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pmid: "32438772"
title: "Mistura de Extrato de Commiphora Atenua Osteoartrite Induzida por Iodoacetato Monossódico."
authors: "Lee D, Ju MK, Kim H"
journal: "Nutrients"
pubdate: "2020 May 19"
doi: "10.3390/nu12051477"
source: "PMC Full Text"

Mistura de Extrato de Commiphora Atenua Osteoartrite Induzida por Iodoacetato Monossódico.

Autores

Lee D, Ju MK, Kim H

Periodico

Nutrients (2020 May 19)

Conteudo

Mistura de Extrato de Commiphora Melhora a Osteoartrite Induzida por Iodoacetato Monossódico

A osteoartrite (OA) é uma doença articular inflamatória crônica que afeta milhões de idosos em todo o mundo. Os tratamentos convencionais para OA, que consistem em anti-inflamatórios não esteroides e esteroides, têm consequências negativas para a saúde, como doenças gastrointestinais, renais e cardíacas. Este estudo avaliou a mistura de extrato de Commiphora (HT083) na progressão da OA como um tratamento alternativo em modelos animais. A raiz de P. lactiflora e a resina gomosa de C. myrrha têm sido utilizadas como medicinas tradicionais contra muitos problemas de saúde, incluindo distúrbios ósseos, desde a antiguidade. Os extratos da raiz de P. lactiflora e da resina gomosa de C. myrrha foram misturados na proporção de 3:1 para seus efeitos ótimos. Ratos machos Sprague-Dawley foram injetados com iodoacetato monossódico (MIA) nas articulações do joelho para induzir sintomas idênticos à OA humana. A HT083 preveniu substancialmente a perda de suporte de peso infligida pelo MIA em ratos. A erosão da cartilagem induzida pelo MIA, bem como o dano ósseo subcondral nos ratos, também foi revertida. Além disso, o aumento da concentração sérica de IL-1β, uma citocina pró-inflamatória crucial envolvida na progressão da OA, foi combatido pela HT083. Além disso, a HT083 reduziu significativamente a resposta de contorção induzida por ácido acético em camundongos.

In vitro, a HT083 demonstrou potentes atividades anti-inflamatórias ao inibir a produção de NO e suprimir a expressão de interleucina-1β, interleucina-6, ciclooxigenase-2 e óxido nítrico sintase induzível em células RAW 264.7 estimuladas por lipopolissacarídeos. Considerando suas potentes atividades analgésicas e anti-inflamatórias em ratos MIA e na contorção induzida por ácido acético em camundongos, a HT083 deve ser mais estudada para explicar seus mecanismos de ação no alívio da dor e inflamação da OA.
Osteoartrite (OA) é a doença articular progressiva mais prevalente entre a população idosa em todo o mundo, caracterizada pela erosão da cartilagem, inflamação sinovial e alteração do osso subcondral, o que causa dor, rigidez e perda de movimento. De acordo com um novo estudo, quase metade da população total com 65 anos ou mais em todo o mundo apresenta sintomas de OA, e 25% deles sofrem de dor incapacitante grave. A dor crônica da OA está ligada à erosão da cartilagem articular causada pela inflamação e, quando piora, os ossos podem entrar em contato uns com os outros, causando dor intensa e até perda de movimento. Como a inflamação sinovial é um dos principais sinais de OA, o papel das citocinas e mediadores inflamatórios na progressão da OA é agora bem reconhecido. A sinóvia e os condrócitos produzem e liberam citocinas e mediadores inflamatórios no líquido sinovial de pacientes com OA. Como os pacientes com OA estão principalmente preocupados com a dor e a inflamação, as estratégias terapêuticas atuais são projetadas exclusivamente para suprimir a dor e a inflamação. Embora os anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) e corticosteroides sejam atualmente usados para o controle da dor na OA, seu uso a longo prazo em idosos está frequentemente associado a consequências negativas para a saúde, incluindo distúrbios cardiovasculares, renais e gastrointestinais. A demanda por um tratamento alternativo para OA que seja seguro e eficaz está, portanto, aumentando.
Produtos naturais bioativos estão atraindo enorme atenção como tratamento alternativo para muitos problemas de saúde, graças ao seu alto nível de segurança e eficácia. Extensos estudos de pesquisa foram realizados com inúmeras ervas medicinais tradicionais para desenvolver tratamentos alternativos para doenças inflamatórias, incluindo artrite. Selecionamos a raiz de Paeonia lactiflora Pall e a resina gomosa de Commiphora myrrha por suas potenciais propriedades antiartríticas. P. lactiflora é uma medicina tradicional usada para tratar dor, inflamação e distúrbios imunológicos há mais de 1000 anos na China. A raiz de P. lactiflora contém vários constituintes farmaceuticamente ativos, como paeoniflorina, albiflorina e penta-O-galoil-β-d-glicose, e é conhecida por ter atividades antioxidante, anti-inflamatória, antiviral e antitumoral. C. myrrha é nativa do nordeste da África; sua resina gomosa aromática tem sido amplamente utilizada para o tratamento de artrite reumatoide, sinusite e tosse, problemas gengivais e gengivite, e dor de garganta. Diversos metabólitos secundários, incluindo terpenoides, esteroides, flavonoides, açúcares, lignanas, etc., foram descobertos neste gênero. Tanto a raiz de P. lactiflora quanto a C. myrrha demonstraram excelentes propriedades antinociceptivas e anti-inflamatórias em modelos animais, bem como propriedades de proteção da cartilagem e anti-inflamatórias em ensaios in vitro de nossos experimentos preliminares.
O uso de fórmulas fitoterápicas na medicina antiga, assim como na medicina natural moderna, é bem documentado. Historicamente, as fórmulas fitoterápicas são consideradas superiores aos tratamentos com ervas individuais em termos de potência e segurança, pois as ervas individuais podem produzir efeitos sinérgicos e neutralizar qualquer toxicidade potencial por meio de interações. Embora P. lactiflora e C. myrrha tenham sido usadas na medicina tradicional para tratar doenças articulares, nenhum estudo investigou a mistura dessas duas ervas contra a OA. Para nosso estudo, P. lactiflora e C. myrrha foram misturadas na proporção de 3:1 (p/p), escolhida após uma série de testes. A mistura do extrato de Commiphora foi denominada HT083.

O modelo animal de OA induzido por monoiodoacetato de sódio (MIA) é bem conhecido por reproduzir os sintomas observados em pacientes com OA. Quando injetado na cavidade articular, o MIA interrompe o metabolismo energético glicolítico nos condrócitos e causa morte celular, levando à inflamação e danos à cartilagem. As contorções induzidas por ácido acético são um modelo bem estabelecido para avaliar as atividades analgésicas periféricas de medicamentos naturais e convencionais, permitindo medir quantitativamente a dor. O ácido acético pode induzir dor ao liberar prostaglandina, histamina, serotonina e citocinas no fluido peritoneal. As células RAW 264.7 estimuladas por lipopolissacarídeo (LPS) são um modelo in vitro amplamente aceito para estudar respostas inflamatórias, que liberam várias citocinas inflamatórias, quimiocinas e mediadores, como óxido nítrico (NO), óxido nítrico sintase induzível (iNOS), ciclooxigenase-2 (COX-2), fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β) e interleucina-6 (IL-6), entre outros, por meio da ativação de vias inflamatórias, como o fator nuclear-kB (NF-kB) e as proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs). O presente estudo tem como objetivo avaliar as atividades antinociceptiva e anti-inflamatória do HT083 contra a OA, utilizando o modelo de rato com MIA, o modelo de camundongo com contorções induzidas por ácido acético e macrófagos RAW 264.7 estimulados por LPS.

2. Resultados

2.1. Análise por CLAE dos Extratos de P. lactiflora e C. myrrha

Os principais compostos nos extratos de P. lactiflora e C. myrrha foram identificados como paeoniflorina e mirona, respectivamente, usando o método CLAE-UV. Um cromatograma tridimensional de CLAE, incluindo a estrutura dos compostos constituintes, é mostrado na Figura 1A,B. O teor de paeoniflorina em P. lactiflora foi de 79,9 mg/g (8%) e o teor de mirona em C. myrrha foi de 0,54 mg/g (0,05%).

2.2. Distribuição de Suporte de Peso em Ratos com Monoiodoacetato de Sódio (MIA)
As mudanças na distribuição de carga entre os membros posteriores direito e esquerdo são um indicador de desconforto e dor articular, e esse índice é frequentemente utilizado em modelos de roedores para avaliar as atividades antinociceptivas de produtos naturais e compostos contra a OA. A distribuição de carga entre os membros direito e esquerdo medida durante o período de tratamento por 24 dias após a injeção de MIA é mostrada na Figura 2A. A injeção de MIA desencadeou uma perda drástica na capacidade de suporte de carga nos ratos desde o dia 3 e continuou significativamente menor em comparação com o grupo sham durante todo o período. No entanto, a suplementação de HT083 aos ratos MIA resultou em uma melhora considerável no suporte de carga. Notavelmente, 300 HT083 teve um nível de efeito semelhante ao da indometacina no aumento da capacidade de suporte de carga nos ratos (Figura 2B).
2.3. Articulações do Joelho e Cartilagem Articular por HT083
As imagens fotográficas das articulações do joelho dos ratos mostram que o MIA infligiu danos enormes à cartilagem, que foram melhorados pelo HT083. Como mostrado na Figura 3A, o rato sham apresentava uma cartilagem normal e lisa na articulação do joelho, enquanto o rato controle injetado com MIA apresentava uma cartilagem danificada com uma superfície mais áspera e menos polida. O HT083 recuperou a perda de cartilagem infligida pelo MIA, e a recuperação da cartilagem no rato alimentado com 300 HT083 foi maior do que no rato tratado com indometacina. Os ratos injetados com MIA também tiveram uma grande perda de osso subcondral na tíbia central, medial e lateral, enquanto essa erosão óssea foi mitigada com o tratamento de 300 HT083, conforme observado nas imagens de micro-CT (Figura 3C). A análise de micro-CT da tíbia subcondral medial e lateral mostra que o MIA causou um afinamento do osso cortical, e a suplementação com 300 HT083 resultou em uma melhora notável no osso cortical (Figura 3D,E).
2.4. IL-1β Sérica em Ratos com Osteoartrite (OA) Induzida por MIA
A presença de citocinas pró-inflamatórias aumenta no soro de indivíduos com OA à medida que a doença progride. O HT083 mostrou um potente efeito anti-inflamatório ao suprimir o nível sérico de IL-1β, um modulador chave na inflamação da OA. Como mostrado na Figura 4, houve um aumento drástico na concentração de IL-1β no grupo controle injetado apenas com MIA, enquanto o tratamento com HT083 (300 mg/kg) atenuou o nível sérico de IL-1β dos ratos MIA (Figura 4).
2.5. Efeitos do HT083 nas Contorções Induzidas por Ácido Acético em Camundongos
Há um consenso crescente de que a contorção induzida por ácido acético em animais de laboratório simula a dor periférica originada de doenças inflamatórias e outras. Sabe-se que o ácido acético induz dor ao produzir mediadores da dor, incluindo prostaglandina, e a dor pode ser medida quantitativamente observando as respostas de contorção. No presente estudo, o ácido acético foi administrado por via oral, e as respostas de contorção dos camundongos foram registradas por 10 minutos. Verificou-se que o número de contorções induzidas por ácido acético foi reduzido pelos tratamentos com HT083. A redução das respostas de contorção pelo HT083 a 600 mg/kg foi de 37%, o que foi comparável ao do fármaco padrão, ibuprofeno (40%) a 200 mg/kg (Figura 5).
2.6. Efeitos do HT083 Contra Respostas Inflamatórias em Células RAW264.7 Estimuladas por Lipopolissacarídeo (LPS)
As atividades anti-inflamatórias do HT083 foram avaliadas em macrófagos RAW264.7 induzidos por LPS. O HT083 mostrou potentes efeitos anti-inflamatórios ao reduzir a concentração de NO e a expressão de IL-1β, IL-6, iNOS e COX-2. Nenhuma citotoxicidade potencial do HT083 foi observada em até 300 µg/mL nas células RAW264.7 (Figura 6A). A produção de NO estimulada por LPS foi diminuída pelo HT083 de forma dose-dependente. Notavelmente, uma redução de ~50% do NO foi obtida com 300 de HT083 em comparação com o controle (Figura 6B). Os efeitos anti-inflamatórios do HT083 em células RAW264.7 induzidas por LPS foram analisados por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), ELISA e western blotting.
Conforme mostrado na Figura 7A, a expressão de mRNA de IL-1β, IL-6, iNOS e COX-2 aumentou dramaticamente nas células estimuladas por LPS. Todas as quatro citocinas nas células foram suprimidas tanto pelo HT083 (30–300 µg/mL) quanto pela dexametasona (1 µg/mL). O efeito anti-inflamatório do HT083 foi dose-dependente, e 300 de HT083 mostrou nível de efeitos semelhante ao da dexametasona.
Conforme ilustrado na Figura 8, a expressão proteica das citocinas e mediadores pró-inflamatórios, como IL-6 e IL-1β, iNOS e COX-2, foi suprimida pelo tratamento com HT083 em células RAW264.7 estimuladas por LPS. 300 de HT083 reduziu as concentrações de IL-6 e IL-1β nas células RAW264.7 para o nível do controle positivo (Figura 8A–C). Como mostrado na imagem de western blot, a expressão de IL-1β, iNOS e COX-2 foi reduzida de forma dose-dependente pelo HT083 (Figura 8D). Notavelmente, 300 de HT083 mostrou efeitos anti-inflamatórios superiores contra todas as três citocinas em comparação com o controle positivo.
3. Discussão
A mistura fitoterápica de raiz de P. lactiflora e goma de C. myrrha HT083 neste estudo mostrou propriedades analgésicas notáveis ao aumentar a capacidade de suporte de peso em ratos com MIA e diminuir as respostas de contorção em camundongos induzidas por ácido acético. Além disso, o HT083 suprimiu a inflamação ao regular negativamente as citocinas e mediadores pró-inflamatórios em ratos com MIA e em células RAW264.7 estimuladas por LPS. Além disso, a degeneração da cartilagem e a erosão do osso subcondral em ratos com MIA foram recuperadas com o tratamento com HT083.
A alteração na capacidade de suporte de peso, medida por um teste comportamental conhecido como teste de incapacidade, é amplamente aceita como um indicador de comportamento doloroso em ratos com MIA, visto que os membros posteriores do roedor suportam menos peso à medida que o animal sente dor. O MIA é um inibidor glicolítico que inibe a glicólise dos condrócitos, levando à morte celular e desencadeando inflamação, resultando na degeneração da cartilagem e alteração do osso subcondral na articulação do joelho. A administração intraperitoneal de MIA em ratos é um modelo amplamente aceito e arquetípico para o estudo da OA, pois pode exibir muitos dos comportamentos nociceptivos, incluindo atributos patológicos, como inflamação do tecido sinovial e degradação da cartilagem. O teste de incapacidade foi realizado em ratos com OA induzida por MIA por 24 dias, e observou-se que a capacidade de suporte de peso dos ratos injetados com MIA foi altamente melhorada com o tratamento com HT083. Embora a indometacina tenha se mostrado mais eficaz no aumento do suporte de peso nos dias iniciais da doença após a injeção de MIA, o HT083 demonstrou eficácias superiores à indometacina após o dia 11. Enquanto o estágio inicial da OA experimental induzida por MIA é caracterizado por infiltração de macrófagos e inflamação sinovial; o estágio tardio da OA induzida por MIA está associado a perda severa de cartilagem e remodelação do osso subcondral. Presumivelmente, o HT083 forneceu maior proteção contra a erosão da cartilagem e maior capacidade de suporte de peso do que a indometacina aos ratos com MIA no estágio tardio da doença. Além disso, sabe-se que analgésicos centrais, como canabinoides espinhais, podem ter melhor desempenho no alívio da dor do que os AINEs no estágio avançado da OA. Foi sugerido que C. myrrha exerceu funções analgésicas por meio da ativação dos mecanismos opioides cerebrais em camundongos. Um estudo recente relatou que a paeoniflorina, obtida de P. lactiflora, pode mitigar a dor inflamatória ao suprimir a via Akt-NF-kB. Nosso estudo identificou a paeoniflorina em P. lactiflora como um composto majoritário (8%) a partir da análise por CLAE. Pode-se sugerir que os efeitos analgésicos centrais de C. myrrha e os efeitos inibidores de P. lactiflora contra a dor inflamatória podem ter contribuído para o alívio da dor e o aumento do suporte de peso no estágio tardio em ratos com MIA. O aumento da capacidade de suporte de peso dos membros posteriores pelo HT083 nos ratos indica seu efeito antinociceptivo no joelho artrítico.
Uma vez que a dor da OA induz a secreção de substância P das fibras nervosas e agrava ainda mais a inflamação, suprimir a dor não só melhora a qualidade de vida, mas também inibe a progressão adicional da artrite. Como ambos os mecanismos periférico e central estão associados à dor artrítica no modelo MIA, presume-se que o HT083 tenha suprimido a dor de origem tanto periférica quanto central. C. myrrha e P. lactiflora têm sido historicamente usadas como antinociceptivos naturais desde os tempos antigos, e ambas têm funções comprovadas contra dores periféricas e centrais. Este estudo demonstrou os efeitos terapêuticos combinados, bem como os efeitos sinérgicos de C. myrrha e P. lactiflora para tratar a dor e a inflamação da OA em ratos MIA. De acordo com a literatura, as características patológicas das articulações e cartilagens observadas na OA induzida por MIA se assemelham às da OA humana. Portanto, o alívio da dor em ratos OA induzidos por MIA pelo HT083 no presente estudo implica um efeito semelhante na OA humana.
Citocinas pró-inflamatórias desempenham um papel significativo na fisiopatologia da OA ao acelerar a inflamação sinovial, bem como a destruição da cartilagem. Em particular, a IL-1β é considerada um mediador-chave na progressão da inflamação na OA. Foi sugerido que a IL-1β inicia uma resposta inicial à inflamação da OA ao regular positivamente a geração de enzimas de degradação de proteínas extracelulares que danificam as células da cartilagem na OA, enquanto regula negativamente a biossíntese de proteoglicanos e colágeno, os principais componentes da cartilagem. Este estudo descobriu que a IL-1β no soro aumentou após a injeção de MIA em ratos, enquanto a HT083 reduziu significativamente a IL-1β sérica ao nível equivalente ao do controle positivo. A produção excessiva de IL-1β juntamente com outras citocinas pró-inflamatórias promove a progressão da OA ao induzir inflamação e danos à cartilagem, levando à diminuição da capacidade de suporte de peso. Portanto, a redução da IL-1β sérica pela HT083 implica a supressão da resposta inicial à inflamação e a melhora nas capacidades de suporte de peso dos ratos.

A degeneração da cartilagem e a erosão do osso subcondral são dois sintomas patológicos importantes da OA. As imagens fotográficas da secção transversal e as imagens de micro TC das articulações do joelho dos ratos MIA mostram que a supressão da dor pela HT083 ocorreu simultaneamente com a melhora da estrutura da articulação do joelho. Uma recuperação notável da estrutura da cartilagem foi observada nos ratos MIA alimentados com HT083 em comparação com os ratos não tratados. Evidências de pesquisa indicam que o MIA desencadeia a ruptura da matriz da cartilagem e prejudica a estrutura articular em animais experimentais, resultando em características comportamentais e fisiopatológicas idênticas à OA humana. Uma recuperação acentuada da perda óssea subcondral causada pelo MIA foi obtida com o tratamento com HT083, conforme visto nas imagens de micro TC. A literatura sugere que a degeneração da cartilagem e a remodelação da arquitetura do osso subcondral em joelhos artríticos ocorrem devido às respostas inflamatórias no líquido sinovial. De acordo com um estudo anterior, a densidade óssea cortical diminuiu nos ratos MIA em comparação com os ratos normais. O relatório indicou que a microarquitetura subcondral poderia ser modificada devido à remodelação causada pela administração de MIA. Da mesma forma, nosso estudo descobriu que o córtex da tíbia medial e lateral dos ratos MIA foi danificado, o que foi substancialmente recuperado com a suplementação de HT083. Em resumo, HT083 forneceu uma proteção notável contra os danos induzidos por MIA na cartilagem e no osso subcondral.
Embora o papel dos estímulos centrais na dor da OA seja bem reconhecido, as evidências de pesquisas clínicas enfatizam que a dor da OA é predominantemente ocasionada por estímulos periféricos, uma vez que a substituição articular ou o tratamento com analgésicos periféricos pode aliviar a dor da OA na maioria dos casos. O teste de contorção abdominal induzida por ácido acético foi realizado para avaliar os efeitos antinociceptivos do HT083 contra a dor periférica. Na contorção induzida por ácido acético, as atividades de um agente analgésico são medidas quantitativamente a partir das alterações nas respostas de contorção. Neste estudo, o HT083 diminuiu de forma dose-dependente as contorções induzidas por ácido acético em camundongos. Após a injeção, o ácido acético induz dor ao liberar mediadores da dor, o que leva à resposta de contorção no animal. Ao diminuir a resposta de contorção induzida por ácido acético, o HT083 demonstrou alta eficácia contra a dor periférica.

As células RAW264.7 são amplamente utilizadas como modelo inflamatório in vitro para estudar a eficácia de agentes anti-inflamatórios. Quando estimuladas com LPS, essas células imunes liberam citocinas inflamatórias como resposta inflamatória. O presente estudo mostrou que o HT083 pode suprimir efetivamente as respostas inflamatórias induzidas por LPS em células RAW264.7. O HT083 suprimiu notavelmente a superprodução induzida por LPS de NO e das citocinas inflamatórias, como IL-1β, IL-6, iNOS e COX-2. Relatórios indicam que as quantidades aumentadas de COX-2 e iNOS no líquido sinovial desencadeiam a geração de várias citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e mediadores, causando a destruição da estrutura da cartilagem e inchaço sinovial, o que leva a dor e rigidez articular. Portanto, a eficácia do HT083 contra as respostas inflamatórias em células RAW264.7, bem como em ratos MIA, indica que o HT083 poderia ajudar a aliviar a inflamação da OA.

Este estudo é o primeiro a mostrar que a fórmula fitoterápica de P. lactiflora e C. myrrha (HT083) tem efeitos analgésicos e anti-inflamatórios na OA induzida por MIA em ratos e nas contorções abdominais induzidas por ácido acético em camundongos. É importante ressaltar que o HT083 foi mais eficaz do que o medicamento padrão na redução da sustentação de peso em ratos MIA. A prevenção da degeneração da cartilagem e dos danos no osso subcondral nos joelhos afetados, bem como a supressão das citocinas e mediadores inflamatórios em ratos MIA e em macrófagos RAW264.7 ativados por LPS pelo HT083, também foram notáveis. Além disso, as contorções abdominais induzidas por ácido acético em camundongos, que medem quantitativamente a dor, foram substancialmente reduzidas pelo HT083. Estudos extensivos adicionais poderiam explicar os mecanismos moleculares dos efeitos analgésicos e anti-inflamatórios desta nova fórmula fitoterápica.

4. Materiais e Métodos

4.1. Preparação da Amostra e Análise por CLAE
A raiz seca de P. lactiflora e a goma-resina seca de C. myrrha utilizadas no experimento foram obtidas da Daewoo-pharmacist Co. LTD. (Seul, Coreia) e da Hyun-Jin pharmaceutical Co. LTD. (Seul, Coreia), respectivamente. Os materiais foram identificados pelo Professor Dong-Hun Lee, do Departamento de Medicina Fitoterápica, Colégio de Medicina Oriental, Universidade Gachon, onde os espécimes testemunha (18101802 e 18110104, 18110107) estão preservados. P. lactiflora e C. myrrha secas foram extraídas com EtOH a 30% sob refluxo a 80 °C por 3 h. Em seguida, o extrato foi filtrado e o etanol foi removido sob pressão reduzida antes de liofilizar o extrato a −80 °C. Uma mistura de P. lactiflora e C. myrrha (HT083) na proporção de 3:1 (p/p) foi preparada para o experimento. A análise cromatográfica de cada amostra foi realizada com o sistema HPLC 1260 Infinity Ⅱ (Agilent, EUA). A separação foi feita com uma coluna Eclipse XDB C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm, Agilent, EUA) a 35 °C. A amostra (100 mg) foi sonicada em 10 mL de metanol a 50% por 10 minutos e filtrada usando um filtro de seringa de 0,45 μm (Waters Corp., Milford, EUA). A fase móvel foi composta por ácido fosfórico a 0,1% (A) e acetonitrila (B). O volume de injeção foi de 10 μL e a vazão foi de 1,0 mL/min. O efluente foi monitorado a 235 e 254 nm. Cada extrato foi analisado em triplicata.

4.2. Manejo dos Animais, Injeção de MIA e Preparação da Dieta

Ratos Sprague-Dawley (SD) machos (5 semanas de idade) e camundongos ICR machos (6 semanas de idade) foram adquiridos da Samtako Inc. (Osan, Coreia). Os animais foram mantidos em uma sala sob condição laboratorial padrão com um ciclo claro-escuro de 12:12 h, com temperatura constante de 22 ± 2 °C e umidade de 55 ± 10%. Os animais foram aclimatados por uma semana antes do experimento. Os ratos tiveram acesso ad libitum a ração e água. O experimento foi conduzido em conformidade com as regulamentações éticas vigentes para cuidado e uso de animais na Neumed Inc. (Seul, Coreia) (KISTEM-IACUC-2019-001 em 22/02/2019 e KISTEM-IACUC-2018-002 em 27/04/2018).

Os ratos SD foram divididos aleatoriamente em cinco grupos: sham, controle, indometacina, 100 HT083 e 300 HT083. Os ratos foram primeiro anestesiados usando uma mistura de isofluorano a 2% em O2 e, em seguida, 50 μL de MIA (Sigma, EUA) a 40 mg/mL dissolvida em solução salina a 0,9% (Sigma, EUA) foi injetada intra-articularmente na articulação do joelho usando uma agulha de 26 gauge de 0,5 polegada. Os grupos experimentais foram tratados da seguinte forma: os grupos sham e controle receberam apenas dieta básica (AIN-39G); o grupo indometacina recebeu dieta AIN-93G contendo 0,003% de indometacina para que a dose final fosse de 3 mg/kg; o grupo 100 HT083 recebeu dieta AIN-93G contendo 0,11% de HT083 para que a dose final fosse de 100 mg/kg; e o grupo 300 HT083 recebeu dieta AIN-93G contendo 0,33% de HT083 para que a dose final fosse de 300 mg/kg. A partir do dia da injeção de MIA, a dieta foi servida por 24 dias na quantidade de 18 g por 200 g de peso corporal por dia.

4.3. Capacidade de Suporte de Peso
Após a injeção de MIA, a sustentação de peso do membro posterior foi medida nos dias 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 e 24 usando um Medidor de Incapacidade Tester 600 (IITC Life Science Inc., Woodland Hills, EUA) por 10 s. A capacidade de sustentação de peso do membro posterior direito foi calculada usando a fórmula abaixo: razão de sustentação de peso (%) = (peso no membro posterior direito / peso no membro posterior esquerdo + peso no membro posterior direito) × 100.

4.4. Análise de IL-1β Sérica em Ratos com MIA

O sangue total foi coletado da veia abdominal. As amostras foram centrifugadas por 10 min a 4000 rpm, e o soro isolado foi preservado a −70 °C até o uso. O ensaio multiplex foi realizado usando o Kit de Multi-Análise Pré-Misturada de IL-1β para Ratos (R&D Systems Inc., Minneapolis, EUA) para medição de IL-1β sérica seguindo o protocolo do fabricante. Os dados foram analisados com um analisador Luminex MAGPIX (Luminex Co., Austin, EUA).

4.5. Análise de Microtomografia Computadorizada (Micro-CT)

Os membros posteriores direitos dos animais foram removidos e fixados com formaldeído (Sigma, EUA). As amostras foram escaneadas com o sistema de micro-CT SKYscan 1176 (Skyscan, Kartuizersweg, Bélgica). A imagem e análise 2D e 3D foram realizadas com o software NRecon (Skyscan v. 1.6.10.1), software DataViewer (Skyscan v.1.5.1.9), software CTAn (Skyscan v.1.17.7.2), software CTvol (Skyscan v. 2.3.2.0) com as seguintes condições: fonte de raios X: 70 kV/355 µA, tempo de exposição: 800 ms, filtro: alumínio de 0,5 mm, tamanho do pixel: 8,9 µm, ângulo de rotação: 180° com etapas de rotação de 0,4°.

4.6. Medição da Resposta de Contorção Induzida por Ácido Acético

Camundongos ICR foram divididos aleatoriamente em quatro grupos. Ácido acético (0,7%) foi injetado intraperitonealmente no camundongo a 10 mL/kg de peso corporal. Após 10 min da injeção, as respostas de contorção (constrições abdominais) do camundongo foram registradas por 30 min dentro de uma câmara de observação. Os camundongos foram pré-tratados com o veículo, ibuprofeno (200 mg/kg) e HT083 (300 e 600 mg/kg) 30 min antes da injeção de MIA. A redução significativa nas respostas de contorção nos grupos experimentais em comparação ao controle foi considerada como resposta analgésica.

4.7. Cultura de Células

As células RAW 264.7 foram obtidas do Korean Cell Line Bank (Seul, Coreia). As células foram mantidas a 37 °C e 5% CO2 com meio DMEM contendo 10% de SBF, 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (Gibco BRL, Grand Island, NY, EUA).

4.8. Geração de NO e Medição de Toxicidade Celular

As células RAW 264.7 foram cultivadas a 37 °C e 5% CO2 por 24 h. Após a semeadura, as células foram incubadas com diferentes concentrações de HT083 (10–300 µg/mL) e LPS (1 µg/mL) por 24 h. O reagente de Greiss foi adicionado ao sobrenadante da cultura (1:1) e a absorbância foi medida a 540 nm. A citotoxicidade foi medida usando o ensaio MTT. Resumidamente, 5 mg/mL de reagente MTT foram adicionados às células RAW 264.7 e incubados a 37 °C e 5% CO2 por 1 h. Após remover o sobrenadante, 100 μL de DMSO foram adicionados e mantidos por 10 min antes de medir a absorbância a 540 nm.
4.9. Análise de Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR)
O RNA total foi extraído usando o reagente de lise QIAzol (Qiagen Ltd., Manchester, Reino Unido). O cDNA foi gerado usando um kit de transcrição reversa (R&D Systems, EUA) seguindo o protocolo do fabricante. A PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) foi realizada com o sistema StepOnePlus de PCR em tempo real (Applied Biosystems, CA, EUA). O cDNA foi amplificado usando o Power SYBR® Green PCR Master mix (Applied Biosystems, CA, EUA). As sequências de iniciadores utilizadas no experimento estão indicadas na Tabela 1.

4.10. Análise de Expressão de Proteínas
As células RAW 264.7 foram tratadas com 30, 100 e 300 µg/mL de HT083 e 1 µg/mL de LPS por 24 h. A proteína total foi extraída com a Solução de Extração de Proteínas PRO-PREPTM (iNtRON Biotech, Seongnam, Coreia). Quantidades iguais de proteína (µg) foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e transferidas para membranas de nitrocelulose por 2 h a 100 mA de corrente constante/cm², seguidas de bloqueio por 1 h. Os blots foram então incubados durante a noite com os anticorpos primários (iNOS, COX-2 e IL-1β) e sondados com o anticorpo secundário à temperatura ambiente por 2 h. Os blots foram visualizados com um Amersham ImagerTM 600 (GE Healthcare Bio-sciences Corp., Piscataway, EUA) usando a solução de substrato Pierce™ ECL Western Blotting (Thermo Scientific, Waltham, EUA). Os ensaios multiplex foram realizados usando o Mouse Premixed Multi - Analyte Kit (R&D Systems, EUA) e os resultados foram medidos e analisados com o analisador Luminex MAGPIX (Luminex Corp., TX, EUA) seguindo os protocolos do fabricante.

4.11. Análise Estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism® 5.0 (GraphPad Software, CA, EUA) usando ANOVA de uma via e teste post hoc de Dunnett. A significância foi determinada em p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001. Todos os dados experimentais foram expressos como média ± erro padrão da média.

Contribuições dos Autores
Investigação, M.-K.J.; administração do projeto e redação do rascunho original, D.L.; conceito e design do projeto, H.K. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Desenvolvimento Tecnológico (S2666224) financiado pelo Ministério de PMEs e Startups (MSS, Coreia).

Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesse.

Referências
Compreendendo a dor da osteoartrite através de modelos animais
Osteoartrite: Rumo a uma compreensão abrangente do mecanismo patológico
Mecanismos da Dor na Osteoartrite
Papéis das citocinas inflamatórias e anabólicas no metabolismo da cartilagem: Sinais e múltiplos efetores convergem na regulação da MMP-13 na osteoartrite
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Efeito anti-inflamatório e anti-osteoartrite do extrato de Mollugo pentaphylla
Contribuições diferenciais dos mecanismos periféricos e centrais para a dor em um modelo roedor de osteoartrite
Um estudo piloto sobre constituintes bioativos e efeitos analgésicos do MyrLiq®, um extrato de Commiphora myrrha com alto teor de furanodieno
Mecanismos envolvidos nos efeitos terapêuticos de Paeonia lactiflora Pallas na artrite reumatoide
A inflamação e a dor articular induzidas por monoiodoacetato de sódio são reduzidas em camundongos deficientes em TRPA1 – possível papel do TRPA1 na osteoartrite
A inibição simultânea dos sinais de PGE2 e PGI2 é necessária para suprimir a hiperalgesia em modelos de dor inflamatória em ratos
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Efeitos dos fatores de crescimento e interleucina-1α sobre a renovação de proteoglicano e colágeno tipo II em culturas de pellets de condrócitos nasais e articulares bovinos
Desenvolvimento de terapêuticas anti-inflamatórias para pacientes com osteoartrite
O dano à cartilagem e a erosão óssea são determinantes mais proeminentes da deficiência funcional na artrite experimental de longa duração do que a inflamação sinovial
Efeitos do Kyejiinsam-tang em ratos com osteoartrite induzida por MIA
Atenuação da inflamação e degradação da cartilagem pelo ácido hialurônico contendo sulfassalazina em modelo de osteoartrite em ratos
Avaliação das alterações ósseas corticais e trabeculares em dois modelos de osteoartrite pós-traumática
Mecanismos periféricos que contribuem para a dor na osteoartrite
Liberação de prostaglandinas E e F em uma reação algogênica e sua inibição
Efeitos anti-inflamatórios do ácido ursodesoxicólico nas respostas inflamatórias estimuladas por lipopolissacarídeo em macrófagos RAW 264.7
Prós e contras da inibição seletiva da ciclooxigenase-2 versus inibição dupla da lipoxigenase/ciclooxigenase: Dois é melhor que um?
A via da interleucina 1beta na patogênese da osteoartrite
Cromatograma HPLC 3-D dos extratos de Paeonia lactiflora e Commiphora myrrha. A detecção foi realizada utilizando um detector de arranjo de fotodiodos. O eixo X é o tempo de retenção; o eixo Y é o comprimento de onda e o eixo Z é a unidade de absorbância. As condições analíticas foram as seguintes: coluna, C18 (4,6 × 250, 5 µm); fase móvel, solvente A (ácido fosfórico a 0,1%) e solvente B (acetonitrila); taxa de fluxo, 1 mL/min; programa, 20–20%; 15–15,1 min, 20–70%; 15,1–20 min, 70–70%; 20–20,1 min, 70–20%; 20,1–25 min, 20–20% de solvente B para o extrato de P. lactiflora (A). Adicionalmente, 0–60 min, 0–100%; 60–65 min, 100–100%; 65–67 min, 100–0%; 67–72 min, 0–0% de solvente B para o extrato de C. myrrha (B).
Efeitos do HT083 na mudança de suporte de peso em ratos injetados com monoiodoacetato (MIA). (A) Razão de distribuição do suporte de peso dos membros posteriores direito e esquerdo dos ratos MIA após 24 dias da injeção de MIA. O controle positivo (PC) foi a indometacina (10 mg/kg). (B) AUC, área sob a curva; avaliou o suporte de peso dos membros posteriores direito e esquerdo em ratos MIA após 24 dias da injeção de MIA. Os valores foram expressos como média ± E.P.M. (n = 9). ### p < 0,001 vs sham, * p < 0,05 e *** p < 0,001 vs controle.
Efeitos do HT083 sobre os danos na cartilagem e no osso subcondral. (A) Imagens macroscópicas das superfícies articulares da tíbia e fêmur dos ratos sham e MIA (B) Imagem axial de microtomografia computadorizada (Micro-CT) de uma tíbia de rato, no compartimento ósseo subcondral medial (M) e lateral (L) (C) Imagens de Micro-CT da superfície da cartilagem dos ratos sham e MIA. (D,E) Parâmetros de histomorfometria obtidos por micro-CT da espessura cortical medial e lateral do osso subcondral (Cor.Th). Cada valor é a média ± EPM. O número de animais foi nove em cada grupo; * p < 0,001 vs. controle e ### p < 0,001 vs sham (ANOVA de uma via, teste post hoc de Dunnett).
A alteração da concentração sérica de IL-1β em ratos MIA após tratamento com HT083. Cada valor é a média ± EPM. O número de animais é nove por grupo; * p < 0,05, * p < 0,01 e * p < 0,001 vs. controle (ANOVA de uma via, teste post hoc de Dunnett).
Efeitos do HT083 sobre a resposta de contorção induzida por ácido acético em ratos. O número de contorções foi medido após injeção de ácido acético a 0,7% por 10 min. Cada valor é a média ± EPM. O número de animais é oito por grupo; ** p < 0,01 e *** p < 0,001 vs. controle (ANOVA de uma via, teste post hoc de Dunnett).
Efeitos do HT083 sobre a viabilidade celular (A) e produção de NO (B) em células RAW 264.7 estimuladas por lipopolissacarídeo (LPS). As células foram pré-tratadas com 10, 30, 100 e 300 μg/mL de HT083. Cada valor é a média ± EPM. * p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001 vs. controle; ### p < 0,001 vs. sem tratamento (NT) (ANOVA de uma via, teste post hoc de Dunnett). MTT; brometo de tiazolil azul de tetrazólio, NO; óxido nítrico.
Análise por PCR em Tempo Real Quantitativa (qRT-PCR) da expressão de mRNA de IL-1β, IL-6, COX-2 e iNOS em células RAW264.7 estimuladas por LPS. As células foram pré-tratadas com controle positivo, Dexametasona 1 μg/mL e HT083 (30, 100, 300 μg/mL), e então incubadas com LPS por 24 h. As células foram lisadas, e o RNA total foi submetido à PCR em Tempo Real Quantitativa com os primers IL-1β, IL-6, COX-2 e iNOS (A–D). Cada experimento foi repetido três vezes. Cada valor é a média ± EPM. O número de animais é nove por grupo; * p < 0,05, ** p < 0,01 e *** p < 0,001 vs. controle; ### p < 0,001 vs. sem tratamento (NT) (ANOVA de uma via, teste post hoc de Dunnett).
Efeitos do HT083 na expressão proteica de citocinas inflamatórias em células RAW264.7 estimuladas por LPS. (A–C) Análise multiplex da expressão de TNFα, IL-6 e IL-1β. As células foram estimuladas com PBS, lisados de trofozoítos ou LPS por 24 h. Os sobrenadantes foram coletados e as concentrações de citocinas inflamatórias (pg/mL) foram medidas. * p < 0,05, *** p < 0,001 indicam diferenças estatisticamente significativas em relação ao grupo controle. ### p < 0,001 indica diferença significativa em relação ao grupo não tratado (NT). (D–G) Imagem de Western blot e análise da expressão de COX-2, iNOS e IL-1β.
Sequência de primers de mRNA para análise por PCR em Tempo Real Quantitativa.
IL-6 F 5′-ACCAGAGGAAATTTTCAATAGG-3′ R 5′-TGATGCACTTGCAGAAAACA-3′ COX-2 F 5′-AACCGCATTGCCTCTGAAT-3′ R 5′-CATGTTCCAGGAGGATGGAG-3′ IL-1β F 5′-CCTAAAGTATGGGCTGGACTGT-3′ R 5′-GACTAAGGAGTCCCCTGGAGAT-3′ iNOS F 5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3′ R 5′-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTGG-3′ GAPDH F 5′-TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC-3′ R 5′-CAGCAACTGAGGGCCTCTCT-3′
Interleucina-6 (IL-6); ciclooxigenase-2 (COX-2); Interleucina-1β (IL-1β); Óxido nítrico sintase induzível (iNOS); Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH).