1700 cm⁻¹, que está principalmente relacionada à vibração de estiramento da ligação C=O ao longo da cadeia principal do peptídeo. A banda amida I pode ser usada para analisar a estrutura secundária das proteínas; quanto maior o valor da frequência, maior a ordem do esqueleto da cadeia peptídica. Os picos de absorção das amostras de colágeno não tratado e tratado estavam em 1656,06 cm⁻¹ e 1649,13 cm⁻¹, respectivamente. Além disso, os picos de absorção para as bandas amida II nas amostras não tratada e tratada estavam em 1543,05 cm⁻¹ e 1541,23 cm⁻¹, respectivamente, causados pela vibração de flexão N-H acoplada à vibração de estiramento C-N do colágeno. Frequências altas da amida II indicam a presença de muitas ligações de hidrogênio intermoleculares no colágeno, especialmente na parte helicoidal da estrutura do colágeno. Os picos de absorbância das amostras de colágeno não tratado e tratado em 1483,18 cm⁻¹ e 1477,17 cm⁻¹ estão mais próximos da absorbância 1,0, indicando que a estrutura terciária do colágeno está intacta. Finalmente, as bandas amida III para as amostras não tratada e tratada foram observadas em 1220,94 cm⁻¹ e 1217,08 cm⁻¹, respectivamente. Essa descoberta sugere que o teor de glicina, prolina (Pro) e hidroxiprolina no colágeno era relativamente alto, o que faz com que ossos de cavalo tratados de diferentes maneiras tenham picos de absorção únicos em 1200–1400 cm⁻¹ devido às vibrações de estiramento C-N e flexão N-H, consistentes com o pico de vibração de balanço CH₂ atribuído ao esqueleto da glicina e à cadeia lateral da Pro. Em conclusão, descobrimos que a estrutura secundária do colágeno do osso equino extraído estava intacta.
Também descobrimos que os picos de absorção da costela e da tíbia diminuíram ligeiramente com a idade na zona amida, sugerindo que os ossos de cavalo têm uma estrutura de tripla hélice completa, independentemente da idade. Kobrina et al. analisaram o pico de absorção espectral infravermelho do colágeno da cartilagem equina desde o recém-nascido (0 dias) até a idade imatura (5 a 11 meses) e da idade imatura até a idade adulta (6 a 10 anos), observando que os picos de absorção espectral infravermelho aumentaram com a idade, consistentes com nossos resultados.
Também descobrimos que a temperatura de desnaturação do colágeno aumentou ligeiramente com a idade, possivelmente devido a um maior grau de reticulação das fibras fibrilares do osso e ao tamanho dos cristais minerais, que mudam com a idade, resultando em um ligeiro aumento na temperatura de desnaturação térmica do colágeno de osso de cavalo. Notavelmente, a temperatura de desnaturação foi menor em amostras de colágeno de cavalos mais velhos tratadas com ultra-alta pressão do que em amostras não tratadas. Isso pode ser devido à fratura das ligações de reticulação do colágeno na farinha de osso após o tratamento, enfraquecendo a estabilidade e, assim, diminuindo a estabilidade térmica.
Extraindo peptídeos curtos do colágeno de osso de cavalo
Após caracterizar o colágeno de osso de cavalo, tentamos extrair peptídeos curtos das amostras de colágeno e otimizar as condições da protease alcalina. Medimos o rendimento após variar o pH (constantes: tempo de hidrólise: 4 h, temperatura: 50 °C e dose de enzima [isto é, protease alcalina]: 3% em massa); tempo de hidrólise enzimática (constantes: temperatura: 50 °C, pH: 9,0 e dose de enzima: 3%); temperatura (constantes: tempo de hidrólise: 4 h, pH: 9,0 e dose de enzima: 3%); e dose de enzima (constantes: tempo de hidrólise: 4 h, temperatura: 50 °C e pH: 9,0) (Fig. 9). As condições ideais para um rendimento máximo de peptídeos curtos foram pH 9 (Fig. 9A), 4 h de enzimólise (Fig. 9B), temperatura de 50 °C (Fig. 9C) e dose de enzima de 3% (Fig. 9D).
Otimizando o rendimento de peptídeos curtos do colágeno extraído de ossos de cavalo. Efeitos de (A) pH (constantes: tempo de hidrólise: 4 h, temperatura: 50 °C e quantidade de enzima [isto é, protease alcalina]: 3% em massa); (B) tempo de hidrólise enzimática (constantes: temperatura: 50 °C, pH: 9,0 e dose de enzima: 3%); (C) temperatura (constantes: tempo de hidrólise: 4 h, pH: 9,0 e dose de enzima: 3%); e (D) dose de enzima (constantes: tempo de hidrólise: 4 h, temperatura: 50 °C e pH: 9,0). a: P < 0,001; b: P < 0,01; c: P < 0,05.
O pH para o rendimento ideal de peptídeos curtos foi 9,0, indicando que o pH afeta principalmente a atividade da protease. Cada protease possui uma faixa de pH ideal, fora da qual a atividade diminui, e a eficiência da hidrólise enzimática será correspondentemente baixa, reduzindo o rendimento de peptídeos curtos. Além disso, descobrimos que tempos de reação superiores a 4 h reduziram o rendimento. Provavelmente, uma reação mais longa resultou em mais produtos de enzimólise e complexos, que inibiram a reação de enzimólise, diminuíram a velocidade da reação e, portanto, reduziram o rendimento. Além disso, o sítio de reação do peptídeo torna-se saturado com o tempo; alguns peptídeos são decompostos em aminoácidos, e a taxa de decomposição excede a taxa de formação de peptídeos proteicos, diminuindo o rendimento de peptídeos. Também descobrimos que o rendimento de peptídeos curtos aumentou e depois diminuiu com o aumento da temperatura, atingindo o pico a 50 °C (rendimento: 63,78%). Quando a temperatura aumenta, a taxa de conversão de proteínas aumenta; no entanto, a proteína enzimática desnaturará ou desativará lentamente, diminuindo a taxa de reação enzimática e, portanto, o rendimento de peptídeos. Finalmente, encontramos os maiores rendimentos com uma dose de 3% de enzima (rendimento: 62,63%). Adicionar enzimas à reação aumenta a probabilidade de interação entre a enzima e o colágeno, o que aumenta o rendimento. No entanto, o rendimento não aumentará mais uma vez que o substrato esteja saturado.
Atividade antioxidante de peptídeos curtos
Isolamos quatro grupos de peptídeos de colágeno de cavalo com diferentes pesos moleculares: 5–10, 3–5, 1–3 e < 1 KDa. As capacidades redutoras dos peptídeos curtos de colágeno de osso de cavalo com diferentes pesos moleculares extraídos de cavalos de diferentes idades aumentaram gradualmente à medida que a concentração aumentou de 5 para 10 mg/mL (P < 0,05; Tabelas 8 e 9). As capacidades redutoras diminuíram à medida que os pesos moleculares aumentaram; os componentes de 1–3 kDa tiveram as capacidades mais fortes, enquanto os componentes de 5–10 kDa tiveram as capacidades mais fracas. Esses resultados foram comparados com o poder redutor do antioxidante VC. No entanto, em comparação com o do antioxidante VC na mesma concentração, o poder redutor foi mais fraco com a redução dos pesos moleculares, e a diferença foi significativa (P < 0,05). Além disso, a capacidade de eliminação de radicais hidroxila dos peptídeos com o mesmo peso molecular diferiu com base na idade dos ossos, e a atividade foi mais forte nos extratos de ossos de 8 anos de idade (Tabelas 10 e 11). Finalmente, com o aumento da concentração da solução de peptídeos de colágeno, a taxa de eliminação de radicais livres de O2 aumentou para cada componente de ultrafiltração (Tabelas 12 e 13).
Capacidade de redução de peptídeos isolados de colágeno extraído de ossos de costela de cavalo.
Idade concentração (mg/mL) Força redutora 5–10 KDa 3–5 KDa 1–3 KDa < 1 KDa 2 5 0.0800 ± 0.004d 0.0890 ± 0.001bc 0.1037 ± 0.001a 0.0940 ± 0.002b 10 0.0870 ± 0.001c 0.0903 ± 0.005c 0.1130 ± 0.002a 0.0947 ± 0.002b 8 5 0.0883 ± 0.011c 0.0920 ± 0.002c 0.1350 ± 0.007a 0.1013 ± 0.015ab 10 0.1090 ± 0.012d 0.1217 ± 0.005c 0.1813 ± 0.005a 0.1597 ± 0.003b 13 5 0.0813 ± 0.005c 0.0803 ± 0.001c 0.1043 ± 0.025a 0.0997 ± 0.010b 10 0.0903 ± 0.004c 0.0983 ± 0.011bc 0.1800 ± 0.010a 0.1130 ± 0.002b Vc 5 3.7210 ± 0.010 10 3.8077 ± 0.051
Nota: A capacidade de redução entre pares representada por letras minúsculas diferentes está significativamente correlacionada no nível de 0,05.
Capacidade de redução de peptídeos isolados de colágeno extraído de tíbias de cavalo.
Idade Concentração (mg/mL) Força redutora 10 KDa-5KDa 5 KDa-3KDa 3 KDa-1KDa < 1KDa 2 5 0.0787 ± 0.002c 0.0853 ± 0.001bc 0.1077 ± 0.008a 0.0873 ± 0.001b 10 0.0830 ± 0.002cd 0.0877 ± 0.001bc 0.1213 ± 0.002a 0.0923 ± 0.002b 8 5 0.0833 ± 0.001cd 0.0893 ± 0.0005c 0.1030 ± 0.008a 0.0917 ± 0.001b 10 0.0877 ± 0.001c 0.0943 ± 0.001b 0.1250 ± 0.002a 0.0963 ± 0.004ab 13 5 0.0733 ± 0.001d 0.0873 ± 0.002c 0.1007 ± 0.003a 0.0913 ± 0.002b 10 0.0840 ± 0.025c 0.0903 ± 0.0005b 0.1117 ± 0.006a 0.0940 ± 0.001b
Nota: Letras minúsculas diferentes indicam correlação significativa com a capacidade de redução (P < 0,05).
Capacidade de sequestro de radicais hidroxila de peptídeos isolados de colágeno extraído de costelas de cavalo.
idade concentração (mg/mL) Poder de sequestro de radicais hidroxila 10 KDa-5KDa 5 KDa-3KDa 3 KDa-1KDa < 1KDa 2 5 68.90 ± 0.387d 73.90 ± 0.590c 88.81 ± 1.686a 84.58 ± 0.572b 10 71.64 ± 1.394cd 77.58 ± 0.997c 98.21 ± 0.614a 88.08 ± 1.397b 8 5 69.80 ± 0.554c 81.65 ± 2.159b 92.39 ± 0.775a 85.41 ± 0.964ab 10 73.15 ± 2.015c 86.57 ± 0.757b 98.65 ± 0.675a 92.84 ± 1.027ab 13 5 70.47 ± 1.340c 80.10 ± 1.023b 90.82 ± 2.358a 84.56 ± 1.778ab 10 81.20 ± 1.368c 88.59 ± 2.685bc 97.94 ± 0.741a 89.07 ± 1.045g Vc 5 90.94 ± 1.806 10 92.85 ± 2.057
Nota: Letras minúsculas diferentes indicam correlação significativa com a eliminação de radicais hidroxila (P < 0,05).
Capacidade de sequestro de radicais hidroxila de peptídeos isolados de colágeno extraído de tíbias de cavalo.
idade concentração (mg/mL) Poder de sequestro de radicais hidroxila 10 KDa-5KDa 5 KDa-3KDa 3 KDa-1KDa < 1KDa 2 5 66.66 ± 2.046c 76.95 ± 1.547b 92.41 ± 1.066a 82.96 ± 1.211b 10 75.39 ± 1.394c 78.10 ± 2.685bc 95.27 ± 2.060a 86.57 ± 1.340b 8 5 75.16 ± 2.926c 83.34 ± 2.203b 94.50 ± 1.049a 90.53 ± 1.345ab 10 75.16 ± 2.926c 83.44 ± 2.358bc 96.15 ± 2.425a 93.28 ± 2.006ab 13 5 72.93 ± 0.779cd 78.29 ± 2.536b 93.96 ± 1.160a 87.60 ± 1.346ab 10 75.61 ± 0.779c 82.43 ± 0.851b 95.68 ± 2.679a 89.48 ± 0.774ab
Nota: Letras minúsculas diferentes indicam correlação significativa com a eliminação de radicais hidroxila (P < 0,05).
Capacidade de remoção de ânion superóxido de peptídeos isolados de colágeno extraído de costelas de cavalo.
Idade concentração(mg/mL) Capacidade de eliminação do ânion superóxido 10 KDa-5KDa 5 KDa-3KDa 3 KDa-1KDa < 1KDa 2 5 19,84 ± 2,745d 26,19 ± 2,380c 41,27 ± 1,377a 34,12 ± 0,374b 10 20,63 ± 0,634d 27,77 ± 2,380c 46,82 ± 1,374a 39,68 ± 1,371b 8 5 29,36 ± 1,231d 34,91 ± 0,663c 46,03 ± 1,072a 41,27 ± 0,635b 10 35,71 ± 2,385d 40,50 ± 2,004c 51,99 ± 0,656a 49,77 ± 2,412b 13 5 22,96 ± 0,764d 27,77 ± 1,371c 41,27 ± 1,376a 37,33 ± 1,406b 10 23,75 ± 1,166d 34,91 ± 0,374c 45,12 ± 0,412a 39,68 ± 0,517ab Vc 5 60,52 ± 0,745 10 79,74 ± 1,011
Nota: Letras minúsculas diferentes indicam uma correlação significativa com a eliminação do ânion superóxido (P < 0,05).
Capacidade de remoção do ânion superóxido de peptídeos isolados de colágeno extraído de ossos de tíbia de cavalo.
Idade concentração(mg/mL) Capacidade de eliminação do ânion superóxido
Existe uma relação dose-efeito entre peptídeos de colágeno de diferentes pesos moleculares e sua capacidade de eliminar radicais hidroxila. Descobrimos que peptídeos com o mesmo peso molecular apresentavam capacidades variáveis de eliminação de radicais hidroxila (atividades antioxidantes), dependendo da idade do osso; o extrato de cavalos de 8 anos de idade apresentou a atividade mais forte. Além disso, quando a concentração da solução de peptídeo de colágeno era a mesma, a capacidade de eliminação de radicais hidroxila dos peptídeos curtos (peso molecular: 1–3 KDa) foi significativamente maior do que a de outros componentes de peso molecular. Além disso, a capacidade de eliminação de radicais livres hidroxila foi ligeiramente maior com uma concentração equivalente de VC do que com VC isolado. As capacidades de eliminação de radicais livres hidroxila dos peptídeos de colágeno extraídos da tíbia e das costelas do cavalo demonstraram que esses peptídeos poderiam eliminar radicais hidroxila, consistente com a descoberta de Hernández-Ruiz et al., que relataram que os componentes de peptídeos de colágeno de baixo peso molecular apresentavam atividade superior em comparação com os componentes de alto peso molecular. No entanto, alguns pesquisadores descobriram que a atividade antioxidante de peptídeos de colágeno de baixo peso molecular talvez não seja a melhor. Por exemplo, Shen et al. relataram que os peptídeos antioxidantes de colágeno de pele suína com peso molecular de 5–10 KDa apresentam boa atividade antioxidante, sugerindo que a atividade antioxidante dos peptídeos de colágeno está relacionada ao seu peso molecular relativo e é influenciada por sua composição e sequência de aminoácidos.
Ânions radicais superóxido (O2−·) são produzidos durante processos como transporte de oxigênio na hemoglobina, autoxidação, cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e reações do citocromo. Quando a luz induz a produção de melanina, muitos pares de elétrons isolados são formados, e O2−· pode se formar. Kobayashi et al. demonstraram que sequências de peptídeos incluindo Gly, Hyp, Glu e Ala podem desempenhar um papel-chave nos efeitos antioxidantes do novo peptídeo de colágeno tratado com pepsina (P-NCP) sobre as EROs. Além disso, os radicais cátions superóxido podem induzir a formação de outros grupos autônomos, como os radicais hidroxila.
Por fim, constatamos que, à medida que a concentração da solução de peptídeos de colágeno aumentava, a taxa de eliminação de radicais livres de O2 aumentava para cada componente ultrafiltrado, sugerindo uma relação dose-efeito. Além disso, para peptídeos com o mesmo peso molecular, a atividade antioxidante dos peptídeos diferiu com base na idade dos ossos, e a atividade de eliminação do ânion superóxido foi a mais forte com os peptídeos extraídos de um osso de cavalo de 8 anos. Quando a concentração da solução de peptídeos de colágeno era equivalente, a atividade de eliminação de O2−· diminuía à medida que os pesos moleculares aumentavam; os componentes de 1–3 kDa apresentaram as maiores capacidades, enquanto os componentes de 5–10 kDa apresentaram as menores capacidades. Assim, peptídeos de colágeno de farinha de osso de cavalo com diferentes pesos moleculares podem eliminar O2−· em taxas semelhantes às da VC, embora os componentes de 5–10 kDa tenham uma taxa de eliminação de ânion superóxido menor do que a VC. Resultados semelhantes foram relatados em um estudo de Irshad et al., que descobriram que polipeptídeos de medula espinhal bovina de 1–3 kDa apresentaram melhor atividade antioxidante do que outros componentes.
Conclusão
Neste estudo, extraímos e caracterizamos colágeno de osso de cavalo, seguido pela extração de peptídeos curtos dessas amostras de colágeno. Uma análise de imagem confirmou primeiro diferenças significativas nas fibras fibrilares de ossos de cavalo de diferentes idades. Além disso, as fibras de colágeno dos ossos de cavalo adultos tinham formato regular, densidade uniforme, disposição ordenada e maior densidade óssea do que outros ossos de animais (bovino e caprino). A estabilidade térmica dos ossos de cavalo também aumentou com a idade. Além disso, o tratamento com ultra-alta pressão melhorou a taxa de desengorduramento do osso de cavalo em comparação com o uso de acetato de etila, mas diminuiu a temperatura de desnaturação do colágeno do osso de cavalo. No entanto, o tratamento manteve a estrutura terciária do colágeno intacta. Finalmente, isolamos quatro grupos de peptídeos de colágeno de cavalo com diferentes pesos moleculares, que apresentaram diferentes capacidades antioxidantes; os componentes com os menores pesos moleculares (1–3 KDa) tiveram as maiores atividades. Além disso, a idade afetou a atividade antioxidante do peptídeo independentemente do peso molecular, e a atividade antioxidante dos peptídeos de ossos de cavalo de 8 anos foi a mais forte. Pesquisas nacionais têm sido conduzidas com base nas condições nacionais da China, de acordo com as características regionais da indústria equina. No entanto, existem poucos estudos sobre o recurso de alta qualidade, o osso de cavalo mongol. Portanto, como usar a tecnologia de bioengenharia de forma razoável para desenvolver e estudar o precioso recurso do osso de cavalo e explorar seu valor econômico é um tópico de pesquisa com amplas perspectivas e significado prático. Atualmente, nossa equipe está focada no estudo do colágeno e peptídeos de ossos bovinos e ovinos. Com base nisso, o colágeno foi extraído do osso de cavalo mongol e preparado em peptídeos curtos de colágeno, e sua atividade antioxidante foi determinada. Este estudo estabelece a base para o desenvolvimento, utilização e atualização industrial dos peptídeos de colágeno de osso de cavalo.
Abreviaturas
UHP
Processamento por ultra-alta pressão
DSC
Calorímetro de varredura diferencial
Nota do editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Contribuições dos autores
Jindi Wu, proposição de tópicos de pesquisa, desenho de planos de pesquisa, redação da tese
Heya Na, análise estatística de dados
Fan Bai, coleta de amostra
Siyu Li, análise estatística de dados
Hao Gao, análise estatística de dados
Rina Sha, proposição de tópicos de pesquisa, desenho de planos de pesquisa, obtenção de financiamento de pesquisa.
Disponibilidade de dados
Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado.
Declarações
Interesses concorrentes
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Declaração de ética
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as regulamentações da Administração de Assuntos Relativos a Animais Experimentais na China. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Bem-Estar Animal e Ética em Pesquisa da Universidade Agrícola da Mongólia Interior (ID de aprovação: 20154617–8).
Referências
Status atual e tendência de desenvolvimento de equipamentos de processamento de alimentos por ultra-alta pressão
Pesquisa aplicada de equipamentos de processamento de alimentos por ultra-pressão na indústria alimentícia
Processamento de alimentos por alta pressão hidrostática
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