pmid: "34336357"
title: "Impacto de Diferentes Métodos de Extração no Conteúdo de Furanosesquiterpenoides e Atividade Antibacteriana de"
authors: "Alqahtani AS, Herqash RN, Noman OM, Tabish Rehman M, Shahat AA, Alajmi MF, Nasr FA"
journal: "Journal of analytical methods in chemistry"
pubdate: "2021"
doi: "10.1155/2021/5525173"
source: "PMC Full Text"
Impacto de Diferentes Métodos de Extração no Conteúdo de Furanosesquiterpenoides e Atividade Antibacteriana de
Autores
Alqahtani AS, Herqash RN, Noman OM, Tabish Rehman M, Shahat AA, Alajmi MF, Nasr FA
Periodico
Journal of analytical methods in chemistry (2021)
Conteudo
Impacto de Diferentes Métodos de Extração no Conteúdo de Furanosesquiterpenoides e Atividade Antibacteriana da Resina de Commiphora myrrha
O oleo-goma-resina de Commiphora myrrha é um dos agentes antimicrobianos naturais mais conhecidos, principalmente devido aos seus furanosesquiterpenos. Um método validado baseado na extração de amostras por dispersão da matriz em fase sólida (MSPD) seguida de determinação por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é aplicado para analisar dois furanosesquiterpenoides, a saber, 2-metoxifuranodieno (CM-1) e 2-acetoxifuranodieno (CM-2), existentes em C. myrrha. Os parâmetros do ensaio que controlaram o potencial de extração foram estudados e otimizados. Estes incluem a natureza do dispersante, a razão de massa da amostra para o dispersante e o volume do solvente de eluição. Um estudo antimicrobiano comparativo utilizando o método de Concentração Inibitória Mínima (CIM) entre extratos de mirra obtidos por MSPD, ultrassom e Soxhlet também foi conduzido. Os parâmetros ótimos de MSPD utilizados foram (i) 15 mL de metanol aplicado como solvente de eluição; (ii) razão sílica gel/massa de amostra de 2:1; e (iii) sorvente dispersante selecionado como sílica gel. As recuperações da técnica foram reguladas de 96,87% a 100,54%, com desvios padrão relativos (RSDs) de 1,24% a 4,45%. O extrato de Commiphora myrrha-MSPD (CM-MSPD) apresentou a maior atividade antibacteriana contra bactérias gram-positivas e gram-negativas (156,25 μg/mL e 312,5 μg/mL, respectivamente) e atividade antifúngica (156,25 μg/mL). Os rendimentos obtidos através da técnica MSPD foram maiores do que os rendimentos de outras técnicas de extração (métodos de sonicação e extração por refluxo tradicional) com menor consumo de tempo, amostra e solvente. O modo de ação antibacteriana do CM-1 e CM-2 foi elucidado por meio de docking molecular com a DNA girase bacteriana. Ambos os compostos interagiram com resíduos-chave da DNA girase.
- Introdução
A planta medicinal Commiphora myrrha (família Burseraceae) produz a oleo-goma-resina aromática, conhecida como mirra. O gênero Commiphora inclui mais de 150 espécies de árvores e arbustos localizados principalmente na África, Índia, Iêmen e regiões do sul da Arábia Saudita.. Centenas de fitoquímicos da mirra foram identificados e examinados para diversas atividades terapêuticas desde que a planta foi descoberta. A composição da mirra é 30%–60% de goma (incluindo polissacarídeos ácidos), 25%–40% de resina e 3%–8% de óleo volátil (eugenol, herbolene e muitos furanosesquiterpenos). Dois furanosesquiterpenoides, 2-metoxifuranodieno (CM1) e 2-acetoxifuranodieno (CM2), foram previamente isolados e identificados a partir do extrato etanólico da mirra. Usando o ensaio citotóxico MTT, ambos os compostos exibiram atividade promissora contra células cancerígenas de fígado (HepG2) e mama (MCF-7) com valores de IC50 de 3,6 e 4,4 μm, respectivamente. Além disso, a influência das variações no conteúdo de 2-metoxifuranodieno e 2-acetoxifuranodieno nas propriedades biológicas de dezessete amostras comerciais de Commiphora myrrha mostrou variabilidade no conteúdo de furanosesquiterpenoides (CM-1 e CM-2) com maior atividade antioxidante para amostras coletadas da Arábia Saudita. Portanto, técnicas simples, eficazes e rápidas são necessárias para a extração desses dois principais constituintes fitoquímicos (ou seja, 2-metoxifuranodieno e 2-acetoxifuranodieno). Barker et al. apresentaram a inovação da matriz de dispersão em fase sólida (MSPD) como uma nova técnica para extrair entidades medicinais de tecido animal. Desde então, a técnica MSPD tem atraído amplo e intenso interesse, pois realiza extração e limpeza em uma única etapa e fraciona com sucesso amostras semissólidas, sólidas e altamente pegajosas. A MSPD tem sido recentemente utilizada como alternativa às técnicas de extração tradicionais para extrair constituintes de plantas terapêuticas. De acordo com a revisão da literatura, não há ensaio disponível sobre a MSPD como tipo de extração de 2-metoxifuranodieno e 2-acetoxifuranodieno de C. myrrha que conheçamos atualmente. Os métodos de extração de Zhang et al. e também de AlZain et al. foram seguidos e adotados. - Materiais e Métodos
2.1. Produtos Químicos e Reagentes
2-Metoxifuranodieno (CM1) e 2-acetoxifuranodieno (CM2) foram selecionados como padrões. As estruturas químicas desses compostos são mostradas na Figura 1.
2.2. Material Vegetal
A oleo-goma-resina de C. myrrha utilizada foi adquirida no Mercado Alothaim em Riade, Arábia Saudita. Cinco amostras de 100 g da goma-resina moída foram utilizadas para os experimentos.
2.3. Instrumentação HPLC e Condições Cromatográficas
0–16 min (10%–30% B)
16–17 min (30%–40% B)
17–20 min (40%–60% B)
20–22 min (60%–95% B)
22–23 min (95%–85% B)
23–25 min (85%–10% B)
25–30 min (10% B)
Para quantificação, foi utilizado um Módulo de Separação Alliance 2695 equipado com detectores de absorbância de comprimento de onda duplo 2487 (Waters Instruments, Inc., Milford, MA, EUA). A análise cromatográfica foi realizada utilizando o seguinte equipamento: bomba quaternária embutida; coluna Pinnacle C18 (5 μm, 250 × 4,6 mm); desgaseificador de quatro canais; e um amostrador automático com temperatura programável (25°C). A fase móvel foi composta por diferentes proporções de ácido fórmico a 0,5% em água ultrapura (A), e uma mistura 1:1 de acetonitrila e metanol (B) foi utilizada com uma vazão de 1 mL/min. O programa de gradiente otimizado foi o seguinte:
As amostras foram filtradas por filtro de seringa PDVF 0,45 μm e, em seguida, injetadas no sistema a 20 μL. O sinal de saída (254 nm) foi detectado e processado usando o software EMPOWER, versão 2.
2.4. Método de Extração por MSPD
Um pó de C. myrrha e sílica gel (100 e 200 mg, respectivamente) foram colocados juntos e misturados por 5 min para obter uma uniformidade homogênea. Em seguida, a mistura foi transferida para uma seringa de vidro (5 mL) pré-carregada com algodão no fundo para servir como camada adsorvente. Para evitar qualquer contaminação e derramamento, um segundo pedaço de algodão foi fixado no topo da mistura. A coleta do eluente foi realizada em um balão volumétrico que foi preenchido com MeOH até um nível de 15 mL. Um filtro (0,45 μm) foi usado para filtrar o extrato obtido, que subsequentemente foi analisado por CLAE.
2.5. Método de Extração por Soxhlet
Desde séculos, a extração por Soxhlet representa o método padrão para extração eficaz entre os diversos procedimentos de extração. Cerca de 500 mg de C. myrrha foi embalada em um cartucho de extração e, em seguida, colocada em um extrator Soxhlet. Sob refluxo, metanol (90 mL) foi então adicionado a um balão de destilação e aquecido por 6 h. Para um balão volumétrico de 100 mL, o extrato foi suavemente transferido e preenchido com CH3OH. Antes da análise por CLAE, a solução do extrato foi filtrada através de um filtro de 0,45 μm.
2.6. Método de Extração por Sonicação
A extração por sonicação de C. myrrha foi realizada pesando 250 mg de amostra, colocada em um balão volumétrico de 20 mL e extraída com 30 mL de metanol. Em seguida, a mistura foi submetida à sonicação por 20 min. A solução da amostra foi então filtrada através de um filtro de 0,45 μm antes da análise por CLAE. - Estudos Biológicos
3.1. Determinação da Atividade Antimicrobiana
3.1.1. Microrganismos Testados
Quatro espécies de bactérias, incluindo duas gram-positivas (Staphylococcus aureus e ATCC 25923; Enterococcus faecalis e ATCC 29212) e duas gram-negativas (Escherichia coli e ATCC 25922; Proteus vulgaris e ATCC 8427), bem como uma cepa fúngica de Candida albicans (ATCC 60193) foram utilizadas nesta investigação.
3.1.2. Concentrações Inibitórias Mínimas
As CIMs dos extratos metanólicos de C. myrrha resultantes das três extrações (CM-Sonicação, CM-Soxhlet e CM-MSPD) foram testadas quanto à sua atividade antimicrobiana conforme descrito por Mann e Markham. Diluições seriadas duplas de cada extrato (100 μL/poço) foram pipetadas em placas de cultura de 96 poços. Ambos os extratos foram preparados nos meios de caldo necessários para obter concentrações de 2.000 a 31,2 mg/mL. Uma suspensão de 100 μL e 1.106 UFC/mL de bactérias e fungos foi então adicionada e incubada nas temperaturas apropriadas por 24 h e 72 h, respectivamente. A menor concentração que não apresentou crescimento bacteriano ou fúngico detectável (CIM) foi determinada. Cinco microlitros dos poços que não apresentaram crescimento foram transferidos para placas de ágar. Eles foram então incubados por 24 h ou 72 h para as concentrações bactericidas/fungicidas mínimas (CBM/CFM). Tanto a gentamicina quanto a nistatina foram usadas como controles positivos.
3.2. Docking Molecular
A ligação e interação de CM-1 e CM-2 com a DNA girase B bacteriana foi avaliada por docking molecular usando AutoDock4.2 conforme descrito anteriormente por Al-Shabib et al.. Estruturas 2D de CM-1 e CM-2 foram desenhadas no ChemSketch. PyRx v0.8 foi usado para minimizar as energias de CM-1 e CM-2 empregando o campo de força universal (UFF). Os estados minimizados de CM-1 e CM-2 foram convertidos para o formato pdbqt pronto para docking no PyRx v0.8. As coordenadas tridimensionais da DNA girase B bacteriana (PDB ID: 4KFG) foram baixadas do banco de dados RCSB e pré-processadas antes de realizar o docking molecular. As moléculas de água e todos os ligantes ligados foram removidos, átomos de H foram adicionados e as ordens de ligação foram definidas na estrutura da DNA girase B. Uma nova rede de ligações de H foi definida e a energia do sistema completo foi minimizada usando UFF. O docking molecular foi realizado dentro de uma caixa de grade de dimensões 22,5 × 17,5 × 20,7 Å centrada em 30,2 × 18,5 × −2,3 Å com espaçamento de 0,375 Å. O Algoritmo Genético Lamarckiano combinado com os métodos de busca local Solis e Wets foram utilizados para o docking molecular, conforme descrito anteriormente por Rabbani et al.. As posições iniciais de CM-1 e CM-2, suas orientações e torções foram definidas indiscriminadamente. Um total de 10 execuções de docking foram enumeradas. Para cada execução, um máximo de 2.500.000 termos de energia foram calculados. O tamanho da população foi definido como 150 e a etapa translacional foi fixada em 0,2 Å. As torções e quatérnions foram definidos em 5. Os resultados foram analisados e as imagens finais foram preparadas no Discovery Studio (Accelrys). As afinidades de docking (Kd) de CM-1 e CM-2 para o domínio quinase da DNA girase B foram determinadas a partir das energias de docking (△G) usando a seguinte equação: onde R e T representam a constante do gás de Boltzmann e a temperatura, respectivamente. - Resultados e Discussão
4.1. Otimização do MSPD
MSPD é uma técnica de extração amplamente utilizada e eficaz que compreende as funções de extração, destruição e purificação em uma única etapa. Assim, para obter o rendimento máximo de extração dos dois compostos furanosesquiterpênicos de C. myrrh, os fatores de extração mais convenientes do processo MSPD foram otimizados. Os experimentos foram realizados para regular os fatores essenciais, como a proporção de sorvente dispersante para amostra, tipo de sorvente dispersante e volume do solvente de eluição, que determinam, em última análise, o rendimento de extração do concentrado final.
4.1.1. Seleção do Sorvente Dispersante
A dispersão do sorvente atua como um solvente ligado e bruto. Ela desintegra a matriz da amostra, perturba seus componentes e eleva a interação entre solvente e amostra através do procedimento de mistura MSPD. Portanto, a seletividade específica de um método MSPD depende inteiramente do sorvente aplicado. Três solventes dispersantes foram testados nesta fase, compreendendo sílica gel, C18 e Sephadex LH-20. A Figura 2 ilustra os rendimentos de extração de CM-1 e CM-2 de C. myrrha obtidos com os três diferentes solventes dispersantes. Os rendimentos de extração de CM-1 e CM-2 foram maiores quando se utilizou sílica gel do que os rendimentos de extração com C18. Portanto, a sílica gel foi selecionada como sorvente dispersante designado para o método MSPD, pois forneceu a melhor produção de extração dos dois furanosesquiterpenos (i.e., 2-metoxifuranodieno e 2-acetoxifuranodieno) e era comparativamente mais barata para adquirir.
4.1.2. Efeito da Razão de Massa entre Amostra e Sorvente
Uma proporção equilibrada de sorvente dispersante para amostra poderia construir a zona de contato entre o teste e os sorventes dispersantes e poderia melhorar a adsorção dos exames nos sorventes dispersantes. Devido a isso, quatro diferentes razões de massa de amostra para sílica gel foram estudadas, variando de 0,5 : 1 a 1 : 3. Esses resultados são exibidos na Figura 3. A razão de massa de 1 : 2 (amostra para sílica gel) resultou no maior rendimento de extração para os 2 furanosesquiterpenos. No entanto, um aumento adicional na razão de massa para 1 : 3 resultou em uma redução nos rendimentos de extração de ambos os compostos. Assim, neste trabalho, 1 : 2 foi selecionada como a razão de massa ideal.
4.1.3. Efeito do Volume do Solvente de Eluição
Ao executar um método MSPD, o volume de eluição é um fator importante a ser considerado. O procedimento de extração foi realizado utilizando quatro volumes diferentes de solvente orgânico metanol (5, 10, 15 e 20 mL). Os resultados (Figura 4) demonstraram que os rendimentos de CM-1 e CM-2 aumentaram com volumes crescentes de metanol de 5 mL para 15 mL; os rendimentos se estabilizaram após o aumento final para 20 mL. Portanto, 15 mL foi selecionado para garantir a dessorção completa dos compostos dos sorventes dispersantes com o consumo mínimo de solvente.
4.2. MSPD-HPLC
As soluções padrão combinadas dos cromatogramas de HPLC dos extratos de C. myrrha são apresentadas na Figura 5. O método desenvolvido foi validado para estabelecer que suas características de desempenho eram compatíveis com o desempenho desejado para a análise dos dois compostos da amostra de C. myrrha. A validação dos métodos foi realizada com base nas diretrizes estabelecidas pela Conferência Internacional de Harmonização. Os seguintes parâmetros de validação foram avaliados: linearidade, limite de quantificação dos analitos, repetibilidade dos resultados (precisão) e recuperação.
A linearidade foi avaliada por meio da construção de curvas de calibração externas para cada composto, utilizando uma solução padrão de trabalho contendo ambos os compostos. As curvas de calibração foram estudadas com base na correlação linear entre a área do pico do analito (eixo y) e sua concentração (μg/mL), para seis níveis de concentração diferentes (0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 12,00 e 25,00 μg/mL). Cada concentração da solução padrão mista foi injetada em triplicata, e os parâmetros de regressão foram calculados. Os coeficientes de correlação estimados (r²) das curvas de calibração foram superiores a 0,996, comprovando assim a linearidade do método quantitativo proposto (Tabela 1).
LOD = 3,3 σ/S
LOQ = 10 σ/S
A sensibilidade do método foi avaliada pelo cálculo dos limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) dos dois analitos. O LOD e o LOQ foram calculados com base na curva de calibração e calculados de acordo com os exemplos (1) e (2): onde σ é o desvio padrão da resposta e S é a inclinação da curva de calibração.
O LOD do método desenvolvido foi de 0,60 e 0,62 μg/mL para CM-1 e CM-2, respectivamente, e os valores de LOQ correspondentes foram de 1,82 e 1,87 μg/mL (Tabela 1). A precisão do método desenvolvido foi determinada com base em dois parâmetros: repetibilidade dos resultados e precisão intermediária. A repetibilidade foi avaliada com base nos resultados da análise replicada (n = 3) realizada no mesmo dia (intradia). A precisão intermediária foi avaliada de acordo com os resultados de análises consecutivas (n = 3) realizadas ao longo de três dias (interdias). A repetibilidade e a precisão intermediária dos métodos foram expressas como desvio padrão relativo (RSD). O %RSD no teste de repetibilidade variou de 0,28% a 3,91% para CM-1 e de 0,29% a 1,05% para CM-2, respectivamente. As faixas correspondentes de precisão intermediária foram de 0,36% a 4,00% e de 0,45% a 1,15% (Tabela 2). O ensaio forneceu resultados satisfatórios, pois os valores gerais de %RSD para os testes intra e interdias foram inferiores a 4,00%, o que indica que o método desenvolvido estava de acordo com as especificações exigidas.
A precisão do método desenvolvido foi avaliada por meio de um experimento de recuperação; as áreas de pico obtidas de amostras de C. myrrha previamente fortificadas com quantidades conhecidas de padrões analíticos (CM-1 e CM-2) foram comparadas com amostras em branco "não fortificadas" em três níveis de concentração diferentes (alto, médio e baixo). As porcentagens de recuperação foram calculadas com base na seguinte equação: (quantidade total determinada × quantidade original)/quantidade adicionada × 100%. A Tabela 3 mostra as recuperações médias dos compostos analisados na faixa de 95,13%–100,39% com DPR menor que 1,41%, indicando que o método desenvolvido é suficientemente preciso para a quantificação de ambos os compostos de C. myrrha.
4.3. Estudo Antimicrobiano
Os efeitos antimicrobianos resultantes dos três métodos de extração de C. myrrha (CM-Sonicação, CM-Soxhlet e CM-MSPD) em termos de CIM e CBM/CFM são apresentados na Tabela 4. O CM-MSPD exibiu atividade antimicrobiana mais forte do que os extratos de CM-Sonicação e CM-Soxhlet; as cepas mais sensíveis são as gram-positivas Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis (E. faecalis; CIM: 156,25 mg/mL). Os valores de CBM ou CFM foram aproximadamente duas vezes maiores que as CIMs (Tabela 4). Isso pode ser devido à presença de um alto teor de constituintes fitoquímicos, incluindo 2-metoxifuranodieno e 2-acetoxifuranodieno.
4.4. Comparação dos Procedimentos de MSPD, Soxhlet e Sonicação
A Tabela 5 mostra a comparação dos métodos de extração por MSPD, Soxhlet e sonicação. Os resultados mostraram que o MSPD apresentou rendimento máximo de extração dos dois compostos furanosesquiterpênicos (38,7 mg/g) em comparação com o método de Soxhlet (33,75 mg/g) e de extração por sonicação (29,3 mg/g) (Figura 6). O método MSPD também exigiu apenas 0,1 g de amostra, 15 mL de solvente e 15 minutos para extrair os furanosesquiterpenos alvo da C. myrrha. Isso demonstrou que o consumo de solvente, amostra e tempo foi reduzido pelo método MSPD em comparação com métodos de extração convencionais como Soxhlet, sonicação e outras novas técnicas. Mais importante ainda, a extração por MSPD não requer aquecimento. Por fim, o método MSPD como ferramenta instrumental de critérios é benéfico. A implementação do método requer apenas um cartucho e almofariz acessíveis que podem ser criados por qualquer laboratório químico. Esses benefícios mostram que a extração por MSPD de C. myrrha deve ser um método apropriado para extrair furanosesquiterpenos alvo.
4.5. Análise de Docking Molecular
A DNA girase bacteriana é uma topoisomerase do tipo II que pode se ligar ao DNA e introduzir superenrolamentos negativos durante a replicação, à custa da hidrólise de ATP. É encontrada em todas as bactérias e está ausente em eucariotos superiores, servindo assim como um alvo potencial para projetar agentes antibacterianos. Ela contém duas subunidades, A e B, que se associam para formar o complexo A2B2 na forma ativa da enzima. A subunidade A da DNA girase se liga ao DNA e possui o resíduo de Tyr do sítio ativo para a clivagem, enquanto a subunidade B da DNA girase possui um domínio quinase onde ocorre a hidrólise de ATP. Neste estudo, foi avaliada a capacidade de furanosesquiterpenos (CM-1 e CM-2) de se ligarem ao domínio quinase da DNA girase usando docking molecular. O docking de CM-1 e CM-2 com a DNA girase B resultou em múltiplas conformações de baixa energia. As conformações de ligação com a menor energia foram investigadas posteriormente para interações detalhadas proteína-ligante (Figura 7 e Tabela 6). Ficou evidente que CM-1 e CM-2 se ligaram ao sítio de ligação de ATP da DNA girase B. CM-1 formou 2 interações eletrostáticas com Arg76: NH1 e Glu50: OE1; e 7 interações hidrofóbicas com Arg76, Gly77, Ile78, Pro79 e Ile90. Alguns outros resíduos que formaram interações de van der Waals com CM-1 foram Asn76, Gly75, Asp73, Gly164, Thr165 e Val167. A energia de docking e a afinidade de ligação correspondente de CM-1 para a DNA girase B foram estimadas em −7.5 kcal mol⁻¹ e 3.17 × 10⁵ m⁻¹, respectivamente. Por outro lado, CM-2 interagiu com a DNA girase B através de uma ligação de hidrogênio convencional com Arg76: HH12, e 6 interações hidrofóbicas com Ile78, Ile90 e Val167. Os resíduos Asn46, Ala47, Glu50, Asp73, Gly77, Pro79 e Thr165 estavam envolvidos na formação de interações de van der Waals com CM-2.
A energia de docking da interação CM-2-DNA girase B foi determinada como −7.9 kcal m⁻¹, enquanto a afinidade de ligação de CM-2 para a DNA girase B foi de 6.23 × 10⁵ m⁻¹. Para análises comparativas, o docking entre o ligante cognato (como controle) foi realizado e apresentado em uma estrutura cristalográfica de raios X com a DNA girase B (Figura 7 e Tabela 5). O ligante controle formou 2 ligações de hidrogênio convencionais com Asp73: OD1 e 3 ligações de hidrogênio de carbono com Asn46: OD1, Val71: O e Gly77: O. Além disso, uma ligação de halogênio entre o íon F e Asn46: CG também foi observada entre o ligante controle e a DNA girase B. Adicionalmente, o complexo ligante controle-DNA girase B foi estabilizado por 7 interações hidrofóbicas com Asn46: C, O-Ala47: N, Gly77: C, O-Ile78: N, Ile78 e Thr165: CG2. Alguns outros resíduos como Val43, Ala47, Glu50, Gly75, Arg76, Pro79, Ile90, Val120, Arg136 e Val120 foram avaliados. A energia de docking e a afinidade de ligação dos ligantes controle para a DNA girase B foram determinadas como −9.3 kcal m⁻¹ e 9.3 × 10⁶ m⁻¹, respectivamente.
É evidente que CM-1 e CM-2 se ligaram a um sítio da DNA girase B onde os ligantes de controle se ligam. Os resíduos de aminoácidos comumente ocupados por CM-1 e pelo ligante de controle foram Glu50, Asp73, Gly75, Arg76, Gly77, Ile78, Pro79, Ile90, Thr165 e Val167, enquanto os resíduos de aminoácidos comumente ocupados por CM-2 e pelo ligante de controle foram Ala47, Glu50, Asp73, Arg76, Gly77, Ile78, Pro79, Ile90, Val120, Thr165 e Val167. Estudos anteriores relataram que a rutina também ocupou o mesmo sítio de ligação na DNA girase B e interagiu por meio de Asn46, Ala47, Asp49, Glu50, Ala53, Asp73, Gly75, Arg76, Gly77, Ile78, Pro79, Ile90, Val118, Gly119, Val120, Arg136 e Thr165. Na estrutura cristalográfica da DNA girase B, Asp73 forma uma ligação de hidrogênio com o grupo amino adenosina do AMP, e a mutação de Asp73 para Ala73 ou Asn73 aboliu completamente as atividades de ATPase e de superenrolamento do DNA. Da mesma forma, Gly77 está nas proximidades do anel de adenina (~4,3 Å do carbono C-2 e ~5,1 Å do N-3). Assim, qualquer mutação em Gly77 tem um efeito dramático na probabilidade de ligação do ATP, o que leva à redução da atividade de hidrólise do ATP. Outro resíduo importante, Ile78, encontra-se ~4,5 Å acima do anel de adenina e desempenha um papel significativo na ligação do ATP e sua consequente hidrólise. Thr165 é um resíduo de aminoácido chave conservado em todas as subunidades B da DNA girase e nas topoisomerases tipo II. Também desempenha um papel crucial na ligação do ATP.
5. Conclusões
A MSPD foi utilizada com sucesso e seguida por CLAE para a extração e determinação de dois furanosesquiterpenos em C. myrrha, a fim de obter o rendimento máximo. As propriedades dos fatores essenciais ajustados, compreendendo o volume de solvente, o sorvente dispersante e a razão de dispersão do sorvente para a amostra na competência de extração por MSPD dos furanosesquiterpenos foram principalmente avaliadas e otimizadas. A autenticação geral para o método de CLAE foi então determinada, incluindo a quantificação dos dois compostos furanosesquiterpênicos, linearidade, limites de sensibilidade, precisões e recuperação. Além disso, os rendimentos de extração obtidos pela técnica de MSPD foram comparados com aqueles produzidos pelas técnicas ultrassônica e de Soxhlet habituais.
Disponibilidade dos Dados
Todos os dados relacionados a esses achados estão incluídos no manuscrito.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram que não possuem quaisquer conflitos de interesse em relação à publicação deste artigo.
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Cromatogramas de HPLC do padrão de dois compostos furanodienos.
Cromatogramas de HPLC de C. myrrh. (a) Método de extração por MSPD. (b) Método de extração por Soxhlet. (c) Método de extração por sonicação.
Docking molecular e interação entre DNA girase B e ligante controle, CM-1 e CM-2. (a) Ligação do ligante controle (cor dourada), CM-1 (cor verde-azulado) e CM-2 (cor verde) no domínio de ligação ao ATP da DNA girase B. Interação entre DNA girase B e ligante controle (b), CM-1 (c) e CM-2 (d).
Parâmetros de calibração e dados de sensibilidade para dois compostos usando o método de HPLC proposto.
Composto Tempo de retenção (min) Faixa (μg/mL) Linearidade (r2) LOD (μg/mL) LOQ (μg/mL) CM-1 17,126 ± 0,03 0,5–25,00 0,9965 0,60 1,82 CM-2 13,382 ± 0,05 0,5–25,00 0,9963 0,62 1,87
Resultados analíticos de repetibilidade e precisão intermediária para dois compostos na amostra de C. myrrha.
Analito Conc. (μg/mL) Intradiaa (% DPR) (n = 3) Interdiab (% DPR) (n = 3) CM-1 0,5 0,28 1,30 5 3,91 4,00 25 0,81 0,36 CM-2 0,5 0,29 0,45 5 4,01 0,93 25 1,05 1,15
aRepetibilidade. bPrecisão intermediária.
Dados de recuperação analítica dos dois analistas durante a quantificação (n = 6).
Analito Adicionado (μg/mL) Recuperação média (%) DPR (%) (n = 6) CM-1 0,5 97,11 0,47 5 98,24 0,36 25 96,43 0,79 CM-2 0,5 98,34 1,23 5 95,13 1,41 25 100,39 0,89
Concentrações inibitórias mínimas, concentrações bactericidas mínimas (CBM) e concentrações fungicidas mínimas (CFM) dos extratos brutos de C. myrrha.
Atividade S. aureus E. faecalis E. coli P. vulgaris C. albicans CM-sonicação CIM 312,5 312,5 625 625 156,25 CBM 625 625 1250 1250 — CFM NT NT NT NT 312,5 CM-Soxhlet CIM 312,5 312,5 625 625 156,25 CBM 625 625 1250 1250 — CFM NT NT NT NT 312,5 CM-MSPD CIM 156,25 156,25 625 625 156,25 CBM 312,5 312,5 1250 1250 — CFM NT NT NT NT 312,5 Gentamicina CIM 7,8 7,8 3,9 3,9 NT CBM 15,6 15,6 7,8 7,8 NT Nistatina CIM NT NT NT NT 3,5 CFM — — — — 7,0
Comparação do MSPD com outros métodos de extração para a extração dos principais furanosesquiterpenoides de C. myrrha.
MSPD Soxhlet Soniciação Rendimento total de extração (mg/g) 38,7 33,75 29,3 Amostra (g) 0,1 0,5 0,25 Solvente 15 mL MeOH 100 mL MeOH 30 mL MeOH Tempo 15 min 3,5 h 0,5 h Aparelho especial Nenhum Soxhlet Ultrassonicador
Parâmetros de docking molecular para a interação de CM-1 e CM-1 com o domínio de ligação ao ATP da DNA Girase B bacteriana.
Par doador-aceptor Distância (Å) Natureza da interação Energia de docking (kcal m−1) Afinidade de ligação, Kd (m−1) Controle LIG:H–ASP73:OD1 1,9066 Ligação H convencional −9,3 6,62 × 106 LIG:H–ASP73:OD1 1,9014 Ligação H convencional LIG:C–GLY77:O 3,3299 Ligação H de carbono LIG:C–ASN46:OD1 3,5462 Ligação H de carbono LIG:C–VAL71:O 3,6145 Ligação H de carbono ASN46:CG–LIG:F 3,6104 Ligação de halogênio THR165:CG2–LIG 3,8251 Hidrofóbica (pi-sigma) ASN46:C, O; ALA47:N–LIG 4,4879 Hidrofóbica (amida-pi) ASN46:C, O; ALA47:N–LIG 4,5389 Hidrofóbica (amida-pi) GLY77:C, O; ILE78:N–LIG 4,7710 Hidrofóbica (amida-pi) LIG–ILE78 5,1181 Hidrofóbica (pi-alquila) LIG–ILE78 4,6140 Hidrofóbica (pi-alquila) LIG–ILE78 4,3432 Hidrofóbica (pi-alquila) CM-1 ARG76:NH1–LIG 4,0868 Eletrostática (pi-cátion) −7,5 3,17 × 105 GLU50:OE1–LIG 4,3017 Eletrostática (pi-ânion) GLY77:C, O; ILE78:N–LIG 4,4654 Hidrofóbica (amida-pi) ILE78–LIG 4,0246 Hidrofóbica (alquila) LIG:C–ILE78 4,5502 Hidrofóbica (alquila) LIG:C–ILE90 3,8908 Hidrofóbica (alquila) LIG:C–PRO79 4,3208 Hidrofóbica (alquila) LIG–ARG76 5,0625 Hidrofóbica (pi-alquila) LIG–PRO79 4,6901 Hidrofóbica (pi-alquila) CM-2 ARG76:HH12–LIG:O 2,6933 Ligação H convencional −7,9 6,23 × 105 ILE78–LIG 4,1178 Hidrofóbica (alquila) LIG:C–ILE90 4,1266 Hidrofóbica (alquila) LIG:C–ILE78 5,0569 Hidrofóbica (alquila) LIG:C–ILE78 5,1356 Hidrofóbica (alquila) LIG:C–VAL167 4,6831 Hidrofóbica (alquila) LIG–ILE78 5,0433 Hidrofóbica (pi-alquila)