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pmid: "41918372"
title: "Atividade Antimicrobiana In Vitro e Regulação da Barreira Intestinal In Vivo por Extrato da Casca de Commiphora leptophloeos na Mucosite Induzida por 5-Fluorouracila."
authors: "de Araújo Barbosa SJ, Dantas-Medeiros R, Ribeiro SB, da Silva AS, de Carvalho LVS, Dantas da Silva RT, Guerra GCB, de Araújo Júnior RF, Costa da Silva N, Andrade RVS, de Paiva GM, Zucolotto SM, de Sousa Fé RAS, de Souza Lima ML, Grougnet R, Ortiz S, Zanatta AC, de Araújo AA"
journal: "Chemistry & biodiversity"
pubdate: "2026 Apr"
doi: "10.1002/cbdv.202503251"
source: "PMC Full Text"

Atividade Antimicrobiana In Vitro e Regulação da Barreira Intestinal In Vivo por Extrato da Casca de Commiphora leptophloeos na Mucosite Induzida por 5-Fluorouracila.

Autores

de Araújo Barbosa SJ, Dantas-Medeiros R, Ribeiro SB, da Silva AS, de Carvalho LVS, Dantas da Silva RT, Guerra GCB, de Araújo Júnior RF, Costa da Silva N, Andrade RVS, de Paiva GM, Zucolotto SM, de Sousa Fé RAS, de Souza Lima ML, Grougnet R, Ortiz S, Zanatta AC, de Araújo AA

Periodico

Chemistry & biodiversity (2026 Apr)

Conteudo

Atividade Antimicrobiana In Vitro e Regulação da Barreira Intestinal In Vivo pelo Extrato da Casca de Commiphora leptophloeos na Mucosite Induzida por 5‐Fluorouracil

RESUMO

Este estudo avaliou a composição fitoquímica, a atividade antimicrobiana e os efeitos protetores in vivo do extrato hidroetanólico da casca do caule de Commiphora leptophloeos (HECL) contra a mucosite intestinal induzida por 5‐fluorouracil (5‐FU). Apesar do amplo uso tradicional de C. leptophloeos em distúrbios gastrointestinais, seu extrato da casca do caule ainda não foi quimicamente caracterizado nem investigado sistematicamente em modelos experimentais de lesão intestinal induzida por quimioterapia. A análise fitoquímica por espectrometria de massas identificou 21 metabólitos, principalmente procianidinas e flavonoides. A triagem antimicrobiana contra 90 cepas bacterianas mostrou inibição seletiva de bactérias Gram‐positivas a 40–80 µg/mL. In vivo, a mucosite foi induzida em camundongos Swiss fêmeas com 5‐FU (450 mg/kg, i.p.). O tratamento com HECL (10 mg/kg) preservou significativamente a arquitetura das vilosidades e criptas (p < 0.05) e reduziu os níveis de IL‐6 (p < 0.05). O HECL também aumentou a expressão de MUC‐2 (p < 0.05), mantendo a integridade da barreira intestinal, conforme indicado pela imunomarcação de ocludina. Além disso, o extrato modulou o estresse oxidativo (malondialdeído) e a atividade da acetilcolinesterase. No geral, o HECL demonstrou potencial bioativo com atividade antimicrobiana de amplo espectro e efeitos protetores contra lesão intestinal induzida por quimioterapia, apoiando seu papel como adjuvante terapêutico em distúrbios intestinais.

Introdução

As plantas medicinais desempenharam um papel fundamental na farmacoterapia tradicional e moderna. O conhecimento etnofarmacológico tem sido especialmente valioso para orientar a seleção de espécies vegetais com potenciais aplicações terapêuticas em condições caracterizadas por inflamação, estresse oxidativo e dano epitelial, que são comumente exacerbadas por terapias antineoplásicas.
A quimioterapia continua sendo um pilar do tratamento do câncer em todo o mundo e é rotineiramente empregada isoladamente ou em combinação com cirurgia, radioterapia e terapias-alvo. Apesar de sua eficácia, a quimioterapia é frequentemente associada a toxicidade fora do alvo em tecidos normais de rápida proliferação, reforçando a necessidade de intervenções adjuvantes seguras capazes de mitigar os efeitos adversos. Entre as diferentes classes de agentes quimioterápicos, os antimetabólitos desempenham um papel central no manejo de tumores sólidos, particularmente aqueles caracterizados por altas taxas proliferativas. O 5-Fluorouracil (5-FU) é um dos antimetabólitos mais amplamente utilizados na oncologia clínica e constitui uma terapia de primeira linha ou adjuvante para diversas neoplasias, incluindo cânceres colorretal, de mama, gástrico, pancreático e de cabeça e pescoço. Agindo principalmente por meio da inibição da timidilato sintase e da incorporação de nucleotídeos fraudulentos no DNA e RNA, o 5-FU suprime efetivamente a proliferação de células tumorais e induz apoptose. Apesar de sua eficácia comprovada e uso clínico de longa data, a ação citotóxica inespecífica do 5-FU também afeta tecidos normais de rápida divisão, particularmente o epitélio gastrointestinal, levando a toxicidades limitantes de dose que comprometem a adesão ao tratamento e a qualidade de vida do paciente.

A patogênese da mucosite intestinal (MI) induzida por quimioterapia é um processo complexo, dinâmico e de múltiplas etapas que foi extensivamente caracterizado pelo modelo biológico proposto por Sonis. De acordo com este modelo, a mucosite se desenvolve através de cinco fases sobrepostas que envolvem lesão citotóxica direta, estresse oxidativo, sinalização inflamatória, degradação tecidual e reparo subsequente.

A fase de iniciação ocorre imediatamente após a exposição a agentes quimioterápicos como o 5-fluorouracil e é caracterizada por dano direto ao DNA nas células das criptas intestinais de rápida divisão, juntamente com a geração excessiva de espécies reativas de oxigênio (EROs). Esses eventos precoces interrompem a homeostase celular, induzem disfunção mitocondrial e atuam como gatilhos primários para cascatas inflamatórias a jusante.

Na fase de regulação positiva e geração de mensagem, o estresse oxidativo e a lesão celular ativam fatores de transcrição chave, particularmente o fator nuclear kappa B (NF-κB). Essa ativação leva ao aumento da expressão de mediadores pró-inflamatórios, incluindo fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β) e interleucina-6 (IL-6), que prejudicam ainda mais a renovação epitelial e promovem apoptose das células intestinais.

A fase de amplificação do sinal é impulsionada por mecanismos de feedback positivo nos quais citocinas, quimiocinas e metaloproteinases da matriz intensificam o dano tecidual. A produção contínua de EROs e a sinalização inflamatória sustentada exacerbam a perda de criptas, comprometem a integridade epitelial e amplificam a lesão mucosa para além do insulto citotóxico inicial.
A fase de ulceração representa o estágio clinicamente mais grave da MI e é caracterizada por extensa denudação epitelial, ruptura da barreira intestinal e exposição da lâmina própria subjacente. Esta fase está associada a sintomas gastrointestinais graves, incluindo diarreia, dor abdominal, má absorção e aumento do risco de translocação bacteriana e infecção sistêmica.

Finalmente, a fase de cicatrização envolve a restituição epitelial por meio da proliferação, diferenciação e migração de células-tronco intestinais sobreviventes, levando à restauração gradual da estrutura e função da mucosa uma vez que a pressão da quimioterapia é aliviada. No entanto, a cicatrização incompleta ou retardada pode predispor os pacientes a inflamação persistente e disfunção gastrointestinal de longo prazo.

Nesse contexto biológico, estratégias terapêuticas capazes de exercer ações duplas — atenuar danos oxidativos e inflamatórios durante as fases iniciais, ao mesmo tempo em que apoiam a reparação tecidual e a recuperação funcional nas fases posteriores — são particularmente atraentes para o manejo da mucosite intestinal induzida por quimioterapia.

Dentro do campo da etnofarmacologia, a Commiphora leptophloeos tem atraído interesse crescente devido ao seu uso tradicional em condições inflamatórias e cicatrização de feridas. Apesar das evidências empíricas que apoiam suas aplicações medicinais, as investigações científicas sobre suas propriedades biológicas e mecanismos de ação permanecem limitadas. Estudos envolvendo outras espécies do gênero Commiphora relatam atividades anti-inflamatórias, antioxidantes e de reparação tecidual, reforçando a justificativa para uma investigação mais aprofundada da C. leptophloeos. A Commiphora leptophloeos (Mart.) J.B. Gillett (Burseraceae) surge como uma espécie medicinal relevante nativa do Brasil, tradicionalmente utilizada por comunidades indígenas e rurais para o tratamento de feridas, processos inflamatórios, infecções e distúrbios gastrointestinais. Em um estudo recente, Da Silva et al. (2024) investigaram o perfil fitoquímico e os efeitos terapêuticos do extrato foliar de C. leptophloeos no contexto da doença inflamatória intestinal (DII). O extrato, caracterizado por altos níveis de ácidos fenólicos e flavonoides, exibiu propriedades anti-inflamatórias ao diminuir mediadores pró-inflamatórios tanto em macrófagos ativados quanto em um modelo de colite induzida por ácido 2,4-dinitrobenzenossulfônico (DNBS) em camundongos. A administração intragástrica do extrato nas doses de 300, 400 e 500 mg/kg resultou na supressão de vias de sinalização inflamatória chave. Esses resultados apontam para o potencial da C. leptophloeos como candidata para terapia da DII e apoiam a necessidade de investigação adicional.
Embora estudos anteriores tenham demonstrado propriedades antibacterianas e anti-inflamatórias de C. leptophloeos, a maioria das investigações concentrou-se no extrato foliar e testou apenas um número limitado de cepas microbianas. Até o momento, o potencial do extrato da casca do caule não foi avaliado sistematicamente no contexto da mucosite intestinal induzida por quimioterapia. Portanto, este estudo aborda essa lacuna caracterizando a composição fitoquímica, avaliando a atividade antibacteriana contra um amplo painel de isolados clínicos e investigando os efeitos protetores do extrato da casca do caule em um modelo de mucosite induzida por 5-FU.

Ao contrário do extrato foliar, a casca do caule contém níveis mais elevados de proantocianidinas e flavonoides glicosilados, compostos fortemente associados a propriedades antibacterianas, antioxidantes e protetoras da mucosa. Portanto, investigar a casca do caule é consistente com as práticas etnofarmacológicas e pode revelar atividades bioativas únicas ou complementares em comparação com as folhas (Tabela 1).

Escore de classificação histopatológica.

Escore Descrição dos achados 0 Arquitetura normal das vilosidades e criptas; ausência de alterações inflamatórias. 1 Alterações leves, incluindo encurtamento das vilosidades e perda parcial da arquitetura das criptas; infiltrado inflamatório discreto; vacuolização e edema discreto na mucosa; camada muscular preservada. 2 Achatamento acentuado das vilosidades com achatamento epitelial e vacuolização; necrose focal das criptas; infiltrado inflamatório moderado; edema e vacuolização tanto na mucosa quanto na submucosa; camada muscular permanece intacta. 3 Atrofia grave das vilosidades e necrose extensa das criptas; infiltração inflamatória intensa; edema e vacuolização proeminentes nas camadas mucosa, submucosa e muscular; presença de neutrófilos na camada muscular.

Com base nesse contexto, levantamos a hipótese de que o extrato hidroetanólico da casca do caule de C. leptophloeos exerce efeitos benéficos na lesão intestinal induzida por quimioterapia, modulando a inflamação, o estresse oxidativo, a integridade epitelial e a suscetibilidade microbiana. Assim, o presente estudo teve como objetivo caracterizar a composição fitoquímica do extrato da casca do caule, avaliar sua atividade antibacteriana contra um painel extenso de isolados bacterianos e investigar seus efeitos na arquitetura intestinal, marcadores inflamatórios, estresse oxidativo e função de barreira em um modelo de mucosite induzida por 5-fluorouracil em camundongos.

Resultados e Discussão

Identificação Fitoquímica Putativa do Extrato de Commiphora Leptophloeos
Esta abordagem resultou na anotação putativa de 21 compostos no nível de confiança 3 da iniciativa de padrões de metabolômica (MSI) (Figura 1, Tabela 2), com base em seus íons [M–H]−, padrões de fragmentação MS/MS e comparação com metabólitos previamente relatados no gênero ou espécie Commiphora. Embora 22 picos tenham sido detectados no cromatograma, um pico não pôde ser caracterizado estruturalmente e, portanto, permanece não identificado. Em geral, os perfis de fragmentação foram caracterizados principalmente por perdas neutras de unidades de hexose (–162 Da), desoxi-hexose (–146 Da) e galoíla (–152 Da), além de clivagens retro‐Diels–Alder e de fissão do anel heterocíclico típicas de proantocianidinas e flavonoides, conforme já relatado em nossos estudos anteriores.

Cromatograma de pico base (BPC) obtido por análise UPLC‐ESI‐IT‐MS em modo de íon negativo da casca do caule HECL. Os picos correspondem a compostos tentativamente anotados com base em padrões de fragmentação MS/MS e comparação com dados da literatura.

Compostos tentativamente identificados no extrato da casca do caule de C. leptophloeos (HECL) por espectrometria de massas.
Pico Rt(min) [M‐H]−m/z MS/MSm/z Identificação tentativa
1 0.83 191 173, 127, 85 Ácido quínico
2 2.80 879 577, 451, 425, 289 Proantocianidina trimérica tipo B
3 3.33 865 577, 451, 425, 289 Procianidina trimérica tipo B
4 3.50 1153 865, 577, 451, 425, 289 Procianidina tetramérica tipo B
5 3.72 577 429, 357, 327, 285 Procianidina dimérica tipo B
6 4.22 865 577, 451, 425, 289 Procianidina trimérica tipo B
7 4.45 1153 865, 577, 451, 425, 289 Procianidina tetramérica tipo B
8 5.17 1153 865, 577, 451, 425, 289 Procianidina tetramérica tipo B
9 5.24 1153 865, 577, 451, 425, 289 Procianidina tetramérica tipo B
10 5.29 1441 1153, 865, 577, 289 Procianidina pentamérica tipo B
11 5.43 863 575, 451, 425, 289 Proantocianidina trimérica tipo A
12 5.49 1151 863, 577, 451, 425, 289 Proantocianidina tetramérica tipo A
13 5.55 447 357, 327, 285 Luteolina-hexose
14 5.61 447 429, 357, 327, 285 Luteolina-hexose
15 5.61 599 447, 429, 357, 327, 285 Galoilorientina
16 5.72 865 577, 451, 425, 289 Procianidina trimérica tipo B
17 5.92 431 341, 311, 283 Apigenina-hexose
18 6.23 431 413, 341, 311, 283 Apigenina-hexose
19 6.54 501 301 Hexosídeo de ácido elágico
20 6.74 535 — Não identificado
21 7.08 447 301, 179, 151 Quercetina-desoxi-hexose
22 7.26 623 477, 461, 301 Metoxiquercetina-hexose-desoxi-hexose

Referências dos estudos listados na Tabela 2. Picos: 1–6; 7–1218, 13–18, 19; 21 e 22.
Assim, o primeiro composto detectado (pico 1, m/z 191) foi tentativamente identificado como ácido quínico, que fragmentou em m/z 173, m/z 127 e m/z 85. Os picos principais de 2 a 10 apresentaram íons precursores em m/z 577, m/z 865, m/z 879 e m/z 1153 correspondentes aos dímeros, trímeros e tetrâmeros de procianidinas com ligação do tipo B e seus respectivos isômeros. Essas estruturas oligoméricas indicam um alto grau de polimerização de proantocianidinas, consistente com perfis previamente relatados para esta espécie. Duas procianidinas do tipo A também foram tentativamente identificadas. O trímero (pico 11, m/z 863) apresentou um fragmento em m/z 575 (–288 e –2 Da), indicativo de uma ligação éter adicional conectando as unidades de flavan‐3‐ol, uma característica marcante das ligações do tipo A. A proantocianidina tetramérica do tipo A (pico 12, m/z 1151) gerou íons fragmento em m/z 863, 577, 451, 425 e 289, confirmando uma conexão interflavano semelhante.

Além disso, vários glicosídeos flavonoides também foram anotados. Os picos 13 e 14 (m/z 447) foram atribuídos à luteolina‐hexosídeo e seus respectivos isômeros. Seus espectros de EM/EM mostraram padrões de fragmentação com íons em m/z 357, 327 e 285 para o composto 13, e m/z 429, 357, 327 e 285 para o composto 14, consistentes com clivagens do anel cruzado das porções de hexose ligadas. O pico 15 (m/z 599) foi tentativamente identificado como galoilorientina, exibindo uma perda primária do grupo galoíla (−152 Da), seguida por clivagem do açúcar, resultando em m/z 285 (aglicona luteolina). Os picos 17 e 18 (m/z 431) foram anotados como isômero de apigenina‐hexosídeo, com íons fragmento em m/z 341, 311 e 283 para o composto 17, e m/z 413, 341, 311 e 283 para o composto 18. Esses padrões de fragmentação suportam a anotação de flavonas glicosiladas.

Somado a isso, um composto em m/z 501 (pico 19) foi proposto como hexosídeo de ácido elágico. Sua fragmentação levou a um único íon dominante em m/z 301, representando a aglicona do ácido elágico após a perda de uma porção hexose (–162 Da). Embora não seja possível anotar o composto em m/z 535 (pico 20) devido à sua baixa intensidade e ausência de fragmentação informativa por EM/EM. O pico 21 (m/z 447), em contraste, foi anotado como quercetina‐desoxihexose, apresentando íons fragmento característicos em m/z 301 (aglicona quercetina), 179 e 151. Finalmente, o pico 22 (m/z 623) foi tentativamente identificado como metoxiquercetina‐hexose‐desoxihexose, fragmentando-se sequencialmente para m/z 477, 461 e, finalmente, m/z 301, confirmando a presença de uma metoxilação diglicosilada.
É importante enfatizar que o objetivo da presente análise baseada em EM foi confirmar a conservação do perfil fitoquímico do extrato hidroetanólico da casca do caule, em vez de fornecer identificação estrutural definitiva. Vários dos principais constituintes do HECL, particularmente as procianidinas do tipo B, foram previamente isolados desta espécie e suas estruturas foram inequivocamente elucidadas por RMN e espectrometria de massas. Além disso, esses compostos foram quantificados anteriormente usando um método validado de CLAE–UV–ELSD, que demonstrou que a procianidina dimérica do tipo B é o principal constituinte do HECL e um forte candidato como marcador químico para controle de qualidade. Procianidinas triméricas, tetraméricas e pentaméricas do tipo B também foram quantificadas, embora ocorram em concentrações mais baixas em comparação com o dímero. Portanto, os presentes resultados reforçam a predominância de derivados de procianidina no HECL e confirmam a estabilidade do seu padrão fitoquímico característico.
Atividade Antibacteriana do HECL
O HECL exibiu atividade antibacteriana interessante contra várias cepas clínicas e de referência Gram‐positivas. A inibição foi observada para Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Enterococcus faecalis, Enterococcus avium, Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium striatum e Bacillus cereus, com CIM variando de 40 a 100 µg/mL, conforme detalhado na Tabela 3.
Concentração inibitória mínima (CIM) do HECL e do antibiótico de referência ofloxacina contra bactérias Gram‐positivas. Todos os ensaios foram conduzidos em triplicata (n = 3).
Espécie bacteriana Referência CIM (µg/mL) Ofloxacino HECL Bacillus cereus CIP 6624 0,25 60 Bacillus cereus N551 0,25 60 Bacillus cereus N839 0,25 40 Bacillus cereus N1060 0,5 40 Bacillus cereus N1139 0,5 40 Corynebacterium minutissimum CIP 100652T 2 40 Corynebacterium striatum N1129 0,5 60 Enterococcus avium CIP 104 053 0,5 > 100 Enterococcus avium N1061 2 > 100 Enterococcus avium N1064 2 > 100 Enterococcus casseliflavus CIP 103.
Durante os experimentos, não foram observadas mortes de animais nos grupos NC, 5-FU e tratados com HECL por três dias. Em relação ao peso corporal, o grupo NC apresentou aumento na porcentagem de peso (102,8%) no dia 3, enquanto o grupo 5-FU sofreu perda de peso (96,9%). O tratamento com HECL não preveniu a perda de peso induzida por 5-FU, embora os animais nos grupos de 1 e 10 mg/kg tenham apresentado recuperação significativa de peso em comparação ao grupo controle positivo (p < 0,01 e p < 0,001, respectivamente), (Figura 2a). No HECL 0,5 mg/kg, a porcentagem de peso corporal foi de 90,5%, p > 0,05.
Efeito dos tratamentos em diferentes parâmetros em animais experimentais (a): Porcentagem do peso corporal no primeiro e terceiro dias; (b) contagem total de leucócitos; (c) porcentagem da atividade da acetilcolinesterase em diferentes pontos de tempo (segundos); (d) níveis de malonaldeído (MDA) expressos em nmol/g de tecido. Níveis das citocinas pró-inflamatórias (e) IL-1β (esquerda) e (f) IL-6 (direita) no tecido intestinal de camundongos tratados com 5-fluorouracil (5FU) e extrato hidroetanólico de Commiphora leptophloeos (HECL) nas doses de 0,5, 1 e 10 mg/kg. Os dados são expressos como média ± EPM. Uma redução significativa nos níveis de IL-6 foi observada no grupo HECL-10 em comparação ao grupo 5FU. Grupos: CN (controle negativo); 5FU; HECL0,5; HECL1 e HECL10. *p < 0,05, **p < 0,01; ***p < 0,001.
Os dados da contagem global de leucócitos mostraram valores de 2920 ± 1189/mm3 para o grupo NC e 2028 ± 217,5/mm3 para o grupo 5-FU. Para os grupos tratados com HECL nas doses de 0,5, 1 e 10 mg, as contagens de leucócitos foram 2380 ± 712,9/mm3, 2920 ± 1622/mm3 e 2386 ± 975,6/mm3, respectivamente (Figura 2b).
A Tabela 4 apresenta os valores de referência e os achados bioquímicos para ALT/TGP (U/L), creatinina (mg/dL) e ureia (mg/dL), que permaneceram dentro da faixa de referência.
Parâmetros bioquímicos da função hepática e renal.
Grupos ALT (U/L) Creatinina (mg/dL) Ureia (mg/dL) NC 58,14 ± 23,54 0,38 ± 0,19 44,2 ± 8,41 5FU 56,30 ± 25,89 0,4 ± 0,18 29,6 ± 3,13 HECL 0,5 49,80 ± 29,55 0,392 ± 0,07 55,40 ± 5,68(a) HECL 1 48,78 ± 40,58 0,292 ± 0,11 43,40 ± 10,64 HECL 10 70,32 ± 45,39 0,408 ± 0,04 36,20 ± 7,26 Valores de referência (mínimo e máximo) 24–131 0,1–0,62 45–90
NC: Controle negativo; 5FU (grupo 5-fluorouracil); Extrato hidroetanólico da casca do caule de C. leptophloeos (HECL) doses: 0,5, 1 e 10 mg/kg. (a) 5FU vs HECL 0,5 < 0,01. Valores de referência.
Em todos os grupos, os valores de ALT/TGP estavam dentro da faixa de referência (24–131 U/L), indicando ausência de lesão hepática induzida pelos tratamentos. Os grupos NC (58,14 ± 23,54 U/L), 5FU (56,30 ± 25,89 U/L) e tratados com HECL (49,80 ± 29,55; 48,78 ± 40,58 e 70,32 ± 45,39 U/L para 0,5, 1 e 10 mg/kg, respectivamente) não apresentaram desvios significativos dos valores de referência.
Os níveis de creatinina em todos os grupos também permaneceram dentro da faixa normal (0,1–0,62 mg/dL), sugerindo função renal preservada. O grupo NC apresentou 0,38 ± 0,19 mg/dL, enquanto o grupo 5FU teve 0,4 ± 0,18 mg/dL. Os grupos HECL mostraram valores semelhantes (0,392 ± 0,07; 0,292 ± 0,11; 0,408 ± 0,04 mg/dL para 0,5, 1 e 10 mg/kg, respectivamente).

Em relação aos níveis de ureia (referência 45–90 mg/dL), a maioria dos grupos permaneceu dentro da faixa normal, exceto o grupo 5FU, que apresentou um valor médio mais baixo (29,6 ± 3,13 mg/dL) e significância estatística em comparação com o grupo HECL 0,5 mg/kg (p < 0,01). Os grupos NC, HECL 0,5 mg/kg, HECL 1 mg/kg e HECL 10 mg/kg apresentaram valores de ureia dentro da faixa de referência (44,2 ± 8,41; 55,40 ± 5,68 mg/dL; 43,40 ± 10,64; e 36,20 ± 7,26 mg/dL, respectivamente).

Dosagem de Malonaldeído (MDA)

Os resultados da produção de malondialdeído indicaram uma tendência de redução dos níveis no grupo tratado com HECL 10 mg (110,3 ± 57,4), sugerindo um potencial efeito terapêutico. Embora não estatisticamente significativo (p > 0,05), os níveis de MDA mostraram uma tendência de queda no grupo HECL 10 mg, sugerindo uma possível redução na peroxidação lipídica (Figura 2d).

Atividade da Acetilcolinesterase e Retenção Fecal no Intestino

Nossos achados mostraram que, para os grupos CN e HECL10, escore 0 com ausência de retenção fecal ao longo do intestino, enquanto a retenção foi intensa em volume e extensão para os grupos 5FU, HECL0,5 e HECL1.

A atividade da acetilcolinesterase (AChE) foi avaliada em todos os grupos experimentais em diferentes momentos (0, 30, 120 e 360 s). Conforme mostrado na Figura 2c, o grupo NC apresentou a menor porcentagem de atividade da AChE ao longo do tempo, refletindo condições fisiológicas e motilidade intestinal normal. Em contraste, o grupo 5FU manteve valores relativamente altos de atividade da AChE, com apenas uma modesta diminuição ao longo do tempo. Entre os grupos tratados com HECL, o padrão de atividade variou com a dose: HECL 0,5 mg e HECL 1 mg mostraram níveis de atividade da AChE intermediários, mais próximos aos do grupo 5FU nos momentos iniciais, mas com um declínio progressivo após 120 e 360 s. HECL 10 mg exibiu um perfil mais semelhante ao NC, demonstrando uma diminuição acentuada na atividade da AChE ao final do período de observação. No geral, os tratamentos com HECL, particularmente nas doses mais altas, produziram padrões de atividade da AChE que se aproximaram do grupo NC, sugerindo um potencial efeito modulador na atividade enzimática em comparação com o tratamento com 5FU.

Níveis de Citocinas (IL-1β e IL-6)
Treatment with C. leptophloeos bark extract (HECL) significantly attenuated IL‐1β (pg/mL). According to nonparametric Mann–Whitney analysis followed by Dunn's post hoc test, animals treated with HECL at 1 mg/kg showed a statistically significant reduction in IL‐1β concentrations compared to the 5‐FU group (p < 0.05), Figure 2e. Treatment with C. leptophloeos bark extract (HECL) significantly attenuated IL‐6 levels. According to nonparametric Mann–Whitney analysis followed by Dunn's post hoc test, animals treated with HECL at 1 and 10 mg/kg showed a statistically significant reduction in IL‐6 concentrations compared to the 5‐FU group (p < 0.05). Among the tested doses, HECL treatment resulted in a marked suppression of IL‐6 release, with cytokine levels approaching those observed under noninflamed conditions, Figure 2f.
Histopatological Analysis
Our findings revealed that 5‐FU induced intestinal damage across duodenum 1 (1.0–2.5) and Ileum 1.5 (1.0–2.5) intestinal segments (Figures 3 and 4) compared with CN 0.0 (0.0–0.0), p < 0.01 and p < 0.5, respectively. This damage manifested as shortened villi, compromised crypt architecture, submucosal edema, and a pronounced influx of inflammatory cells into the propria lamina.
Histopathological analysis of duodenum tissues obtained from animals in control and treated groups. (A) Negative control group (CN) showing preservation of villi architecture and overall organ structure. (B) Positive control group (CP) demonstrating a marked loss of organ architecture, with villi shortening, loss of crypt architecture, presence of necrosis, vacuolization and edema in the muscular layer. (C) and (D) Treated groups CL 0.5 and CL 1 mg/kg, respectively, showing villi shortening, loss of crypt architecture, and sparse infiltration of inflammatory cells. (E) Group CL 10 mg/kg demonstrating preservation of intestinal villi and organ architecture, with absence of inflammatory cells. A –Negative control (NC); B: 5FU; C: HECL0.5; D: HECL1; E: HECL10. ** p < 0.01; * p < 0.05. Histological scores are expressed as median with interquartile range (IQR). Error bars represent the 25th–75th percentiles. Statistical analysis was performed using Kruskal–Wallis test followed by Dunn's post hoc test.
Análise histopatológica do tecido do íleo obtido de animais dos grupos controle e tratado. O grupo controle negativo (A) mostra preservação da arquitetura das vilosidades, criptas e estrutura do órgão. O grupo controle positivo (B) exibe perda significativa da arquitetura tecidual, incluindo encurtamento das vilosidades, desorganização das criptas e necrose. Nos grupos tratados, CL 0,5 (C) e CL 1 (D), observam-se encurtamento das vilosidades, desorganização das criptas e infiltração esparsa de células inflamatórias. No grupo CL 10 (E), é evidente maior preservação das vilosidades intestinais e ausência de células inflamatórias. O gráfico de barras à direita representa o escore histopatológico, onde os asteriscos indicam diferença estatisticamente significativa em comparação ao grupo controle negativo. A – Controle negativo (CN); B: 5FU; C: HECL0,5; D: HECL1; E: HECL10. * p < 0,05. Os escores histológicos são expressos como mediana com intervalo interquartil (IIQ). As barras de erro representam os percentis 25–75. A análise estatística foi realizada pelo teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste post hoc de Dunn.
O HECL a 10 mg/kg preservou significativamente a arquitetura histológica do duodeno, com escores 0 (0,0–0,75) próximos aos do grupo controle, indicando proteção contra a lesão da mucosa induzida por 5‐FU (p < 0,05), Figura 3. A Figura 5 mostrou o jejuno com diferença significativa entre o escore do HECL0,5 1,5 (1,5–1,88) e o HECL10, escore 1,0 (1,0–1,0). O CN apresentou diferença significativa em comparação a todos os grupos (p < 0,001).
Análise histopatológica do tecido do jejuno obtido dos grupos controle e tratado: O grupo controle negativo (A) mostra preservação da arquitetura das vilosidades e da estrutura geral do órgão. No grupo controle positivo (B), há perda significativa da arquitetura do órgão com encurtamento das vilosidades, distorção das criptas e necrose. Nos grupos tratados, CL 0,5 (C) e CL 1 (D), observam-se encurtamento das vilosidades, perda da arquitetura das criptas e infiltração esparsa de células inflamatórias. No grupo CL 10 (E), observa-se maior preservação das vilosidades intestinais e infiltração esparsa de células inflamatórias. O gráfico de barras à direita representa o escore histopatológico, onde os asteriscos indicam significância estatística. A – Controle negativo (CN); B: 5FU; C: HECL0,5; D: HECL1; E: HECL10. * p < 0,05. a = CN comparado a todos os grupos (p˂0,001). Os escores histológicos são expressos como mediana com intervalo interquartil (IIQ). As barras de erro representam os percentis 25–75. A análise estatística foi realizada pelo teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste post hoc de Dunn.
Na Figura 6, foi observada diferença estatisticamente significativa entre o escore do grupo CN 0,0 (0,0–0,0) e o escore do 5‐FU 0,5 (0,5–1,0), HECL0,5 escore 1,0 (0,5–1,0) e HECL1 escore 0,75 (0,5–1,0) (p < 0,05). Notavelmente, o escore do HECL10 0,5 (0,25–1,0) não mostrou alterações morfológicas patológicas na região do cólon quando comparado ao grupo CN (p > 0,05).
Seções histológicas representativas do cólon (A–E) coradas com hematoxilina e eosina (H&E). (A) Grupo controle (CN) mostrando arquitetura mucosa normal com revestimento epitelial intacto, criptas preservadas e abundantes células caliciformes. (B) Grupo 5‐FU exibindo acentuada ruptura epitelial, encurtamento das criptas, infiltração de células inflamatórias na lâmina própria e redução de células caliciformes. (C) Grupo tratado com HECL0,5 com estrutura de criptas majoritariamente preservada, infiltração inflamatória mínima e revestimento epitelial intacto, indicando um efeito protetor. (D) Grupo tratado com HECL1 mostrando dano epitelial leve e discreta ruptura das criptas com infiltração inflamatória leve. (E) Grupo tratado com HECL10 com arquitetura mucosa quase normal, células inflamatórias esparsas e células caliciformes preservadas semelhantes ao controle. O gráfico (C) representa os escores histopatológicos do cólon; o grupo CN mostra uma diminuição significativa em comparação com 5FU, HECL0,5 e HECL1,0 (*p < 0,05). A – Controle negativo (NC); B: 5FU; C: HECL0,5; D: HECL1; E: HECL10. Os escores histológicos são expressos como mediana com intervalo interquartil (IQR). As barras de erro representam os percentis 25–75. A análise estatística foi realizada usando o teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste post hoc de Dunn.

Imunocoloração de MUC-2 e Ocluddin
A expressão de MUC‐2 no duodeno foi significativamente aumentada no grupo HECL 10 mg/kg [1,6 (1,4–2,0)] em comparação ao grupo 5‐FU [1,2 (0,8–1,6); p < 0,05] (Figura 7). Em contraste, a expressão de ocludina não diferiu significativamente entre os grupos (p > 0,05; não mostrado).

Coloração imuno-histoquímica para MUC‐2 no tecido do cólon. (A) Grupo controle (CN) mostrando imunorreatividade forte e uniforme para MUC‐2 ao longo do epitélio mucoso e das criptas, com coloração intensa das células caliciformes. (B) Grupo tratado com 5‐FU exibindo redução acentuada e perda focal da imunocoloração de MUC‐2, com ruptura da integridade epitelial e depleção de células caliciformes. (C) Grupo tratado com HECL10 demonstrando expressão aumentada de MUC‐2 em comparação ao grupo 5‐FU, com maior intensidade de coloração e restauração da arquitetura mucosa. O gráfico de barras representa o escore quantitativo de imunocoloração de MUC‐2; o grupo 5‐FU mostra uma diminuição significativa em comparação ao controle, enquanto o grupo HECL10 apresenta expressão de MUC‐2 significativamente maior (*p < 0,05), indicando proteção da mucosa pelo HECL10. Controle negativo (NC); 5FU; HECL10. Os escores histológicos são expressos como mediana com intervalo interquartil (IQR). As barras de erro representam os percentis 25–75. A análise estatística foi realizada usando o teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste post hoc de Dunn.
Estudos fitoquímicos anteriores sobre vários extratos da casca do caule de C. leptophloeos, incluindo extratos hexânico, acetato de etila, metanólico, etanólico e aquoso, desenvolveram um perfil complexo de compostos bioativos. Consistente com relatos anteriores, o HECL era rico em compostos fenólicos, particularmente proantocianidinas oligoméricas e poliméricas, que estão ligadas às suas propriedades antimicrobianas. Claramente, as proantocianidinas oligoméricas e poliméricas foram identificadas provisoriamente como os principais constituintes, principalmente relacionados às atividades antifúngica e antibacteriana da espécie.

A análise por espectrometria de massas do HECL neste estudo revelou que as proantocianidinas constituem a principal classe de metabólitos secundários, conforme indicado pela maior intensidade de picos no perfil cromatográfico. Além disso, flavonoides glicosilados foram detectados no extrato, embora em menores quantidades. Essa descoberta é notável, uma vez que tais compostos são tipicamente relatados em extratos foliares, e não na casca do caule, conforme demonstrado aqui. A presença desses flavonoides glicosilados pode implicar um potencial farmacológico aprimorado devido às suas reconhecidas atividades antioxidante e anti-inflamatória.

O HECL apresentou atividade antibacteriana contra uma variedade de bactérias Gram-positivas, incluindo S. aureus, S. epidermidis, E. faecalis e C. striatum, patógenos comumente implicados em infecções sistêmicas em pacientes imunocomprometidos. A inibição desses patógenos é particularmente relevante devido ao seu papel em infecções secundárias associadas à ruptura da barreira mucosa induzida por quimioterapia.
A inibição de Bacillus cereus, um agente causador de gastroenterite de origem alimentar, e de C. striatum, um patógeno emergente multirresistente associado a infecções da corrente sanguínea e gastrointestinais, corrobora ainda mais a utilidade potencial do HECL no tratamento de infecções secundárias associadas a danos à barreira mucosa durante a mucosite intestinal. Em contraste, nenhuma atividade foi observada contra bactérias Gram-negativas em concentrações de até 100 µg/mL. Isso é consistente com sua resistência intrínseca devido à impermeabilidade da membrana externa. A atividade antibacteriana seletiva do extrato da casca do caule de C. leptophloeos pode ser atribuída ao seu alto teor de compostos fenólicos, particularmente proantocianidinas. Esses compostos são capazes de desestabilizar a camada de peptidoglicano, danificar a membrana citoplasmática e interferir na síntese de proteínas e ácidos nucleicos, o que explica sua eficácia contra bactérias Gram-positivas. Em organismos Gram-negativos, no entanto, a presença de uma membrana externa adicional composta por lipopolissacarídeos atua como uma barreira de permeabilidade, dificultando a entrada de muitos compostos fenólicos, especialmente aqueles de maior peso molecular. Essa diferença estrutural justifica por que extratos ricos em fenólicos geralmente apresentam atividade mais forte contra patógenos Gram-positivos e atividade limitada ou ausente contra cepas Gram-negativas. Estudos anteriores com extratos de C. leptophloeos corroboram esses achados, relatando efeitos antibacterianos contra cepas Gram-negativas apenas em concentrações superiores a 1000 µg/mL. De acordo com, extratos vegetais são considerados como tendo atividade antibacteriana clinicamente importante quando os valores de CIM estão abaixo de 100 µg/mL. Embora concentrações mais altas sejam frequentemente exploradas, o presente estudo focou em concentrações ≤ 100 µg/mL, consistentes com a relevância terapêutica e o potencial para aplicação clínica.
A atividade seletiva do HECL contra bactérias Gram-positivas pode ser atribuída ao seu alto teor de compostos fenólicos, incluindo procianidinas. Embora esses compostos tenham ação limitada contra organismos Gram-negativos, sabe-se que eles exercem múltiplos mecanismos antibacterianos contra patógenos Gram-positivos, como desestabilização da parede celular e da integridade da membrana, inibição da síntese proteica e interações com o DNA que levam à morte bacteriana.
Nossos achados mostraram que parâmetros como peso corporal, contagem de leucócitos e atividade da acetilcolinesterase (AChE) forneceram insights sobre os impactos sistêmicos de C. leptophloeos. Embora o HECL tenha mantido parcialmente as contagens de leucócitos durante o tratamento com 5‐FU, sugerindo um potencial papel imunomodulador, a interpretação desse efeito é limitada. Nossa análise baseou-se principalmente em parâmetros hematológicos gerais, sem caracterização de subpopulações de células imunes (por exemplo, perfis de linfócitos, neutrófilos, monócitos) ou um painel de citocinas mais amplo além dos mediadores selecionados. Além disso, o HECL não preveniu significativamente a perda de peso associada à quimioterapia, o que levanta questões sobre sua capacidade protetora sistêmica. Essas limitações destacam a necessidade de avaliações imunológicas e fisiológicas mais abrangentes, como citometria de fluxo, ensaios metabólicos e estudos de toxicidade de longo prazo, para determinar a relevância terapêutica de C. leptophloeos na redução dos efeitos adversos induzidos pela quimioterapia. Enquanto o extrato não preveniu significativamente a perda de peso associada à quimioterapia, a manutenção relativa das contagens de leucócitos sugere um efeito imunomodulador.
Notavelmente, o tratamento com C. leptophloeos na dose de 10 mg/kg (HECL) preservou a atividade da AChE, indicando que a motilidade intestinal permanece relativamente mantida, o que pode ajudar a mitigar a gravidade da diarreia ou constipação. Em contraste, a mucosite intestinal induzida pelo agente quimioterápico 5‐fluorouracil (5‐FU) está tipicamente associada a um aumento significativo na atividade da AChE, refletindo alterações na função do sistema nervoso entérico. Esse aumento leva a um acúmulo de AChE, o que pode resultar em desregulação da resposta inflamatória e exacerbação do dano tecidual. Portanto, manter a atividade adequada da AChE é crucial para equilibrar a resposta inflamatória durante a mucosite intestinal, contribuindo para a integridade e funcionalidade da mucosa gastrointestinal.
O tratamento com C. leptophloeos na dose de 10 mg/kg (HECL) reduziu significativamente os níveis de IL‐6, o que pode contribuir para a preservação da atividade da AChE e, consequentemente, para a manutenção da motilidade intestinal. Sabe-se que a IL‐6 elevada perturba a função do sistema nervoso entérico, podendo levar à alteração da atividade da AChE e ao comprometimento da motilidade intestinal. Ao reduzir a IL‐6, o HECL ajuda a normalizar a atividade da AChE, mitigando o risco de diarreia ou constipação em condições de mucosite intestinal induzida por 5‐fluorouracil (5‐FU). Esses achados são apoiados por estudos anteriores que demonstraram uma correlação entre citocinas pró-inflamatórias e a regulação da motilidade intestinal mediada pela AChE.
Os marcadores bioquímicos (ALT, creatinina e ureia) permaneceram dentro dos limites fisiológicos em todos os grupos tratados, sugerindo que o HECL não induziu toxicidade sistêmica nas doses testadas. Esses achados estão alinhados com estudos de toxicidade anteriores, que não relataram alterações comportamentais ou bioquímicas após a administração de altas doses de C. leptophloeos (2000 mg/kg, v.o.) em roedores. Os parâmetros bioquímicos (triglicerídeos, proteínas, colesterol, glicose, ureia, creatinina e aspartato aminotransferase) não foram estatisticamente significativos entre os grupos teste e controle (solução salina).

A mucosite intestinal destaca-se como uma das complicações mais desafiadoras decorrentes da quimioterapia, particularmente com a administração de 5-FU, em grande parte devido aos seus mecanismos multifacetados que englobam estresse oxidativo, inflamação e lesão epitelial. Neste estudo, o HECL demonstrou um efeito protetor na mucosa intestinal, especialmente na dose de 10 mg/kg, evidenciado pela preservação das vilosidades e criptas em seções duodenais. Esses achados estão de acordo com observações anteriores de que espécies de Commiphora possuem propriedades anti-inflamatórias, possivelmente ligadas a compostos fenólicos e flavonoides. Além disso, a expressão de MUC-2 em animais tratados com HECL é indicativa de uma função melhorada da barreira de muco, o que é crítico para mitigar a permeabilidade intestinal e, assim, reduzir a gravidade da mucosite. Embora o tratamento com HECL tenha preservado a arquitetura intestinal e aumentado a expressão de MUC-2, apoiando uma função de barreira melhorada, os mecanismos moleculares exatos subjacentes a esses efeitos permanecem incompletamente definidos. A análise fitoquímica confirmou uma predominância de proantocianidinas e flavonoides, ambos conhecidos por suas atividades antioxidantes e anti-inflamatórias; no entanto, sua contribuição individual para os efeitos protetores não foi especificamente dissecada in vivo. Além disso, embora a MUC-2 tenha sido significativamente regulada positivamente, outros marcadores de integridade epitelial (por exemplo, claudinas, ZO-1), estresse oxidativo (por exemplo, Nrf2/HO-1) e vias de sinalização inflamatória (por exemplo, NF-κB, COX-2 e iNOS) não foram investigados. Isso limita conclusões definitivas sobre a base molecular da atividade do HECL. Portanto, nossos achados devem ser considerados como um passo inicial, e estudos futuros são necessários para integrar a biodisponibilidade fitoquímica com análises mecanísticas da preservação da barreira epitelial e modulação imunológica.

A pesquisa sobre outros compostos fenólicos sugere que eles podem modular a expressão de MUC-2, contribuindo para a proteção da mucosa intestinal. Por exemplo, um estudo utilizando uma linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano indicou que os polifenóis podem regular a expressão de MUC-2, protegendo contra danos à mucosa. Adicionalmente, a vitexina, um flavonoide, mostrou aumentar a expressão de MUC-2 de forma dose-dependente em tecidos colônicos de camundongos com colite induzida.
In vivo no modelo de inflamação intestinal induzida por ácido 2,4‐dinitrobenzenossulfônico (DNBS) em camundongos, quando tratados com C. leptophloeos, foi capaz de regular negativamente NF‐κB p65/COX‐2, mTOR, iNOS e IL‐17, diminuir os níveis de malondialdeído e mieloperoxidase e as citocinas TNF‐α, IL‐1β e IL‐6. Além disso, a tendência observada de diminuição dos níveis de MDA em nosso estudo, embora não estatisticamente significativa, apoia a hipótese de que os compostos do HECL têm potencial para reduzir a peroxidação lipídica, um processo chave na patogênese da lesão intestinal.
Em resumo, o extrato da casca do caule de C. leptophloeos exibiu um efeito protetor multifacetado contra a mucosite intestinal induzida por 5‐FU, provavelmente mediado por suas propriedades antibacterianas, anti-inflamatórias e de preservação da barreira. Esses resultados apoiam seu uso tradicional e ressaltam a necessidade de mais estudos mecanísticos e translacionais.
Conclusões
Em resumo, o extrato hidroetanólico da casca do caule de C. leptophloeos (HECL) demonstrou potencial farmacológico promissor em um modelo murino de mucosite intestinal induzida por 5‐FU. O extrato exibiu atividade antibacteriana seletiva contra patógenos Gram‐positivos clinicamente relevantes e preservou a arquitetura intestinal e a integridade da mucosa. Esses efeitos podem ser atribuídos à predominância de proantocianidinas e à presença de flavonoides glicosilados, que provavelmente estão envolvidos nas propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e imunomoduladoras do extrato. No entanto, nossos achados devem ser interpretados com cautela. A análise imunológica foi baseada em parâmetros hematológicos gerais, sem avaliação de subconjuntos de células imunes ou de um perfil completo de citocinas, e o HECL não preveniu significativamente a perda de peso corporal. Além disso, embora a expressão de MUC‐2 tenha aumentado, outros marcadores críticos de integridade epitelial e sinalização inflamatória não foram avaliados. Essas limitações enfatizam a necessidade de estudos futuros que explorem a dinâmica das células imunes, as vias de sinalização molecular e a segurança a longo prazo para confirmar a relevância terapêutica de C. leptophloeos na redução da toxicidade induzida por quimioterapia. Coletivamente, esses resultados apoiam o uso etnofarmacológico de C. leptophloeos e sugerem seu potencial como estratégia terapêutica adjuvante para o manejo da mucosite intestinal e infecções bacterianas associadas em contextos oncológicos. Este estudo representa a primeira avaliação abrangente do potencial terapêutico duplo do extrato da casca de C. leptophloeos como terapia adjuvante para mitigar a mucosite intestinal induzida por quimioterapia, fornecendo validação científica para seu uso tradicional e abrindo caminho para o futuro desenvolvimento de medicamentos.
Seção Experimental
Material Vegetal e Preparação do Extrato Hidroetanólico
Cascas do caule de C. leptophloeos (Mart.) J.B. Gillett (Burseraceae) foram coletadas na cidade de Altinho, Estado de Pernambuco, Brasil, em julho de 2018, nas seguintes coordenadas 8° 29' 32" S e 36° 03' 03" O. O material vegetal foi identificado botanicamente pelo Dr. Geraldo Mariz e espécimes de cascas do caule de C. leptophloeos foram depositados no Herbário Geraldo Mariz da Universidade Federal de Pernambuco (número de voucher UFPE 46.191). A permissão para coleta foi emitida pelo Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBIO/Brasil 35017) e pelo Conselho de Gestão do Patrimônio Genético do Ministério do Meio Ambiente (CGEN/MMA—SISGEN/Brasil A618873). O nome da planta foi confirmado utilizando o banco de dados World Flora Online (www.worldfloraonline.org; acessado em 24 de janeiro de 2025).

O extrato hidroetanólico da casca do caule de C. leptophloeos (HECL) foi preparado de acordo com Dantas–Medeiros et al. (2021). Em resumo, uma porção de casca seca do caule (100 g) foi ressuspendida em uma mistura de etanol:água (7:3, v/v) na proporção de 1:10 (p/v). O solvente foi então evaporado a ≤40°C sob pressão reduzida com auxílio de um evaporador rotatório (Buchi‐Model V‐700, Altendorfer Str. 3, Essen, Alemanha). Após a completa secagem do solvente (etanol), a fase úmida foi liofilizada e armazenada a −20°C, resultando em um rendimento de 16,5% (16,5 g).

Análise da Composição Fitoquímica por Espectrometria de Massas

A caracterização qualitativa por UPLC‐ESI‐IT‐MS foi realizada utilizando um sistema de cromatografia líquida de ultraeficiência (Thermo Scientific) equipado com um amostrador automático Accela AS e uma bomba quaternária Accela 600, acoplado a um espectrômetro de massas do tipo ion trap LTQ XL com uma fonte de ionização por electrospray (ESI) operando no modo de íons negativos (Thermo, San Jose, CA, EUA). A separação cromatográfica ocorreu em uma coluna de fase reversa Waters C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 µm) mantida à temperatura ambiente. A temperatura da coluna não foi controlada ativamente porque o objetivo da análise era um perfil fitoquímico qualitativo baseado principalmente em padrões de fragmentação MS/MS, para os quais pequenas flutuações de temperatura não afetam significativamente a anotação de compostos ou o desempenho cromatográfico.

As fases móveis consistiram em água contendo 0,1% de ácido fórmico (fase A) e metanol (fase B), com um gradiente linear de 5% a 100% de B ao longo de 10 min. As amostras foram injetadas em um volume de 10 µL, e o sistema operou a uma vazão de 300 µL/min. O espectrômetro de massas foi configurado com uma voltagem capilar de −40 V, voltagem de spray de 5,00 kV, corrente da fonte de 5,09 µA e temperatura capilar de 350°C.
Para infusão direta, as amostras foram introduzidas através de um capilar de sílica fundida mantido a 280°C, utilizando o mesmo sistema LTQ XL. Os parâmetros operacionais incluíram uma tensão de spray de 5,00 kV, tensão do capilar de −47 V e tensão da lente do tubo de −226 V. Espectros de massa de varredura completa foram adquiridos dentro de uma faixa m/z de 150–1500. Análises de fragmentação MS/MS foram realizadas em íons precursores selecionados usando uma energia de colisão de 30% e tempo de ativação de 30 ms. Os dados foram processados utilizando o software Xcalibur (versão 2.0).
É importante notar que a separação cromatográfica foi utilizada para o perfil metabólico e seleção de íons precursores, enquanto a infusão direta foi aplicada exclusivamente para aumentar a intensidade do sinal de fragmentação para anotação estrutural qualitativa. Assim, a anotação dos compostos baseou-se na interpretação do comportamento de fragmentação MS/MS, comparação com dados da literatura para metabólitos relatados no gênero Commiphora e compostos previamente isolados de C. leptophloeos.
Ensaio de Atividade Antibacteriana
O potencial antibacteriano do HECL foi determinado através da técnica de diluição em ágar, seguindo os protocolos estabelecidos pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2000). O HECL foi inicialmente solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO) e incorporado em ágar Mueller–Hinton para obter concentrações finais variando de 1,0 a 100 µg/mL. Para triagem preliminar, uma concentração de 100 µg/mL foi utilizada. Cada placa de ágar (20 mL) foi preparada combinando 250 µL do extrato dissolvido em DMSO com 1,75 mL de água destilada estéril, seguido pela adição de meio Mueller–Hinton fundido. Após a solidificação, as superfícies do ágar foram inoculadas usando um replicador de Steers com aproximadamente 10³ UFC por ponto dos organismos teste.
O ensaio antimicrobiano incluiu um total de 90 cepas bacterianas, abrangendo tanto cepas de referência quanto isolados clínicos. As cepas padrão foram obtidas de repositórios microbianos reconhecidos, como American Type Culture Collection/ATCC (EUA), Collection of the Institut Pasteur/CIP e Centre de Ressources Biologiques de l'Institut Pasteur/CRBIP (França), enquanto os isolados clínicos foram categorizados como E- e N-, representando patógenos associados a infecções respiratórias, gastrointestinais e do trato urinário. O painel cobriu uma ampla gama de bactérias Gram-positivas, incluindo Bacillus, Enterococcus, Listeria, Staphylococcus e Streptococcus, bem como gêneros Gram-negativos como Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Pseudomonas, Yersinia, Vibrio, Citrobacter, Achromobacter e Aeromonas.
Ofloxacina serviu como controle positivo, enquanto DMSO na concentração final de 1,25% foi empregado como controle negativo. Todas as placas foram incubadas aerobicamente a 37°C por 24 h. A ofloxacina foi selecionada como controle positivo devido à sua atividade antibacteriana de amplo espectro bem estabelecida contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, permitindo uma comparação confiável do potencial antimicrobiano do HECL com um fármaco de referência padrão.

O ensaio antibacteriano contra cepas anaeróbicas de Streptococcus foi realizado de acordo com, utilizando ágar Wilkins–Chalgren. A incubação das placas foi realizada sob condições anaeróbicas usando sachês Genbox Microaer por 24 h a 37°C. Todas as outras etapas, incluindo preparação da amostra e inoculação microbiana, seguiram o mesmo protocolo experimental. A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada como a menor concentração de HECL capaz de prevenir completamente o crescimento bacteriano visível após a incubação, com base na comparação visual com controles positivo e negativo apropriados. Os resultados são expressos como valores médios acompanhados do desvio padrão. Cada teste foi realizado em triplicata (n = 3).

Modelo Experimental de Mucosite Intestinal

A mucosite intestinal foi induzida conforme descrito anteriormente. Resumidamente, uma dose única de 450 mg/kg de 5-Fluorouracil (Libbs Pharmaceuticals LTDA, São Paulo, Brasil) foi administrada por via intraperitoneal e os animais foram eutanasiados 12 dias depois por overdose de cetamina (240 mg/kg) e xilazina (30 mg/kg).

Animais e Tamanho Amostral

Camundongos Swiss fêmeas (Mus musculus), com aproximadamente 8 semanas de idade e pesando entre 25 e 30 g, foram mantidos em gaiolas de polipropileno sob condições ambientais padronizadas (temperatura: 24°C ± 2°C; umidade: 50% ± 5%) com ciclo claro/escuro de 12 h. Os animais tiveram livre acesso a ração padrão e água durante todo o estudo. Os camundongos foram obtidos do biotério do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Brasil. Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com os padrões éticos institucionais e internacionais, após aprovação pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da UFRN (Protocolo nº 052/2023) e seguindo as diretrizes ARRIVE e os marcos regulatórios relevantes.

O número de animais por grupo foi determinado de acordo com a fórmula de tamanho amostral n = DF/k + 1, que pode ser usada para três delineamentos ANOVA comuns aplicáveis a estudos com animais, onde k = número de grupos, n = número de sujeitos por grupo e DF = graus de liberdade. Tendo em vista as considerações éticas que recomendam o refinamento do tamanho amostral em estudos com animais, optamos por utilizar o número mínimo de animais (5 animais/grupo) para realizar os experimentos.

Grupos Experimental e Controle
Para investigar o impacto do HECL na mucosite intestinal induzida por 5-Fluorouracil, 3 grupos de 5 animais receberam administração oral uma vez ao dia de HECL (doses: 0,5 ou 1,0 ou 10 mg/kg), iniciando 30 minutos após a injeção de 5-Fluorouracil. Os animais controle foram divididos em dois subgrupos controle (n = 5/grupo): um grupo de animais saudáveis, não submetidos à mucosite intestinal induzida por 5-Fluorouracil, que recebeu administração uma vez ao dia de solução salina até a eutanásia e uma única injeção intraperitoneal de solução salina no dia 1 (grupo salina/Grupo Controle Negativo/CN) e um grupo de animais submetidos à mucosite intestinal induzida por 5-Fluorouracil que recebeu administração uma vez ao dia de solução salina do dia 0 ao dia 3 (grupo 5FU). Todos os animais foram submetidos à eutanásia 4 dias após a injeção de 5-Fluorouracil.

Os animais foram monitorados diariamente até o quarto dia quanto a sinais de morbidade e mortalidade, como falta de resposta à estimulação manual; imobilidade; e/ou incapacidade de comer ou beber.

Peso Corporal, Contagem de Leucócitos no Sangue Periférico e Análise Hematológica

O peso corporal e as contagens de leucócitos no sangue periférico foram avaliados para identificar possível toxicidade sistêmica associada ao 5FU. O peso corporal foi medido no primeiro e no terceiro dia do experimento. Para fins de comparação, o peso de cada grupo no primeiro dia foi definido como 100%. No terceiro dia, a variação do peso corporal foi expressa como aumento ou diminuição em relação ao valor inicial. Antes da eutanásia, amostras de sangue (20 µL) foram coletadas por punção cardíaca de animais anestesiados. Essas amostras foram então diluídas em 380 µL de solução de Turk. A contagem manual de leucócitos totais foi realizada usando uma câmara de Neubauer, com os resultados apresentados como o número de glóbulos brancos por mm³ de sangue. Alanina aminotransferase ALT, ureia e creatinina.

Dosagem de Malonaldeído (MDA)

O conteúdo de MDA, um produto da peroxidação lipídica, foi investigado em amostras de tecido jejunal (n = 5/grupo) como um marcador de estresse oxidativo, conforme descrito anteriormente. As amostras foram diluídas em tampão Trizma na proporção de 1:5 (p/v). As misturas foram incubadas em banho-maria a 45°C por 40 min, seguidas de centrifugação a 2500 g por 5 min a 4°C. Posteriormente, 300 µL do sobrenadante foram coletados e a absorbância foi medida a 586 nm. A quantificação foi realizada por interpolação usando uma curva padrão. Os sobrenadantes foram distribuídos em microplacas para a determinação dos níveis de malondialdeído (MDA). As leituras de absorbância foram feitas a 586 nm, e os resultados foram expressos em nanomoles de MDA por mililitro de plasma ou por miligrama de tecido.

Atividade da Acetilcolinesterase e Retenção Fecal no Intestino

A retenção fecal em cada grupo foi avaliada no momento da eutanásia. A quantidade e a extensão das fezes retidas foram avaliadas. Estabelecemos um escore de 0 a 2, onde 0 significa sem retenção; 1 significa retenção baixa; e 2 significa retenção moderada a grave.
A determinação da atividade da acetilcolinesterase (AChE) em amostras de cólon foi realizada seguindo o protocolo descrito por Ellman et al.. Segmentos de cólon (n = 5/grupo) foram homogeneizados em tampão fosfato de sódio (pH 7,0) na proporção de 10 mg de tecido para 100 µL de tampão e, em seguida, centrifugados a 5000 rpm por 20 min a 4°C. Para o ensaio enzimático, 500 µL de tampão fosfato, 895 µL de água destilada, 50 µL de solução de ácido 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoico)/DTNB (preparada dissolvendo 0,04 g de DTNB e 0,015 g de bicarbonato de sódio em 10 mL de tampão fosfato) e 5 µL de homogeneizado de tecido foram transferidos para uma cubeta de vidro. Após calibrar o espectrofotômetro com a solução branco, 50 µL de solução de iodeto de acetiltiocolina (0,073 g dissolvidos em 5 mL de água destilada) foram adicionados para iniciar a reação. As leituras de absorbância foram registradas a 412 nm nos tempos 0, 30, 120 e 360 s para monitorar a atividade enzimática.

Ensaio de Citocinas (IL-1β e IL-6)

Os níveis de IL-1β e IL-6 foram determinados a partir de amostras de jejuno (n = 5/grupo), que foram armazenadas a −80°C até serem necessárias para este ensaio. As amostras foram homogeneizadas e processadas conforme descrito anteriormente. As concentrações de IL-1β, IL-6 e TNF-α nas amostras foram determinadas usando um kit comercial de ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Resumidamente, placas de microtitulação foram revestidas durante a noite a 4°C com anticorpos contra IL-1β (faixa de detecção: 62,5–4000 pg/mL; sensibilidade ou limite inferior de detecção: 12,5 ng/mL de IL-1β recombinante de camundongo), IL-6 (faixa de detecção: 125–8000 pg/mL). Após o bloqueio das placas, as amostras e o padrão em várias diluições foram adicionados em duplicata e incubados a 4°C por 24 h. Após a lavagem das placas (três vezes com tampão), anticorpo policlonal biotinilado anti-IL-1β ou anti-TNF-α, diluído 1:1000 com tampão de ensaio BSA 1%, foi adicionado aos poços. Após incubação adicional à temperatura ambiente por 1 h, as placas foram lavadas e estreptavidina-HRP, diluída 1:5000, foi adicionada a cada poço. O reagente cromogênico O-fenilenodiamina foi adicionado 15 min depois e as placas foram incubadas no escuro por 15 min. A reação enzimática foi interrompida com H2SO4 e a absorbância foi medida a 490 nm usando espectrofotometria UV-vis. Os resultados são expressos em pg/mL.

Análise Histopatológica

Após a eutanásia, amostras de espessura total (n = 5/grupo) de diferentes regiões do intestino delgado (duodeno, jejuno e íleo) e cólon, incluindo as camadas mucosa, submucosa, muscular e serosa, foram coletadas. Os tecidos foram fixados em formalina tamponada neutra a 10%, seguido por desidratação e inclusão em parafina para análises histológicas e imuno-histoquímicas. Secções seriadas (5 µm de espessura) foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E) e examinadas ao microscópio óptico em aumento de 200×. A extensão da lesão da mucosa foi avaliada de forma cega usando uma versão modificada do sistema de classificação histopatológica originalmente descrito por Macpherson e Pfeiffer.

Análise Imuno-histoquímica
Seções de tecido intestinal (duodeno, n = 5/grupo) com espessura de 4 µm foram obtidas de amostras embebidas em parafina. Após a desparafinização, a recuperação antigênica foi realizada incubando as lâminas em tampão citrato (pH 6,0) a 95°C por 20 min. A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada usando peróxido de hidrogênio a 3% por 10 min. As seções foram então incubadas por 2 h com anticorpos primários contra MUC-2 ou ocludina (Santa Cruz Biotechnology). A detecção foi realizada usando um sistema de detecção baseado em polímero (K4061, Dako) por 30 min, seguido de visualização com uma solução de diaminobenzidina (DAB) e peróxido de hidrogênio (Dako). Controles negativos foram preparados omitindo o anticorpo primário e incubando as seções apenas com diluente de anticorpo. A imunorreatividade foi quantificada a partir de imagens digitais capturadas em aumento de 400× em pelo menos dez campos selecionados aleatoriamente por seção (quatro espécimes por grupo). A porcentagem de área imunopositiva foi calculada dividindo a área corada positiva para DAB (em pixels) pelo número total de pixels em cada imagem de tecido e multiplicando por 100, conforme descrito anteriormente.
Análise Estatística
Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) e ilustrados como gráficos de barras. Os escores histológicos são expressos como mediana com intervalo interquartil (IIQ). As barras de erro representam os percentis 25–75. Devido ao pequeno tamanho amostral (n = 5 animais por grupo) e à ausência de garantia de distribuição normal dos dados, foram aplicados testes estatísticos não paramétricos. A análise estatística foi realizada usando o teste de Kruskal–Wallis seguido pelo teste post hoc de Dunn. p < 0,05, um nível de significância de 5% (p < 0,05) foi adotado para todas as análises estatísticas. Todas as análises foram conduzidas usando o software GraphPad Prism (versão 6.01).
Financiamento
Esta pesquisa foi apoiada pelas agências brasileiras de financiamento à pesquisa: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Renato Dantas‑Medeiros foi Bolsista de Pós‑Doutorado Júnior do CNPq na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) [processo nº 151486/2024‑7]. Silvana Maria Zucolotto é bolsista de produtividade em pesquisa do CNPq [processo nº 313727/2020‑1]. Financiamento adicional foi fornecido pelo CNPq [processos nº 303915/2023‑4, 401672/2023‑9] e INCT iCEIS [CNPq 406264/2022‑8]; INCT‑BIOFOTO BUCAL CNPq: 408830/2024‑7.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Dados disponíveis mediante solicitação aos autores.
Referências
The Potential of Dandelion in the Fight Against Gastrointestinal Diseases: A Review
A Caatinga: Um Bioma Exclusivamente Brasileiro
Medicinal and Poisonous Diversity of the Flora of “Cariri Paraibano”, Brazil
Medicinal Plants With Bioprospecting Potential Used in Semi‑arid Northeastern Brazil
The Pathobiology of Mucositis
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Decocção da Casca de Commiphora Leptophloeos: Composição Fitoquímica, Capacidade Antioxidante e Perfil de Segurança Não Genotóxico

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Caracterização Estrutural e Atividade Antioxidante de Taninos Condensados Fractionados do Grão de Sorgo
Extração Verde de Commiphora Leptophloeos Mart.—J. B. Gillett Visando Aumentar o Conteúdo de Hinokinina, um Bioativo Emergente
Potencial de Plantas Medicinais da Região Semiárida Brasileira (Caatinga) Contra os Estilos de Vida Planctônico e em Biofilme de Staphylococcus epidermidis
Caracterização por Espectrometria de Massas do Extrato de Folhas de Commiphora Leptophloeos e Avaliação Pré-clínica da Toxicidade e do Efeito Potencial Anti-inflamatório
Atividades Antioxidantes de Extratos de Folhas de Commiphora Leptophloeos (Mart.) J. B. Gillett (Burseraceae) Usando Ensaios In Vitro e In Vivo
Emissor de Resfriamento Radiativo Eficiente Adotando a Conversão de Comprimento de Onda de Nanocristais Gigantes de Núcleo-Casca de CdSe/ZnS
Atividade Antibacteriana e Modo de Ação dos Ácidos Ferúlico e Gálico Contra Bactérias Patogênicas
Plantas Medicinais e Atividade Antimicrobiana
Atividade Antimicrobiana de Algumas Espécies de Hypericum
Triagem de Algumas Plantas Usadas na Medicina Popular Brasileira para o Tratamento de Doenças Infecciosas
Polifenóis como Agentes Antimicrobianos
Resultados Clínicos de Flavonoides para Imunomodulação na Doença Inflamatória Intestinal: Uma Revisão Narrativa
Papel dos Receptores Muscarínicos de Acetilcolina na Homeostase Epitelial Intestinal: Perspectivas para o Tratamento da Doença Inflamatória Intestinal
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