pmid: "28174564"
title: ""
authors: "de Souza Pereira JJ, Pereira AP, Jandú JJ, da Paz JA, Crovella S, Dos Santos Correia MT, de Azevêdo Silva J"
journal: "Frontiers in microbiology"
pubdate: "2017"
doi: "10.3389/fmicb.2017.00052"
source: "PMC Full Text"

Autores

de Souza Pereira JJ, Pereira AP, Jandú JJ, da Paz JA, Crovella S, Dos Santos Correia MT, de Azevêdo Silva J

Periodico

Frontiers in microbiology (2017)

Conteudo

Caracterização fitoquímica e antimicrobiana de Commiphora leptophloeos
Commiphora leptophloeos é uma espécie vegetal geralmente conhecida por seus fins medicinais em comunidades locais do Nordeste do Brasil. Com o objetivo de avaliar seu potencial terapêutico, objetivamos determinar as propriedades fitoquímicas e antimicrobianas dos extratos de C. leptophloeos. A Cromatografia em Camada Delgada (TLC) foi capaz de detectar a presença de compostos fenólicos, flavonóides e açúcares redutores. Três compostos fenólicos foram identificados por HPLC e descritos como ácidos gálico, clorogênico e protocatecuico. Por outro lado, a análise de RMN H1 revelou a presença de hinocinina, uma lignana bioativa ainda caracterizada no presente trabalho. Os valores de concentração inibitória mínima (CIM) para hinocinina variaram de 0,0485 a 3,125 mg/mL em diferentes isolados clínicos de S. aureus e mostraram atividade bactericida contra MRSA isolado de sangue (MMC 0,40 mg/mL) e secreção pós-operatória (MMC = 3,125 mg/mL). Os extratos de C. leptophloeos também apresentaram atividade antimicrobiana contra espécies de Mycobacterium como M. smegmatis (CIM = 12,5 mg/mL) e M. tuberculose (CIM = 52 mg/mL). Além disso, determinamos a toxicidade de C. leptophloeos por testes in vitro de HC50 com atividade hemolítica detectada de 313 ± 0,5 μg/mL. Nossos resultados mostraram que C. leptophloeos possui propriedades inibitórias contra MRSA, bem como vários outros microrganismos clinicamente importantes. Além disso, o presente trabalho é o primeiro relato da presença de hinocinina no gênero Commiphora.
Introdução
A descoberta de agentes antibacterianos foi um acontecimento inovador na medicina e representou um marco na saúde humana. No entanto, o uso indevido generalizado destes agentes trouxe à luz dois grandes problemas que envolvem o tratamento de infecções bacterianas: (i) o surgimento de organismos multirresistentes (MDROs) e (ii) a existência de bactérias inatamente resistentes à maioria dos antibióticos. O número crescente de MDROs é uma ameaça iminente em todo o mundo, especialmente o Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), que adquiriu um gene envolvido na resistência a todos os antibióticos β-lactâmicos disponíveis. Nesse cenário, a Tuberculose (TB), doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis, coevoluiu junto com o ser humano e permanece até hoje como um problema de saúde pública. Em 2015, a TB foi considerada a doença infecciosa mais mortal do mundo, pois 1 milhão de crianças com menos de 14 anos adoeceram, 140.000 crianças morreram e mais de 53 milhões de crianças saudáveis ​​eram portadoras do bacilo da TB. Além disso, a TB é a principal causa de mortes de indivíduos seropositivos, uma vez que, em 2015, 1 em cada 3 mortes por VIH estava ligada à infecção por TB. No contexto da multirresistência, aproximadamente 480 000 pessoas desenvolveram TB multirresistente (TB-MDR) em todo o mundo e as principais causas são o tratamento inadequado, o uso indevido de medicamentos ou o uso de medicamentos de má qualidade.
Os produtos naturais encontrados em plantas medicinais são uma fonte promissora para novos compostos antibacterianos. Os compostos antimicrobianos derivados de plantas pertencem a uma diversidade excepcionalmente ampla de classes, incluindo terpenoides, lignanas, alcaloides e peptídeos, compostos fenólicos e cumarinas. Todos os compostos mencionados são considerados produtos do metabolismo secundário nas plantas, não estritamente necessários para sua sobrevivência, mas geralmente conferindo um efeito positivo para seu uso medicinal.

Commiphora leptophloeos, geralmente conhecida como Imburana do Sertão, pertence à família Burseraceae, que inclui árvores e arbustos de regiões tropicais e subtropicais, e é tradicionalmente usada por tribos indígenas como infusão, chá ou xarope para o tratamento de suas doenças, como as infecciosas e inflamatórias. O gênero Commiphora compreende mais de 150 espécies, a maioria das quais está confinada à África Oriental e é geralmente aplicada na medicina tradicional. No Brasil, é encontrada onde a vegetação está exposta a condições adversas de clima e solo, típicas da fisionomia do Sertão, uma região semiárida no Nordeste do Brasil caracterizada por um clima muito seco e extremamente quente durante todo o ano, com baixos índices pluviométricos.

Portanto, as espécies de plantas dos ecossistemas da Caatinga podem se tornar alvos promissores nas buscas por novas substâncias ativas. O objetivo do presente estudo incluiu a caracterização dos extratos de C. leptophloeos, o isolamento de biomoléculas e frações com atividade antimicrobiana e a análise do possível efeito tóxico em células sanguíneas humanas.

Materiais e Métodos

Material Biológico (Planta)

A casca do caule de C. leptophloeos foi coletada no Parque Nacional do Catimbau, Pernambuco – Brasil. Os autores confirmam que a autoridade nomeada Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade concedeu permissão (SISBIO 16806) para nossas buscas de campo descritas. A identificação botânica e a deposição de espécimes vegetais foram realizadas no Herbário do Instituto de Pesquisas Agronômicas de Pernambuco (IPA-PE) (IPA n° 84037).

Preparação dos Extratos

A casca seca (25 g) de C. leptophloeos foi obtida por saturação em ordem crescente de polaridade: submetida a Ciclohexano (CLCHE), Clorofórmio (CLCLE), Acetato de Etila (CLAEE), Metanólico (CLMEE) e Aquoso (CLAQE) (250 mL) por agitação a 180 rotações por minuto (rpm). Após 24 h, o extrato foi filtrado (Whatman® número 2) e concentrado a 45°C sob vácuo em um evaporador rotatório (Concentrator 5301, Eppendorf®). O pó produzido foi mantido a –20°C para uso futuro. Para análise fitoquímica e antimicrobiana, os extratos foram dissolvidos em seus respectivos solventes na concentração de 100 mg/mL para todos os ensaios biológicos.

Análise Fitoquímica

Determinação de Compostos de Ácidos Fenólicos por HPLC
Para a determinação de ácidos fenólicos, o pó do extrato (0,5 g) foi diluído em metanol:água (20%, v/v) em banho ultrassônico por 30 min. Em seguida, os extratos foram filtrados e passados através de um cartucho SPE C18 com os seguintes solventes: acetona, ácido tricloroacético, água (4%, v/v) e metanol. As amostras foram posteriormente submetidas a um evaporador rotativo (Concentrator 5301, Eppendorf®) e ressuspensas em metanol. A análise qualitativa do conteúdo fenólico para cada extrato foi realizada por UFLC (Cromatografia Líquida Ultra-Rápida - LC-20AD, Shimadzu). As separações foram conduzidas em uma coluna XR ODS, 50 μm × 3,0 μm × 2,2 μm. A eluição foi realizada com água:acetonitrila:metanol:acetato de etila:ácido acético glacial (86:6:1:3:1, respectivamente). A temperatura da coluna foi ajustada para 40°C e a vazão foi de 0,4 mL/minuto por 5 min. Antes da injeção, os extratos das amostras (200 μL) foram filtrados com filtros de seringa PTFE de 0,22 μm (Phenomenex, Reino Unido). Os fenóis em cada extrato de casca foram identificados pela comparação de seus tempos de retenção com padrões correspondentes e por seus espectros UV obtidos com o detector de arranjo de diodos – DAD (SPD-M20A). Ácido gálico, ácido vanílico, ácido protocatecuico, ácido clorogênico, ácido cumárico, ácido ferúlico, quercetina e rutina foram utilizados como compostos padrão. A equação de regressão linear para cada curva padrão foi obtida plotando a quantidade de composto padrão injetada contra a área do pico.
Análise Fitoquímica Qualitativa por CCD
Uma alíquota de 100 μL de cada extrato de C. leptophloeos foi submetida à análise fitoquímica qualitativa para verificar a presença de metabólitos secundários, tais como: cumarinas, flavonoides, taninos e fitosteroides, açúcares redutores e saponinas, respectivamente. As classes de compostos foram visualizadas utilizando Cromatografia em Camada Delgada (CCD) em sílica gel 60 F254 (Merck, Alemanha), e diferentes sistemas de desenvolvimento e técnicas de visualização adequadas foram utilizadas, como: teste de Dragendorff, NEU-PEG, KOH-Etanol, teste de anidrido acético, ácido vanilina-sulfúrico, quercetina, ácido tânico, equivalente de benzopirona, de acordo com o respectivo método de elucidação.
Determinação do Teor de Fenóis Totais
A quantidade total de compostos fenólicos dos extratos foi determinada de acordo com o procedimento de Folin-Ciocalteu com modificações internas. Resumidamente, as amostras (200 μL) foram introduzidas em tubos de ensaio com 1,0 mL de reagente de Folin–Ciocalteu (1:1 v/v) e 2,5 mL de carbonato de sódio (20%). A mistura foi incubada por 30 min à temperatura ambiente e deixada em repouso por mais 30 min. A absorbância da mistura de cor azul foi medida a 765 nm (Gene Quant 1300, GE Healthcare). A quantidade de fenol total foi calculada como miligramas (mg) de Equivalentes de Ácido Gálico (EAG)/g de massa seca a partir da curva de calibração da solução padrão de ácido gálico. Para o ácido gálico, a curva de absorbância versus concentração é descrita pela equação y = 1,5221x + 0,0081 (r² = 0,9712).
Análise Cromatográfica por Cromatografia Flash e CCD
Com base nos resultados fitoquímicos iniciais e na visualização da presença de fitoesteroides e lignanas nos testes qualitativos, o CLCLE com rendimento de 0,8 g foi então submetido à Cromatografia Flash utilizando sílica gel 60 F254 (Merck, Alemanha) como fase estacionária e CHCl3/MeOH (99:1) como fase móvel. Deste experimento, foram obtidas 45 frações de 15 mL cada. As frações foram submetidas à Cromatografia em Camada Delgada (CCD) em diferentes grupos, dependendo de seus padrões cromatográficos e similaridade, da seguinte forma: F1-F8, F9, F10-F14, F15-19, F20-26, F27-F28, F29-F38, F39-F42 e F44-F45. A fração F9, que rendeu 0,06 g, foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel e 100 novas frações foram obtidas e analisadas seguindo os dados do Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC). Entre todas as frações, a F16 foi a mais pura e foi submetida à RMN de 1H.
Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN de 1H)
Os espectros de RMN de 1H da fração F16 foram obtidos em espectrômetro Mercury-Varian utilizando 200 MHz – 1H. O solvente utilizado foi clorofórmio deuterado (CDCl3), cujos picos respectivos na RMN de 1H foram usados para ajustar a escala de frequência.
Atividades Antimicrobianas
Micro-organismos e Preparação do Inóculo
Quinze cepas de micro-organismos de onze espécies (Aspergillus sp., Bacillus subtilis, Candida albicans, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luteus, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, incluindo isolados clínicos de Staphylococcus aureus), obtidas da coleção de micro-organismos do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco (UFPEDA), foram utilizadas para os testes antimicrobianos, conforme a Tabela 1. As cepas bacterianas foram cultivadas a 37°C por 18 horas em Caldo Mueller-Hinton e as culturas fúngicas mantidas em meio Ágar Sabouraud Dextrose e incubadas a 35°C por 24 h. Quanto à preparação do inóculo, as cepas selecionadas foram transferidas para solução salina estéril (NaCl 0,9%), compondo uma suspensão bacteriana/fúngica (inóculo) até obter a concentração de 10⁶ UFC/mL de acordo com a escala de McFarland. Os testes de suscetibilidade foram realizados pelo método de difusão em poço de ágar Mueller-Hinton.
Micro-organismos utilizados no presente estudo distribuídos de acordo com os grupos: bactérias e fungos
Bactérias UFPEDA Bactérias UFPEDA Fungos UFPEDA Mycobacterium smegmatis 71 Staphylococcus aureus 02 Aspergillus sp. 807 Mycobacterium tuberculosis 82 Staphylococcus aureus 6721 Candida albicans 1007 Bacillus subtilis 86 Staphylococcus aureus 6771 Micrococcus luteus 100 Staphylococcus aureus 6821 Enterococcus faecalis 138 Staphylococcus aureus 7281 Escherichia coli 224 Klebsiella pneumoniae 396 Pseudomonas aeruginosa 416
Testes de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Microbicida Mínima (CMM)
A CIM e a CMM foram determinadas para extratos vegetais que apresentaram atividade antimicrobiana, por um método de microdiluição em caldo. Resumidamente, 100 μL de Caldo Mueller-Hinton, mais diferentes concentrações dos extratos vegetais, foram preparados e transferidos para cada poço da microplaca para obter diluições do extrato ativo, variando de 0,001 a 100 mg/mL. Em seguida, 10 μL de uma cultura fresca (concentração final de 1 × 10⁶ UFC/mL) dos organismos teste foram adicionados. As microplacas foram incubadas a 37°C por 24 h e a CIM foi definida como a menor concentração do extrato que restringiu o crescimento visível do microrganismo testado. Para determinar a CMM, 100 μL de cada poço que não apresentou crescimento visível foram reinoculados em placas de ágar MH; em seguida, as placas foram incubadas a 37°C por 24 h. A CMM foi definida como a menor concentração do extrato sem crescimento bacteriano. DMSO foi usado como branco.

Cultura Antimicobacteriana

O M. smegmatis e o M. tuberculosis foram mantidos em caldo Middlebrook 7H9 contendo 0,05% de Tween 80 e suplemento OADC (Ácido Oleico, Albumina, Dextrose e Catalase) a 10% (v/v). A triagem da cultura foi realizada por coloração de Ziehl-Neelsen antes do uso nos ensaios antimicrobianos. Diluições seriadas ao meio do extrato CLCLE e da Rifampicina foram feitas com 100 μl de cada; água destilada estéril e meio de cultura Middlebrook 7H9 para M. tuberculosis e M. smegmatis em placas de microplaca de 96 poços. As placas foram incubadas a 37°C por 24 dias. O revelador (40 μL) utilizado foi o iodonitrotetrazólio (INT) da Sigma–Aldrich. Os valores da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram registrados como as menores concentrações dos extratos que não apresentaram crescimento, e o crescimento bacteriano nos poços foi indicado pela mudança de cor.

Atividade Antimicrobiana da Hinokinina de C. leptophloeos contra Isolados Clínicos Selecionados de MRSA

O estudo incluiu quatro cepas de S. aureus obtidas do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco (UFPEDA). Colônias com características macroscópicas dos padrões de suscetibilidade antimicrobiana dos isolados foram determinadas de acordo com a técnica de difusão em disco de Kirby Bauer, conforme descrito pelo CLSI, e pela Concentração Inibitória Mínima (CIM). Os três antibióticos a seguir foram utilizados para determinar o antibiograma dos isolados: Tobramicina (10 μg), Vancomicina (30 μg) e Cefoxitina (30 μg). A detecção de S. aureus resistente à meticilina (MRSA) foi realizada usando cefoxitina (30 μg); um diâmetro do halo de inibição ≤21 mm foi relatado como resistente à meticilina/oxacilina e ≥22 mm foi considerado sensível à meticilina/oxacilina.

Ensaios Hemolíticos in vitro
Para o ensaio hemolítico in vitro, sangue total (5 ml) foi obtido de voluntários saudáveis e não fumantes por punção venosa, após obtenção de consentimento informado por escrito (Comitê Nacional de Ética, número de referência 30667014.5.0000.5208). Eritrócitos humanos do sangue citratado foram imediatamente isolados por centrifugação a 1500 rpm por 10 min a 4°C. Após a remoção do plasma, os eritrócitos foram lavados três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 7,4) e, em seguida, ressuspensos usando o mesmo tampão, e uma suspensão de eritrócitos a 1% foi preparada. A atividade hemolítica dos extratos de C. leptophloeos foi testada sob condições in vitro. Cada tubo recebeu 1,1 mL de suspensão de eritrócitos e 0,4 mL de extrato em diferentes concentrações variando de 50 a 500 μg/mL. O controle negativo foi apenas solvente e o controle positivo recebeu 0,4 mL de saponina de Quillaja (0,0025%). Após 60 min de incubação à temperatura ambiente, as células foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 min e o sobrenadante foi utilizado para medir a absorbância da hemoglobina liberada no comprimento de 540 nm. O valor médio foi calculado a partir de ensaios em triplicata.
Análise Estatística
Cada experimento foi realizado em duplicatas biológicas e triplicatas técnicas e os resultados são apresentados como médias e ± desvio padrão (DP). A análise estatística foi realizada pelo teste t de Student e testes ANOVA. As diferenças foram consideradas significativas para p < 0,05. A concentração necessária para 50% de inibição (IC50) foi estimada graficamente por análise de regressão linear.
Resultados
Análises Fitoquímicas de C. leptophloeos
Os rendimentos dos extratos avaliados apresentaram valores variando entre 9,8 e 12,3%, sendo 9,8% para CLCHE, 10,2% para CLECL, 10,5% para CLAEE, 11,8% para CLMEE e 12,3% para CLAQE. A análise fitoquímica qualitativa de C. leptophloeos por HPLC detectou a presença de três compostos específicos: ácido gálico (GA), ácido clorogênico (CGA) e ácido protocatecuico (PCA), conforme mostrado na Figura 1. A análise fitoquímica qualitativa por CCD dos extratos de C. leptophloeos detectou a presença de compostos fenólicos, flavonoides e açúcares redutores em todos os extratos (Tabela 2). A estimativa do teor de fenólicos totais revelou que CLAQE (33,64 ± 0,5 mg de EAG/g) e CLMEE (20,3 ± 0,78 mg de EAG/g) apresentaram o maior teor de fenólicos (p < 0,05). Os outros extratos apresentaram valores de teor fenólico variando de 13,8 ± 0,53 a 12,54 ± 0,55 mg de EAG/g, conforme mostrado na Tabela 2. A fração F16 de CLCLE estudada mostrou a presença de hinokinina em nossa análise, e o espectro de 1H RMN (CDCl3, 200 MHz) de F16 de CLCLE apresentou dois multiplicos (δH 2,45 e 2,48) em campo alto, referentes aos hidrogênios sp3 ligados aos carbonos vizinhos do carbono quiral (C-7 e C-7’). Em δH 2,85 foi observado um duplo dupleto (dd, J = 4,7; 14,5 Hz, 1H) de 1 H diretamente ligado ao carbono quiral C-8. Em δH 3,00, o duplo dupleto (dd, J = 4,7; 14,5 Hz, 1H) do hidrogênio 1 diretamente ligado ao carbono quiral (C-8’). Em δH 3,85 (dd, J = 7,0; 9,2 Hz, 1H) e 4,15 (dd, J = 6,2; 9,0 Hz, 1H), dois duplos dupletos referentes aos hidrogênios ligados ao carbono C-9. Em δH 5,9471, um multipleto em 4 H ligados ao carbono C-10 e C-10’, simultaneamente. Finalmente, um multipleto de 6H em δH 6,5 atribuído aos hidrogênios aromáticos foi identificado. A elucidação do espectro é mostrada na Figura 2. A hinokinina é um dos constituintes dos metabólitos secundários de C. leptophloeos descrito pela primeira vez nesta espécie.
Impressões digitais de HPLC obtidas do extrato clorofórmico (CLECL). A análise por UFLC detectou a presença dos compostos bioativos: (A) ácido gálico, (B) ácido clorogênico e (C) ácido protocatecuico.
Análises fitoquímicas de extratos de cascas de Commiphora leptophloeos.
Extrato de Commiphora leptophloeos Teor de fenólicos Triagem fitoquímica
Testes positivos para Testes negativos para
CLAQE 33,64 ± 0,5 Compostos fenólicos, Taninos, Flavonoides e Açúcares redutores. Cumarinas, Saponina, Fitosteroides e Lignanas.
CLMEE 20,3 ± 0,78 Compostos fenólicos, Taninos, Cumarinas, Flavonoides, Açúcares redutores e Saponina. Fitosteroides e Lignanas.
CLCLE 12,54 ± 0,55 Compostos fenólicos, Taninos, Cumarinas, Flavonoides, Açúcares redutores, Fitosteroides e Lignanas. Saponina
CLCHE 13,8 ± 0,53 Compostos fenólicos, Taninos, Cumarinas, Flavonoides e Açúcares redutores. Saponina, Fitosteroides e Lignanas.
CLAEE 13,7 ± 0,04 Compostos fenólicos, Flavonoides e Açúcares redutores. Taninos, Cumarinas, Saponina, Fitosteroides e Lignanas.
Espectros de RMN de 1H da fração F16 (δ, CDCl3, 200 MHz) da estrutura 2D de Hinokinina por ACD/I-Lab.
Triagem Antimicrobiana
A atividade antibacteriana dos extratos de C. leptophloeos foi registrada contra vários microrganismos e está apresentada nas Tabelas 3–5. No geral, todos os extratos vegetais exibem uma gama de potenciais inibitórios com amplo espectro, pois inibiram todas as espécies de bactérias e leveduras testadas. Os melhores resultados antimicrobianos observados foram fornecidos pelo CLMEE, no qual a CIM variou de 0,097 a 50,0 mg/mL (valor de p < 0,05) (Tabelas 3 e 4). O CLMEE apresentou melhores atividades antimicrobianas contra bactérias Gram-positivas, com melhores resultados para B. subtilis (CIM = 3,125 mg/mL), E. faecalis (CIM = 25 mg/mL) e M. luteus (CIM = 0,097 mg/mL e CMM = 12,5 mg/mL). Contra a cepa de S. aureus, a melhor ação bacteriostática foi do CLCLE (CIM = 1,125 mg/mL) e, por esse motivo, utilizamos a fração F16 purificada de hinokinina de C. leptophloeos para avaliar a ação dessa lignana contra cepas de MRSA (Tabela 5). C. leptophloeos também apresentou atividade antifúngica, como Aspergillus sp. (valores de CIM variaram de 3,125 a 6,25 mg/mL) e C. albicans (valores de CIM variaram de 6,25 a 12,5 mg/mL, valor de p < 0,05) mostrados na Tabela 3. As atividades antimicrobianas contra bactérias Gram-negativas foram mostradas na Tabela 4. O CLCHE apresentou melhor efeito bacteriostático contra P. aeruginosa (CIM = 6,25 mg/mL) e K. pneumoniae (CIM e CMM = CMM 12,5 mg/mL), o CLAEE apresentou a melhor atividade contra E. coli (CIM e CMM = 12,5 mg/mL), e o CLCLE foi testado contra Mycobacterium, indicando M. smegmatis (CIM = 12,5 mg/mL) como mais suscetível ao CLCLE do que M. tuberculosis (CIM = 52 mg/mL), Tabela 4. Os valores de CIM da hinokinina (obtida da purificação F16 do CLCLE) variaram de 0,0485 a 3,125 mg/mL (valor de p = 0,002) para os diferentes isolados clínicos de S. aureus testados, e apresentaram atividade bactericida contra MRSA isolado de sangue (CMM 0,40 mg/mL) e secreção pós-operatória (CMM = 3,125 mg/mL) mostrados na Tabela 5.
Atividade antimicrobiana de extratos das cascas de C. leptophloeos contra bactérias Gram-positivas e fungos selecionados.
Commiphora leptophloeos Extracto Bacillus subtilis Enterococcus faecalis Micrococcus luteus Staphylococcus aureus Aspergillus sp. Candida albicans CIM CMM CIM CMM CIM CMM CIM CMM CIM CMM CIM CMM CLMEE 3,125 – 25 – 0,097 12,5 1,56 – 3,15 – 6,25 – CLCLE 25,0 – 25 – 0,78 25 1,125 – 6,25 – 12,5 – CLCHE 12,5 – 25 – 0,195 – 3,125 – 6,25 – 6,25 – CLAEE 12,5 – 25 – 12,5 12,5 12,5 12,5 3,125 – 12,5 – Controle CIM CIM CIM CIM CIM CIM KAN 4 0,614 6,8 1,6 N.d. 3,2 KCZ N.d. N.d. N.d. N.d. 0,32 N.d.
Atividade antimicrobiana de extratos das cascas de C. leptophloeos contra bactérias Gram-negativas e Mycobacterium selecionados.
Commiphora leptophloeos Extrato Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Mycobacterium smegmatis Mycobacterium tuberculosis CIM CMM CIM CMM CIM CMM CIM CMM CIM CMM CLMEE 50.0 – 12.5 25 12.5 – N.d. N.d. N.d. N.d. CLCLE 50.0 – 12.5 – 12.5 – 12.5 – 54.1 – CLCHE 6,25 – 12,5 – 12,5 12,5 N.d. N.d. N.d. N.d. CLAEE – – 12,5 12,5 12,5 25 N.d. N.d. N.d. N.d. Controle CIM CIM CIM CIM CIM AMP 0,008 0,004 0,008 N.d. N.d. RIF N.d. N.d. N.d. 1,16 2,5
Atividade Antimicrobiana de C. leptophloeos hinokinina contra isolados clínicos selecionados de S. aureus.
UFPEDA Fonte1 HKN VA TOB CFX CIM CMM IDZ 672 Sangue 0,395 0,400 11,4 13,9 14,2 677 Secreção pós-operatória 0,0485 3,125 15,1 16 14,2 682 Secreção ocular 3,125 – 13,3 12 15 728 Orofaringe 1,560 – 14 14,8 16
Ensaios Hemolíticos In Vitro
A concentração dos extratos CLAQE, CLMEE, CLAEE, CLCLEE e CLCHE demonstrou um HC50 (concentração necessária para 50% de hemólise) de 313 ± 0,5 μg/mL; 304,9 μg/mL ± 0,8; 287,49 μg/mL ± 3,0; 239,5 μg/mL ± 1,4 e 177,21 μg/mL ± 0,45, respectivamente (valor de p = 0,001).
Discussão
Análises Fitoquímicas de C. leptophloeos
Espécies do gênero Commiphora apresentam compostos bioativos amplamente conhecidos e utilizados como terapia para várias patologias na cultura popular. Aqui, realizamos uma caracterização fitoquímica minuciosa de C. leptophloeos, mostrando suas quantidades notáveis de compostos fenólicos, nomeadamente ácido gálico (GA), ácido clorogênico (CGA) e ácido protocatecuico (PCA). O GA é dotado de atividades farmacológicas, incluindo atividade antioxidante, anti-inflamatória, antimicrobiana e antiproliferativa. Por outro lado, o CGA foi recentemente apontado como modulador do metabolismo da glicose e dos lipídios in vivo, sob condições metabólicas desequilibradas, como diabetes. Além disso, o PCA, principal metabólito das antocianinas, proporciona atividades benéficas à saúde humana, como redução do risco de doenças cardiovasculares, atividades anti-inflamatória, antioxidante e de eliminação de radicais livres, bem como atividade estrogênica e antiestrogênica.
Nossa caracterização fitoquímica mostrou a presença de outros compostos bioativos em C. leptophloeos, como a hinokinina, uma importante classe de lignanas, que tem sido recentemente investigada para estabelecer suas atividades biológicas (REFERÊNCIA). As lignanas são componentes importantes de alimentos e medicamentos, derivadas biossinteticamente do acoplamento radicalar de duas moléculas de álcool coniferílico nas posições C-8/C-8′. Nos últimos anos, as atividades biológicas de várias lignanas têm sido estudadas em profundidade e, entre elas, a hinokinina (Figura 2) está emergindo como um novo composto interessante com potencial farmacológico. A hinokinina foi isolada pela primeira vez em 1933 por Yoshiki e Ishiguro a partir de um extrato etéreo da madeira de Hinoki – Chamaecyparis obtusa – como um composto cristalino incolor e, ao longo dos anos, foi gradualmente caracterizada e descrita por outros pesquisadores.
Triagem Antimicrobiana
Commiphora leptophloeos mostra atividade antibacteriana contra vários patógenos Gram-positivos humanos, como B. subtilis, E. faecalis, M. luteus e S. aureus (Tabela 3). A inibição do crescimento bacteriano in vitro pelos extratos de C. leptophloeos pode ser devida à presença de alguns compostos ativos, incluindo flavonoides, ácidos fenólicos e taninos, descritos na Tabela 2, conhecidos por serem agentes antimicrobianos eficazes contra uma ampla gama de microrganismos. Esses compostos ativos podem agir isoladamente ou em combinação para inibir o crescimento bacteriano. Nossos resultados contra a cepa de M. luteus mostraram uma MIC variando de 0,097 a 12,5 mg/mL, sendo o CLMEE o extrato que apresentou a melhor ação bacteriostática e bactericida (MMC = 12,5 mg/mL), particularmente quando comparado a outros estudos com o gênero Commiphora e quando comparado ao valor de MIC obtido pelo aminoglicosídeo Canamicina (MIC = 6,8 mg/mL). M. luteus é um constituinte natural da microflora da pele de mamíferos e considerado um contaminante nosocomial principalmente em indivíduos imunodeficientes, causando meningite e endocardite em infecções graves. A imunodeficiência é um fator de risco capaz de intensificar a seleção e disseminação de cepas multirresistentes. Os extratos de C. leptophloeos também são eficazes contra Aspergillus sp. e C. albicans, as espécies fúngicas mais prevalentes da microbiota humana, frequentemente associadas a diversas complicações em indivíduos imunossuprimidos.
Patógenos Gram-negativos são particularmente alarmantes, devido à sua resistência a quase todas as drogas inicialmente consideradas para tratamento. A razão para isso reside em suas várias vias de resistência aos β-lactâmicos através da produção de enzimas β-lactamases, interferindo assim no mecanismo de ação dos antibióticos β-lactâmicos. A mesma premissa tornou-se mais frequente em infecções Gram-positivas (por exemplo, Staphylococcus). P. aeruginosa é um patógeno oportunista ubíquo, possuindo estrutura de membrana celular externa que confere resistência pronunciada a xenobióticos. Estudos anteriores já haviam relatado a ação do extrato aquoso de C. leptophloeos na inibição de biofilmes de P. aeruginosa e S. epidermidis. De acordo com esses estudos mencionados, o CLCHE apresentou ampla atividade bacteriostática contra P. aeruginosa, com CIM de 6,25 mg/mL (Tabela 4). Esse maior potencial de ação se deve à presença de taninos no CLCHE, conforme observado em nosso perfil fitoquímico (Tabela 2). E. coli é uma bactéria geralmente encontrada na microflora intestinal; no entanto, algumas podem causar doenças humanas debilitantes e às vezes fatais. As cepas patogênicas são divididas em patógenos intestinais causadores de diarreia e extraintestinais, principalmente relacionados a infecções do trato urinário, pielonefrite, cistite e urossepse. Apenas duas frações, CLCHE e a CLMEE, apresentaram ação bactericida (CMM variando de 12,5 a 25 mg/mL), sugerindo que essa ação pode ser devida à presença de altas quantidades de ácidos fenólicos (Figura 1), como o AG, que pode contribuir para a inibição da cepa de E. coli.
Klebsiella pneumoniae é um tipo de bactéria Gram-negativa que pode causar diferentes tipos de infecções, incluindo pneumonia, meningite, infecções da corrente sanguínea. A geração de β-lactamases de espectro estendido é um dos principais mecanismos pelos quais a K. pneumoniae clínica desenvolve resistência aos antibióticos. Aqui identificamos que as frações CLCHE e CLAEE atuam efetivamente como agente antibacteriano nas cepas Gram-negativas testadas (Tabela 4). As atividades antibacterianas dos extratos de C. leptophloeos também foram detectadas contra cepas de M. smegmatis e M. tuberculosis, conforme mostrado na Tabela 4. Um efeito bacteriostático contra espécies de Mycobacterium por metabólitos secundários de plantas pode ser devido à espessa membrana externa do patógeno, que é altamente hidrofóbica e possivelmente proporcionou uma permeabilidade ao extrato.
Oxacilina e S. aureus resistente à meticilina (MRSA) são resistentes a todos os agentes β-lactâmicos, incluindo cefalosporinas e carbapenêmicos, causando um compromisso global em conter sua disseminação, responsável por aproximadamente 40% das infecções por S. aureus em Unidades de Terapia Intensiva (UTI) globais. Em nosso estudo, foram avaliadas quatro cepas clínicas isoladas de MRSA relatadas como Resistência à Meticilina (Resistência à Oxacilina), confirmadas com testes de disco de inibição de CFX, onde a cefoxitina é usada como substituta para a resistência à oxacilina mediada por mecA. A hinokinina de C. leptophloeos apresentou a maior atividade antibacteriana contra MRSA isolado de sangue, com atividade bacteriostática (CIM) de 0,39 mg/mL e bactericida (CBM) de 0,40 mg/mL, ambos com valores muito semelhantes (Tabela 5). Nossos resultados apontam para um potencial antimicrobiano promissor contra S. aureus resistente, especialmente quando comparados a outros estudos, uma vez que obtivemos resultados antibacterianos mais pronunciados, corroborando o potencial antimicrobiano da hinokinina.
Em relação à atividade hemolítica dos extratos de C. leptophloeos, os valores obtidos para hemólise foram superiores aos relativos à sua atividade antimicrobiana, demonstrando sua segurança. Embora um estudo fitoquímico em outro gênero Commiphora tenha mostrado a presença de compostos possivelmente tóxicos, o ensaio de toxicidade realizado in vitro para as propriedades hemolíticas de Amburana não apresentou os mesmos resultados. Independentemente disso, reconhecemos a importância de aplicar outros métodos para avaliar a toxicidade desses extratos sobre outros componentes celulares. Ensaios hemolíticos foram realizados para avaliar a segurança celular em futuras preparações farmacológicas sem causar danos. No presente estudo, nossos testes com Commiphora mostraram menor atividade hemolítica quando comparados a outras espécies do bioma Caatinga.
Conclusão
No presente estudo, identificamos que os extratos da casca de C. leptophloeos contêm uma quantidade importante de compostos fenólicos, como GA, PCA e CGA. Além disso, identificamos pela primeira vez a presença de hinokinina no gênero Commiphora. Nossos resultados mostraram que C. leptophloeos apresenta potencial propriedade inibitória contra espécies de S. aureus multirresistentes, bem como vários Gram-positivos, Gram-negativos e fungos, e deve também ser estudada quanto ao seu potencial contra Mycobacterium.
Contribuições dos Autores
JdS, realizou a coleta de plantas, ensaios bioquímicos e antimicrobianos, análise e escreveu o artigo; AdP, realizou a coleta de plantas e participou de todos os ensaios bioquímicos e de microrganismos; JJ, realizou a coleta e todos os ensaios de microrganismos; JdP, realizou ensaios e análises químicas; SC, discutiu os resultados e auxiliou na sua delimitação para o manuscrito final; MdS, Coordenou o projeto, participou da coleta de plantas, durante todos os ensaios bioquímicos, análises químicas e na redação do manuscrito; JdA, Coordenou o projeto incluindo toda a coleta de plantas, ensaios bioquímicos, químicos e biológicos e discutiu todos os resultados.
Declaração de Conflito de Interesses
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Financiamento. Este trabalho foi apoiado pelas seguintes agências de fomento brasileiras: CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e FACEPE (Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco).
Referências
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