pmid: "20676046"
title: "tRNA e citocromo c na morte celular e além."
authors: "Mei Y, Yong J, Stonestrom A, Yang X"
journal: "Cell cycle (Georgetown, Tex.)"
pubdate: "2010 Aug 01"
doi: ""
source: "PMC Full Text"
tRNA e citocromo c na morte celular e além.
Autores
Mei Y, Yong J, Stonestrom A, Yang X
Periodico
Cell cycle (Georgetown, Tex.) (2010 Aug 01)
Conteudo
tRNA e citocromo c na morte celular e além
Tanto o RNA transportador (tRNA) quanto o citocromo c são essenciais para a função celular: o tRNA medeia a síntese proteica enquanto o citocromo c é necessário para a fosforilação oxidativa e a indução da apoptose. Recentemente, o tRNA foi implicado como um regulador direto do papel bem conservado do citocromo c na apoptose. A interação entre essas moléculas poderia potencialmente coordenar a biossíntese, a produção de energia e a apoptose. Aqui revisamos a diversidade e a dinâmica do tRNA e como essa classe de RNAs não codificantes pode regular o papel do citocromo c na apoptose. Comentamos sobre questões não respondidas na biologia celular dessa interação e como as respostas podem influenciar nossa compreensão das doenças.
tRNA: o intérprete genético
O tRNA interpreta o código genético conectando fisicamente os códons de ácido nucleico aos aminoácidos. O genoma nuclear humano codifica mais de 500 tRNAs. Os tRNAs nucleares são transcritos como pré-tRNAs mais longos pela RNA polimerase III, aparados em cada extremidade e emendados para remover íntrons conforme necessário. Todos os tRNAs maduros têm de 73 a 93 ribonucleotídeos e se dobram em estruturas terciárias semelhantes. Os tRNAs são ativados por conjugação a aminoácidos em uma sequência trinucleotídica CCA em suas extremidades 3'. Oposta a essa extremidade na estrutura dobrada do tRNA, uma sequência anticódon de três nucleotídeos pode parear com códons do mRNA no ribossomo. O tRNA deve interagir transitoriamente, e não estavelmente, com proteínas celulares para funcionar na síntese proteica. Esse requisito único para os tRNAs pode permitir que eles tenham mais versatilidade funcional do que outros pequenos RNAs não codificantes. Isso é exemplificado pela maneira como o vírus da imunodeficiência humana usa o tRNA para iniciar a transcrição reversa de seu genoma de RNA.
O processo de maturação do tRNA envolve modificação extensa tanto no núcleo quanto no citoplasma. Aproximadamente 100 modificações quimicamente distintas foram relatadas; a maioria funcionalmente indefinida. Até recentemente, acreditava-se que, após a maturação, os tRNAs nucleares se localizavam exclusivamente no citosol. No entanto, novos estudos mostraram que, sob condições de estresse, como privação de nutrientes, os tRNAs maduros podem sofrer translocação retrógrada para o núcleo.
O genoma mitocondrial humano codifica 22 tRNAs. Ao contrário de muitos outros organismos, estes incluem um conjunto completo capaz de especificar todos os aminoácidos comuns. Espera-se que a maioria dos tRNAs mitocondriais esteja presente na matriz, onde ocorre a síntese proteica mitocondrial. Geralmente, pensava-se que os sistemas de tRNA mitocondrial e nuclear humanos são completamente separados até que um artigo recente desafiou essa ideia ao mostrar que as mitocôndrias humanas podem importar tRNA citosólico com a adição de ATP.
Pequenos fragmentos derivados de tRNA (tRFs) foram recentemente reconhecidos como uma espécie importante de RNA em células humanas. Notavelmente, um fragmento derivado de pré-tRNA mostrou ser necessário para a proliferação celular. Interessantemente, várias linhas de evidência mostraram que a clivagem endonucleolítica de tRNAs existe em células sob uma variedade de condições de estresse. Particularmente, a clivagem de tRNA ocorre durante o estresse oxidativo. Metades de tRNA estão presentes em células humanas, células de Drosophila e provavelmente em muitas de outros organismos. Esses fragmentos podem inibir a síntese proteica como "tRNAs clivados" que são cortados mas de outra forma totalmente dobrados. Embora intrigante, a importância das metades de tRNA na fisiologia celular e o mecanismo e regulação desse processo permanecem em grande parte não comprovados.
Citocromo c: um indutor de morte apoptótica
O papel mais conservado do citocromo c está na cadeia de transporte de elétrons que alimenta a fosforilação oxidativa. O citocromo c transporta elétrons do complexo proteico III da membrana mitocondrial interna para o complexo IV e é essencial para a geração do potencial de membrana mitocondrial (Δψ) que impulsiona a formação de ATP. Em células humanas e de outros vertebrados, o citocromo c também é um efetor apoptótico central. Nessas células, duas principais vias apoptóticas foram descritas: a via extrínseca e a via intrínseca. A liberação do citocromo c no citosol está particularmente associada à ativação da via intrínseca, que responde a estímulos intracelulares como dano ao DNA, informações de linhagem e ativação de oncogenes. Uma vez no citosol, o citocromo c se liga à proteína adaptadora Apaf-1 (fator 1 de ativação de protease apoptótica) e monta o complexo apoptossomo, causando o recrutamento e ativação da caspase-9 iniciadora. A subsequente cascata proteolítica efetua as mudanças morfológicas que definem a apoptose, incluindo encolhimento celular, formação de bolhas na membrana, condensação nuclear e fragmentação das células em corpos apoptóticos que podem ser rapidamente eliminados.
A formação do apoptossomo é intricadamente regulada. Antes da ligação do citocromo c, Apaf-1 está firmemente associada a dATP, que contata múltiplos domínios de Apaf-1 e ajuda a manter Apaf-1 em sua forma inativa. A ligação do citocromo c leva à hidrólise do dATP ligado a dADP, e subsequente troca do dADP ligado a Apaf-1 por um dATP livre. Apaf-1 pode então se montar em uma plataforma heptamérica funcional. Esta plataforma recruta múltiplas moléculas de procaspase-9, levando à sua oligomerização e subsequente processamento autoproteolítico. A hidrólise de dATP é potencializada pela ação combinada de pelo menos três proteínas: o supressor tumoral PHAPI, a proteína de susceptibilidade à apoptose celular (CAS) e a proteína de choque térmico 70 (Hsp70). Uma variedade de fatores celulares se opõem à formação do apoptossomo, incluindo altos níveis dos cátions potássio e cálcio, bem como a ação das proteínas HSP27, HSP90 e protimocina-α (ProT). Baixos níveis de dATP também promovem a formação do apoptossomo, mas altos níveis de dATP a inibem.
A capacidade do citocromo c de iniciar a apoptose depende de numerosos fatores celulares, incluindo o ambiente redox intracelular. O citocromo c oxidado, mas não o reduzido, ativa caspases e promove a apoptose. A glutationa intracelular (GSH) gerada via via das pentoses fosfato é necessária para inibir a função pró-apoptótica do citocromo c, mantendo-o em uma forma reduzida, pelo menos em alguns neurônios e células cancerígenas.
Descoberta da Interação entre tRNA e Citocromo c
O papel dos nucleotídeos na ativação de caspase mediada pelo citocromo c nos levou a especular que o RNA poderia estar envolvido nesse processo. O tratamento de extratos S100 de mamíferos com RNase aumentou fortemente a ativação de caspase-9 induzida pelo citocromo c, enquanto a adição de RNA aos extratos prejudicou a ativação de caspase-9. Esses resultados sugeriram que uma ou mais espécies de RNA inibem um fator necessário para a ativação de caspase-9. A avaliação sistemática das etapas que levam à ativação de caspase-9 revelou que a inibição mediada por RNA ocorre no nível do citocromo c. Nós estabilizamos complexos de RNA-proteína dentro de células intactas com baixa concentração de formaldeído e então lisamos as células em tampão contendo o detergente forte Empigen BB para prevenir interações não específicas que poderiam ocorrer durante a lise celular. Esta análise mostrou que vários tRNAs citosólicos e mitocondriais se associam especificamente com o citocromo c. A microinjeção de tRNA atenuou a capacidade do citocromo c de induzir apoptose, enquanto a degradação de tRNA por uma RNase que degrada preferencialmente tRNA, Onconase, potencializou a apoptose pela via intrínseca. Esta descoberta revela um papel direto do tRNA na regulação da apoptose (Figura 1).
Direções futuras
A interação celular entre citocromo c e tRNA é provavelmente afetada pela afinidade relativa do tRNA, sua abundância e acessibilidade ao citocromo c. Embora o citocromo c seja rico em lisina e altamente carregado positivamente, a incapacidade dos rRNAs de atuarem como competidores eficazes da interação citocromo c:tRNA sugere que características estruturais específicas dos tRNAs são importantes. Se o citocromo c reconhece diferentes tRNAs com afinidade semelhante e se a associação é afetada pela aminoacilação ou modificação pós-transcricional dos nucleotídeos do tRNA permanecem sem resposta.
A localização subcelular da ligação citocromo c:tRNA também é enigmática. A análise de células saudáveis mostra que o citocromo c se liga preferencialmente ao tRNA mitocondrial. Essa observação está em desacordo com a localização sub-mitocondrial esperada do citocromo c no espaço intermembranas e do tRNA mitocondrial na matriz mitocondrial. É notável que a localização do tRNA mitocondrial não foi visualizada por microscopia eletrônica e pode estar pelo menos parcialmente presente no espaço da membrana interna (IMS). O transporte para o IMS pode até ocorrer junto com o citocromo c, uma vez que essa proteína é dobrada na matriz antes de cruzar a membrana mitocondrial interna para o IMS. Alternativamente, os tRNAs podem ser ativamente transportados entre os diferentes compartimentos da mitocôndria. Os tRNAs citosólicos também se ligam ao citocromo c, embora em menor extensão em comparação com os tRNAs mitocondriais. Combinada com a descoberta recente de que tRNAs citosólicos são ativamente transportados para as mitocôndrias, essa observação é consistente com um modelo no qual a interação em células saudáveis ocorre no espaço da membrana interna. A associação do citocromo c com tRNA em células saudáveis pode afetar a função do citocromo c na transferência de elétrons. Se for esse o caso, a conexão citocromo c-tRNA pode representar um elo entre a síntese de proteínas e a produção de ATP. Durante a apoptose, espera-se que a associação do citocromo c com tRNAs citosólicos aumente à medida que o citocromo c entra no citosol. O nível de tRNA citosólico pode regular um limiar de sensibilidade apoptótica ao citocromo c, coordenando assim a síntese proteica com a sobrevivência celular. Um corolário disso seria que a translocação nuclear retrógrada de tRNA, como em algumas condições de estresse, reduziria o um limiar apoptótico determinado pelo citocromo c.
A interação entre tRNA e citocromo c pode informar nossa compreensão das doenças.
A compreensão da interação entre citocromo c e tRNA pode lançar luz importante sobre doenças associadas a mutações genéticas no tRNA. Mutações pontuais em genes de tRNA mitocondrial humano causam uma série de síndromes neurológicas, neuromusculares e neurodegenerativas. Geralmente, assume-se que estas resultam de déficits na síntese proteica mitocondrial. No entanto, defeitos na síntese proteica nem sempre podem ser detectados. A associação do tRNA mitocondrial com o citocromo c é um aspecto potencialmente inexplorado da patogênese nesses casos. Por exemplo, mutações no tRNA mitocondrial podem afetar a ligação do citocromo c e alterar o limiar apoptótico ou a geração de energia via transferência de elétrons. A caracterização dos domínios de interação do citocromo c e do tRNA deve revelar quaisquer correlações genótipo-fenótipo em qualquer uma das moléculas resultantes de efeitos na função da outra.
A inibição da apoptose é uma parte essencial da patogênese do câncer. Como os tRNAs são altamente expressos em células tumorais, isso pode representar um mecanismo pelo qual as células tumorais se protegem da morte. Embora altos níveis de tRNA sejam um requisito geral para a rápida síntese proteica que ocorre comumente em células tumorais, a superexpressão de tRNA no câncer pode exceder a de células normais crescendo em taxas semelhantes, e os tRNAs em células malignas podem diferir daqueles em células normais da mesma origem. A atividade da transcrição de tRNA mediada pela Pol III é marcadamente aumentada pelas vias oncogênicas cMyc, mTOR e Ras. O supressor tumoral p53 inibe potentemente a atividade da Pol III e a síntese de tRNA é fortemente aumentada em células deficientes em p53. Similarmente, o supressor tumoral Rb inibe a atividade da Pol III. A desregulação da RNA Pol III leva a um aumento dramático nos níveis de tRNA em células tumorais. O efeito causal de altos níveis de tRNA na transformação celular foi estabelecido por um estudo recente do grupo de Robert White mostrando que a superexpressão de um tRNA iniciador metionina por si só pode transformar células 3T3.
Se as células tumorais dependem de altos níveis de tRNA tanto para o crescimento quanto para a resistência apoptótica, o tRNA pode ser um alvo potencialmente valioso para a terapia tumoral. Isso é apoiado pela potência da apoptose induzida por onconase em células tumorais. A onconase é um membro de uma família crescente de RNases citotóxicas extracelulares. Embora análises extensas tenham estabelecido que a onconase degrada especificamente o tRNA nas células, deixando o mRNA e o rRNA intactos, outros pequenos RNAs também são possíveis alvos alternativos ou complementares da onconase. Nossos dados mostram que a onconase desabilita um mecanismo de resistência à apoptose a jusante da liberação do citocromo c. Se isso provar ser o principal mecanismo pelo qual a onconase mata células tumorais, poderia fornecer um guia racional para o desenvolvimento e uso de terapêuticas relacionadas à RNase.
Conclusões
A identificação da interação entre o citocromo c e o tRNA revela uma conexão anteriormente inesperada entre duas moléculas antigas. Essa interação é claramente importante no contexto da apoptose e pode representar uma conexão evolutivamente conservada entre metabolismo e sobrevivência celular. Uma caracterização mais aprofundada dessa interação pode iluminar mecanismos que atuam amplamente na vida eucariótica. Hipotetizamos que a exploração focada da mutação, modificação e degradação do tRNA pode levar a uma melhor compreensão de algumas doenças genéticas. Também acreditamos que a interação entre o tRNA e o citocromo c, combinada com a ação terapêutica da onconase, fornece um incentivo para a exploração da terapia do câncer baseada em tRNA.
Referências
Dinâmica celular dos tRNAs e seus genes
Formação do complexo de empacotamento do tRNALys no HIV-1
Acúmulo nuclear retrógrado de tRNA citoplasmático em hepatoma de rato em resposta à privação de aminoácidos
Mitocôndrias de mamíferos têm a capacidade inata de importar tRNAs por um mecanismo distinto da importação de proteínas
Uma nova classe de pequenos RNAs: fragmentos de RNA derivados de tRNA (tRFs)
A clivagem de tRNA é uma resposta conservada ao estresse oxidativo em eucariotos
Angiogenina cliva tRNA e promove repressão traducional induzida por estresse
O perfil de pequenos RNAs durante o desenvolvimento de Drosophila melanogaster
Camadas ocultas de pequenos RNAs humanos
O pool de RNA entregue pelo floema contém pequenos RNAs não codificantes e interfere na tradução
Um complexo multimérico APAF-1.citocromo c é um apoptossomo funcional que ativa a procaspase-9
O apoptossomo: plataforma de sinalização da morte celular
O apoptossomo: modos fisiológicos, de desenvolvimento e patológicos de regulação
A formação do apoptossomo é iniciada pela hidrólise de dATP induzida pelo citocromo c e subsequente troca de nucleotídeos no Apaf-1
Estrutura do fator 1 ativador de protease apoptótica ligado ao ADP
PHAPI, CAS e Hsp70 promovem a formação do apoptossomo prevenindo a agregação do Apaf-1 e aumentando a troca de nucleotídeos no Apaf-1
Nucleotídeos intracelulares atuam como fatores críticos de pró-sobrevivência ao se ligarem ao citocromo C e inibirem o apoptossomo
O estado redox do citocromo c regula o ROS celular e a cascata de caspases em modelo de célula permeabilizada
Regulação mitocondrial da ativação de caspases pela citocromo oxidase e tetrametilfenilenodiamina via estado redox do citocromo c citosólico
Supressão da função pró-apoptótica do citocromo c pelo oxigênio singlete via um mecanismo independente do estado redox do heme
O metabolismo da glicose inibe a apoptose em neurônios e células cancerígenas pela inativação redox do citocromo c
O tRNA se liga ao citocromo c e inibe a ativação de caspases
Aspectos genéticos moleculares das doenças mitocondriais humanas
Doenças mitocondriais em humanos e camundongos
A mutação 3243 associada ao diabetes no tRNA mitocondrial (Leu(UUR)) causa disfunção mitocondrial grave sem uma forte diminuição na taxa de síntese proteica
As marcas do câncer
O ribossomo traduz o câncer?
Superexpressão de tRNA no câncer de mama e consequências funcionais
Morte celular pelo gene reaper da Drosophila
tRNA de fenilalanina específico de tumor contém duas bases metiladas supranumerárias
Ativação da transcrição pela RNA polimerase III em células transformadas pelo vírus símio 40
Requisito da quinase mTOR para a regulação da fosforilação de Maf1 e controle da transcrição dependente de RNA polimerase III em células cancerígenas
Ativação por c-Myc da transcrição pelas RNA polimerases I, II e III
p53 reprime a transcrição da RNA polimerase III ao direcionar TBP e inibir a ocupação do promotor por TFIIIB
RNA polimerases I e III, controle de crescimento e câncer
A síntese elevada de tRNA(iMet) pode impulsionar a proliferação celular e a transformação oncogênica
Ribonucleases como uma nova estratégia pró-apoptótica anticancerígena: revisão dos dados pré-clínicos e clínicos para ranpirnase
Determinantes moleculares da apoptose induzida pela ribonuclease citotóxica onconase: evidência de mecanismos citotóxicos diferentes da inibição da síntese proteica
Clivagens do RNA transportador por onconase revelam sítios de clivagem incomuns
Caracterização do mecanismo de inibição da síntese proteica celular e livre de células por uma ribonuclease antitumoral
A ribonuclease citotóxica onconase tem como alvo a interferência de RNA (siRNA)
Figura
O citocromo c (esferas vermelhas) está presente principalmente no espaço da membrana interna mitocondrial de células saudáveis, mas se transloca para o citosol quando estímulos apoptóticos intrínsecos estão presentes. O RNA transportador (meio) pode interagir com o citocromo c e impedir a associação com Apaf-1, bloqueando a formação do complexo apoptossomo (canto superior direito). Quando ativo, o apoptossomo inicia uma cascata proteolítica que resulta em blebbing da membrana, condensação nuclear e