pmid: "40108160"
title: "Decifrando o código de enovelamento dos colágenos"
authors: "Malcor JD, Ferruz N, Romero-Romero S, Dhingra S, Sagar V, Jalan AA"
journal: "Nature communications"
pubdate: "2025 Mar 19"
doi: "10.1038/s41467-024-54046-y"
source: "PMC Full Text"
Decifrando o código de enovelamento dos colágenos
Autores
Malcor JD, Ferruz N, Romero-Romero S, Dhingra S, Sagar V, Jalan AA
Periodico
Nature communications (2025 Mar 19)
Conteudo
Decifrando o código de enovelamento dos colágenos
As proteínas de colágeno contêm um motivo estrutural característico chamado tripla hélice. Durante a automontagem desse motivo, três polipeptídeos formam um núcleo de enovelamento nos terminais C e depois propagam em direção aos terminais N como uma corrente de zíper. Enquanto os polipeptídeos de colágenos humanos contêm até 1000 aminoácidos, os encontrados em bactérias podem conter até 6000 aminoácidos. Além disso, os polipeptídeos de colágeno são frequentemente interrompidos por sequências não helicoidais que perturbam o enovelamento e reduzem a estabilidade. Dado o comprimento dos polipeptídeos e as interrupções perturbadoras, os mecanismos compensatórios que estabilizam contra o desenovelamento local durante a propagação e compensam o custo entrópico do enovelamento não são totalmente compreendidos. Aqui, mostramos que a informação para o enovelamento correto das triplas hélices de colágeno está codificada em sua sequência como interações eletrostáticas intercadeias, que provavelmente atuam como grampos moleculares que impedem o desenovelamento local. No caso dos humanos, a ruptura dessas interações eletrostáticas está associada a doenças graves a letais.
Triplas hélices de colágeno são encontradas em todos os três domínios da vida, bem como em vírus. Aqui, os autores mostram que os colágenos convergiram para um mecanismo de enovelamento semelhante que utiliza interações de pontes salinas para guiar a montagem da tripla hélice.
Introdução
Os colágenos são proteínas humanas altamente abundantes que fornecem estrutura e resistência aos tecidos e se ligam a proteínas da superfície celular e secretadas para regular processos biológicos chave, incluindo homeostase tecidual e coagulação sanguínea. Todas as proteínas de colágeno contêm um domínio característico chamado tripla hélice, composto por três polipeptídeos superenrolados. Em humanos, os genes de colágeno codificam 44 polipeptídeos, também chamados de cadeias α, que se automontam em 28 tipos distintos de colágeno (I-XXVIII). As cadeias α contêm uma sequência repetitiva de três aminoácidos Gly-Xaa-Yaa, onde a glicina ocupa cada terceira posição e Xaa e Yaa são mais frequentemente aminoácidos não glicina. Após a trimerização, as glicinas recorrentes se segregam em um núcleo firmemente compactado da tripla hélice. Consequentemente, sua mutação para outros aminoácidos perturba a estrutura, resultando em enovelamento retardado e estabilidade reduzida. Esta é a principal causa de doenças hereditárias relacionadas ao colágeno. O estudo direto do enovelamento e estabilidade do colágeno é complicado pela propensão dos colágenos nativos a formarem agregados insolúveis in vitro. Felizmente, peptídeos sintéticos contendo repetições suficientes de Gly-Xaa-Yaa se automontam intrinsecamente em uma tripla hélice. Investigações usando tais peptídeos sugerem que as triplas hélices se enovelam através de um mecanismo de nucleação-ziper, onde três peptídeos nucleiam no terminal C e depois propagam em direção ao terminal N como uma corrente de zíper.
As cadeias α de colágenos humanos contêm até 330 repetições Gly-Xaa-Yaa. Intuitivamente, até que a tripla hélice em propagação tenha atingido um comprimento crítico suficiente para sustentar um dobramento adicional, espera-se que a fase de propagação seja entropicamente perturbada devido ao comprimento substancial das cadeias α.
Em alguns colágenos, o padrão perfeito de repetição de tripletos também é frequentemente interrompido por sequências não helicoidais que reduzem a estabilidade térmica da tripla hélice e interrompem o dobramento. Nesses casos, a tripla hélice deve renuclear após a interrupção, ao mesmo tempo que compensa a perda de estabilidade local e de taxa de dobramento.
Uma chaperona específica de colágeno, a proteína de choque térmico (Hsp) 47, residente no retículo endoplasmático, demonstrou reconhecer sítios únicos no domínio de tripla hélice de alguns colágenos humanos. Acredita-se que essa interação entre Hsp47 e as triplas hélices de colágeno forneça estabilidade contra o desenovelamento local, ao mesmo tempo que compensa a perda entrópica.
No entanto, várias características observadas experimentalmente do dobramento do colágeno não são totalmente consistentes com o paradigma de dobramento chaperonado por Hsp47. Entre estas, destaca-se a observação de que a Hsp47 não reconhece alguns tipos de colágenos, ou o faz apenas fracamente. Além disso, em nível estrutural, polipeptídeos dentro de uma tripla hélice adotam um alinhamento escalonado de um aminoácido entre si. Mas, alinhamentos de polipeptídeos não canônicos, nos quais as cadeias são deslocadas por mais de um aminoácido, não são incomuns. A ligação da Hsp47 não explica como os polipeptídeos evitam alinhamento incorreto durante o dobramento. A ligação da Hsp47 também não explica como as triplas hélices no colágeno nativo renucleam após uma interrupção e compensam a perda de estabilidade e de taxa de dobramento.
Além disso, além dos colágenos eucarióticos, eucariotos, procariotos e vírus também codificam proteínas semelhantes a colágeno contendo as repetições características Gly-Xaa-Yaa que formam triplas hélices estáveis e funcionais. Enquanto as cadeias α humanas têm até 330 tripletos de comprimento, polipeptídeos semelhantes a colágeno em procariotos podem atingir comprimentos de até 2000 tripletos e conter um número maior de interrupções. Como polipeptídeos tão longos atenuam o desenovelamento local durante a fase de propagação, ao mesmo tempo que compensam o efeito disruptivo das interrupções, atualmente não é compreendido.
A informação para o dobramento correto da maioria das proteínas está codificada em sua sequência de aminoácidos. Nossos resultados aqui sugerem que isso também é verdadeiro para colágenos.
Aqui mostramos que colágenos humanos e proteínas semelhantes a colágeno em arqueias, bactérias e eucariotos (excluindo ortólogos de colágeno humano), e vírus contêm motivos de aminoácidos capazes de formar pontes salinas lisina-glutamato e lisina-aspartato geometricamente específicas. As pontes salinas diminuem a taxa de desenrolamento, ou seja, aumentam a estabilidade cinética de peptídeos tripla-hélice modelo, bem como de vários colágenos nativos testados aqui. Descobrimos que os 28 subtipos de colágeno conhecidos contêm, em média, 50 pontes salinas cada. Em comparação, apenas alguns sítios de ligação para Hsp47 foram formalmente identificados nos colágenos humanos tipo II e III. Importante, o alinhamento incorreto das cadeias nas respectivas triplas hélices diminui drasticamente o número de possíveis pontes salinas em todos os subtipos de colágeno. Também descobrimos que as pontes salinas estão distribuídas ao longo de todo o domínio tripla-hélice dos colágenos humanos, mas sua densidade é especialmente maior nas proximidades de interrupções não colagenosas. Isso, combinado com sua capacidade de aumentar a estabilidade cinética, sugere que as pontes salinas atuam como grampos eletrostáticos locais que fixam as regiões enoveladas das triplas hélices no lugar e permitem que as regiões restantes se propaguem. Portanto, nossos resultados fornecem um mecanismo geral para como as triplas hélices de colágeno evitam o desenrolamento local enquanto impedem intermediários de enovelamento improdutivos. Também descobrimos que mutações que interrompem pontes salinas estão associadas a doenças graves ou letais, o que tem consequências importantes para entender por que algumas mutações em colágenos humanos causam fenótipos mais graves do que outras.
Resultados
Triplos que formam pontes salinas são anormalmente frequentes em colágeno e proteínas semelhantes a colágeno
A análise de colágenos fibrilares humanos, representando 9 das 44 cadeias α de colágeno, revelou anteriormente que vários triplos Yaa-Gly-Xaa, incluindo KGE e KGD, ocorrem no domínio tripla-hélice com uma frequência maior do que a esperada a partir de uma distribuição aleatória de aminoácidos. Tal frequência anômala sugere pressão seletiva e, portanto, um papel biológico proeminente no enovelamento e/ou função. Esses triplos possuem um grupo amônio (na cadeia lateral das lisinas) e um grupo carboxilato (nas cadeias laterais de aspartato ou glutamato) em estreita proximidade, tornando-os prováveis de participar de interações de pontes salinas eletrostáticas. Revisitamos a análise da frequência de triplos KGD ou KGE em todas as 44 cadeias α de colágeno em humanos. Além disso, também analisamos a frequência de triplos em proteínas semelhantes a colágeno de arqueias, bactérias, eucariotos e vírus para entender como estas se comparam aos colágenos humanos.
Considerando os 20 aminoácidos naturais, existem 400 combinações teóricas de resíduos pareados Xaa e Yaa nos tripletos Yaa-Gly-Xaa. Embora as glicinas presentes nas posições Xaa e Yaa tenham sido tradicionalmente consideradas parte do domínio de tripla hélice, aqui as consideramos como interrupções. A presença de glicinas na posição Xaa ou Yaa interrompe a estrutura helicoidal firmemente enrolada no local da interrupção. Isso é evidente pelo fato de que os ângulos diedros da cadeia principal dessa glicina e dos resíduos ao seu redor se desviam da área canônica de poliprolina tipo II do gráfico de Ramachandran. Essa interrupção causa uma perda do padrão canônico de pontes de hidrogênio entre as cadeias, o que reduz a área de contato de van der Waals entre as cadeias e diminui drasticamente a estabilidade térmica das triplas hélices. Assim, os motivos Gly-Yaa-Gly-Gly e Gly-Gly-Xaa-Gly, abreviados daqui em diante como GYGG e GGXGG, devem ser mais apropriadamente considerados interrupções em vez de parte do domínio de tripla hélice.
Excluindo a glicina, existem 361 combinações possíveis de pares de resíduos em um tripleto Yaa-Gly-Xaa. Considerando que 6 ou mais repetições contíguas de tripletos Yaa-Gly-Xaa foram previamente definidas como um domínio de tripla hélice, identificamos 468 domínios de colágeno em humanos, enquanto archaea, bactérias, eucariotos e vírus foram responsáveis por 58002 domínios proteicos similares ao colágeno (Tabela Suplementar 1 e Dados Suplementares 1). Para entender a frequência de tripletos nos domínios de colágeno e similares ao colágeno, a ocorrência de cada tripleto Yaa-Gly-Xaa foi primeiro prevista com base na frequência individual observada de resíduos de aminoácidos nas posições Xaa e Yaa dentro das sequências de colágeno humano, conforme relatado anteriormente (veja métodos para detalhes). Essa previsão foi então comparada à ocorrência observada de combinações de pares Xaa e Yaa em tripletos Yaa-Gly-Xaa.
Tripletos eletrostaticamente carregados são anomalamente frequentes em colágeno e proteínas similares ao colágeno.
Frequência de tripletos Yaa-Gly-Xaa nos domínios de tripla hélice ininterruptos (A) e ao redor das interrupções (B) nas 44 cadeias α de colágeno humano conhecidas e nas proteínas similares ao colágeno de humanos, vírus e os três super-reinos. No caso de interrupções GnG, onde 0 ≥ n ≤ 15, a frequência do tripleto foi determinada nos quatro tripletos (rotulados P1-P4) ao redor das interrupções.
Tripletos com escores Z maiores que 3 ou menores que −3 (mais de três desvios padrão da média da diferença entre valores observados e previstos) foram considerados anomalamente frequentes. Para entender se tripletos com frequência anomalamente alta também possuem alta abundância relativa, os escores Z foram plotados contra a abundância relativa, que é definida como a porcentagem de ocorrência observada de um triplete em relação ao número total de tripletos em colágenos ou proteínas similares a colágeno. Conforme mostrado na Fig. 1A, os tripletos KGE e/ou KGD são outliers de escore Z e, portanto, anomalamente frequentes não apenas nas cadeias α de colágenos humanos, mas também em proteínas similares a colágeno em archaea, eucariotos, bactérias e vírus. Os tripletos KGE e KGD também possuem alta abundância relativa variando entre 3 e 6% tanto em colágenos quanto em proteínas similares a colágeno. No caso de proteínas virais similares a colágeno, o KGD representa estupendos 13% de todos os tripletos observados. Em eucariotos, o triplete PGP, ou OGP após a modificação pós-traducional da prolina em 4(R)-hidroxiprolina (notada como O), é de longe o mais abundante. Deve-se notar que a modificação pós-traducional da prolina na posição Yaa é presumida para muitos tipos de colágeno, em vez de demonstrada experimentalmente. Em qualquer caso, uma sucessão de tripletos OGP se monta na tripla hélice mais termicamente estável, com qualquer mutação individual na posição Xaa ou Yaa resultando em desestabilização. Em particular, em peptídeos modelo de tripla hélice, uma mutação de hidroxiprolina para lisina diminui a estabilidade térmica da tripla hélice em 10 °C, e uma mutação de prolina para glutamato ou aspartato a desestabiliza em 7 °C ou 4 °C, respectivamente. No entanto, mutar tanto hidroxiprolina quanto prolina para lisina e glutamato resulta em uma diminuição moderada da estabilidade térmica de 5–8 °C, sugerindo um mecanismo de estabilização compensatória decorrente da formação de ponte salina.
Tripletos contendo treonina, TGA e TGP, também são encontrados como anomalamente frequentes com alta abundância relativa em archaea, bactérias e vírus, mas não em colágeno humano ou proteínas similares a colágeno em eucariotos. Bactérias carecem da enzima prolil hidroxilase necessária para a modificação pós-traducional da prolina em hidroxiprolina. A alta abundância de treonina no lugar de hidroxiprolina foi racionalizada com base na capacidade das bactérias de glicosilar a treonina, o que presumivelmente aumenta a estabilidade da tripla hélice por meio de pontes de hidrogênio mediadas por água.
Analisamos em seguida a frequência de tripletos Yaa-Gly-Xaa que circundam interrupções em colágenos humanos e proteínas semelhantes a colágeno, seguindo um protocolo desenvolvido por Bella et al.. Nessa nomenclatura, as interrupções são denotadas como GnG de acordo com o comprimento da sequência, onde n é o comprimento da interrupção de até 15 aminoácidos entre duas glicinas. Por exemplo, a deleção de um aminoácido da sequência repetida de tripletos é denotada como G1G, e a inserção de um aminoácido é anotada como G3G. Importantemente, consideramos a presença de glicina nas posições Xaa ou Yaa como interrupções. Abreviamos os motivos GXGG e GGYG resultantes como interrupções G2G. Colágenos fibrilares (especialmente colágeno tipo III) contêm muitas instâncias de tais interrupções.
Incluindo G2G, identificamos 393 interrupções em colágenos humanos e 30.124 interrupções em proteínas semelhantes a colágeno após remover duplicatas (Tabela Suplementar 1 e Dados Suplementares 2). Em colágenos humanos, uma interrupção duplicada é encontrada tanto no colágeno tipo II quanto no tipo V, totalizando 394 interrupções. Em seguida, determinamos a frequência de tripletos Yaa-Gly-Xaa focando apenas na sequência ao redor das interrupções. Começando pelas extremidades N-terminais, os dois tripletos de cada lado das interrupções foram rotulados como P1-P4. Conforme mostrado na Fig. 1B, KGE e/ou KGD são anormalmente frequentes nas posições P1-P4 ao redor das interrupções não apenas em colágenos humanos, mas também em proteínas semelhantes a colágeno de bactérias, eucariotos e vírus. Intrigantemente, descobrimos que o tripleto OGP é anormalmente frequente nos domínios tripla-hélice em geral, mas não aparece com frequência anormal perto das interrupções em humanos. Proteínas semelhantes a colágeno de archaea mostram frequência anormal de KGD apenas na posição P4. A abundância relativa dos tripletos KGE e KGD ao redor das interrupções em proteínas semelhantes a colágeno de bactérias e eucariotos varia entre 2 e 6%. Entre todos os grupos analisados, os vírus mostram a maior abundância relativa desses tripletos, de 10 a 12%, em todas as quatro posições ao redor das interrupções.
A observação consistente de que os tripletos KGE e KGD são anormalmente frequentes nos domínios tripla-hélice de colágenos humanos e proteínas semelhantes a colágeno nos quatro grupos e que também são enriquecidos nos tripletos ao redor de sítios de interrupção (em P1 a P4 para bactérias, eucariotos e vírus, e em P4 para archaea) sugere um papel proeminente e provavelmente comum na estabilidade, dobramento e/ou função.
Pontes salinas mediadas por tripletos KGE e KGD são amplamente distribuídas em todos os colágenos humanos.
Estabelecemos a frequência anormalmente alta de tripletes KGE e KGD em colágenos humanos por meio da análise de cadeias α de colágeno isoladas. No entanto, quais desses tripletes são capazes de formar pontes salinas após a trimerização, quantas dessas pontes salinas são viáveis em um determinado subtipo de colágeno, qual é sua distribuição dentro do domínio tripla-hélice e como estão localizadas em relação às interrupções atualmente não é conhecido. Para tal fim, alinhamos as 44 cadeias α de colágeno nas estequiometrias tripla-helicoidais observadas em humanos e determinamos o número e a localização das pontes salinas nos domínios tripla-hélice e também ao redor das interrupções (Fig. Suplementar 1). Deve-se notar que alinhamos colágenos humanos usando considerações de informações previamente publicadas baseadas em sequência e análise experimental da ligação do colágeno a outras proteínas (ver métodos e Tabela Suplementar 2). Nos casos em que tais considerações não estavam disponíveis, alinhamos sequências otimizando o comprimento do domínio tripla-hélice. Visto que a verificação experimental direta de tais alinhamentos atualmente não está disponível, referimo-nos aos nossos como alinhamentos propostos.
Pontes salinas são abundantes em todos os 28 colágenos humanos.
A Uma representação esquemática da restrição de sequência para a formação de pontes salinas entre as cadeias líder (laranja), média (verde) e final (azul) de uma tripla hélice [pdb: 6q3p]. B O número total de pontes salinas (azul) e interrupções (amarelo) observadas no domínio tripla-hélice de cada subtipo de colágeno. C Uma representação visual da distribuição de pontes salinas (azul), tripletes KGE ou KGD (azul claro) e interrupções (amarelo) nos domínios tripla-hélice dos colágenos humanos.
Os resíduos de lisina e aspartato/glutamato capazes de formar uma ponte salina em uma tripla hélice são restritos pela sequência. Para entender essas restrições, referimo-nos às três cadeias deslocadas da tripla hélice como líder (deslocada em direção à extremidade N-terminal), média ou retardatária (deslocada em direção à extremidade C-terminal). Neste esquema, a i-ésima lisina das cadeias líder e média forma pontes salinas com o i + 2 aspartato ou glutamato da cadeia média e retardatária, respectivamente (Fig. 2A). A lisina restante na cadeia retardatária também pode formar uma ponte salina com o aspartato ou glutamato que ocupa as posições i + 5 na cadeia líder. As pontes salinas que obedecem às três restrições de sequência são idênticas em relação à condição espacial para interação. No entanto, a ponte salina i→ i + 5 é formada por resíduos que podem ou não estar presentes dentro de um tripleto KGE ou KGD. Uma busca nos domínios tripla-hélice alinhados de colágenos humanos mostrados na Fig. Suplementar 1 por pares de resíduos de lisina e aspartato/glutamato que satisfazem qualquer uma das três restrições de sequência revelou 1553 pontes salinas (Fig. 2B e Tabela Suplementar 3). Destas, 21% são pontes salinas i→ i + 5 que não se originam dos tripletos KGE ou KGD. Isso enfatiza a necessidade de buscar sequências tripla-hélice alinhadas, em vez de confiar apenas em ocorrências de tripletos KGE e KGD para identificar potenciais interações de ponte salina.
As 1553 pontes salinas observadas estão distribuídas entre os 28 colágenos humanos, com uma média de ~50 em cada subtipo. Uma inspeção visual de sua distribuição mostrada na Fig. 2C sugere que elas estão presentes ao longo de todo o domínio tripla-hélice. Para entender melhor essa distribuição, dividimos os domínios tripla-hélice das sequências de colágeno alinhadas em quatro partes iguais e contamos o número de pontes salinas em cada quarto. Conforme mostrado na Fig. Suplementar 2, o quarto C-terminal é responsável por ~50% (757 de 1553) de todas as pontes salinas. Essa distribuição altamente distorcida de pontes salinas assume importância em vista do modelo de nucleação-propagação C-terminal atualmente aceito para o dobramento de triplas hélices de colágeno.
O desalinhamento das cadeias α reduz o número de pontes salinas possíveis.
Os polipeptídeos em uma hélice tripla estão desalinhados em um aminoácido um em relação ao outro. Esse alinhamento canônico maximiza as ligações de hidrogênio entre as cadeias e permite que os resíduos de glicina se sequestrem no núcleo da hélice tripla. Em teoria, os polipeptídeos podem ser desalinhados por uma série aritmética de 1, 4, 7, 10,… aminoácidos, mantendo a estrutura tripla-helicoidal compacta. No entanto, alinhamentos não canônicos de mais de 1 aminoácido resultariam na perda de ligações de hidrogênio nas extremidades. Assim, hélices triplas contendo polipeptídeos alinhados de forma não canônica não foram observadas experimentalmente em peptídeos de colágeno curtos. No entanto, dado que os domínios tripla-helicoidais dos colágenos humanos contêm até 1000 aminoácidos e >900 ligações de hidrogênio, espera-se que a diferença de energia livre entre as hélices triplas canônica e não canônica seja pequena. Portanto, se apenas as ligações de hidrogênio e o empacotamento de Van der Waals forem considerados, os desalinhamentos canônicos e não canônicos dos colágenos seriam separados por barreiras de baixa energia, resultando em dobramentos incorretos frequentes devido ao desalinhamento das cadeias. Ainda não se sabe como os colágenos evitam tais armadilhas locais de dobramento e encontram o mínimo global.
O desalinhamento das cadeias α reduz o número de pontes salinas.
Número de pontes salinas observadas no alinhamento proposto mostrado na Fig. Suplementar 1 (vermelho) e quando a cadeia do meio (roxo) ou a cadeia final (ciano) estão desalinhadas com um deslocamento de quatro resíduos A. O gráfico de caixa e bigodes em B mostra a perda agregada no número de pontes salinas após o desalinhamento. Os limites das barras de erro mostram o número mínimo e máximo de pontes salinas, a caixa representa o quartil inferior e superior do número total de pontes salinas e a linha horizontal na caixa denota o valor mediano.
Conforme observado na seção anterior, todos os colágenos humanos contêm uma média de 50 pontes salinas em cada subtipo de colágeno. Descobrimos que o número de pontes salinas possíveis diminui drasticamente ao desalinhar intencionalmente a cadeia do meio ou a cadeia final em apenas 4 resíduos (Fig. 3 e Tabela Suplementar 3). A perda média de pontes salinas ao desalinhar a cadeia do meio e a cadeia final é de 40% e 30%, respectivamente. Como exemplo representativo, o heterotrímero α3α4α5 do colágeno tipo IV perde 8% das pontes salinas, enquanto o colágeno tipo X homotrimérico perde 94% das pontes salinas com o desalinhamento da cadeia do meio em 4 resíduos. Espera-se que a perda de pontes salinas aumente a diferença de energia livre entre o estado nativo e os estados mal dobrados concorrentes, garantindo assim que apenas o estado com o alinhamento canônico seja povoado. Importante, dado que 50% de todas as pontes salinas estão concentradas no quarto C-terminal dos domínios tripla-helicoidais, a decisão para o alinhamento correto dos polipeptídeos provavelmente é tomada no início da fase de propagação.
Subtipos de colágeno com mais interrupções também contêm mais pontes salinas.
Verificamos que o número de pontes salinas em cada subtipo de colágeno está positivamente correlacionado tanto com o número de interrupções quanto com o comprimento do domínio de hélice tripla (Fig. Supl. 3a–c). Em termos físicos, colágenos com mais interrupções ou domínios de hélice tripla mais longos também contêm um maior número de pontes salinas. Como exemplo representativo, o heterotrímero (α1)2α2 do colágeno tipo I com 4 interrupções contém 35 pontes salinas, mas o do colágeno tipo IV com 23 interrupções contém 129 pontes salinas. Da mesma forma, o colágeno tipo XX, com o domínio de hélice tripla mais curto (141 resíduos) entre todos os colágenos, contém apenas 10 pontes salinas, enquanto o colágeno tipo VII, com o domínio de hélice tripla mais longo (1380 resíduos), contém impressionantes 141 pontes salinas. Embora o número de pontes salinas esteja fortemente correlacionado tanto com o número de interrupções (correlação de Pearson = 0,69, P bicaudal < 0,0001, α = 0,05) quanto com o número de tripletos (correlação de Pearson = 0,68, P bicaudal < 0,0001, α = 0,05), observa-se uma correlação mais fraca entre o número de tripletos e interrupções (correlação de Pearson = 0,53, P bicaudal = 0,0014, α = 0,05). Assim, hélices triplas mais longas não necessariamente contêm mais interrupções.
Em comparação, conforme mostrado na Fig. Supl. 3D, E, o número de tripletos OGP está fortemente correlacionado ao comprimento da hélice tripla do colágeno (correlação de Pearson = 0,78, P bicaudal < 0,0001, α = 0,05), mas apenas fracamente correlacionado ao número de interrupções (correlação de Pearson = 0,44, P bicaudal < 0,0001, α = 0,05). As interrupções perturbam a estrutura da hélice tripla, causando atraso no dobramento e diminuição da estabilidade geral. Da mesma forma, espera-se que colágenos com domínios de hélice tripla mais longos sofram maior perturbação entrópica do dobramento durante a fase de propagação. Hipotetizamos que o aumento da abundância de pontes salinas, mas não de tripletos OGP, provavelmente compensa os efeitos disruptivos das interrupções, enquanto tanto as pontes salinas quanto os tripletos OGP estabilizam domínios de hélice tripla mais longos.
As interrupções do colágeno humano são ladeadas por “nós” de pontes salinas
Nós de pontes salinas ladeiam os sítios de interrupção nos colágenos humanos.
Exemplos representativos de nós de pontes salinas observados em colágenos humanos contendo de dois a seis (A–E) e oito (F) pontes salinas. Pares de interação de lisina e aspartato/glutamato são mostrados em azul escuro, os tripletos KGE e KGD são mostrados em roxo claro e as interrupções são mostradas em amarelo. As pontes salinas intercadeia i → i + 2 são mostradas com linha preta, enquanto as pontes salinas i → i + 5 são mostradas em vermelho. Embora os exemplos representativos mostrados nesta figura contenham interrupções apenas em direção ao C-terminal, exemplos de nós de pontes salinas no N-terminal também são abundantes (Fig. Supl. 4).
Das 394 interrupções identificadas nos domínios tripla-hélice alinhados de colágenos humanos, 58% contêm pontes salinas nos N- ou C-terminais ou em ambos (Tabela Suplementar 3). A inspeção minuciosa sugere que as pontes salinas raramente aparecem sozinhas. Descobrimos que, análogo aos nós de cisteína em colágenos, onde dois ou mais pares de resíduos de cisteína formam pontes dissulfeto ligando covalentemente todas as três cadeias, dois ou mais pares de resíduos de lisina e aspartato/glutamato em interação também ligam todas as três cadeias. Chamamos estes de nós de ponte salina (Figura Suplementar 4). Distinguimos nós de ponte salina de pontes salinas complexas observadas em muitas proteínas globulares. Conforme originalmente definido por Musafia et al., em uma ponte salina complexa, um resíduo catiônico ou aniônico interage simultaneamente com dois ou mais resíduos carregados. Em contraste, definimos nós de ponte salina como pares de resíduos catiônicos e aniônicos em interação. Como mostrado na Fig. 4, identificamos nós contendo até oito pontes salinas dentro do espaço sequencial de quatro tripletos.
Uma avaliação quantitativa mostra que os nós de ponte salina estão predominantemente localizados próximos às interrupções. Conforme observado na Tabela Suplementar 3, os alinhamentos propostos de colágenos humanos neste trabalho revelam um total de 394 sítios de interrupção. As regiões P1-P4 flanqueadoras dessas interrupções correspondem a 21% (394 * 4 tripletos * 3 cadeias = 4728 tripletos) dos 22811 tripletos nas sequências de colágeno alinhadas, mas contêm 48% (228 de 474) de todos os nós de ponte salina. Isso sugere que mais nós de ponte salina estão localizados próximos às interrupções do que em outras partes da tripla hélice. Além disso, dentro da região P1-P4, 19% dos tripletos estão envolvidos em nós de ponte salina. Isso é significativamente maior do que a porcentagem de tripletos envolvidos em nós de ponte salina fora da região P1-P4 (6%) e em todos os domínios tripla-hélice de colágenos humanos (9%, ANOVA de uma via, pós-teste de Tukey, Figura Suplementar 5).
A abundância geral de nós de ponte salina em colágenos humanos e, em particular, seu enriquecimento preferencial próximo às interrupções é intrigante e sugere um papel funcional proeminente. Embora atualmente não entendamos qual possa ser essa função, uma investigação sobre a abundância e estabilidade de pontes salinas em organismos termofílicos, hipertermofílicos e halofílicos oferece uma pista. Proteínas desses organismos frequentemente contêm pontes salinas complexas, que estabilizam cooperativamente as proteínas, ou seja, o aumento total na estabilidade é maior do que o obtido a partir de uma simples soma de pontes salinas individuais. Devido à topologia estendida em forma de bastão e à restrição sequencial para interação, pontes salinas complexas não são geometricamente viáveis em triplas hélices. É plausível que os nós de ponte salina em colágenos tenham evoluído como uma alternativa com um papel energeticamente semelhante ao das pontes salinas complexas em proteínas globulares.
Tripletos KGE e KGD formam pontes salinas geometricamente específicas
Pontes salinas podem ser estabilizadoras ou desestabilizadoras, dependendo do contexto proteico. Em um trabalho notável, Kumar et al. mostraram que a geometria relativa dos grupos cabeça catiônicos (amônio ou guanidínio) e aniônicos (carboxilato) determina se uma ponte salina é ou não estabilizadora. Isso sugere que a estabilidade conferida por uma ponte salina está intimamente ligada à sua geometria. Assim, analisamos a geometria de pontes salinas nas estruturas cristalinas e de solução publicadas de triplas hélices de colágeno usando uma parametrização previamente desenvolvida para aquelas em proteínas globulares. Nessa parametrização, a geometria de pontes salinas lisina-aspartato/glutamato é definida pelo ângulo entre o oxigênio do carboxilato e os átomos Cε-Nζ da lisina e pelo ângulo diedro entre o oxigênio do carboxilato e os átomos Cδ-Cε-Nζ da lisina. O grupo carboxilato pode adotar uma de três configurações escalonadas em relação ao grupo amônio tetraédrico; gauche plus (g+), trans (t) e gauche minus (g−). Em proteínas globulares, as pontes salinas são encontradas favorecendo configurações g+ ou g-. Além disso, os carboxilatos de glutamato ou aspartato podem aceitar ligações de hidrogênio através de qualquer um dos dois pares de elétrons não ligantes chamados syn e anti. O ácido carboxílico syn é um ácido mais fraco que o anti e, portanto, sua base conjugada é mais básica. Apesar da basicidade aumentada, as pontes salinas lisina-aspartato/glutamato em proteínas globulares formam predominantemente ligações de hidrogênio através do par de elétrons anti.
O efeito estabilizador de ambas as pontes salinas KGE/KGD em uma tripla hélice está bem documentado na literatura e sua estrutura molecular que afirma a interação direta entre a lisina e o aspartato/glutamato em peptídeos triplo-helicoidais modelo também foi demonstrada por vários laboratórios de pesquisa independentes usando cristalografia, bem como RMN. Até onde sabemos, existe apenas uma estrutura molecular publicada contendo duas pontes salinas lisina-glutamato em triplas hélices de colágeno (pdb: 3t4f). Devido à falta de pontos de dados suficientes para pontes salinas lisina-glutamato, tentamos entender a preferência geométrica de pontes salinas em colágenos usando estruturas publicadas de peptídeos triplo-helicoidais contendo pontes salinas lisina-aspartato.
Conforme mostrado na Fig. Suplementar 6 e nos Dados Suplementares 3, o ângulo diedro Cδ-Cε-Nζ---Ocarboxilato e o ângulo Cε-Nζ---Ocarboxilato das pontes salinas se agrupam em torno de 180° e 90°, respectivamente. Isso sugere uma preferência esmagadora pela configuração trans, em contraste com a preferência g + /g- em proteínas globulares. A especificidade geométrica também se manifesta em se o par isolado sin ou anti interage com a porção amônio. Parametrizamos isso usando o ângulo Oδ2-Oδ2---Nζlisina. Ângulos entre 0 e 120° foram classificados como sin e aqueles acima de 120° como anti. Conforme mostrado nos Dados Suplementares 3, a maioria das interações entre o carboxilato e o grupo amônio ocorre através do par isolado sin mais básico, novamente em contraste com as proteínas globulares. Assim, nossa análise sugere que os tripletos KGD e KGE também promovem pontes salinas geometricamente específicas, mas, em contraste com as proteínas globulares, essas pontes salinas favorecem fortemente a configuração trans e quase sempre interagem através do par isolado sin mais básico.
Deve-se notar que a caracterização experimental direta da geometria das pontes salinas em moléculas de colágeno nativo tem sido dificultada devido à limitação técnica de obtenção de estruturas moleculares de proteínas tão complexas, propensas à agregação e conformacionalmente flexíveis. Temos conhecimento de pelo menos um caso em que a estrutura molecular do colágeno tipo I foi obtida por meio de simulações de dinâmica molecular restritas por parâmetros de difração de fibra determinados experimentalmente. Embora sua inspeção sugira a presença de várias pontes salinas de lisina-aspartato, bem como de lisina-glutamato, decidimos excluir essa estrutura de nossa análise. Isso se deve principalmente ao fato de que o alinhamento das cadeias α1 e α2 na estrutura do heterotrímero não corresponde ao determinado experimentalmente anteriormente.
Pontes salinas aumentam a estabilidade cinética dos colágenos
Parâmetros de estabilidade e cinéticos para o desdobramento de peptídeos modelo de colágeno e colágenos nativos
Técnica Parâmetro Peptídeosd Colágeno nativoe OGPa KGDb KGEc Tipo II Tipo IV Tipo V DSC Tm (°C) 67,6 ± 2,5 (67,5 ± 2,4) 62,6 ± 1,9 (60,7 ± 2,1) 58,9 ± 2,1 (56,3 ± 2,0) – – – Ea (kcal mol−1) por ajuste individual 59,7 ± 1,2 (59,5 ± 1,1) 70,8 ± 1,3 (68,1 ± 1,2) 73,3 ± 0,8 (70,6 ± 0,7) – – – Ea (kcal mol−1) do gráfico de Arrhenius 58,8 ± 0,4 (59,1 ± 0,5) 70,4 ± 0,5 (68,9 ± 1,9) 71,7 ± 0,7 (71,8 ± 0,6) – – – k (min−1, 25 °C) do gráfico de Arrhenius 1,59e−06 (1,595e−06) 7,91e−07 (8,961e−07) 7,47e−07 (8,345e−07) – – – Meia-vida (dias, 25 °C) 302,9 (301,8) 608,8 (537,2) 644,2 (576,8) – – – CD kpH=2,5 (min−1, 37 °C) – – – 5,6e−04 ± 1,1e-4 (1,5e−02 ± 1,9e−03) 1,2e−03 ± 2,1e-4 (1,3e−02 ± 1,0e-03) 1,0e-03 ± 3,9e-4 (3,4e−02 ± 3,4e-03) kpH=7,4 (min−1, 37 °C) – – – 2,9e−04 ± 5,5e-5 (1,3e−02 ± 2,4e-03) 2,9e-04 ± 4,4e-5 (1,3e−02 ± 1,9e-03) 2,8e−04 ± 5,2e-5 (1,4e−02 ± 2,4e-03) Meia-vidapH=2,5 (horas, 37 °C) – – – 20,8 (0,78) 9,5 (0,91) 11,4 (0,35) Meia-vidapH=7,4 (horas, 37 °C) – – – 39,3 (0,95) 39,5 (0,90) 41,9 (0,83) MD tempo de simulação (μs) 199,0 – 210,4 – – – MFPToff (ms) 0,7 ± 0,1 50,0 ± 14,7 (20,2 ± 9,5) – – –
aOGP = Ac-(GPO)3GPOGPOG(GPO)3-NH2; bKGD = Ac-(GPO)3GPKGDOG(GPO)3-NH2; cKGE = Ac-(GPO)3GPKGEOG(GPO)3-NH2.
dpH neutro ou na presença de 154 mM NaCl (parênteses); MFPToff para KGD não relatado, pois a análise de escala de tempo implícita não convergiu.
eConstantes de taxa para a fase de desenrolamento mais rápida são mostradas entre parênteses.
A frequência anormalmente alta dos tripletos KGE e KGD foi anteriormente racionalizada com base em sua capacidade de promover pontes salinas, o que presumivelmente aumenta a estabilidade termodinâmica dos colágenos. No entanto, é bem estabelecido que peptídeos tripla-hélice contendo um tripleto OGP desenrolam a uma temperatura semelhante ou marginalmente superior à daqueles contendo KGE ou KGD. Também observamos isso com peptídeos tripla-hélice compostos pelos motivos GPKGDO, GPKGEO ou GPOGPO flanqueados por três tripletos GPO (Tabela 1). Diante disso, os tripletos KGE ou KGD não oferecem qualquer vantagem de estabilidade térmica em comparação com um tripleto OGP. Assim, as implicações evolutivas da retenção dos tripletos KGE/KGD em uma frequência comparável à OGP não são explicadas termodinamicamente.
Geralmente, as pontes salinas aumentam a estabilidade termodinâmica das proteínas. No entanto, aquelas com efeitos limitados ou mesmo desestabilizadores na estabilidade também são abundantes. A desestabilização ocorre devido à energia de dessolvatação desfavorável das cargas eletrostáticas que interagem, competindo com a atração coulombiana favorável. Dada a pressão evolutiva para reter mesmo pontes salinas desestabilizadoras, postulou-se que elas modulam a cinética de enovelamento, em vez de influenciar a estabilidade termodinâmica. Isso levou a uma apreciação geral do papel das pontes salinas na cinética, independentemente do componente termodinâmico. Por exemplo, uma ponte salina superficial de arginina-glutamato na nuclease estafilocócica dificulta a desnaturação ao aumentar a barreira cinética para o desenovelamento em ~7 kcal/mol. Importantemente, uma ponte salina superficial geometricamente otimizada diminui a taxa de desenovelamento de peptídeos α-helicoidais, enquanto a geometria desfavorável tem o efeito oposto. Dado que KGE e KGD formam pontes salinas geometricamente específicas, mas não oferecem qualquer vantagem termodinâmica em comparação com o tripleto OGP, também suspeitamos de um papel cinético.
Devido à sua natureza trimérica, a taxa de nucleação do colágeno é dependente da concentração, ao mesmo tempo que é limitada pela lenta taxa de isomerização cis-trans da prolina (kcis→trans ~ 0,1 s−1). Consequentemente, desconvoluir o efeito das pontes salinas na taxa de renaturação da isomerização limitante da prolina é desafiador. Assim, investigamos a cinética de desenovelamento de peptídeos de colágeno contendo tripletos KGE ou KGD por meio de dicroísmo circular (CD), calorimetria exploratória diferencial (DSC) e simulações de dinâmica molecular (MD).
Pontes salinas diminuem a taxa de desenovelamento dos colágenos.
Uma diminuição no sinal característico de elipticidade do tipo poliprolina II dos peptídeos OGP, KGE e KGD após incubação isotérmica a 37 °C. Os espectros de CD iniciais e após 8 h são mostrados em azul e amarelo, respectivamente. (B-C) Cinética de desenovelamento dos peptídeos KGE e KGD (B) e dos colágenos tipo II, IV e V em pH 2,5 (azul) e 7,0 (laranja) (C). Os resíduos do ajuste monoexponencial dos peptídeos de colágeno e do ajuste biexponencial dos colágenos nativos são mostrados na Fig. Suplementar 7. D Comparação da estabilidade cinética dos peptídeos OGP (cinza), KGE (azul) e KGD (amarelo) analisada por um gráfico de Arrhenius derivado de experimentos de calorimetria exploratória diferencial realizados em diferentes taxas de varredura. A linha representa o melhor ajuste à equação de Arrhenius. Os parâmetros cinéticos são mostrados na Tabela 1. Os endotermas de DSC e o ajuste a um modelo cinético de dois estados são mostrados na Fig. Suplementar 8.
As interações de ponte salina incluem componentes eletrostáticos e de ligação de hidrogênio. Em pH menor que o pKa das cadeias laterais de glutamato e aspartato, os carboxilatos são protonados, anulando o componente eletrostático. Assim, monitoramos o desenovelamento isotérmico dos peptídeos KGE, KGD e OGP em pH ácido e neutro para entender como as pontes salinas contribuem para a cinética (ver métodos). Em pH 2,5, os peptídeos KGE e KGD se desenovelam até ~80% do valor inicial após incubação a 37 °C por 8 h, mas nenhuma alteração significativa no sinal é observada em pH neutro (Fig. 5A). Importante, o sinal para o peptídeo OGP é amplamente independente do pH. O desenovelamento de ambos os peptídeos em pH neutro é lento, com menos de 10% de perda de sinal ao longo de 8 h (Fig. 5B). No entanto, em pH 2,5, ambos os peptídeos se desenovelam rapidamente com meia-vida de 1,6 e 3,5 h (Tabela 1). Essa dependência do pH da meia-vida de desenovelamento sugere que a maior estabilidade cinética das triplas hélices de KGE e KGD em pH neutro se deve principalmente às interações de ponte salina.
Investigamos ainda a cinética de desenovelamento dos colágenos fibrilares nativos tipos II e V e do colágeno tipo IV formador de rede. Como mostrado na Fig. 5C, todos os três tipos de colágeno apresentam cinética de desenovelamento dependente do pH. As curvas de desenovelamento puderam ser ajustadas a uma cinética biexponencial com uma fase de decaimento mais rápida e outra mais lenta. A meia-vida da fase de desenovelamento mais rápida é amplamente independente do pH, bem como do tipo de colágeno, exceto para o tipo V, onde uma diferença de duas vezes é observada. Em contraste, a meia-vida da fase de desenovelamento mais lenta é dependente do pH para todos os subtipos de colágeno. O colágeno tipo IV e V se desenovelam ~4 vezes mais lentamente em pH 7,4 do que em pH 2,5, enquanto o colágeno tipo II se desenovela duas vezes mais lentamente, conforme julgado por suas meias-vidas.
Investigamos também o desenovelamento dos peptídeos KGD e KGE por DSC para determinar a energia de ativação, que é a energia necessária para superar a barreira que separa os estados nativo e desenovelado. Extraímos a energia de ativação de uma análise cinética dos endotermas de desenovelamento dos peptídeos obtidos em diferentes taxas de varredura. Os endotermas de desenovelamento térmico mostram um deslocamento na temperatura de transição de fusão ao variar a taxa de varredura (Fig. Suplementar 8). Isso sugere que um processo cinético controla o desenovelamento. O controle cinético do desenovelamento do colágeno também foi observado por outros. Em nosso caso, o ajuste dos endotermas a um modelo cinético fornece uma estimativa da energia de ativação do desenovelamento (métodos). Esse parâmetro foi previamente correlacionado com a magnitude da estabilidade cinética da proteína. Em comparação com o peptídeo OGP, os peptídeos KGD e KGE têm uma menor estabilidade térmica, mas uma energia de ativação consideravelmente maior (Tabela 1), tanto no gráfico de Arrhenius (Fig. 5D) quanto no ajuste do endoterma (Fig. Suplementar 8). Esses resultados indicam uma clara diferença na estabilidade cinética, conforme inferido pela mudança de uma ordem de grandeza na constante cinética (k) e, consequentemente, no tempo de meia-vida de desenovelamento dos peptídeos (Tabela 1).
Para confirmar ainda mais que as diferenças observadas são realmente devidas a interações de pontes salinas, realizamos medições de DSC na presença de concentrações fisiológicas de NaCl (Fig. Suplementar 9). Enquanto a temperatura de fusão (Tm) e a energia de ativação permanecem essencialmente inalteradas para OGP na presença de sal, um efeito desestabilizador é observado tanto para KGE quanto para KGD (Tabela Suplementar 4). Com base nesses resultados, parece que a desestabilização na presença de sal tornaria as pontes salinas ineficazes como um código de enovelamento. No entanto, isso não é direto. Esses resultados, que são baseados em pequenos peptídeos tripla-hélice contendo apenas 2 pontes salinas, não podem ser simplesmente extrapolados para colágenos naturais contendo uma média de 50 pontes salinas devido a várias razões discutidas abaixo.
Embora se acredite geralmente que a alta força iônica proteja cargas eletrostáticas e, teoricamente, deva diminuir a estabilidade proteica, isso nem sempre é observado. O efeito da força iônica na estabilidade e cinética das proteínas é fortemente dependente do contexto. Por exemplo, a estabilidade termodinâmica da pequena proteína modificadora de arqueia 1 (SAMP1) do organismo halófilo Haloferax volcanii aumenta com o aumento da força iônica. O aumento da força iônica também diminui a taxa de desenovelamento, ou seja, aumenta a estabilidade cinética da SAMP1. Assim, neste caso, a alta força iônica parece aumentar tanto a estabilidade termodinâmica quanto a cinética. Em outro relato, ao comparar o efeito do sal em uma proteína de choque-frio de organismos mesófilos, termófilos e hipertermófilos, Dominy et al. descobriram que a proteína mesófila é estabilizada, mas aquelas de organismos termófilos e hipertermófilos são desestabilizadas na presença de sal. Esses exemplos destacam como concentrações salinas fisiológicas podem ter efeitos amplamente diferentes, e por vezes opostos, dependendo do contexto em que a proteína funciona.
Conforme observado anteriormente, as pontes salinas em colágenos naturais ocorrem predominantemente em aglomerados densos que chamamos de nós de pontes salinas, e muitos colágenos contêm vários desses nós, preferencialmente enriquecidos ao redor de interrupções (Tabela Suplementar 3). Embora atualmente não compreendamos a função de aglomerados tão altamente localizados de pontes salinas em colágenos, uma breve avaliação da abundância e estabilidade de pontes salinas em organismos termofílicos, hipertermofílicos e halofílicos oferece uma pista. Proteínas desses organismos frequentemente contêm pontes salinas complexas, onde um resíduo ácido ou básico interage com múltiplos parceiros de carga oposta. Isso estabiliza cooperativamente as proteínas, ou seja, o aumento total na estabilidade é maior do que o obtido a partir de uma simples soma de pontes salinas individuais. Por exemplo, a enzima glutamato desidrogenase da arqueia hipertermoestável Pyrococcus furiosus contém uma rede de pontes salinas complexas, que está ausente no homólogo mesofílico Clostridium symbiosum. Da mesma forma, proteínas halofílicas permanecem enoveladas em concentrações salinas intracelulares e extracelulares que se aproximam de 5 moles por litro. A análise bioinformática de proteínas halofílicas sugere uma abundância de aminoácidos eletrostaticamente carregados capazes de formar redes de pontes salinas. Também foi argumentado que a abundância aumentada de pontes salinas, especialmente na superfície proteica exposta ao solvente, contribui para sua notável termoestabilidade sob condições salinas extremas. Suspeitamos que a alta densidade de pontes salinas nos nós de pontes salinas expostos na superfície em colágenos desempenha uma função não muito diferente das pontes salinas complexas e em rede em organismos extremófilos. Elas provavelmente compensam a perda de estabilidade devido à presença de concentração salina fisiológica.
Deve-se também notar que o efeito do sal na estabilidade e cinética do colágeno nativo não pode ser avaliado diretamente devido à sua tendência a formar grandes agregados e, em última análise, hidrogéis na presença de concentrações salinas fisiológicas. Como alternativa, estamos atualmente no processo de investigar esse aspecto usando peptídeos triplo-helicoidais modelo contendo nós de pontes salinas. Relataremos o resultado no devido tempo. No entanto, suspeitamos que triplas hélices estabilizadas por tais nós seriam muito menos sensíveis à força iônica do que os peptídeos KGE e KGD empregados aqui.
A tendência na estabilidade cinética de peptídeos, conforme observada por experimentos de CD e DSC, é ainda confirmada por simulações de dinâmica molecular (MD). Partindo das estruturas cristalográficas publicadas anteriormente de peptídeos de colágeno contendo os tripletos KGD e KGE ou OGP, realizamos múltiplas simulações de todos os átomos em paralelo, cada uma capaz de amostrar diversas paisagens conformacionais. Especificamente, simulações foram conduzidas para sistemas contendo os tripletos KGE, KGD e OGP, juntamente com uma simulação com o tripleto KGE a uma concentração de NaCl de 150 mM (métodos). No total, acumulamos mais de 750 μs de tempo simulado agregado (Tabela 1). Para facilitar processos de desenovelamento dentro de uma escala de tempo razoável, todos os sistemas foram mantidos a 400 K. Cada simulação individual foi executada por 100 ns, o que impediu a observação de eventos completos de desenovelamento, mas nos permitiu amostrar fragmentos parciais do processo. Portanto, empregamos modelos de Markov de estados (MSMs) para combinar as informações de todos os conjuntos e analisar seu comportamento coletivo. Os MSMs têm se mostrado inestimáveis para caracterizar a cinética, a termodinâmica e as trajetórias de processos como ligação de ligantes, enovelamento e interações proteína-proteína com precisão atômica. Calculamos MSMs para todos os nossos sistemas, o que nos permitiu obter taxas de transição aproximadas entre os estados enovelado e desenovelado (métodos e Fig. Suplementar 10). Mais especificamente, no contexto dos MSMs, definimos o tempo médio de primeira passagem (MFPT) como o tempo médio necessário para transitar de um estado para outro. Calculamos os MFPTs para nossas simulações, caracterizando assim os tempos médios necessários para que os diferentes sistemas alcancem o estado desenovelado. As escalas de tempo implícitas para os sistemas OGP, KGE e KGE na presença de concentrações salinas fisiológicas convergiram, mas não para o KGD. Assim, o KGD foi excluído de análises posteriores. Conforme indicado na Tabela 1, o peptídeo tripla-hélice com KGE se desenovela aproximadamente duas ordens de grandeza mais lentamente do que aqueles contendo hidroxiprolina ou alta concentração salina. Em resumo, tanto investigações teóricas quanto experimentais sugerem que as interações de pontes salinas aumentam a estabilidade cinética de peptídeos tripla-hélice de colágeno mais do que aquelas contendo apenas prolina e hidroxiprolina. Isso fornece uma justificativa para o motivo de a Natureza ter mantido os tripletos formadores de pontes salinas com frequência anormalmente alta em colágenos humanos. Mutações que interrompem pontes salinas estão associadas a doenças.
A mutação de aminoácidos críticos para o dobramento e função de proteínas causa doenças. Investigamos se mutações dentro ou na periferia de pontes salinas no colágeno também estão associadas a doenças. Foi demonstrado anteriormente que uma mutação Gly → Ala desenrola completamente uma região localizada 9 resíduos a montante em direção ao N-terminal. Em um estudo separado, a mutação Gly → Ser também induz dinâmicas semelhantes a monômeros desenrolados nos resíduos N-terminais. As mutações também perturbam a estrutura tripla-helicoidal no C-terminal, mas em uma extensão mais restrita do que no N-terminal. Por exemplo, a mutação Gly → Ser perturba uma ponte salina localizada dois tripletos em direção ao C-terminal, mas aquela localizada a cinco tripletos de distância apresenta uma conformação tripla-helicoidal canônica. Assim, com efeito, a mutação de uma glicina perturbaria minimamente uma ponte salina localizada a três tripletos em direção ao N-terminal ou dois tripletos na direção oposta. Referimo-nos a esta região sobre a qual uma mutação pode perturbar pontes salinas e potencialmente influenciar o dobramento e a estabilidade como a pegada da ponte salina (ver métodos). Uma pegada de ponte salina é mostrada esquematicamente na Fig. Suplementar 11A.
Para entender se mutações dentro da pegada da ponte salina estão associadas a doenças, pesquisamos nos bancos de dados Clinvar, Leiden Open Variation Database (LOVD) e Alport Syndrome Database por mutações de sentido trocado patogênicas devido a alteração de um único nucleotídeo. Identificamos um total de 2294 mutações, das quais 565 (~25%) ocorrem dentro das pegadas das pontes salinas (Tabela Suplementar 5). As pegadas das pontes salinas em sequências alinhadas e as mutações de sentido trocado patogênicas identificadas são mostradas na Fig. Suplementar 11B.
A localização mais dramática de mutações na pegada da ponte salina é observada nas cadeias α5 (38%) e α6 (52%) do colágeno tipo IV e na cadeia α1 (45%) do colágeno tipo VII. A associação da perturbação da ponte salina com mutações causadoras de doenças atesta sua função biológica. Antecipa-se que as mutações reduziriam a estabilidade cinética das triplas hélices, causando efeitos a jusante, como alteração na fibrilogênese, renovação do colágeno e transporte e secreção para a matriz extracelular, mas o mecanismo exato ainda precisa ser investigado.
Mutações de glicina na pegada da ponte salina do colágeno tipo I estão associadas a fenótipos letais.
Mutações na região tripla-hélice do colágeno tipo I causam osteogênese imperfeita (OI), também conhecida como doença dos ossos frágeis. Com base no modo de herança e nos sintomas clínicos, Sillence et al. classificaram a OI em quatro grandes categorias; OI1 apresenta fenótipo moderado, OI2 é letal causando natimorto ou morte perinatal, OI3 causa fenótipo mais grave, porém não letal, enquanto o fenótipo OI4 varia entre 1 e 3. Uma pesquisa no banco de dados LOVD sugere que 192 mutações de sentido trocado presentes no domínio tripla-hélice de col1α1 e 164 em col1α2 causam fenótipo letal (OI2) ou grave (OI3) (Dados Suplementares 4). Destas, 54 mutações na cadeia α1 (28%) e 40 mutações na cadeia α2 (24%) estão presentes dentro da pegada de ponte salina. Importante, 55% (52 de 94) das mutações na pegada de ponte salina das cadeias α1 e α2 são letais.
Anteriormente, hotspots mutacionais no colágeno tipo I que causam OI letal foram mapeados em duas regiões da sequência na cadeia α1 (resíduos 869-1001 e 1088-1142) e 8 na cadeia α2 (resíduos 409-454, 541-592, 637-670, 712-727, 784-796, 847-901, 949-997 e 1027-1084). Essas regiões letais são mostradas esquematicamente na Fig. Suplementar 12. Anteriormente, postulou-se que as regiões letais na sequência do colágeno se correlacionam com as principais regiões de ligação a ligantes do domínio tripla-hélice. Presumivelmente, as mutações interrompem a interação das fibrilas de colágeno com outras proteínas, resultando em patologia. No entanto, apenas 8 das 54 mutações letais na cadeia α1 dentro da pegada de ponte salina co-localizam com a região letal conhecida. Nossos resultados sugerem que, além das interações proteína-proteína, os efeitos moleculares de mutações que potencialmente perturbam as pontes salinas também podem ser consequentes na determinação da gravidade do fenótipo.
Ressalta-se que as mutações não são estatisticamente mais propensas a aparecer na pegada do que em outras partes das triplas hélices dos colágenos nativos. Conforme mostrado na Tabela Suplementar 5, as pegadas de pontes salinas representam ~43% de todos os tripletos que analisamos. No entanto, elas contêm apenas 33% de todas as mutações patogênicas. Contudo, gostaríamos de qualificar essa conclusão com uma ressalva importante. Uma condição prévia para tal análise estatística é que a natureza patogênica ou benigna das mutações de sentido trocado em cada posição da sequência em todos os colágenos nativos seja conhecida a priori. Isso está longe de ser alcançado. Sabemos a localização das pontes salinas e da pegada com precisão, mas não conhecemos todas as mutações, tanto dentro quanto fora da pegada, que possam contribuir para a doença. O banco de dados atual de mutações é incompleto, e mutações patogênicas em novas posições de resíduos são adicionadas à medida que são descobertas com base em sintomas clínicos. Assim, temos apenas parte da informação. Por exemplo, apenas uma mutação patogênica de sentido trocado é conhecida para os tipos de colágeno XIII e XV, ambas fora da pegada. Em contraste, 1 e 3 mutações são conhecidas nos colágenos tipo XXIV e XXV, respectivamente, todas dentro da pegada de ponte salina. Além disso, há 42 mutações patogênicas identificadas na cadeia α1 do colágeno tipo XI, mas este é um heterotrímero ABC composto por α1, α2 e α3, que não conseguimos alinhar as cadeias de forma inequívoca. Assim, não está claro para nós qual proporção das 42 mutações está dentro ou fora da pegada. Esses números mudarão à medida que mais mutações forem identificadas, assim como a análise estatística. Portanto, em nossa opinião, a interpretação do resultado das análises estatísticas neste estágio é em grande parte sem sentido.
Apesar da falta de significância estatística, a hipótese de que a ruptura da ponte salina e a consequente diminuição na estabilidade cinética poderiam explicar a gravidade fenotípica dependente da localização de colágenos naturais é intrigante. Permanecer dobrado por tempo suficiente é uma pré-condição para a função de quase todas as proteínas. Assim, mutações prejudiciais à estabilidade cinética provavelmente causam patologia. Em nosso caso, mutações que causam perda de estabilidade cinética induziriam o desdobramento local da hélice tripla. Embora pareça um evento menor, esse microdesdobramento provavelmente desencadeia uma cascata catastrófica. Ele pode tornar a hélice tripla mais suscetível à clivagem por colagenases. Também pode causar supermodificação dos resíduos de prolina e lisina pela prolil hidroxilase e pela lisil oxidase, respectivamente, alterando consideravelmente a estabilidade e a organização hierárquica subsequente em fibras, redes ou microfibrilas, bem como o reconhecimento alterado de outras proteínas. Diante disso, levantamos a hipótese de que a gravidade fenotípica de uma mutação poderia ser determinada por quão fortemente ela altera a estabilidade cinética da hélice tripla do colágeno. Atualmente, estamos investigando essa hipótese usando uma combinação de peptídeos modelo de colágeno e proteínas de colágeno mutante expressas recombinantemente.
Discussão
O colágeno é uma proteína enigmática do ponto de vista do dobramento. Diferentemente de proteínas globulares e outras proteínas com super-hélice, a hélice tripla carece de um núcleo hidrofóbico e é estabilizada principalmente por pontes de hidrogênio intercadeias formadas pelas glicinas repetitivas. Os aminoácidos nas posições Xaa e Yaa determinam vários aspectos do dobramento e da estabilidade. As cadeias α do colágeno são geralmente traduzidas com um prodomínio C-terminal globular que se autotrimeriza e direciona a montagem da estequiometria correta da hélice tripla, ao mesmo tempo que facilita a nucleação limitante da taxa. É importante ressaltar que os prodomínios são clivados antes que as hélices triplas recentemente dobradas passem por uma nova automontagem em fibras, redes e filamentos. Em um trabalho notável, Leikina et al. mostraram que o colágeno tipo I se desdobra à temperatura corporal. A implicação é que as hélices triplas nascentes têm energia livre desfavorável e começariam a se desdobrar assim que os prodomínios fossem clivados. Para explicar como a Natureza contorna esse problema de dobramento, foi proposto que a chaperona residente no RE, Hsp47, se liga a sítios únicos nas hélices triplas. Acredita-se que essa interação minimize o desdobramento local, que poderia ser um precursor do desdobramento global, e também compense o custo entrópico para a propagação passo a passo de um polipeptídeo de cerca de 1000 aminoácidos. No entanto, esse paradigma de dobramento não se concilia com a observação experimental de que a Hsp47 adicionada exogenamente não influencia significativamente nem a estabilidade nem a taxa de dobramento do colágeno tipo I in vitro. Várias outras observações bioquímicas também não são totalmente consistentes com o paradigma de dobramento assistido por Hsp47.
Primeiro, os sítios de ligação de Hsp47 estão predominantemente localizados em direção à metade N-terminal dos colágenos tipo I, II e III. Dada a propagação C- para N-terminal, a implicação é que a Hsp47 se liga a esses colágenos depois que metade da hélice tripla já se enovelou.
Segundo, a Hsp47 não reconhece os colágenos tipo XI, XIV, XXII, ou o faz apenas fracamente. Isso também é corroborado por nossa análise da distribuição de potenciais sítios de reconhecimento de Hsp47 nos 28 colágenos humanos (Figura Suplementar 13A–C). Descobrimos que colágenos tipo VIII, XIII, XIV, XV, XVIII, XIX, XXI e XXV contêm menos de 3 sítios de ligação de Hsp47, mesmo quando sítios de baixa afinidade são considerados.
Terceiro, o enovelamento chaperonado pela Hsp47 contradiz a observação experimental geral de que colágenos nativos se reenovelam espontaneamente in vitro na sua ausência.
Quarto, o papel da Hsp47 durante estágios tardios do enovelamento do colágeno, como prevenir a agregação lateral prematura de hélices triplas enoveladas, transportar hélices triplas clivadas do pró-domínio para a fronteira ER-Golgi e então classificar em grandes cargas de pró-colágeno para secreção oportuna na matriz extracelular, é bem estabelecido. As observações experimentais de que a ablação da Hsp47 não influencia a secreção de microfibrilas de colágeno tipo VI, mas apenas sua montagem lateral, apoiam esse argumento. Também descobrimos que colágenos fibrilares, que são compostos por hélices triplas montadas lateralmente, contêm a maior abundância de sítios de ligação de Hsp47 (Figura Suplementar 13D).
Finalmente, domínios proteicos semelhantes a colágeno de comprimento considerável e interrupções também são encontrados em archaea, bactérias, eucariotos (excluindo ortólogos de colágeno humano) e vírus. Até onde sabemos, atualmente não há evidências da presença de proteínas semelhantes à Hsp47 em organismos desses grupos. Assim, como os colágenos e proteínas semelhantes a colágeno nesses grupos se enovelam e depois permanecem enovelados é uma questão em aberto.
Pontes salinas ajudam proteínas globulares a evitar vias de enovelamento não produtivas ao estabilizar intermediários de enovelamento produtivos. Aqui, propomos que as pontes salinas também estabilizam a hélice tripla em propagação, na prática um intermediário de enovelamento, até que esta atinja um comprimento suficiente para contrariar a ruptura entrópica do enovelamento adicional. Esse paradigma de enovelamento é uma consequência direta da especificidade geométrica das pontes salinas e de sua capacidade de diminuir a taxa de desenrolamento das hélices triplas. Descobrimos que os 28 colágenos humanos contêm 1553 pontes salinas de lisina–aspartato/glutamato, com uma média de 50 em cada subtipo de colágeno. Também descobrimos que a interação entre os resíduos de lisina e aspartato/glutamato é geometricamente específica e que eles aumentam a estabilidade cinética de peptídeos triplo-helicoidais modelo, bem como de colágenos nativos. Das 1553 pontes salinas, 50% estão localizadas no quarto C-terminal dos domínios triplo-helicoidais. Essa concentração altamente desproporcional no quarto C-terminal, juntamente com sua capacidade de aumentar a estabilidade cinética, sugere que as pontes salinas atuam como grampos eletrostáticos para prevenir o desenrolamento local e, no processo, permitir que as hélices triplas atinjam um comprimento crítico a partir do qual o restante da propagação pode ocorrer. Nossa observação de que colágenos com domínios triplo-helicoidais mais longos ou com um número maior de interrupções não colagenosas estrutural e energeticamente disruptivas também possuem mais pontes salinas corrobora ainda mais essa hipótese. Além disso, a observação de que as interrupções são predominantemente flanqueadas por múltiplas pontes salinas próximas, que denominamos nós de pontes salinas, adiciona ainda mais peso a ela.
Experimentos de DC e DSC sugerem que o aumento da estabilidade cinética é resultado de uma barreira cinética elevada ao desenrolamento. Importante, essa barreira cinética é menor para as hélices triplas contendo apenas prolina e hidroxiprolina do que para aquelas contendo pontes salinas. Essas descobertas esclarecem a observação contraintuitiva de que o colágeno tipo I é termodinamicamente instável, apesar da abundância de trigêmeos OGP. Ao elevar a barreira cinética, as pontes salinas atrasam o desenrolamento do colágeno, permitindo tempo suficiente para que a auto-organização hierárquica em estruturas de ordem superior ocorra. Essa organização pode contribuir para uma força de empacotamento que impediria ainda mais o desenrolamento. Isso fornece uma justificativa para o fato de que os trigêmeos KGE e KGD são anomalamente frequentes, apesar de uma contribuição de estabilidade térmica comparável à do OGP.
Também consideramos se os tripletos contendo lisina poderiam ser anomalamente frequentes por razões que não o dobramento. Resíduos carregados individuais são fundamentais para a montagem de moléculas de colágeno em fibrilas, bem como para o reconhecimento de outras proteínas. Por exemplo, a oxidação da lisina em hidroxilisina é necessária para a reticulação inter-tripla-hélice das fibras. Embora as sequências de colágeno sejam muito ricas em lisinas, apenas uma pequena fração delas faz parte do tripleto KGE e KGD. Por exemplo, a cadeia α1 do colágeno tipo I contém 37 lisinas, das quais apenas 7 fazem parte de um tripleto KGE ou KGD. As 24 restantes estão disponíveis para reticulação das fibrilas de colágeno. Diante disso, podemos especular que a probabilidade de as lisinas em tripletos KGE e KGD estarem envolvidas na reticulação do colágeno e de serem retidas pela Natureza por esse motivo é pequena. Da mesma forma, os sítios de ligação ao colágeno frequentemente contêm resíduos de lisina, aspartato ou glutamato (em particular nos motivos de reconhecimento de integrina GxxGEx). No entanto, até onde sabemos, nenhum motivo de ligação contendo tripletos KGE/KGD foi identificado. A prevalência de lisina e aspartato/glutamato próximos no espaço sequencial, como em KGE ou KGD, é o que impulsiona a formação de muitas pontes salinas em colágenos humanos. Assim, especulamos que existe uma pressão evolutiva para reter motivos KGE ou KGD por razões de dobramento, em vez de para sítios de reticulação ou reconhecimento de proteínas.
Também consideramos se o tripleto OGP, também encontrado em frequência anômala em colágenos humanos, poderia fazer parte do código de dobramento. No entanto, vários argumentos sugerem o contrário.
Primeiro, os tripletos KGE e KGD guiam o dobramento devido à sua capacidade de formar pontes salinas intercadeias. As cadeias laterais de OGP não possuem essa capacidade. Os resíduos de prolina e hidroxiprolina pré-organizam a cadeia principal e estes últimos também formam ligações de hidrogênio mediadas por água, mas não se envolvem em interações intercadeias específicas. A interação de ponte salina também é restrita tanto pela sequência quanto pela geometria. Essa especificidade de interação em relação à sequência e geometria é a base subjacente do código ao qual nos referimos no manuscrito.
Segundo, as pontes salinas reduzem a taxa na qual as triplas hélices se desenrolam. Embora o OGP também reduza a taxa de desenrolamento, a energia de ativação para o desenrolamento de triplas hélices contendo OGP é significativamente menor do que aquelas contendo pontes salinas (Tabela 1). Isso se reflete na meia-vida 2 vezes menor do OGP em comparação com as triplas hélices contendo KGE/KGD. Acreditamos que uma razão chave para a menor estabilidade cinética conferida pelos tripletos OGP é a falta de interações intercadeias estabilizadoras que possam dificultar o desenrolamento.
Terceiro, os tripletos OGP não são anormalmente frequentes na região ao redor das interrupções. Em contraste, o aumento da estabilidade cinética e a especificidade da interação são as principais razões pelas quais as pontes salinas mediadas por KGE e KGD também podem compensar os efeitos deletérios das interrupções. Isso também é corroborado pela forte correlação positiva observada entre o número de interrupções e o número de pontes salinas. Notavelmente, existe apenas uma correlação fraca entre as interrupções e o número de tripletos OGP.
Finalmente, os tripletos OGP são sítios de ligação para o receptor Glicoproteína (GP) VI, um receptor chave para a ativação e agregação de plaquetas, bem como para o receptor inibitório de lise celular, receptor-1 tipo imunoglobulina associado a leucócitos. Como resultado, é difícil avaliar se a prevalência e localização observadas dos tripletos OGP no colágeno humano se devem às suas contribuições para o dobramento/estabilidade da tripla hélice, ao seu papel biológico no desencadeamento da ativação plaquetária, à prevenção da lise quando a célula é identificada como própria, ou a todas essas funções.
Como resultado, embora o OGP seja crucial para a estabilidade da tripla hélice de colágeno, não podemos distinguir entre seus diferentes papéis e, portanto, não podemos tirar conclusões com base em sua localização específica dentro da tripla hélice. Isso é contrário aos tripletos KGE/KGD, que raramente aparecem em sítios de ligação de proteínas.
O mecanismo de dobramento assistido por pontes salinas elimina a necessidade de uma chaperona durante a fase de propagação da tripla hélice. Esse paradigma de dobramento provavelmente também explica como proteínas semelhantes ao colágeno de archaea, bactérias, eucariotos e vírus, com seus domínios de tripla hélice extremamente longos e muitas interrupções, conseguem se dobrar com sucesso e permanecer dobradas. A implicação mais ampla é que a evolução convergiu para um mecanismo similar para estabilizar triplas hélices, tornando KGD o único tripleto com frequência anormalmente alta nos três domínios da vida, bem como nos vírus. Atestando a função genômica das pontes salinas, Mohs et al. demonstraram que o domínio semelhante ao colágeno da proteína bacteriana Scl2 da superfície celular de Streptococcus pyogenes não contém nenhuma hidroxiprolina e que é estabilizado por pontes salinas. Isso é deduzido a partir de uma comparação da temperatura de fusão e da elipticidade molar residual do Scl2 recombinante em pH 7 e pH 2,2. Da mesma forma, Ghosh et al. mostraram que a proteína EPclA da cepa patogênica de Escherichia coli entero-hemorrágica O157:H7 é termicamente mais estável (Tm = 42 °C) do que o colágeno de mamíferos, apesar de seu comprimento de sequência muito menor. A EPclA não possui prolina hidroxilada. Sua notável estabilidade é atribuída a uma abundância de prolina na posição Xaa, bem como aos aproximadamente 22% de resíduos eletrostaticamente carregados encontrados nas sequências. Nossa análise revelou que os tripletos contendo treonina também são anormalmente frequentes em archaea, bactérias e vírus, mas os domínios semelhantes ao colágeno tanto em Scl2 quanto em EPclA não contêm uma abundância de tripletos contendo treonina. Assim, essas proteínas semelhantes ao colágeno parecem ser estabilizadas por prolina ou interações eletrostáticas, ou uma combinação de ambas.
O tripleto TGP, anomalamente frequente em vírus, foi previamente incorporado em um peptídeo de colágeno. Esse peptídeo Ac-(Gly-Pro-Thr)10-NH2 é um enrolamento aleatório em solução, mas a glicosilação de todos os dez resíduos de treonina com beta-D-galactose torna o peptídeo tripla-helicoidal. Isso sugere que a glicosilação da treonina é um mecanismo estabilizador alternativo à hidroxilação das prolina. Organismos de todos os táxons possuem a capacidade de glicosilar a treonina. Se essa glicosilação ocorre no polipeptídeo desenovelado ou nas triplas hélices completamente enoveladas é atualmente desconhecido, até onde sabemos. Claramente, isso determinará o grau em que os tripletos TGP contribuem para o enovelamento e requerem investigação experimental adicional.
Também notamos que o tripleto QGP é anomalamente frequente em arqueias. Uma classe de enzimas chamada Transglutaminase Tecidual (tTG) demonstrou desamidar a glutamina em um tripleto QGP no colágeno tipo II para ácido glutâmico e facilitar a reticulação inter-tripla-hélice via ligação imina. Transglutaminases homólogas também foram identificadas em arqueias. Se as transglutaminases em arqueias modificam pós-traducionalmente as glutaminas nos tripletos QGP ou não, permanece a ser investigado.
Nossos resultados sobre o papel das pontes salinas têm consequências importantes adicionais para o enovelamento do colágeno. As três polipeptídeos de uma tripla hélice de colágeno são deslocadas em um aminoácido uma em relação à outra para otimizar as ligações de hidrogênio intercadeias e o empacotamento de van der Waals. Dada a enorme extensão dos domínios de tripla hélice e a diversidade de interrupções, deslocamentos incorretos de mais de um aminoácido são plausíveis. Como os colágenos evitam tais estados mal enovelados atualmente não é compreendido. Nossa observação de que o deslocamento incorreto das cadeias α reduz o número de pontes salinas em média 50% em todos os subtipos de colágeno sugere um mecanismo de como os colágenos podem garantir o deslocamento correto. De forma mais reveladora, descobrimos que mutações de resíduos de glicina dentro ou na periferia de uma ponte salina estão associadas a doenças hereditárias em vários tipos de colágeno, enquanto tais mutações no colágeno tipo I frequentemente resultam em fenótipo letal. Anteriormente, esforços para racionalizar por que a mutação de alguns resíduos de glicina no colágeno tipo I causa um fenótipo mais grave do que outros, usando a perda de estabilidade térmica, mostraram uma correlação fraca. Podemos extrapolar de nossos resultados que a gravidade fenotípica provavelmente está correlacionada com a perda de estabilidade cinética, e não termodinâmica. A consequência estrutural da mutação em uma região de ponte salina, como ela afeta a cinética de enovelamento, a estabilidade, a fibrilogênese e, em última análise, o transporte para a matriz extracelular, e por que ela resulta esmagadoramente em fenótipo letal não está clara para nós. No entanto, essas questões ganham significado à luz de nossa observação de que mutações em pontes salinas geralmente resultam em fenótipos letais a graves, mesmo quando presentes fora das regiões letais mencionadas anteriormente. Dado o efeito das pontes salinas na estabilidade cinética do colágeno, conforme demonstrado aqui, um estudo sistemático para explorar a correlação entre a perda de estabilidade cinética e a gravidade fenotípica devido a uma mutação é desejável no futuro.
Métodos
O banco de dados UniProtKB foi consultado em 16.03.2023 para proteínas contendo sequências de colágeno ou semelhantes a colágeno, aplicando filtros taxonômicos (archaea, bacteria, eukarya ou vírus) enquanto filtrava por sequências anotadas pelo InterPro como contendo repetições tripla-hélice de colágeno (ipr008160). Os termos de busca utilizados foram “(taxonomy_id:2759) AND (xref:interpro-ipr008160)” para eucariotos, “(taxonomy_id: 10239) AND (xref:interpro-ipr008160)” para vírus, “(taxonomy_id:2157) AND (xref:interpro-ipr008160)” para arqueias, “(taxonomy_id:2) AND (xref:interpro-ipr008160)” para eubactérias. As 44 cadeias α das sequências de colágeno humano também foram obtidas do UniProtKB aplicando o filtro taxonômico 9606 e pesquisando nomes de genes como COL1A1, COL2A1, etc. Um total de 59226 sequências de colágeno foram baixadas do UniProtKB, as quais foram divididas em conjuntos de dados menores com base no filo de onde foram recuperadas. CD-HIT, um algoritmo de agrupamento para produzir um conjunto de dados não redundante, foi usado para agrupar esses domínios de colágeno de cada táxon. As sequências foram agrupadas a 70% de identidade para remover a maioria das proteínas com alta similaridade de sequência e reter diversidade suficiente. Após a remoção de sequências duplicadas, os domínios de colágeno ou semelhantes a colágeno nos arquivos FASTA específicos de cada táxon foram identificados buscando repetições contíguas de 6 ou mais trincas Yaa-Gly-Xaa. Dados os 20 aminoácidos canônicos e excluindo a Glicina nas posições Xaa e Yaa, um total de 361 combinações de pares de resíduos são teoricamente possíveis na trinca Yaa-Gly-Xaa. O número de cada uma das 361 trincas Yaa-Gly-Xaa possíveis em cada colagenoma foi contado e sua abundância relativa foi determinada usando a Eq. 1 abaixo.
A distribuição prevista das trincas foi calculada com base no modelo estatístico descrito anteriormente. Contamos as ocorrências observadas das diferentes trincas e calculamos os Z-scores a partir da diferença numérica entre a contagem observada e a prevista das trincas usando a função de Z-score no pacote R. Motivos com Z-scores maiores que 3 foram considerados outliers e, portanto, anormalmente frequentes.
Interrupções nos domínios de colágeno humano e nas proteínas semelhantes a colágeno em arqueias, bactérias, eucariotos e vírus foram identificadas essencialmente como descrito anteriormente. Resumidamente, as interrupções foram definidas por seu comprimento de sequência. Por exemplo, uma deleção do resíduo Xaa ou Yaa de uma trinca Yaa-Gly-Xaa foi denotada como G1G; uma deleção de ambos Xaa e Yaa foi denotada G0G; uma inserção de n resíduos, onde 3 ≤ n ≤ 15, foi denotada GnG. Além disso, motivos onde a glicina ocupa a posição Xaa ou Yaa foram identificados como interrupções G2G. Esses motivos foram extraídos dos arquivos FASTA humanos e específicos de cada táxon contendo os domínios de colágeno e semelhantes a colágeno, juntamente com 7 aminoácidos nas extremidades N- e C-, para obter as sequências das interrupções juntamente com as trincas flanqueadoras P1-P4. Sequências duplicadas ou redundantes foram removidas, mantendo apenas interrupções únicas.
Os aminoácidos em ambos os lados das interrupções contêm um total de quatro tripletos Yaa-Gly-Xaa denominados aqui como P1 a P4, começando a partir dos N-terminais. No caso de interrupções G0G, a inspeção manual revelou falsos positivos ao permitir mais de uma glicina na posição X ou Y dos tripletos P1 a P4. Para contornar isso, permitimos apenas uma glicina na posição X ou Y, que poderia estar na posição P1, P2, P3 ou P4. Os escores Z para a frequência de tripletos ao redor das interrupções foram calculados conforme descrito no caso da análise de domínios triplo-helicoidais ininterruptos. Uma lista de interrupções específicas de táxons é fornecida no arquivo Dados Suplementares 2.
Determinação do alinhamento das cadeias de colágenos nativos
Apesar dos avanços estupendos em tecnologia, obter a estrutura molecular de colágenos naturais tem se mostrado incrivelmente difícil devido à sua arquitetura hierárquica altamente complexa e à tendência de formar agregados insolúveis após extração de tecidos nativos. Assim, o alinhamento dos colágenos não pode ser verificado experimentalmente. Consequentemente, a noção atual do alinhamento correto em colágenos nativos é uma conjectura. No entanto, no caso de alguns dos colágenos mais amplamente estudados, como os tipos I, II, III, IV VI e IX, essa conjectura é informada por considerações baseadas em sequência e experimentais. Abaixo, discutimos essas considerações para os subtipos de colágeno mencionados anteriormente. No caso dos colágenos restantes, nos baseamos na otimização do domínio triplo-helicoidal como critério para obter o alinhamento. Também discutimos isso brevemente abaixo e apresentamos em formato tabular na Tabela Suplementar 2.
Colágeno tipo I
O alinhamento do colágeno tipo I foi previamente deduzido pela investigação da interação de um epítopo dentro dele com outras proteínas. Resumidamente, o epítopo só conseguia reconhecer as proteínas (domínio A3 do fator de von Willebrand e receptor de domínio discoidina 1 e 2) se apresentado no alinhamento correto. Os autores projetaram vários alinhamentos, dos quais apenas um reconheceu todas as três proteínas com a maior afinidade. Os autores presumiram que este alinhamento é o correto para o colágeno tipo I.
Colágenos tipo II e III
Semelhante ao colágeno tipo I, o alinhamento dos colágenos tipo II e III também foi deduzido a partir de uma consideração do alinhamento de epítopos necessário para reconhecer os receptores de adesão celular integrinas α1β1 e α2β1, bem como os receptores de domínio discoidina 1 e 2.
Colágeno tipo IV
O alinhamento do colágeno tipo IV [(α1)2α2 heterotrímero] foi deduzido a partir da interação de um epítopo com a integrina α1β1. Este alinhamento também foi deduzido por Hohenester et al. através da análise de supostos sítios de ligação da osteonectina no heterotrímero (α1)2α2 do colágeno tipo IV. Este alinhamento foi adicionalmente confirmado por Parkin et al., que também foi a base para alinhar os heterotrímeros (α5)2α6 e α3α4α5 do colágeno tipo IV.
Colágeno tipo VI
O alinhamento do heterotrímero α3α2α1 do colágeno tipo VI foi deduzido por Ball et al. com base em um epítopo proposto para interagir com a integrina α2β1. O alinhamento dos heterotrímeros α5α2α1 e α6α2α1 restantes foi baseado na otimização do domínio tripla hélice.
Colágeno tipo IX
Aqui, baseamo-nos no alinhamento proposto por Käpylä et al. com base na interação do colágeno tipo IX com os domínios αI das integrinas α1β1, α2β1, α11β1 e α10β1. O colágeno tipo IX também contém quatro domínios não colagenosos (NC1-NC4) intercalados entre os domínios de colágeno. Boudko et al. apresentaram um alinhamento desses domínios NC com base na localização dos nós de cisteína nos domínios NC1, NC2 e NC3. Isso confirmou ainda mais o alinhamento que usamos para nossa análise.
Tipos de colágeno restantes
O alinhamento de todos os subtipos de colágeno restantes foi deduzido garantindo que os tripletos Yaa-Gly-Xaa disponíveis nas três cadeias formassem o domínio tripla hélice mais longo. Deve-se notar que todos os tipos de colágeno alinhados dessa maneira são homotriméricos. Assim, quaisquer interrupções presentes dentro do domínio tripla hélice são proporcionais, conforme definido anteriormente por Bella et al.. Consequentemente, o alinhamento das cadeias conforme mostrado na Fig. Suplementar 1 não contém lacunas, e o alinhamento antes e depois das interrupções permanece inalterado.
Como observado anteriormente, a estrutura molecular dos colágenos nativos é difícil de obter devido à sua natureza altamente complexa e hierárquica e à flexibilidade conformacional. Consequentemente, essas conjecturas são talvez o melhor que podemos fazer até que novos avanços em técnicas estruturais experimentais revelem a estrutura molecular e o alinhamento correto dos polipeptídeos nos colágenos nativos. Deve-se também notar que os alinhamentos das cadeias alfa do colágeno são diferentes dos alinhamentos múltiplos de sequências (MSAs) convencionais. Aqui, eles denotam o alinhamento de três cadeias ao longo do eixo principal da tripla hélice. Da mesma forma, lacunas na sequência de alinhamentos tripla hélice, denotadas por travessão, também têm um significado diferente. Em um MSA típico, as lacunas representam inserções ou deleções entre sequências relacionadas. No entanto, os travessões aqui representam incomensurabilidade, conforme definido anteriormente por Bella et al., e não devem ser interpretados como lacunas no sentido tradicional.
Em alguns casos de triplas hélices heterotriméricas mostradas na Fig. Suplementar 1, todas as três cadeias podem ou não apresentar interrupções. Além disso, o comprimento das interrupções também pode diferir entre as três cadeias. Isso causa mudanças no deslocamento antes e depois da interrupção e é chamado de incomensurável. Para compensar essa incomensuração, são introduzidas lacunas de modo que as três cadeias de cada lado sejam deslocadas por um aminoácido uma em relação à outra. As consequências estruturais de interrupções incomensuráveis atualmente não são compreendidas, pois estruturas cristalinas de triplas hélices de colágeno contendo tais interrupções não estão disponíveis. No entanto, foi proposto anteriormente que tais interrupções introduzem uma dobra na tripla hélice. Especulamos que as interrupções dentro da dobra provavelmente adotam conformações de alça semiestruturadas, permitindo que o registro em ambos os lados prossiga no deslocamento canônico de um resíduo. No entanto, isso requer investigação experimental adicional.
Determinação da pegada da ponte salina
Conforme observado no texto principal, a mutação da glicina pode potencialmente interromper pontes salinas localizadas até três tripletos em direção ao N-terminal e até dois tripletos em direção ao C-terminal. Essa região é denominada pegada da ponte salina (Fig. Suplementar 11). Como a mutação dos próprios resíduos de lisina e aspartato/glutamato pode obviamente interromper uma ponte salina, esses resíduos também são considerados parte da pegada. Conforme observado anteriormente, a i-ésima lisina das cadeias líder e média forma uma ponte salina com o i+2 aspartato/glutamato das cadeias média e traseira, respectivamente. No entanto, a i-ésima lisina das cadeias traseiras emparelha com o i+5 aspartato/glutamato da cadeia líder. Como consequência, a pegada para a ponte salina de i para i+5 é mais longa do que a de i para i+2.
Síntese de peptídeos
Os peptídeos Ac-(GPO)3GPKGEO(GPO)3-NH2 (KGE), Ac-(GPO)3GPKGDO(GPO)3-NH2 (KGD) e Ac-(GPO)8-NH2 (OGP) foram sintetizados em resina TentaGel Rink Amide MBHA em uma escala de 0,1 mmol usando química de síntese de peptídeos em fase sólida padrão baseada em Fmoc em um sintetizador de peptídeos por micro-ondas CEM. Os peptídeos foram acetilados na extremidade N-terminal e amidados na extremidade C-terminal e clivados da resina usando uma mistura volumétrica de 95:2,5:2,5 de ácido trifluoroacético (TFA), triisopropilsilano e miliQ-H2O. Os peptídeos clivados foram precipitados da solução de TFA usando éter dietílico gelado em gelo seco, filtrados a vácuo, redissolvidos em água:acetonitrila 95:5 (0,1% TFA), liofilizados e armazenados a −20 °C. Os peptídeos clivados foram purificados por HPLC de fase reversa usando um gradiente de acetonitrila em água com 0,1% TFA. Múltiplas frações correspondentes ao pico de eluição principal foram coletadas e analisadas por espectrometria de massa por ionização e dessorção a laser assistida por matriz. As frações contendo o peptídeo desejado foram agrupadas, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e liofilizadas para obter peptídeos puros usados em todos os experimentos posteriores.
Determinação das taxas de desenovelamento via Dicroísmo Circular
O desenovelamento de peptídeos foi determinado para investigar o efeito das interações eletrostáticas em sua estabilidade cinética. Peptídeos OGP, KGE ou KGD em pH 2,5 (HCl aquoso) ou 7,0 (tampão fosfato de sódio 10 mM) a uma concentração total de peptídeo de 0,4 mg/ml foram equilibrados em um Eppendorf Thermomixer a 37 °C e o máximo de CD característico das hélices poliprolina tipo II a 225 nm foi monitorado em função do tempo até que pelo menos 80% do sinal inicial tivesse decaído. Para medir os espectros, as soluções de peptídeo foram transferidas para uma cubeta de quartzo (caminho óptico = 1 mm) pré-equilibrada a 37 °C por meio de um controlador de temperatura Peltier acoplado a um espectropolarímetro de CD Jasco-815 e os espectros de CD registrados com um passo de dados de 5 s e tempo de resposta de 4 s em intervalos predeterminados. O tempo médio morto entre a transferência das soluções para a cubeta e o registro dos espectros foi de 3 s. Todos os espectros foram registrados três vezes com três amostras independentes preparadas a partir de uma solução estoque comum. A elipticidade das soluções de peptídeo foi plotada em função do comprimento de onda sem processamento adicional dos dados.
As taxas de desenovelamento foram medidas a 37 °C para corresponder à condição experimental para monitorar o desenovelamento de colágenos nativos descrito posteriormente. Soluções de peptídeo a 0,4 mg/ml em pH 2,5 ou 7,0 foram incubadas a 37 °C em um Eppendorf Thermomixer e a mudança no sinal de CD a 225 nm foi monitorada em função do tempo. Para cada ponto de dados, o sinal a 225 nm foi calculado como média por 2 min. As amostras foram armazenadas a 37 °C em um tubo Eppendorf entre as medições. Os espectros de desenovelamento foram registrados três vezes com amostras preparadas independentemente a partir de uma solução estoque comum. Os dados brutos das amostras foram ajustados a um modelo de decaimento monoexponencial no GraphPad Prism de acordo com a Eq. 2 abaixo e os dados normalizados usando a Eq. 3.
Para entender como as interações eletrostáticas influenciam a estabilidade cinética dos colágenos nativos, monitoramos a cinética de desenovelamento dos colágenos nativos tipo II (cartilagem traqueal bovina; Sigma-Aldrich C1188), tipo IV (placenta humana; Sigma-Aldrich C5533) e tipo V (placenta humana; Sigma-Aldrich C3657) em tampão aquoso a pH 7,4 (fosfato de sódio 200 mM, pH 7,4 contendo glicerol 0,5 M para prevenir fibrilogênese) e HCl aquoso a pH 2,5. 1 mg de cada colágeno foi suspenso em 1 ml de tampão neutro ou de baixo pH pré-resfriado em banho de gelo e vortexado por 10 min. Após agitação orbital durante a noite em câmara fria, as suspensões foram centrifugadas a 2200 g por 10 min a 5 °C e os sobrenadantes foram utilizados para experimentos posteriores. Em um experimento cinético típico, as amostras de colágeno nativo armazenadas a 5 °C foram equilibradas a 37 °C por 10 min em um Eppendorf Thermomixer e, em seguida, transferidas para uma cubeta de quartzo (caminho óptico = 1 mm) também mantida a 37 °C no espectropolarímetro. As condições experimentais restantes para aquisição de dados foram idênticas às utilizadas para os peptídeos tripla-hélice de colágeno.
Determinação da energia de ativação por DSC
Medidas de Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) foram coletadas em um VP-Capillary DSC (Malvern Panalytical). As amostras foram analisadas a 0,4 mg/mL em tampão fosfato de sódio 10 mM pH 7,0, variando a taxa de varredura de 0,5 °C/min a 3 °C/min. Para experimentos de determinação do efeito do sal na estabilidade cinética, o desenovelamento térmico foi medido em tampão fosfato de sódio 10 mM pH 7,0 e NaCl 154 mM. Todas as varreduras foram coletadas após diálise exaustiva e desgaseificação do tampão. Em todos os casos, a equilibração adequada do instrumento foi alcançada executando-se pelo menos 2 varreduras tampão-tampão antes dos experimentos amostra-tampão. A última varredura tampão-tampão foi então utilizada para subtrair o sinal de cada varredura peptídeo-tampão para realizar toda a análise termodinâmica.
As transições calorimétricas foram adequadamente descritas pelo modelo cinético de dois estados (N → F), onde N é o peptídeo nativo e F é o estado final. A conversão cinética de N para F é descrita por uma constante de velocidade de primeira ordem (k) que varia com a temperatura de acordo com a equação de Arrhenius (Eq. 4):onde T* é a temperatura na qual a constante cinética k = 1 min−1 e Eact é a energia de ativação entre o estado nativo e o estado de transição que descrevem o processo de desenovelamento. Aqui, Eact foi utilizado para comparar a estabilidade cinética entre os peptídeos. Em seguida, a capacidade calorífica aparente que descreve a endoterma é dada por (Eq. 5):onde T é a temperatura e ∆H é a entalpia de desenovelamento. A Eact também foi obtida a partir da inclinação dos gráficos de Arrhenius, ou seja, ln k vs. 1/T, conforme descrito anteriormente. Os dados e ajustes associados são apresentados nos Dados Suplementares 5.
Determinação dos tempos de desenovelamento por simulações de DM
Os sistemas de simulação foram preparados utilizando as estruturas de raios-X como modelos proteicos (códigos PDB 3T4F e 3U29 para KGE e KGD, respectivamente). As moléculas foram modeladas com 15 resíduos, sendo quatro resíduos na extremidade N-terminal antes do tripleto e oito após (Fig. Suplementar 10). Os sistemas foram solvatados e íons foram adicionados para neutralização, exceto para o sistema KGE, que foi modelado em alta concentração (150 mM de NaCl). Os sistemas foram produzidos em todos os casos utilizando o software HTMD e continham aproximadamente 34.000 átomos, dos quais 33.500 correspondiam a moléculas de água. Todos os sistemas foram minimizados, equilibrados e executados utilizando ACEMD e amberff14SB como campo de força a 400 K, com o modelo de água TIP3P a 400 K para uma réplica durante 2 ns. Para a produção de DM, executamos um esquema de amostragem adaptativa inteligente que realiza as simulações em épocas sucessivas, analisando-as com modelos de estado de Markov (MSMs), começando com 10 geradores para a primeira época. As simulações foram executadas com um integrador multiestado utilizando um passo de tempo de 4 fs em um conjunto NVT, usando o termostato de Langevin. As simulações foram executadas utilizando o método Particle Mesh Ewald com um cutoff de 9 Å para as interações de van der Waals e interações eletrostáticas no espaço real. A métrica utilizada durante as execuções adaptativas para a análise do MSM foram os átomos de carbono alfa da proteína. A análise foi realizada com o software HTMD. O esquema adaptativo foi executado em todos os casos até que amostragem suficiente fosse detectada. Em particular, 29%, 26% e 19% das trajetórias haviam visitado o estado desenovelado obtido nas análises de MSMs para KGE, GPO e KGE-íons, respectivamente. Uma tabela resumo está incluída nas informações de suporte detalhando os aspectos mencionados das simulações de DM (Tabela Suplementar 6).
Análise de modelagem de estado de Markov
A modelagem de estados de Markov procede da discretização do espaço conformacional e da descrição da dinâmica do sistema de estudo como uma sequência de transições entre os clusters discretizados. Um MSM adequadamente discretizado mostra escalas de tempo convergentes com alta probabilidade de transição entre estados cineticamente semelhantes, e uma probabilidade menor entre estados cineticamente separados. A partir deste modelo, as vias e taxas cinéticas entre conformações distintas podem ser derivadas. Aqui, executamos 2104, 1486, 1990 e 2014 simulações de 100 ns cada para os sistemas KGD, KGE, GPO e KGE + íons, respectivamente. As trajetórias foram projetadas usando distâncias euclidianas entre todos os átomos de carbono alfa como métrica. Projetamos os dados multidimensionais em seus parâmetros de ordem lenta usando TICA (análise de componentes independentes com defasagem temporal). Projetamos os dados no número mínimo de dimensões TICA que forneceram uma escala de tempo implícita convergida, em particular, usamos 2, 1, 1 e 3 dimensões TICA, respectivamente. 1000 clusters foram calculados usando o algoritmo mini-batch k-means em todos os casos. Os clusters foram agrupados em 2 macroestados pelo algoritmo PCCA, usando um tempo de lag de 40 ns em todos os casos. As cinéticas de primeira ordem são derivadas dos tempos médios de primeiro passagem (MFPT). Essas análises foram realizadas com HTMD. Estimamos os erros para os tempos de desenovelamento usando uma técnica de bootstrap. Para isso, realizamos 10 execuções independentes nas quais 20% das trajetórias foram eliminadas aleatoriamente e um novo MSM foi construído após o reagrupamento.
Resumo do relatório
Mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Nature Portfolio Reporting Summary vinculado a este artigo.
Informações suplementares
Dados de origem
Nota do editor A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Estes autores contribuíram igualmente: Noelia Ferruz, Sergio Romero-Romero.
Informações suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41467-024-54046-y.
Contribuições dos autores
A.A.J. e J.D.M. conceberam o projeto e desenvolveram a proposta experimental. A.A.J. realizou a análise de sequências, fez deduções baseadas nestas, produziu as figuras, realizou experimentos de CD e também escreveu o manuscrito, S.R.R. realizou experimentos de D.S.C. e a análise de dados relacionada, N.F. realizou as simulações de MD e analisou os dados, S.D. agrupou as sequências de colágeno usando CD-HIT, V.S. realizou os experimentos de desenovelamento cinético por CD dos peptídeos.
Revisão por pares
Informações de revisão por pares
A Nature Communications agradece a Debora Monego, George Pantelopulos, Fei Xu e outro(s) revisor(es) anônimo(s) por sua contribuição à revisão por pares deste trabalho. Um arquivo de revisão por pares está disponível.
Disponibilidade de dados
Os conjuntos de dados, incluindo a lista de domínios semelhantes ao colágeno específicos para táxons, a lista de interrupções, os dados associados aos experimentos de DSC e CD e a análise estatística são fornecidos como dados suplementares neste artigo. O conjunto de dados associado às simulações de dinâmica molecular, incluindo as trajetórias, está disponível mediante solicitação ao autor correspondente. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de Dados de Origem neste artigo.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não ter interesses concorrentes.
Referências
A família do colágeno
Estrutura cristalina e molecular de um peptídeo semelhante ao colágeno com resolução de 1,9 Å
Enovelamento e mau enovelamento da hélice tripla de colágeno: análise de Markov de simulações de dinâmica molecular
A desestabilização de peptídeos modelo semelhantes ao colágeno da osteogênese imperfeita se correlaciona com a identidade do resíduo que substitui a glicina
Colágenos e doenças relacionadas ao colágeno
O enovelamento tipo zíper das hélices triplas de colágeno e os efeitos de mutações que interrompem o zíper
Uma interrupção natural exibe maior estabilidade global e flexibilidade conformacional local do que uma sequência de mutação gly semelhante em peptídeos miméticos de colágeno
Proteínas associadas à superfície celular que se ligam ao colágeno tipo IV nativo ou à gelatina
Identificação por RMN e mutacional do sítio de ligação ao colágeno da Chaperona Hsp47
Base molecular para a ação da chaperona específica de colágeno Hsp47/SERPINH1 e seu reconhecimento de cliente específico de estrutura
Reconhecimento específico da hélice tripla de colágeno pela chaperona HSP47: II. O motivo estrutural de ligação à HSP47 em colágenos e proteínas relacionadas
Novas funções específicas da HSP47 na chaperonagem da subfamília do colágeno
Design racional de uma hélice tripla de colágeno não canônica com 'extremidades adesivas'
Linden, T. A. & King, N. Distribuição generalizada de colágenos e domínios associados ao colágeno em eucariotos. bioRxiv 2021.10.08.463732 (2021).
Insights atuais sobre as diversas estruturas e funções em proteínas bacterianas semelhantes ao colágeno
Identificação e análise baseada em genoma de motivos estruturais relacionados ao colágeno em proteínas bacterianas e virais
A proteína semelhante ao colágeno gp12 é um ligante reversível dependente de temperatura dos capsídeos virais SPP1
Ghosh, N. et al. Proteínas semelhantes ao colágeno em cepas patogênicas de E. coli. PLoS One7, (2012).
As proteínas Scl1 e Scl2 estreptocócicas formam hélices triplas semelhantes ao colágeno
Identificação do sítio de ligação da HSP47 no colágeno nativo e suas implicações para o desenvolvimento de inibidores da HSP47
Interações eletrostáticas envolvendo lisina contribuem majoritariamente para a estabilidade da hélice tripla de colágeno
Efeitos conformacionais de interrupções Gly-X-Gly na hélice tripla de colágeno
Características conformacionais de uma quebra natural na repetição Gly-X-Y do colágeno tipo IV
Um primeiro censo das interrupções do colágeno: as gagueiras e hesitações do próprio colágeno
Propensões de aminoácidos para a hélice tripla de colágeno
Insights estruturais sobre interações de pares de carga em proteínas de hélice tripla semelhantes ao colágeno
Cadeias laterais de oligossacarídeos inéditas da região semelhante ao colágeno de BclA, a principal glicoproteína do exospório do Bacillus anthracis
Treonina glicosilada, mas não 4-hidroxiprolina, domina as posições estabilizadoras da tripla hélice na sequência do colágeno da cutícula de um verme de fonte hidrotermal
Conformação única em uma sequência de interrupção natural do colágeno Tipo XIX revelada por sua estrutura cristalina de alta resolução
Atraso no enovelamento e perturbações estruturais causadas por interrupções naturais do colágeno tipo IV e mutações missense próximas de Gly
DiChiara, A. S. et al. Um código molecular baseado em cisteína informa a montagem do C-própeptídeo do colágeno. Nat. Commun. 9, (2018).
Pontes salinas complexas em proteínas: Análise estatística de estrutura e função
Estabilização cooperativa da hélice por pontes salinas complexas de Arg-Glu
Cooperatividade de pontes salinas complexas
Pontes salinas desestabilizam um zíper de leucina projetado para pareamento iônico maximizado entre hélices
As pontes salinas estabilizam proteínas? Uma análise eletrostática contínua
Estabilidade de pontes salinas em proteínas monoméricas
Pontes salinas: Interações geometricamente específicas e passíveis de design
Ácidos carboxílicos sin vs anti em peptídeos híbridos: análise experimental e teórica da densidade de carga e ligação química
O papel das interações iônicas entre cadeias para a estabilidade de peptídeos modelo de colágeno
Triplas hélices de colágeno heterotriméricas automontadas direcionadas por interações eletrostáticas
A contribuição das pontes salinas intercadeias para a estabilidade tripla-helicoidal no colágeno
Empacotamento molecular escalonado em cristais de um peptídeo semelhante ao colágeno com um único par carregado
Como redes eletrostáticas modulam a especificidade e estabilidade do colágeno
Alinhamento de cadeias do colágeno I decifrado usando heterotrímeros projetados computacionalmente
Estrutura em solução de um heterotrímero de colágeno ABC revela uma hélice de registro único estabilizada por interações eletrostáticas
ColBuilder: Um servidor para construir modelos de fibrilas de colágeno
A importância da ponte salina conservada Arg191-Asp227 da triosefosfato isomerase para enovelamento, estabilidade e catálise
Desnaturação de proteínas induzida por pH: uma única ponte salina contribui com 3–5 kcal/mol para a energia livre de enovelamento da T4 Lisozima
Interações eletrostáticas de superfície contribuem pouco para a estabilidade da barnase
Dicroísmo circular e Raman de ressonância ultravioleta indicam pouca estabilização de peptídeo α-hélice de cadeia lateral Arg-Glu
Pontes salinas enterradas são importantes para a estabilidade proteica e especificidade conformacional?
A ponte salina da α-defensina induz estabilidade da estrutura principal para facilitar o enovelamento e conferir resistência proteolítica
Simulação de dinâmica molecular revela uma ponte salina de superfície formando uma armadilha cinética no desenovelamento da nuclease estafilocócica truncada
Pontes salinas expostas ao solvente influenciam a cinética de enovelamento e desenovelamento da α-hélice
Influência das pontes salinas Glu/Arg, Asp/Arg e Glu/Lys na estabilidade α-helicoidal
Monitoramento de RMN sítio-específico da isomerização cis-trans no dobramento da hélice tripla de colágeno rica em prolina
Histerese cinética no dobramento do colágeno
Estabilidade cinética de proteínas
Reversibilidade e comportamento de dois estados no desdobramento térmico de proteínas oligoméricas do barril TIM
Efeitos da força iônica no dobramento e estabilidade de SAMP1, uma proteína halofílica semelhante à ubiquitina
Os efeitos da força iônica na estabilidade de proteínas: A família de proteínas de choque frio
A estrutura da glutamato desidrogenase de Pyrococcus furiosus revela um papel fundamental das redes de pares iônicos na manutenção da estabilidade enzimática em temperaturas extremas
Insights sobre a base molecular da estabilidade térmica a partir da determinação da estrutura da glutamato desidrogenase de Pyrococcus furiosus
Propriedades dependentes de sal de proteínas de bactérias extremamente halofílicas
Sobre a composição e natureza da proteína bulk de bactérias extremamente halofílicas
Características estruturais que estabilizam a malato desidrogenase halofílica de uma arqueobactéria
Energética de pontes salinas em proteínas halofílicas
Estrutura cristalina de (Gly-Pro-Hyp)9: Implicações para o modelo molecular do colágeno
Um estudo abrangente de ligação ilustra o reconhecimento de ligantes na proteína de ligação periplasmática PotF
Dinâmica de dobramento de proteínas em longo prazo a partir de simulações de dinâmica molecular de curto prazo
Cinética completa de associação proteína-proteína em detalhes atômicos revelada por simulações de dinâmica molecular e modelagem de Markov
Mutações de sentido trocado na osteogênese imperfeita no colágeno: Consequências estruturais de uma substituição de glicina por alanina em um sítio altamente carregado
Ressonância magnética nuclear mostra perda assimétrica da hélice tripla em peptídeos modelando uma mutação do colágeno na doença dos ossos frágeis
Estudos de colágeno recombinante vinculam as mudanças conformacionais severas induzidas por mutações de osteogênese imperfeita à ruptura de um conjunto de pontes salinas intercadeias
ClinVar: melhorando o acesso a interpretações de variantes e evidências de suporte
LOVD v.2.0: A próxima geração em bancos de dados de variantes genéticas
O banco de dados de variantes COL4A5 da síndrome de Alport
Heterogeneidade genética na osteogênese imperfeita
Sałacińska, K. et al. Novas Mutações nos Sítios de Ligação a Ligantes do Colágeno Alpha1(I) e Alpha2(I), Ampliando o Espectro da Osteogênese Imperfeita – Insights Atuais sobre Regiões Letais do Colágeno Tipo I. Front. Genet. 12, 692978 (2021).
Consórcio para mutações de osteogênese imperfeita no domínio helicoidal do colágeno tipo I: Regiões ricas em mutações letais se alinham com sítios de ligação do colágeno para integrinas e proteoglicanos
Mapeamento de marcos estruturais, sítios de ligação a ligantes e mutações de sentido trocado nos heterotrímeros de colágeno IV prevê principais domínios funcionais, novas interações e variação nos fenótipos em doenças hereditárias que afetam as membranas basais
Evidência para o procolágeno, um precursor biossintético do colágeno
O colágeno tipo I é termicamente instável à temperatura corporal
Makareeva, E. & Leikin, S. Montagem da tripla hélice do procolágeno: Um paradigma de enovelamento assistido por chaperona não convencional. PLoS One2, e1029 (2007).
Reconhecimento específico da tripla hélice do colágeno pela chaperona HSP47: Requisito estrutural mínimo e orientação molecular espacial
A HSP47 se liga cooperativamente ao colágeno tipo I de tripla hélice, mas tem pouco efeito na estabilidade térmica ou na taxa de renaturação
A estrutura primária do colágeno determina a estequiometria do complexo colágeno:HSP47
O colágeno tipo I em células Hsp47-nulas é agregado no retículo endoplasmático e deficiente no processamento do N-Própépido e na fibrilogênese
Enovelamento insuficiente do colágeno tipo IV e formação de estrutura anormal de membrana basal em corpos embrioides derivados de células-tronco embrionárias Hsp47-nulas
Envolvimento da proteína de estresse HSP47 no processamento do procolágeno no retículo endoplasmático
Interação intracelular da proteína de estresse específica do colágeno HSP47 com procolágeno recém-sintetizado
Mecanismos intracelulares de reconhecimento molecular e classificação para transporte de grandes moléculas da matriz extracelular
Pontes salinas podem estabilizar, mas não acelerar, o enovelamento do peptídeo de bobina enrolada homodimérico GCN4-p1
Efeito de gatekeepers na cinética de enovelamento inicial de uma proteína β-barril modelo
Reticulação cruzada no colágeno e na elastina
Proteínas de ligação ao colágeno: Insights dos kits de ferramentas de colágeno
Efeitos estereoeletrônicos e estéricos nas cadeias laterais pré-organizam a cadeia principal de uma proteína
Bases estruturais da estabilização do colágeno induzida pela hidroxilação da prolina
Análise da interação do receptor de colágeno plaquetário glicoproteína VI (GPVI) com colágeno: Uma forma dimérica de GPVI, mas não a forma monomérica, mostra afinidade por colágeno fibroso
Estrutura cristalina e sítio de ligação ao colágeno do receptor inibitório imune LAIR-1: Implicações inesperadas para a ligação ao colágeno pelo receptor plaquetário GPVI
Mecanismo de estabilização de uma tripla hélice de colágeno bacteriano na ausência de hidroxiprolina
Doce é estável: Glicosilação estabiliza o colágeno
Transglutaminase tecidual aumenta a artrite induzida por colágeno tipo II e modifica o epítopo de células T imunodominante CII260-270
Uma superfamília de proteínas arqueanas, bacterianas e eucarióticas homólogas às transglutaminases animais
Heterogeneidade estrutural da tripla hélice do colágeno tipo I e seu papel na osteogênese imperfeita
Agrupamento de sequências altamente homólogas para reduzir o tamanho de grandes bancos de dados de proteínas
R Core Team. R: Uma Linguagem e Ambiente para Computação Estatística. R Foundation for Statistical Computing, https://www.R-project.org/ (Viena, Áustria, 2023).
Múltiplos sítios de ligação no colágeno tipo I para as integrinas α1β1 e α2β1
Especificidade de ligação ao colágeno dos receptores do domínio discoidina: Sítios de ligação nos colágenos II e III e determinantes moleculares para o reconhecimento do colágeno IV pelo DDR1
A orientação espacial dos resíduos de aminoácidos essenciais arginina e aspartato no sítio de reconhecimento da integrina α1β1 do colágeno IV foi resolvida usando transferência de energia de ressonância por fluorescência
Base estrutural do reconhecimento de colágeno específico de sequência por SPARC
Base estrutural da formação de dímeros de colágeno tipo VI
O colágeno IX associado a fibrilas fornece um novo mecanismo para adesão celular à matriz cartilaginosa
O domínio NC2 do colágeno IX fornece seleção de cadeia e heterotrimerização
Insight estrutural para seleção de cadeia e controle de deslocamento em colágeno
Modelo estrutural da região semelhante a colágeno de C1q que compreende a região de dobra e o empacotamento fibroso das seis hélices triplas
Análise teórica dos modelos de Lumry-Eyring em calorimetria de varredura diferencial
Romero-Romero, S. et al. A Paisagem de Estabilidade de Barris TIM de Novo Explorada por uma Abordagem de Design Modular. J. Mol. Biol. 433, 167153 (2021).
HTMD: Dinâmica molecular de alto rendimento para descoberta molecular
De. ACEMD: Acelerando a dinâmica biomolecular na escala de tempo de microssegundos
ff14SB: Melhorando a precisão dos parâmetros de cadeia lateral e esqueleto de proteínas a partir do ff99SB
Aprendizado e amostragem em tempo real da ligação de ligantes por simulações moleculares de alto rendimento
Uma implementação do método de malha de partículas suaves Ewald em hardware GPU
Identificação de parâmetros de ordem molecular lentos para construção de modelo de Markov
Scikit-learn: Aprendizado de Máquina em Python
Weber, M. & Kube, S. Análise robusta de cluster Perron para várias aplicações em ciência da vida computacional. in Notas de Aula em Ciência da Computação (incluindo sub-séries Notas de Aula em Inteligência Artificial e Notas de Aula em Bioinformática) (eds. R. Berthold, M., Glen, R. C., Diederichs, K., Kohlbacher, O. & Fischer, I.) 3695 LNBI, 57–66 (Springer Berlin Heidelberg, 2005).
Reconstrução completa de um processo de ligação enzima-inibidor por simulações de dinâmica molecular