pmid: "30991677"
title: "Anti-"
authors: "Zhu CZ, Hu BY, Liu JW, Cai Y, Chen XC, Qin DP, Cheng YX, Zhang ZD"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2019 Apr 15"
doi: "10.3390/molecules24081475"
source: "PMC Full Text"

Anti-

Autores

Zhu CZ, Hu BY, Liu JW, Cai Y, Chen XC, Qin DP, Cheng YX, Zhang ZD

Periodico

Molecules (Basel, Switzerland) (2019 Apr 15)

Conteudo

Anti-Mycobacterium tuberculosis Terpenoids from Resina Commiphora
Four new compounds including two new sesquiterpenoid dimers, commiphoroids E (1) and F (2), a new triterpenoid (3), and a new sesquiterpenoid (4), along with three known terpenoids (5−7) were isolated from Resina Commiphora, whose structures were identified by NMR spectra, HRESIMS, and X-ray diffraction analysis. Compounds 1 and 2 both bear an O-bridge ring and feature a plausible [4 + 2] Diels–Alder cycloaddition reaction. Antimycobacterial activities show that all the tested compounds (200 μM) could inhibit the growth of both sensitive and clinically multi-drug resistant (MDR) isolated strains. In addition, cellular toxicity of the isolates against human cancer cells and THP-1 monocyte cells was examined.

1. Introduction
   Tuberculosis (TB) is one of the leading causes of human mortality by a single infectious agent Mycobacterial tuberculosis (M. tuberculosis). This is illustrated by the approximately 10.0 million infected people and 1.3 million deaths worldwide in 2017. Drug resistance, including multi-drug resistant (MDR), extensively drug-resistant (XDR), and totally drug resistant (TDR), has been spreading worldwide, particularly in India, China, and Russia. Because of the lack of effective new anti-tuberculosis drugs, TB treatment remains challenging. Development of novel agents that could effectively fight against M. tuberculosis are thus of great importance. Within this context, search for anti-Mycobacterium tuberculosis agents have received attention in recent years and increasing numbers of active compounds have been isolated from natural origins or synthesized. Aromatic plants have been used for treating infective diseases, including air cleaning in China since ancient times. In fact, aromatic therapy is also popular worldwide, which inspired our search for anti-TB agents from aromatic plants. The resins from the bark of Commiphora plants, also known as myrrh, have been historically used as aromatic resins in ancient Egypt for wound healing and embalming, which implies that myrrh might contain antimicrobial agents. With this in mind and as a part of our continuous efforts on myrrh, this study afforded two new sesquiterpenoid dimers (1 and 2), a new triterpene (3), a new sesquiterpenoid (4), and three known terpenoids (5−7) (Figure 1). Their antimicrobial properties against multiple M. tuberculosis strains including sensitive and MDR were observed.
2. Results and Discussion
   2.1. Structure Elucidation of the Compounds
   Commiphoroid E (1), obtido como cristais incolores em forma de agulha (MeOH), tem uma fórmula molecular de C30H42O4 (dez graus de insaturação) com base em seu HRESIMS (m/z 467,3150, calculado 467,3156 [M + H]+), nos espectros de 13C NMR e DEPT (Materiais Suplementares). Os dados de 1H NMR (Tabela 1) de 1 exibem seis metilas (3 singletos e 3 dupletos), um grupo metoxila (δH 3,21) e quatro prótons metino olefínicos. Os espectros de 13C NMR e DEPT mostram 30 ressonâncias de carbono, incluindo seis metilas, uma metoxila, seis metilenos, nove metinos (quatro olefínicos, dois oxigenados e três alifáticos) e oito carbonos não protonados (duas cetonas carbonilas, quatro olefínicos, dois alifáticos incluindo um oxigenado). Considerando os dados mencionados e o perfil químico do gênero Commiphora, especulamos que 1 poderia ser um dímero sesquiterpenoide.

A arquitetura estrutural de 1 foi realizada principalmente usando dados de RMN 2D. O espectro de 1H−1H COSY de 1 mostra correlações: H2-1/H2-2/H-3 (δH 4,83), H-5/H-6, H-8(δH 5,05)/H-9, H3-12/H-11/H3-13 e H-2′ (δH 5,95)/H-3′/H-4′/H2-5′/H3-14′ (Figura 2). Com base nas correlações HMBC observadas de H3-15/C-2, C-3 (δC 122,3), C-4 (δC 134,5), C-5, C-6, H-11/C-6, C-7 (δC 146,7), C-8 (δC 121,1), H-8 (δH 5,05)/C-6, C-7 (δC 146,7), C-9, C-10 e H3-14/C-9, C-10, C-1, estabelecemos a estrutura da parte A em 1 (Figura 2). A inspeção dos sinais de carbono restantes no espectro de 13C NMR de 1 mostrou que eles são semelhantes aos do mirterpenoide E. A diferença entre eles é que uma ligação dupla exocíclica Δ10′(15′) e uma carbonila de éster em C-12′ são substituídas por uma cetona carbonila e um grupo metino. Essas alterações são apoiadas pelas correlações HMBC de H-1′ (δH 5,96), H-9′/C-10′ (δC 202,2) e H3-13′/C-12′ (δC 91,7). A estrutura da parte B em 1 foi, portanto, identificada. A noção de que as partes A e B estão conectadas via C-9−C-8′ e C-10−C-12′ é confirmada pelas correlações HMBC de H-8, H-9/C-8′, H-9′, H-12′/C-9, H-12′/C-10 e H3-14/C-12′. Coletivamente, a arquitetura planar de 1 foi deduzida.

É evidente que a presença de uma ponte de oxigênio em 1 forma um anel C rígido, permitindo naturalmente a atribuição das configurações relativas em C-8′ e C-12′. Além disso, são observadas correlações ROESY de H-9/Ha-1 e Hb-1/H-12′, indicando a estereoquímica em C-9 e C-10. Quanto às configurações relativas nos centros quirais do anel B, as correlações ROESY observadas de H3-14′/H-2′, H-3′ e H-1′/H-4′ indicam sua proximidade espacial. Adicionalmente, as correlações ROESY de H-8/H-11, H-2/H3-15 e H-1′/H-4′ indicam que as ligações duplas Δ7(8), Δ3′(4′) e Δ1′(2′) são todas de orientação E. Para finalmente esclarecer a configuração absoluta de 1, um cristal foi felizmente obtido; uma subsequente análise de difração de raios X de monocristal com radiação CuKα (Figura 3) permitiu-nos atribuir a configuração absoluta de 1 como 9S,10S, 3′S,4′R,8′R,12′R.
Commiphoroid F (2), obtido como cristais incolores em forma de agulha (MeOH), apresentou fórmula molecular C30H42O4 (dez graus de insaturação) derivada de seus espectros de HRESIMS (m/z 489,2917, calculado 489,2981 [M + Na]⁺), 13C NMR e DEPT (Materiais Suplementares). Os dados de 1H NMR (Tabela 1) de 2 exibem seis metilas (three singletos e três dupletos) e três prótons de metino olefínico (δH 4,44; 5,07; 4,88). Os espectros de 13C NMR e DEPT mostram 30 carbonos atribuídos a seis metilas, oito metilenos (um olefínico), oito metinos (um olefínico, quatro oxigenados e três alifáticos) e oito carbonos não protonados (um ceto-carbonila, quatro olefínicos, três alifáticos incluindo dois oxigenados). Esses dados indicam que 2 pode ser um dímero sesquiterpenoide. A inspeção dos dados de RMN revelou que os sinais de RMN da parte I em 2 são semelhantes aos da parte I em commiphoroid A. Os demais dados de RMN de 2 são similares aos de 1,2-epoxifuruno-10(15)-germacreno-6-ona, diferindo pelo fato de que um anel furano nesta é substituído por um 2,5-di-hidrofurano em 2. Essa mudança é suportada pelas correlações HMBC de H₃-13′/C-12′ (δC 92,3), H-9′/C-8′ (δC 94,5), C-7′ (δC 140,3). Conforme mostrado na Figura 4, as partes I e II de 1 estão fundidas via C-9−C-8′ e C-10−C-12′, suportadas pelas correlações HMBC de H-9/C-8′, H-8/C-8′, H-9′/C-9, H-12′/C-9, C-10 e H₃-14/C-12′. Dessa forma, a estrutura planar de 2 foi identificada.

As configurações relativas na parte I de 2 são as mesmas de commiphoroid A, pela análise de suas correlações ROESY (Figura 4). Quanto à estereoquímica da parte II, observam-se correlações ROESY de H-4′/H-2′ e H-12′/H₃-13′, indicando sua relação espacial. Além disso, uma correlação ROESY de H-8/H-11 indica que a dupla ligação Δ7(8) possui configuração E. No entanto, é difícil esclarecer a estereoquímica nos centros quirais do macrociclo devido aos conformeros flexíveis. A estereoquímica de 2 foi finalmente atribuída como 3S,4S,9S,10S,1′R,2′R,4′S,8′R,12′S por análise de difração de raios X em monocristal (Figura 5).
O Composto 3, obtido como um pó branco, foi encontrado possuir uma fórmula molecular de C22H32O (sete graus de insaturação) derivada de seus espectros de HRESIMS (m/z 312.2449, calcd 312.2453 [M]+), RMN de 13C e DEPT (Materiais Suplementares). O espectro de RMN de 1H (Tabela 2) de 3 exibe cinco metilas (cinco singletos) e três metinos sp2 (δH 6,17, 6,23 e 5,82). Os espectros de RMN de 13C e DEPT exibem 22 carbonos atribuídos a cinco metilas, seis metilenos, cinco metinos (três sp2) e seis carbonos não protonados (um ceto-carbonila, um olefínico e quatro alifáticos). Esses dados indicam que 3 pode ser um triterpenoide. A inspeção de seus dados de RMN mostrou que os sinais de RMN de 3 são semelhantes aos do commiphorane G2. A diferença entre eles é que um grupo hidroxi em C-3 no commiphorane G2 é substituído por um ceto-carbonila em 3. Essa alteração é suportada pelas correlações de HMBC (Figura 6) de H-2/C-3 e H3-21/C-3. Assim, a estrutura planar de 3 foi identificada e nomeada como 3-oxo-commiphorane G2. Para a estereoquímica de 3, as correlações ROESY de Ha-6/H3-21, H3-18; H3-19/H3-21, H3-18; H-9/H-22, H-5, e H-5/Hb-6, H3-20 indicam claramente que a estereoquímica nos centros quirais é 5R*,8R*,9R*,10R*,14R*.

O Composto 4, obtido como um óleo marrom, possui uma fórmula molecular de C14H16O2 (sete graus de insaturação) derivada de seus espectros de HRESIMS (m/z 217.1219, calculado 217.1223 [M + H]+), RMN de 13C e DEPT (Materiais Suplementares). O espectro de RMN de 1H (Tabela 2) de 4 exibe três metilas (três singletos) e dois metinos sp2 (δH 6,42, 6,61). Os espectros de RMN de 13C e DEPT exibem 14 carbonos classificados em três metilas, dois metilenos, dois metinos (dois olefínicos) e sete carbonos não protonados (um ceto-carbonila e seis olefínicos). Esses dados indicam que 4 é um norsesquiterpenoide semelhante a (4α)-8-hidroxi-12-norcardina-6,8,10-trien-11-ona. A diferença é que uma dupla ligação Δ4(5) aparece no esqueleto de 4, o que obtém suporte das evidências de HMBC (Figura 6) de H3-14/C-4, C-5, e H-3/C-4. Como resultado, a estrutura de 4 foi deduzida como 8-hidroxi-12-norcardina-4,6,8,10-tetraen-11-ona.

Os compostos conhecidos foram identificados como nepetaefolin F (5), ácido 7-oxocalitrísico (6), ácido 7-oxo-ganodérico Z (7), respectivamente, por comparação de seus dados espectroscópicos com aqueles relatados na literatura.
2.2. Avaliação Biológica
É bem conhecido que a daseterapia tem sido utilizada para o tratamento da tuberculose pulmonar, e substâncias aromáticas da floresta, como os terpenos, foram consideradas benéficas para pacientes que sofrem de tuberculose pulmonar. Neste estudo, propusemos que plantas aromáticas podem ser uma fonte potencial de agentes ativos contra M. tuberculosis. Com isso, os compostos 1 e 5−7 foram avaliados quanto às suas atividades antimicobacterianas contra cepas sensíveis (H37Ra, H37Rv) e isolados clínicos MDR (C-200-7, C-200-29 e C-200-39). Todas as cepas foram expostas à mesma concentração (200 μM) por sete dias, e a inibição do crescimento bacteriano foi determinada medindo a absorbância e comparando com um controle negativo por meio de ensaios REMA. Os resultados (Tabela 3) mostram que todos os compostos testados e a isoniazida (INH) inibiram significativamente o crescimento das cepas sensíveis. Para as cepas clínicas MDR, a INH foi utilizada para confirmar três cepas clínicas MDR que eram resistentes à INH por testes microbiológicos clínicos. Os resultados mostraram que todas as três cepas clínicas MDR eram resistentes à INH, em comparação com H37Ra e H37Rv. Entre as cepas clínicas, a potência inibitória dos compostos varia em diferentes cepas. Em comparação, os efeitos inibitórios dos compostos 5 e 6 em cepas clínicas MDR são melhores que os de 1 e 7. Neste estudo, apesar de a concentração inibitória dos compostos isolados contra a TB ser maior que a da INH, isso ainda implica que tais modelos estruturais podem ser úteis para futuras otimizações de medicamentos no campo da TB. Por último, mas não menos importante, os presentes achados indicam que compostos naturais de plantas aromáticas podem possuir mecanismos diferentes contra a TB em contraste com químicos sintéticos como a INH, devido às observações de que os primeiros demonstram principalmente inibição em vez de morte das cepas de M. tuberculosis.

Neste estudo, a citotoxicidade dos compostos 1 e 5−7 também foi determinada usando monócitos humanos THP-1 e linhagem de células de câncer de pulmão (A549) para obter uma visão sobre a toxicidade celular dos isolados. Todas as células foram expostas às mesmas concentrações (200 μM) por 24 h, e a viabilidade celular foi quantificada pelo ensaio WST-1 (Tabela 4). Os resultados mostram que os compostos 1, 6 e 7 são fracamente tóxicos para THP-1 a 200 μM, enquanto este não é o caso para o composto 5. Além disso, os compostos 5 e 7 não exibem efeito inibitório sobre as células A549 mesmo a 200 μM. Em contraste, o composto 1 (200 μM) foi considerado fracamente ativo contra células de câncer humano (A549).

3. Seção Experimental
   3.1. Procedimentos Gerais
   As rotações ópticas foram determinadas em um polarímetro Jasco P-1020. Os espectros de UV foram registrados em um espectrômetro Shimadzu UV-2401PC. Os espectros de CD foram obtidos em um instrumento Chirascan. Os espectros de RMN foram medidos em um espectrômetro Bruker AV-400 ou AV-800, com TMS como padrão interno. ESIMS e HRESIMS foram medidos em um espectrômetro API QSTAR Pulsar 1. Sílica gel (200–300 mesh; Qingdao Marine Chemical Inc., China), YMC-Pack ODS-A 250 mm × 9,4 mm, d.i., 5 µm, Thermo Hypersil GOLD-C18 250 mm × 21,2 mm, d.i., 5 µm., gel MCI CHP 20P (75–150 μm, Mitsubishi Chemical Industries, Tóquio, Japão), sílica gel C-18 (40–60 µm; Daiso Co., Japão) e Sephadex LH-20 (Amersham Pharmacia, Suécia) foram usados para cromatografia em coluna. A HPLC semipreparativa foi realizada utilizando um cromatógrafo líquido Agilent 1200 equipado com uma coluna Agilent Zorbax SB-C18 (250 mm × 9,4 mm, d.i., 5 μm).

3.2. Resinas Vegetais
Os materiais medicinais da Resina Commiphora (mirra) foram obtidos no Mercado Juhuacun de Matéria Médica, Kunming, Província de Yunnan, República Popular da China, em julho de 2013. O material foi identificado pelo Sr. Bin Qiu no Instituto Yunnan de Matéria Médica, e um espécime voucher (CHYX-0585-2) foi depositado na Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de Shenzhen, China, em novembro de 2017.

3.3. Extração e Isolamento
A mirra seca (50 kg) foi moída e embebida com EtOH 95% (180 L, 3 × 48 h) para obter um extrato bruto, o qual foi suspenso em água morna seguido de extração com AcOEt para fornecer um extrato solúvel em AcOEt (8,0 kg). Este extrato foi dividido em seis partes (Fr.A–Fr.F) usando cromatografia em coluna de gel de sílica eluída com éter de petróleo–acetona (100:0, 100:1, 60:1, 40:1, 20:1, 5:1, 3:1, 1:1, 0:100). Fr.B (2,4 kg) foi separada adicionalmente via uma coluna de gel de sílica lavada com éter de petróleo–AcOEt (100:0, 100:1, 60:1, 40:1, 20:1, 5:1, 3:1, 1:1) e éter de petróleo–acetona (5:1, 3:1, 1:1) para fornecer seis porções (Fr.B.1–Fr.B.6). Fr.B.1 (240 g) foi submetida a uma coluna MCI gel CHP 20P lavada com gradiente de MeOH aquoso (30–100%) para fornecer sete porções (Fr.B.1.1–Fr.B.1.7). Fr.B.1.3 (13,0 g) foi separada via C-18 eluída com MeOH aquoso (40–100%) para fornecer três porções (Fr.B.1.3.1–Fr.B.1.3.3). Fr.B.1.3.2 (7,5 g) foi dividida em três porções (Fr.B.1.3.2.1–Fr.B.1.3.2.3) por C-18 eluída com MeOH aquoso (55–100%). Dentre elas, Fr.B.1.3.2.2 (1,1 g) foi submetida a Sephadex LH-20 (MeOH) seguido por HPLC semipreparativa (MeOH aquoso, 80%) para fornecer 4 (1,2 mg, tR = 11,3 min; fluxo: 3 mL/min). Fr.B.5 (186,6 g) foi separada via MCI gel CHP 20P eluída com MeOH aquoso (55–100%) para fornecer oito porções (Fr.B.5.1–Fr.B.5.8). Fr.B.5.5 (16 g) foi separada via C-18 eluída com MeOH aquoso (50–100%) para fornecer nove porções (Fr.B.5.5.1–Fr.B.5.5.9). Fr.B.5.5.7 (4,0 g) foi submetida a Sephadex LH-20 (MeOH) para fornecer cinco frações (Fr.B.5.5.7.1–Fr.B.5.5.7.5). A separação adicional por HPLC semipreparativa em Fr.B.5.5.7.2 (21,2 mg) com MeCN aquoso (70%) forneceu Fr.B.5.5.7.2.8 (10,6 mg), a qual foi purificada por HPLC semipreparativa (MeOH aquoso, 80%) para fornecer 2 (0,9 mg, tR = 19,9 min; fluxo: 3 mL/min). Fr.B.5.7 (17,0 g) foi submetida a uma coluna C-18 lavada com MeOH aquoso (40–100%) para fornecer catorze porções (Fr.B.5.7.1–Fr.B.5.7.14). Fr.B.5.7.5 (510,7 mg) foi submetida a Sephadex LH-20 (MeOH) para fornecer três frações (Fr.B.5.7.5.1−Fr.B.5.7.5.3). Fr.B.5.7.5.3 (20,0 mg) foi purificada por HPLC semipreparativa (MeCN aquoso, 55%) para fornecer duas porções. O composto 7 (0,8 mg, tR = 12,9 min; fluxo: 3 mL/min) foi purificado a partir de Fr.B.5.7.5.3.2 (2,1 mg)) por separação em HPLC (MeOH aquoso, 78%). Fr.B.5.7.10 (1,98 g) foi submetida a uma coluna MCI gel CHP 20P lavada com gradiente de MeOH aquoso (60–100%) para fornecer catorze porções (Fr.B.5.7.10.1–Fr.B.5.7.10.14).
Fr.B.5.7.10.2 (320,0 mg) foi dividido em dez partes (Fr.B.5.7.10.2.1–Fr.B.5.7.10.2.10) usando cromatografia líquida a vácuo em gel de sílica eluído com éter de petróleo–acetona (50:0, 30:1, 20:1, 10:1, 8:1, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1). Posteriormente, HPLC semi-preparativa em Fr.B.5.7.10.2.5 (35,1 mg) com MeOH aquoso (86%) forneceu Fr.B.5.7.10.2.5.3 (11,3 mg), em seguida foi purificada por HPLC semi-preparativa (MeCN aquoso, 83%) para fornecer 1 (1,8 mg, tR = 14,9 min; taxa de fluxo: 3 mL/min). Fr.B.5.8 (25,8 g) foi separado através de uma coluna C-18 eluída com MeOH aquoso (50–100%) para fornecer dez porções (Fr.B.5.8.1–Fr.B.5.8.10). Fr.B.5.8.6 (0,6 g) foi submetido a Sephadex LH-20 (MeOH) para render cinco frações (Fr.B.5.8.6.1–Fr.B.5.8.6.5). Os compostos 5 (2,1 mg, tR = 14,0 min; taxa de fluxo: 3 mL/min) e 6 (1,7 mg, tR = 17,1 min; taxa de fluxo: 3 mL/min) foi fornecido de Fr.B.5.7.5.3.2 (23,2 mg) por separação por HPLC (MeOH aquoso, 62%). Fr.B.5.8.9 (4,7 g) foi submetido a Sephadex LH-20 (MeOH) para render sete frações (Fr.B.5.8.9.1–Fr.B.5.8.9.7). Das quais, Fr.B.5.8.9.6 (160,0 mg) foi fracionado por HPLC semi-preparativa (MeOH aquoso, 90%) para fornecer 3 (1,7 mg, tR = 26,6 min; taxa de fluxo: 3 mL/min).
3.4. Dados de Caracterização dos Compostos
Commiphoroid E (1): cristais incolores em forma de agulha (MeOH), [α]D25 +8.8 (c 0,04, MeOH); UV (MeOH) λmáx (log ε) 226 (0,43, ombro); ESIMS (positivo) m/z 467 [M + H]+; HRESIMS m/z 467,3150 [M + H]+ (calculado para C30H43O4, 467,3156); dados de RMN de 1H e 13C, ver Tabela 1.
Commiphoroid F (2): cristais incolores em forma de agulha (MeOH); [α]D25 + 26,58 (c 0,16, MeOH); UV (MeOH) λmáx (log ε) 248 (3,72), 203 (4,05); ESIMS (positivo) m/z 489 [M + Na]+; HRESIMS m/z 489,2974 [M + Na]+ (calculado para C30H42NaO4 489,2981); dados de RMN de 1H e 13C, ver Tabela 1.
3-Oxo-commiphorane G2 (3): pós brancos; [α]D23 +11,3 (c 0,13, MeOH); EIMS (positivo) m/z 312 [M]+; HREIMS m/z 312,2449 [M]+ (calculado para C22H32O 312,2453); dados de RMN de 1H e 13C, ver Tabela 2.
8-Hydroxy-12-norcardina-4,6,8,10-tetraen-11-one (4): óleos marrons; ESIMS (positivo) m/z 217 [M + H]+; HRESIMS m/z 217,1219 [M + H]+ (calculado para C14H17O2 217,1223); dados de RMN de 1H e 13C, ver Tabela 2.
3.5. Análise Cristalográfica de Raios X de 1 e 2
Dados cristalográficos para o composto 1: Os dados foram coletados usando um CCD Sapphire com radiação Cu Kα monocromada por grafite, λ = 1,54184 Å a 100 K. Dados cristalográficos: C30H42O4, M = 466,63 g/mol, grupo espacial P212121; as dimensões da célula unitária foram determinadas como a = 9,7285(3) Å, b = 15,5353(5) Å, c = 17,4067(6) Å, α = 90°, β = 90°, γ = 90°, V = 2630,75(15) Å3, Z = 4, T = 100,00(10) K, Dcalc = 1,178 g/cm3, F(000) = 1016,0, μ (Cu Kα) = 0,599 mm−1, 13.183 reflexões medidas (7,628° ≤ 2Θ ≤ 147,196°), 5203 únicas (Rint = 0,0435, Rsigma = 0,0358), que foram utilizadas em todos os cálculos. O R1 final foi 0,0575 (I > 2σ(I)) e wR2 foi 0,1596. O refinamento final resultou em R = 0,0575(4971), Rw = 0,1596(5203), S = 1,054 e Flack = 0,04(14). Os dados cristalográficos da estrutura 1 foram depositados no Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC 1900483).
Dados cristalográficos para o composto 2: Dados cristalográficos para cu_q58d_0m: C30H42O4·H2O, M = 484,65, a = 10,9521(4) Å, b = 8,4631(4) Å, c = 15,3423(7) Å, α = 90°, β = 106,964(2)°, γ = 90°, V = 1360,18(10) Å3, T = 100(2) K, grupo espacial P21, Z = 2, μ(CuKα) = 0,624 mm−1, 14.901 reflexões medidas, 4836 reflexões independentes (Rint = 0,0389). Os valores finais de R1 foram 0,0430 (I > 2σ(I)). Os valores finais de wR(F2) foram 0,1122 (I > 2σ(I)). Os valores finais de R1 foram 0,0455 (todos os dados). Os valores finais de wR(F2) foram 0,1141 (todos os dados). A bondade do ajuste em F2 foi 1,062. Parâmetro de Flack = 0,05(10). Os dados cristalográficos da estrutura 1 foram depositados no Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC 1900642).
A estrutura foi resolvida por métodos diretos usando o programa SHELXS-97 e refinada pelo programa SHELXL-97 e cálculos de mínimos quadrados de matriz completa. Nos refinamentos da estrutura, os átomos não-hidrogênio foram colocados nas posições geometricamente ideais pelo método “ride on”. Os átomos de hidrogênio ligados ao oxigênio foram localizados pelos fatores de estrutura com fatores de temperatura isotrópicos.
3.6. Avaliação Antibacteriana contra M. tuberculosis
Cepas de M. tuberculosis: A cepa atenuada de M. tuberculosis H37Ra, a cepa de referência selvagem H37Rv e três cepas clínicas MDR (C-200-7, C-200-29, C-200-39) foram utilizadas no ensaio modificado baseado em microplaca com resazurina. C-200-7 é resistente a INH, rifampicina e estreptomicina. C-200-29 e C-200-39 são ambas resistentes a INH, rifampicina, etambutol e estreptomicina. Todas as cepas de M. tuberculosis foram cultivadas em caldo DifcoTM Middlebrook 7H9 (Becton Dickinson, BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) com 10% de enriquecimento de ácido oleico–albumina–dextrose–catalase (OADC) (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA), 0,05% (v/v) de Tween 80 e 0,2% (v/v) de glicerol a 37 °C. Para determinar os efeitos da atividade bactericida dos compostos contra M. tuberculosis, as culturas bacterianas em fase logarítmica média foram diluídas em caldo Middlebrook 7H9 com OADC até uma absorbância a 600 nm (DO600) de 0,02 usando o espectrofotômetro de microplaca Epoch™ 2 (BioTek, Winooski, VT, EUA). A cultura e os fármacos (200 μM) foram transferidos para placas de 96 poços (Corning, Corning, NY, EUA), e cada placa de triagem de 96 poços continha três colunas de controle com 0,5% de dimetilsulfóxido (DMSO). As culturas bacterianas foram incubadas a 37 °C com agitação lenta horizontal. A atividade bactericida dos compostos foi medida a partir de poços duplicados nos ensaios de absorbância após 7 dias de tratamento usando o espectrofotômetro de microplaca Epoch™ 2.
3.7. Ensaio de Viabilidade Celular
Células monócitas THP-1 e células de câncer de pulmão de células não pequenas humanas A549 foram obtidas do Banco de Células da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). As THP-1 foram cultivadas em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) e as A549 foram mantidas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e suplementadas com 10% de soro fetal bovino, incubadas a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2. As linhagens celulares foram expostas às mesmas concentrações (200 μM) dos compostos 1 e 5−7 por 24 h, e DMSO foi utilizado como controle negativo. A viabilidade celular foi medida usando o kit de reagente WST-1 (Beyotime Biotechnology, Xangai, China). A solução de WST-1 foi adicionada e incubada por 2–4 h a 37 °C. A absorbância foi medida a 450 nm e 650 nm usando o espectrofotômetro de microplaca Epoch™ 2 (BioTek, Winooski, VT, EUA). A viabilidade celular foi calculada de acordo com as instruções do fabricante.
4. Conclusões
No presente estudo, dois novos dímeros sesquiterpenoides, commiphoroides E (1) e F (2), e três terpenoides conhecidos (3−5), foram caracterizados da Resina Commiphora, sendo 1 um dímero norsesquiterpenoide. As atividades antimicrobianas contra M. tuberculosis dos isolados de resinas aromáticas não apenas indicam a justificativa científica da utilização de material aromático no campo antimicrobiano, mas sugerem um novo arcabouço estrutural para o desenvolvimento de fármacos anti-TB.
Amostras Disponíveis: Amostras dos compostos 1, 5 e 6 estão disponíveis com os autores.
Materiais Suplementares
Os seguintes estão disponíveis online. Figuras S1–S7: Espectros de RMN e HREIMS de 1, Figuras S8–S14: Espectros de RMN e HREIMS de 2, Figuras S15–S21: Espectros de RMN e HREIMS de 3, Figuras S22–S28: Espectros de RMN e HREIMS de 4.
Contribuições dos Autores
Y.-X.C. e Z.-D.Z conceberam e desenharam os experimentos, C.-Z.Z. e Y.C. realizaram os experimentos biológicos. B.-Y.H. e J.-W.L. realizaram os experimentos químicos. D.-P.Q. e Y.-X.C. analisaram os dados. B.-Y.H., X.-C.C. e Y.-X.C. escreveram o artigo. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
Financiamento
Este estudo foi apoiado pelo National Science Fund for Distinguished Young Scholars (81525026, 81525016) e pelo National Key Research and Development Program of China (2017YFA0503900) e pelo The National Science and Technology Major Project of China (2015ZX10004801-003 e 2017ZX10201301-004).
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesse.
Referências
Novos fármacos antituberculose com novos mecanismos de ação
Descoberta de fármacos na tuberculose. Novos alvos farmacológicos e agentes antimicobacterianos
Commiphoratones A e B, Dois dímeros de sesquiterpeno de Resina Commiphora
Commiphoranes A−D, terpenoides com esqueleto carbônico de Resina Commiphora
Nepetaefolins A−J, diterpenoides citotóxicos do tipo chinano e abietano de Caryopteris nepetaefolia
Abietanos de folhas de Juniperus chznensis
Novos ácidos ganodéricos, metabólitos triterpenoides bioativos do cogumelo Ganoderma lucidum
Sínteses e avaliação de hidroxamatos aromáticos substituídos e ácidos hidroxâmicos que alvejam Mycobacterium tuberculosis
Caracterização de dímeros de sesquiterpeno de Resina Commiphora que promovem a proliferação e diferenciação de células-tronco derivadas do tecido adiposo
Sesquiterpenoides dos exsudatos resinosos de Commiphora myrrha e seus efeitos neuroprotetores
Novos terpenoides de Resina commiphora
Sesquiterpenoides de Chloranthus henryi e suas atividades antineuroinflamatórias
Efeito de passeios de banho de floresta na função imunológica humana
Avaliação do ensaio antibacteriano colorimétrico modificado baseado em microplaca de resazurina para teste rápido e confiável de suscetibilidade a fármacos antituberculose
As estruturas dos compostos 1–7.
Correlações-chave de 1H-1H COSY e HMBC para 1.
Estrutura cristalográfica de raios X de 1.
Correlações-chave de 1H-1H COSY e HMBC para 2 e estrutura de commiphoroid A.
Estrutura cristalográfica de raios X de 2.
Correlações-chave de 1H-1H COSY e HMBC para 3 e 4.
Dados de 1H (800 MHz) e 13C RMN (200 MHz) de 1 e 2 em CDCl3 (δ em ppm, J em Hz).
1 2 no. δH δC no. δH δC 1 Ha: 1,44, ddd (12,9; 4,7; 1,9) 35,6, CH2 1 Ha: 2,18, brdd (14,4; 5,9) 41,2, CH2 Hb: 0,99, brs Hb: 1,78, ddd (14,4; 4,8; 2,9) 2 Ha: 2,15, m 2,68, dd (6,5; 16,9) 23,5, CH2 2 Ha: 2,03, m 24,2, CH2 Hb: 1,96, m Hb: 1,47, m 3 4,83, brd (7,7) 122,3, CH 3 3,07, brd (10,0) 62,2 a, CH 4 134,5, C 4 62,3 a, C 5 Ha: 2,11, brd (12,6) 37,2, CH2 5 Ha: 2,10, brdd (13,6; 5,1) 36,6, CH2 Hb: 1,77, brdd (12,6; 2,3) Hb: 1,53, brd (13,6) 6 Ha: 2,30, brd (12,4) 27,4, CH2 6 Ha: 2,67, brd (12,0) 25,7, CH2 Hb: 2,20, brd (12,4) Hb: 2,04, m 7 146,7, C 7 146,6, C 8 5,05, d (11,6) 121,1, CH 8 4,44, d (12,0) 121,2, CH 9 2,24, d (11,6) 49,5, CH 9 2,67, d (12,0) 52,8, CH 10 47,6, C 10 47,2, C 11 2,25, m 35,1, CH 11 2,23, m 33,0, CH 12 1,05, d (6,7) 23,5, CH3 12 1,01, d (6,7) 20,9, CH3 13 1,08, d (6,7) 22,2, CH3 13 1,12, d (6,7) 22,5, CH3 14 1,04, s 21,9, CH3 14 0,73, s 17,2, CH3 15 1,49, s 17,8, CH3 15 1,12, s 20,9, CH3 1′ 5,96, d (16,6) 146,2, CH 1′ 2,74, brs 61,4, CH 2′ 5,95, dd (16,6; 9,2) 132,1, CH 2′ 2,25, brdd (10,4; 2,2) 62,2 a, CH 3′ 3,18, brd (9,2) 88,4, CH 3′ Ha: 2,14, m 40,0, CH2 Hb: 1,02, m 4′ 2,67, m 38,4, CH 4′ 2,17, m 29,6, CH 5′ Ha: 2,48 brd (12,1) 47,6, CH2 5′ Ha: 2,92, brd (14,0) 54,2, CH2 Hb: 2,27 brd (12,1) Hb: 2,21, m 6′ 204,6, C 6′ 199,5, C 7′ 147,2, C 7′ 140,3, C 8′ 92,9, C 8′ 94,5, C 9′ Ha: 3,31, d (12,9) 41,6, CH2 9′ Ha: 3,37 d (14,1) 37,1, CH2 Hb: 2,55, d (12,9) Hb: 2,44 d (14,1) 10′ 202,2, C 10′ 141,9, C 11′ 146,1, C 11′ 154,4, C 12′ 4,07, s 91,7, CH 12′ 4,13, s 92,3, CH 13′ 1,99, s 14,9, CH3 13′ 2,19, s 16,4, CH3 14′ 1,17, d (6,8) 18,7, CH3 14′ 1,10, d (6,6) 23,8, CH3 3′-OMe 3,21, s 57,4, CH3 15′ Ha: 5,07, brs 111,6, CH2 Hb: 4,88, brs
a O símbolo na mesma coluna pode ser intercambiável.
Dados de RMN de 1H (800 MHz) e 13C (200 MHz) de 3 e 4 em CDCl3 (δ em ppm, J em Hz).
3 4 no. δH δC δH δC 1 2,50, m 34,1, CH2 125,5, C 2,49, m 2 2,01, m 40,2, CH2 Ha:2,61 sobrep. 23,8, CH2 1,58, m Hb:2,22 sobrep. 3 218,0, C 2,60 sobrep. 28,0, CH2 2,23 sobrep. 4 47,3, C 140,5, C 5 1,50, m 55,2, CH 6,42 d (1,28) 122,0, CH 6 1,50, m 19,7, CH2 135,5, C 1,49, m 7 Ha:1,81, m 36,5, CH2 117,8, C Hb:1,57, sobrep. 8 40,9, C 158,8, C 9 1,48, sobrep. 50,4, CH 6,61 s 116,6, CH 10 37,3, C 143,0, C 11 Ha:1,66, m 23,6, CH2 205,6, C Hb:1,40, sobrep. 12 Ha:2,64, m 26,3, CH2 2,58 s 32,3, CH3 Hb:2,17, m 13 156,9, C 2,25 s 20,4, CH3 14 61,0, C 2,01 s 24,1, CH3 15 6,17, d (5,3) 142,3, CH 16 6,23, dd (5,3; 1,8) 129,7, CH 17 5,82, d (1,8) 120,5, CH 18 0,66, s 15,2, CH3 19 0,91, s 16,3, CH3 20 1,04, s 21,0, CH3 21 1,12, s 27,0, CH3 22 1,03, s 16,9, CH3
As atividades inibitórias dos compostos contra cepas sensíveis e MDR clinicamente isoladas.
Composto Inibição (200 μM) (%) H37Ra H37Rv C-200-7 C-200-29 C-200-39 1 21.61 ± 3.18 70.20 ± 6.43 32.83 ± 4.29 41.28 ± 26.79 3.10 ± 4.38 5 65.82 ± 5.23 85.86 ± 12.86 58.08 ± 2.14 74.11 ± 6.44 35.48 ± 3.7 6 52.58 ± 4.36 85.35 ± 2.86 44.19 ± 2.5 75.78 ± 4.4 38.81 ± 4.38 7 95.80 ± 6.88 98.23 ±1.79 32.58 ± 3.21 42.67 ± 17.28 9.52 ± 2.69 INH a 100 ± 1.86 100 ± 1.20 46.22 ± 2.13 30.81 ± 1.22 25.42 ± 3.84 Controle negativo 0 ± 1.20 2.53 ± 6.43 0 ± 2.86 1.77 ± 7.50 0 ± 2.29
a 2.92 μM.
A citotoxicidade dos compostos em diferentes linhagens celulares.
Composto Viabilidade celular (200 μM) (%) A549 THP-1 1 22.30 ± 0.19 66.58 ± 0.52 5 105.14 ± 7.39 104.69 ± 14.65 6 81.85 ± 0.32 67.14 ± 0.26 7 103.69 ± 3.44 76.57 ± 0.52 Controle negativo 101.71 ± 2.55 103.39 ± 1.83