pmid: "33667034"
title: "O efeito da composição da cadeia lateral da cardiolipina na conformação da proteína citocromo c e na atividade da peroxidase."
authors: "Wilkinson JA, Silvera S, LeBlanc PJ"
journal: "Physiological reports"
pubdate: "2021 Mar"
doi: "10.14814/phy2.14772"
source: "PMC Full Text"

O efeito da composição da cadeia lateral da cardiolipina na conformação da proteína citocromo c e na atividade da peroxidase.

Autores

Wilkinson JA, Silvera S, LeBlanc PJ

Periodico

Physiological reports (2021 Mar)

Conteudo

O efeito da composição das cadeias laterais da cardiolipina na conformação da proteína citocromo c e na atividade de peroxidase
Resumo
O músculo esquelético, um tecido altamente ativo, constitui 40% do peso corporal total. Este tecido depende das mitocôndrias para produção de ATP, homeostase do cálcio e morte celular programada. A composição dos fosfolipídios mitocondriais, nomeadamente a cardiolipina (CL), influencia a eficiência funcional das proteínas mitocondriais, especificamente o citocromo c. A interação da CL com o citocromo c na presença de radicais livres induz alterações estruturais e funcionais promovendo a atividade de peroxidase e a liberação do citocromo c, um evento chave no início da apoptose. O grau de saturação da cadeia acil da CL tem sido implicado na transição do citocromo c para peroxidase de citocromo c em modelos lipossomais. No entanto, as membranas mitocondriais são compostas por diferentes composições de cadeias acil da CL. Atualmente, não está claro como diferentes composições de cadeias acil da CL utilizando lipossomas influenciarão a forma e função do citocromo c como peroxidase. Assim, este estudo examinou o papel da saturação das cadeias acil da CL em lipossomas refletindo amplamente a composição relativa de CL das membranas mitocondriais de músculo de camundongo saudável e distrófico na conformação e função do citocromo c. Apesar de não haver diferenças na conformação ou função da proteína entre lipossomas saudáveis e distróficos, a afinidade do citocromo c pela CL aumentou com maior insaturação. Estes achados sugerem que o aumento da saturação das cadeias acil da CL, como implicado em doenças de wasting muscular, pode não influenciar a transformação e função do citocromo c como peroxidase, mas pode alterar sua interação com a CL, potencialmente impactando efeitos downstream adicionais.
A composição de ácidos graxos da cardiolipina é tipicamente poli-insaturada e é importante para a interação com o citocromo c e seu papel duplo como transportador de elétrons e peroxidase. Os achados deste estudo sugerem que o aumento da saturação das cadeias acil da cardiolipina, como observado em doenças de wasting muscular, pode não influenciar a transformação e função do citocromo c como peroxidase, mas pode alterar sua interação com a cardiolipina, potencialmente impactando efeitos downstream adicionais, como a apoptose.
INTRODUÇÃO
O citocromo c é uma pequena proteína heme fracamente associada à folha voltada para o espaço da membrana interna (IMS) da membrana mitocondrial interna (IMM) (Alvarez‐Paggi et al., 2017). Esta proteína é mais conhecida como transportadora de elétrons entre os complexos III e IV na cadeia de transporte de elétrons durante a fosforilação oxidativa (Alvarez‐Paggi et al., 2017), mas também desempenha um papel pró-apoptótico crítico. A liberação do citocromo c é precedida por uma série de eventos orquestrados que depende de sua interação com a cardiolipina (CL), um fosfolipídio específico da mitocôndria.
Cardiolipina é um fosfolipídeo aniônico localizado predominantemente na folha voltada para a matriz da MIM (Daum, 1985; Gonzalvez & Gottlieb, 2007; Horvath & Daum, 2013). Pequenas quantidades de CL encontradas na folha voltada para o EIM da MIM interagem com o citocromo c por meio de dois mecanismos propostos. Interações eletrostáticas fracamente ligadas permitem que o citocromo c funcione como um transportador de elétrons, enquanto interações hidrofóbicas mais fortes transformam o citocromo c em uma peroxidase (Gonzalvez & Gottlieb, 2007; Huttemann et al., 2011; Kagan et al., 2005; Mohammadyani et al., 2018). A interação hidrofóbica envolve a protrusão de uma cadeia acila da CL na fenda hidrofóbica do citocromo c (Alvarez‐Paggi et al., 2017). Essa transformação do citocromo c em uma peroxidase, mediada por interação hidrofóbica, foi identificada como uma primeira etapa crítica na via apoptótica (Kagan et al., 2005). No entanto, estudos anteriores demonstraram que essa transformação parece depender do grau de saturação das cadeias acila da CL (Abe et al., 2011; Belikova et al., 2006). Essa transformação do citocromo c em peroxidase, específica da cadeia acila, pode ter implicações em doenças musculares esqueléticas que apresentam alteração na composição lipídica da membrana mitocondrial.
Pesquisas anteriores que determinaram o efeito da composição das cadeias acila da CL utilizaram espécies únicas de ácidos graxos em modelos de lipossomas. No entanto, a CL nas membranas mitocondriais é composta por diferentes composições de cadeias acila. Em mitocôndrias de músculo esquelético saudável, 40–70% da CL é composta por 18:2n6, dependendo do músculo examinado, com os 30–60% restantes compostos principalmente por 16:0, 18:0 e 18:1 (Stefanyk et al., 2010; Tsalouhidou et al., 2006). Sob condições patológicas, como a distrofia muscular de Duchenne (DMD), a composição das cadeias acila dos fosfolipídeos do músculo esquelético humano e de modelos de roedores pré-clínicos muda de 18:2n6 para 18:1 (Benabdellah et al., 2009; Tahallah et al., 2008; Touboul et al., 2004), o que se mantém verdadeiro ao examinar a CL (Zibamanzarmofrad, 2015; Zibamanzarmofrad et al., 2013). Atualmente, não se sabe se a forma e a função do citocromo c mudam com lipossomas que refletem amplamente a composição percentual de CL das membranas mitocondriais, de forma semelhante a lipossomas que contêm uma espécie de CL. Além disso, atualmente não se sabe se a mudança na composição das cadeias acila da CL observada em condições distróficas se traduzirá em uma interação CL-citocromo c alterada. Portanto, o presente estudo examinou a influência da composição das cadeias acila da CL, refletindo amplamente a composição percentual de CL das membranas mitocondriais de músculo esquelético saudável e distrófico, na conformação do citocromo c, na afinidade de ligação e na atividade de peroxidase.
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
1',3'-bis[1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfo]-sn-glicerol (tetramiristoil cardiolipina, TMCL, 14:0) e 1',3'-bis[1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo]-sn-glicerol (tetraoleoil cardiolipina, TOCL, 18:1) foram adquiridos da Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, EUA). Cardiolipina de coração bovino (BHCL; ≥80% tetralinoleoil cardiolipina, TLCL, 18:2n6), L-α-fosfatidilcolina (PC) e citocromo c (coração equino) foram adquiridos da Sigma-Aldrich Canadá. 10-acetil-3,7-di-hidroxifenoxazina (ADHP) foi adquirido da Cayman Chemicals.

Preparação de lipossomas e determinação do tamanho
Lipossomas foram criados misturando proporções iguais de PC e CL de acordo com Birk et al. (Birk et al., 2015). O componente cardiolipina consistiu de um tipo de espécie de cardiolipina (TMCL, TOCL, BHCL) ou uma mistura de espécies de cardiolipina que refletia amplamente a composição percentual de CL de mitocôndrias de músculo esquelético saudável (Con; 39% TLCL, 6% TOCL, 5% TMCL) ou distrófico (Dys; 28% TLCL, 17% TOCL, 5% TMCL) (Zibamanzarmofrad et al., 2013). Resumidamente, os lipídios foram misturados em um pequeno frasco de vidro e secos sob um fluxo constante de gás nitrogênio e ressuspendidos em tampão HEPES 32 mM. Cada amostra foi então colocada em gelo e sonicada (2 vezes 30 s com intensidade de sonda 2) usando um sonicador de ponta (Sonic Dismembrator Modelo 100, Fisher Scientific, Ottawa, Ontário, Canadá). Amostras de lipossomas (50 µM) foram avaliadas quanto ao tamanho usando um Módulo de Espalhamento de Luz Dinâmico DynaPro-99-E-50 da Protein Solutions (Santa Bárbara, Califórnia, EUA).

Atividade de peroxidase do citocromo c
A atividade de peroxidase do citocromo c foi avaliada medindo a conversão de ADHP no subproduto fluorescente resorufina, conforme relatado anteriormente (Birk et al., ,2013, 2015; Mandal et al., 2015). Resumidamente, citocromo c (2 µM) foi incubado com os lipossomas mencionados anteriormente (30 µM) e a atividade de peroxidase foi iniciada pela adição de 50 µM de H2O2, o que é semelhante ao trabalho de Mandal et al. (Mandal et al., 2015) e dentro da faixa de H2O2 (10–100 µM) utilizada na literatura anterior que examina a atividade de peroxidase do citocromo c (Abe et al., 2011; Belikova et al., 2006; Birk et al., ,2013, 2015; Kapralov et al., 2011). A atividade de peroxidase do citocromo c foi monitorada fluorometricamente (excitação a 530 nm e emissão a 590 nm) usando um leitor de placas (Synergy HT-1 Plate Reader, Bio-Tek, Winooski, Vermont, EUA).

Espectrofotometria de absorção ultravioleta-visível para oxidação de cardiolipina
Dois lotes de amostras de BHCL disponíveis comercialmente suspensas em clorofórmio:metanol foram adquiridos da Sigma com aproximadamente um ano de diferença e permaneceram armazenados a -20 °C. Diferenças na atividade da peroxidase do citocromo c entre os lotes de BHCL levantaram preocupações sobre possível peroxidação. Para testar a oxidação, ambos os lotes de BHCL foram suspensos em tampão HEPES em uma cubeta de quartzo até uma concentração final de 100 µM. A absorbância a 234 nm foi medida (Ultraspec 2100 Pro, espectrofotômetro UV/Visível, Biochrom, Massachusetts, EUA) para avaliar a formação de dienos conjugados como uma medida indireta da peroxidação lipídica poli-insaturada (Lokhmatikov et al., 2014).

Avaliação das propriedades estruturais do citocromo c
Amostras contendo os vários lipossomas PC:CL (500 µM) e citocromo c (50 µM) foram incubadas em cubetas de quartzo por 15 minutos à temperatura ambiente e protegidas da luz para induzir a formação do complexo cardiolipina‐citocromo c (Birk et al., 2013). A absorção no espectro de 200–900 nm foi medida (Ultraspec 2100 Pro, espectrofotômetro UV/Visível, Biochrom, Massachusetts, EUA) para determinar a influência da cardiolipina no desenovelamento da proteína citocromo c, com foco na absorbância de pico e no comprimento de onda das bandas Soret e Q (Giovannetti, 2012).

Força de ligação cardiolipina‐citocromo c
Medições da ligação cardiolipina‐citocromo c foram previamente relatadas (Belikova et al., 2006) com as seguintes alterações. Amostras de 20 µM de citocromo c em tampão HEPES (pH 7,4) foram incubadas com ou sem 1 mM dos respectivos lipossomas CL:PC por 30 minutos com agitação intermitente à temperatura ambiente. As amostras foram então incubadas com concentrações variadas de laranja de acridina nonil (0–9 mM) por uma hora à temperatura ambiente, conforme Petit et al. (Petit et al., 1992). As amostras foram preenchidas com volume equivalente de tampão de amostra (25% v/v, 62,5 mM Tris HCl, pH 6,8), carregadas em um gel de poliacrilamida nativo a 8% e corridas por uma hora a 150 V. Os géis foram removidos e submetidos a uma série de incubações com agitação constante à temperatura ambiente; uma hora com Coomassie blue R‐250 a 0,2%, duas horas com solução descolorante (20% etanol v/v, 5% ácido acético v/v, 1% glicerol v/v, em água destilada), durante a noite em água destilada e, finalmente, uma hora na solução descolorante. Os géis foram imageados usando iScanner Pro e analisados com Image Studio (Li‐Cor, Lincoln, Nebraska, EUA). A densidade das bandas com citocromo c e lipossomas CL:PC foi comparada com citocromo c apenas, e a constante de ligação (Kb) foi calculada conforme relatado anteriormente (Belikova et al., 2006; Petit et al., 1992).

Estatística
Todos os valores são expressos como média ± erro padrão (EP). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o SPSS Statistics for Windows, versão 25 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). ANOVAs de uma via foram realizadas em todos os conjuntos de dados, seguidas pela análise post hoc de Tukey. A suposição de normalidade foi verificada gerando gráficos de resíduos apropriados. A análise de regressão foi conduzida entre a absorbância dos picos das bandas de Soret e Q e a atividade da peroxidase do citocromo c. Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo para todos os testes.
RESULTADOS
Tamanho do lipossomo
O tamanho do lipossomo não foi diferente entre lipossomos de diferentes composições de CL (Figura 1), confirmando assim que outras comparações entre espécies de CL não foram um artefato de tamanhos de lipossomos diferentes.
Tamanho do lipossomo medido imediatamente após a sonicação. Os valores são média ± EPM, n = 3 para cada condição. TMCL, 1',3'-bis[1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfo]-sn-glicerol cardiolipina; TOCL, 1',3'-bis[1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo]-sn-glicerol cardiolipina; BHCL, cardiolipina de coração bovino; Con, lipossomo refletindo amplamente a composição percentual de cardiolipina das mitocôndrias normais do músculo esquelético; e Dys, lipossomo refletindo amplamente a composição percentual de cardiolipina das mitocôndrias distróficas do músculo esquelético.
A atividade da peroxidase do citocromo c é aumentada com cadeias laterais de cardiolipina insaturadas
A atividade da peroxidase do citocromo c a 50 µM de H2O2 com lipossomos de BHCL Lote 1 (Figura 2a) foi identificada como significativamente menor do que a relatada na literatura (Abe et al., 2011). Um segundo lote de BHCL (Lote 2) resultou em uma atividade da peroxidase do citocromo c significativamente maior. Como a integridade do lote estava em questão, a conjugação diênica, um substituto da peroxidação lipídica poli-insaturada, foi medida (Figura 2b). Como resultado, o BHCL Lote 1 teve absorbância significativamente maior a 234 nm, indicando maior peroxidação lipídica poli-insaturada em comparação com o BHCL Lote 2, e todos os dados subsequentes foram coletados usando o BHCL Lote 2.
A atividade da peroxidase do citocromo c é aumentada na presença de cardiolipina com cadeias laterais acílicas insaturadas não oxidadas a 50 µM de H2O2. (a) Atividade da peroxidase do citocromo c com cardiolipina de coração bovino de dois lotes separados a 50 µM de H2O2. (b) Avaliação espectrofotométrica de dienos conjugados nas cadeias laterais de espécies de cardiolipina poli-insaturada sem citocromo c de dois lotes separados como uma medida substituta da peroxidação da cardiolipina. (c) Atividade da peroxidase do citocromo c com e sem cardiolipina de espécies variadas a 50 µM de H2O2. Os valores são média ±EPM, n = 3 para cada condição; * indica diferença significativa em relação à BHCL (Lote 1); nenhuma diferença estatística entre valores com a mesma letra (p < 0,05). UA, unidades arbitrárias; Cyto C, citocromo c; TMCL, cardiolipina 1’,3’-bis[1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfo]-sn-glicerol; TOCL, cardiolipina 1’,3’-bis[1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo]-sn-glicerol; BHCL, cardiolipina de coração bovino; Con, lipossomo refletindo amplamente a composição percentual de cardiolipina das mitocôndrias do músculo esquelético normal; e Dys, lipossomo refletindo amplamente a composição percentual de cardiolipina das mitocôndrias do músculo esquelético distrófico.
Em comparação com o citocromo c isolado, a atividade da peroxidase do citocromo c a 50 µM de H2O2 aumentou ~50% com lipossomos de CL monoinsaturada (TOCL), poli-insaturada (BHCL) e ambas mistas, refletindo amplamente a composição percentual de cardiolipina mitocondrial de controle (Con) e distrófico (Dys) (Figura 2c). Por outro lado, as espécies de cardiolipina saturada (TMCL) resultaram em um pequeno (19%), mas não significativo (p = 0,07), aumento na atividade da peroxidase em comparação com o citocromo c isolado.
A incubação do citocromo c com espécies de cardiolipina influencia os estados dobrado e desdobrado do citocromo c
O espectro de absorção do citocromo c isolado demonstrou um pico da banda Soret a 409 nm e um pico da banda Q a 528 nm (Figura 3a). Em comparação com o citocromo c isolado, o comprimento de onda do pico não diferiu para a banda Soret ou Q para cada lipossomo (dados não mostrados). No entanto, em comparação com o citocromo c isolado, a absorbância de pico diminuiu para a banda Soret (cyto C > TOCL > BHCL = Con = Dys > TMCL) (Figura 3b) e aumentou para a banda Q (cyto c = TMCL < TOCL < BHCL = Con = Dys) (Figura 3c). As bandas Soret e Q são regiões quantitativas dos espectros UV-Vis que identificam mudanças conformacionais do citocromo c (Nantes et al., 2001), que por sua vez podem influenciar a atividade da peroxidase. Assim, a análise de regressão demonstrou que o aumento da absorbância do pico da banda Q aumentou a atividade da peroxidase do citocromo c (Figura 3e), o que não foi observado com a banda Soret (Figura 3d).
A incubação do citocromo c com espécies de cardiolipina contendo diferentes cadeias laterais acílicas influencia os estados dobrado e desdobrado do citocromo c, mas essas alterações não se correlacionam com a atividade peroxidase do citocromo c. (a) Espectro ultravioleta-visível representativo demonstrando os picos das bandas Soret e Q; absorbância máxima das bandas (b) Soret e (c) Q do citocromo c com ou sem cardiolipina de variada composição de cadeias laterais acílicas; correlação entre a atividade peroxidase do citocromo c usando ADHP e a absorbância máxima das bandas (d) Soret e (e) Q. Os valores são média ± EPM, n = 4 para cada condição; nenhuma diferença estatística entre valores com a mesma letra (p < 0,05). Cyto C, citocromo c; TMCL, 1’,3’‐bis[1,2‐dimyristoil‐sn‐glicero‐3‐fosfo]‐sn‐glicerol cardiolipina; TOCL, 1’,3’‐bis[1,2‐dioleoil‐sn‐glicero‐3‐fosfo]‐sn‐glicerol cardiolipina; BHCL, cardiolipina de coração bovino; Con, lipossomo refletindo amplamente a composição percentual de cardiolipina das mitocôndrias do músculo esquelético normal; e Dys, lipossomo refletindo amplamente a composição percentual de cardiolipina das mitocôndrias do músculo esquelético distrófico.
A afinidade de ligação do citocromo c é influenciada pela presença de espécies de cardiolipina poli-insaturadas
A constante de ligação (Kb) dependeu da composição acílica da cardiolipina, de modo que o citocromo c apresentou a maior afinidade por membranas contendo BHCL e TOCL em comparação com TMCL (Figura 4). Ao comparar a afinidade de ligação do citocromo c por membranas mistas de CL, a afinidade de ligação do citocromo c por Dys foi significativamente menor em comparação com BHCL (e semelhante a TMCL) mas não estatisticamente diferente dos lipossomos Con. Kb não se correlacionou significativamente com a atividade peroxidase do citocromo c (dados não mostrados).
A afinidade de ligação do citocromo c é maior em lipossomos de cardiolipina rica em tetralinoleoil. (a) Eletroforese em gel de poliacrilamida nativa do citocromo c incubado com BHCL e diferentes concentrações de NAO e (b) constantes de ligação resultantes dos diferentes lipossomos de cardiolipina. Os valores são média ± EPM, n = 3 para cada condição; valores com a mesma letra não são significativamente diferentes entre si (p < 0,05); TMCL, 1’,3’‐bis[1,2‐dimyristoil‐sn‐glicero‐3‐fosfo]‐sn‐glicerol cardiolipina; TOCL, 1’,3’‐bis[1,2‐dioleoil‐sn‐glicero‐3‐fosfo]‐sn‐glicerol; BHCL, cardiolipina de coração bovino; Con, lipossomo refletindo amplamente a composição percentual de cardiolipina das mitocôndrias do músculo esquelético normal; Dys, lipossomo refletindo amplamente a composição percentual de cardiolipina das mitocôndrias do músculo esquelético distrófico; Kb, constante de ligação x108 M−1 @ 90%; e NAO, 10‐N‐nonil acridina laranja.
O presente estudo investigou a relação entre lipossomas contendo espécies de CL com diferentes composições de cadeias acílicas e a forma e função do citocromo c como peroxidase. Especificamente, este é o primeiro estudo a examinar o efeito de lipossomas que refletem amplamente a composição relativa de CL das membranas mitocondriais musculares tanto saudáveis quanto distróficas, sobre a conformação e função do citocromo c. Os principais achados deste estudo são os seguintes: (a) A atividade peroxidásica do citocromo c é aumentada na presença de 50 µM de H2O2 e lipossomas contendo CL insaturado, desde que as espécies de CL não estejam oxidadas, (b) a presença de CL, independentemente da composição das cadeias acílicas, influenciou a cinética de enovelamento do citocromo c e, quando focado na absorbância máxima da banda Q, correlacionou-se positivamente com a atividade peroxidásica do citocromo c, e (c) a afinidade de ligação do citocromo c a lipossomas de CL depende da cadeia lateral, de modo que a afinidade de ligação aumentou com o número de ligações duplas.

A forma e função do citocromo c como peroxidase são influenciadas pela composição da cadeia lateral da CL

Nossos resultados sugerem a importância de pelo menos uma ligação dupla em lipossomas contendo cardiolipina durante a transição do citocromo c para uma peroxidase, o que é consistente com a literatura anterior (Abe et al., 2011; Belikova et al., 2006). A presença de CL com cadeias laterais que contêm pelo menos uma ligação dupla (BHCL ou TOCL) resultou em maior ligação (Kb maior em comparação com TMCL) do citocromo c à CL, o que também foi relatado anteriormente (Belikova et al., 2006). No entanto, até onde sabemos, este é o primeiro relato de alteração conformacional do citocromo c, especificamente o pico de absorbância da banda Q, correlacionando-se positivamente com a atividade peroxidásica.

Em sua forma nativa, o citocromo c é hexacoordenado com o quinto e sexto ligantes fornecidos por His18 e Met80, respectivamente (Elove et al., 1994). Quando o citocromo c atua como um transportador de elétrons, forças eletrostáticas o ligam frouxamente à MMI (Tuominen et al., 2002). A mudança conformacional do citocromo c para uma peroxidase envolve uma interação estreita com a membrana (Li et al., 2019; Sinibaldi et al., 2017). Especificamente, o citocromo c se liga hidrofobicamente à CL, resultando em alterações conformacionais da proteína (Tuominen et al., 2002). A ligação hidrofóbica requer que uma cadeia lateral da CL se estenda para uma fenda do citocromo c criada pela remoção do ligante Met80 do citocromo c (Alvarez‐Paggi et al., 2017; Rytomaa & Kinnunen, 1995; Tuominen et al., 2002). Essa ancoragem lipídica estendida é o que causa uma alteração conformacional no ambiente do heme (Mugnol et al., 2008), resultando em aumento da atividade peroxidásica (Kagan et al., 2009; Mohammadyani et al., 2018).
Alterações conformacionais na estrutura do citocromo c podem ser medidas espectrofotometricamente. As alterações espectrofotométricas, especificamente o aumento da absorbância máxima da banda Q no citocromo c interagindo com lipossomos contendo CL em comparação com o citocromo c sozinho, sugerem modificação específica da cadeia lateral de CL na conformação da proteína citocromo c (Droghetti & Smulevich, 2005; Mugnol et al., 2008; Tomaskova et al., 2010; Wiederkehr et al., 2009). Alterações na banda Q foram relatadas anteriormente na literatura, especificamente a absorbância máxima da banda Q diminuiu quando o citocromo c é desnaturado (Mugnol et al., 2008; Tomaskova et al., ,2010, 2018). Assim, na presença de lipossomos contendo CL com pelo menos uma dupla ligação, ocorre transformação do citocromo c em peroxidase, prevenindo danos mediados por H2O2 ao citocromo c e resultando em atividade peroxidásica (Tomaskova et al., 2010). Maiores alterações conformacionais no citocromo c foram induzidas por BHCL em comparação com TOCL, mas isso não se traduziu em diferenças na atividade peroxidásica. Embora a peroxidação da cardiolipina não tenha sido medida após incubação com citocromo c, a literatura anterior demonstrou que ácidos graxos altamente insaturados que contêm múltiplas duplas ligações são mais suscetíveis à peroxidação lipídica (Hulbert et al., 2014). É possível que o citocromo c tenha peroxidado preferencialmente as cadeias acil de TLCL e, devido ao menor grau de insaturação, as cadeias acil de TOCL foram menos propensas à peroxidação. Isso pode ajudar a explicar a correlação positiva, embora indiretamente relacionada, entre a absorção máxima da banda Q e a atividade peroxidásica.
Características da peroxidase do citocromo c na presença de lipossomos de cardiolipina mista
As membranas mitocondriais são compostas por diferentes composições de cadeias acil de CL, em vez de uma única espécie com cadeias acil homogêneas. O músculo distrófico contém proporcionalmente mais cadeias laterais acil de fosfolipídios monoinsaturados e menos poli-insaturados em comparação com controles saudáveis (Benabdellah et al., 2009; Tahallah et al., 2008; Touboul et al., 2004), uma tendência que se estende ao CL (Zibamanzarmofrad, 2015; Zibamanzarmofrad et al., 2013). Embora não seja perfeito e limitado pelas espécies de CL disponíveis comercialmente, lipossomos contendo 39% TLCL, 6% TOCL e 5% TMCL ou 28% TLCL, 17% TOCL e 5% TMCL foram utilizados para imitar amplamente a composição relativa de cadeias acil de CL das membranas mitocondriais do músculo esquelético saudável e distrófico, respectivamente.
Considerando os achados ao examinar a influência de lipossomas compostos por CL com uma espécie de cadeia acil na forma e função do citocromo c, lipossomas mistos seguem um padrão semelhante. Especificamente, a presença de cadeias acil de CL com pelo menos uma ligação dupla levou à transformação do citocromo c em uma peroxidase devido a mudanças conformacionais no ambiente do heme, semelhante a BHCL e TOCL. Alternativamente, alguns desfechos foram intermediários entre BHCL e TMCL, como o coeficiente de ligação. Como resultado, sugerimos uma hipótese de trabalho na qual uma alteração na composição das cadeias acil de CL observada na distrofia muscular pode influenciar a interação entre citocromo c e CL (Figura 5).

Impacto proposto do aumento da cardiolipina monoinsaturada e da diminuição da cardiolipina poli-insaturada na forma e função do citocromo c. Em lipossomas refletindo a composição relativa de cardiolipina de mitocôndrias musculares saudáveis, o citocromo c está firmemente ligado. Na presença de peróxido de hidrogênio, o citocromo c sofre uma transformação em peroxidase, resultando na oxidação da cardiolipina poli-insaturada e na liberação do citocromo c. Em lipossomas refletindo a composição relativa de cardiolipina de mitocôndrias musculares distróficas, especificamente mais monoinsaturada e menos poli-insaturada, o citocromo c está mais fracamente ligado devido a uma constante de ligação menor em comparação aos lipossomas saudáveis. Na presença de peróxido de hidrogênio, o citocromo c se transforma em peroxidase, mas pode não oxidar a cardiolipina monoinsaturada menos susceptível e pode permanecer associado ao lipossoma; TMCL, cardiolipina tetramiristoíla; TOCL, cardiolipina tetraoleoil; TLCL, cardiolipina tetralinoleoil; PC, fosfatidilcolina; cyt c, citocromo c; e H2O2, peróxido de hidrogênio.
Em mitocôndrias musculares saudáveis sob condições normais, o citocromo c contribui para a fosforilação oxidativa. A quantidade limitada de CL no folheto voltado para o EIM da MEI (Horvath & Daum, 2013) promove que o citocromo c, frouxamente ligado por interações eletrostáticas, transporte elétrons entre os complexos III e IV (Huttemann et al., 2011). Com um estímulo apoptótico, o TLCL no folheto voltado para a matriz da MEI se transloca para o folheto voltado para o EIM (Kagan et al., 2015) e se liga hidrofobicamente ao citocromo c, transformando-o em uma peroxidase (Kagan et al., 2009; Mohammadyani et al., 2018). A peroxidase do citocromo c catalisa a clivagem homolítica do H₂O₂, resultando na formação de água e na oxidação do TLCL vizinho, um evento que precede a liberação do citocromo c (Gonzalvez & Gottlieb, 2007; Kagan et al., 2005). Conforme evidenciado por nossos achados (Figura 2a e 2b), o BHCL oxidado (que é ≥80% TLCL) não promove a atividade de peroxidase do citocromo c, o que pode ser devido à falta de interação entre o TLCL oxidado e o citocromo c (Kagan et al., 2005). Pesquisas futuras devem examinar a extensão da ligação do citocromo c às membranas mitocondriais com diferentes saturações de CL e com diferentes concentrações de CL (isto é, ambiente saudável vs apoptótico) e diferentes níveis de oxidação para determinar se os achados se mantêm in vivo. No entanto, uma limitação é o uso de lipossomos com níveis fisiológicos de CL [10–15% encontrados em mitocôndrias de músculo esquelético (Stefanyk et al., 2010)] para examinar sua influência sobre a forma e função do citocromo c in vitro. Pesquisas anteriores demonstraram que baixas concentrações de CL (20%) prejudicam a ligação do citocromo c ao lipossomo (Schweitzer‐Stenner, 2018).

Em contraste, as mitocôndrias do músculo esquelético distrófico apresentam um CL poli-insaturado diminuído e um CL monoinsaturado aumentado, potencialmente influenciando a interação entre o citocromo c e a MEI. Após um estímulo apoptótico e a translocação de fosfolipídeos carregados, mas não neutros, incluindo CL, pela scramblase de fosfolipídeos mitocondrial‐3 para o folheto voltado para o EIM da MEI (Dudek, 2017), o citocromo c se torna uma peroxidase. No entanto, apesar de ter uma afinidade de ligação potencialmente menor ao citocromo c, devido ao menor potencial de oxidação das cadeias laterais acílicas monoinsaturadas em comparação com as poli-insaturadas (Hulbert et al., 2014), é menos provável que o citocromo c seja liberado e permaneça hidrofobicamente ligado. Pesquisas futuras devem determinar como a menor afinidade de ligação e o aumento da atividade de peroxidase podem estar relacionados in vivo à composição da membrana mitocondrial e à apoptose.
Este foi o primeiro estudo a descrever o efeito de lipossomas à base de BHCL, TOCL e TMCL sobre a conformação, função e afinidade de ligação do citocromo c, além de identificar a relação entre essas propriedades no que se refere à transição do citocromo c para uma peroxidase. Foi também o primeiro a determinar os efeitos de lipossomas que mimetizam as membranas de mitocôndrias saudáveis e distróficas sobre essas propriedades. Nossos achados sugerem uma correlação positiva entre a insaturação do CL e a afinidade de ligação do citocromo c ao lipossoma. A ligação do citocromo c ao lipossoma contribui para alterações conformacionais e funcionais que promovem a atividade de peroxidase.
CONFLITO DE INTERESSES
Os autores não têm nada a declarar.
CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES
JAW realizou os experimentos, analisou os dados e escreveu o manuscrito. SS auxiliou na elaboração do ensaio de atividade de peroxidase e editou o manuscrito. PJL desenvolveu o estudo como um todo, analisou os dados e escreveu e editou o manuscrito.
REFERÊNCIAS
Mecanismos moleculares para a indução da atividade de peroxidase do complexo citocromo c‐cardiolipina
Citocromo c multifuncional: Aprendendo novos truques de um cão velho
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