pmid: "36479932"
title: "Citocromo c na terapia e prognóstico do câncer."
authors: "Pessoa J"
journal: "Bioscience reports"
pubdate: "2022 Dec 22"
doi: "10.1042/BSR20222171"
source: "PMC Full Text"
Citocromo c na terapia e prognóstico do câncer.
Autores
Pessoa J
Periodico
Bioscience reports (2022 Dec 22)
Conteudo
Citocromo c na terapia e prognóstico do câncer
Resumo
O citocromo c (cyt c) é um transportador de elétrons da cadeia respiratória mitocondrial. Após a permeabilização da membrana externa mitocondrial, o cyt c é liberado no citoplasma, onde desencadeia a via intrínseca da apoptose. O cyt c citoplasmático pode ainda atingir a corrente sanguínea. A inibição da apoptose é uma das marcas do câncer e sua indução em tumores é uma abordagem terapêutica amplamente utilizada. A inibição e a indução da apoptose correlacionam-se com níveis séricos diminuídos e aumentados de cyt c, respectivamente. A quantificação de cyt c no soro é útil no monitoramento da resposta do paciente à quimioterapia, com potencial valor prognóstico. Vários biossensores altamente sensíveis foram desenvolvidos para a quantificação dos níveis de cyt c no soro humano. Além disso, a entrega de cyt c exógeno ao citoplasma de células cancerosas é uma abordagem eficaz para induzir sua apoptose. Da mesma forma, vários sistemas baseados em proteínas e nanopartículas foram desenvolvidos para a entrega terapêutica de cyt c às células cancerosas. Assim, o cyt c é uma proteína humana com valor promissor no prognóstico e terapia do câncer. Além disso, sua estabilidade térmica pode ser estendida através de PEGuilação e armazenamento em líquido iônico. Esses processos podem contribuir para aprimorar sua exploração terapêutica em instalações clínicas com condições limitadas de refrigeração. Aqui, discuto essas linhas de pesquisa e como sua conjunção oportuna pode avançar a terapia e o prognóstico do câncer.
Introdução
O tratamento eficaz do câncer depende não apenas de abordagens terapêuticas com alta especificidade para células malignas, mas também de marcadores prognósticos precisos. Alcançar esses dois objetivos críticos exige a caracterização detalhada das alterações bioquímicas das células cancerosas. Essas alterações podem revelar moléculas cujas concentrações, modificações e/ou localizações subcelulares são alteradas. Seu retorno ao estado normal durante a terapia do câncer pode ser monitorado para avaliar a eficácia terapêutica. Consequentemente, corrigir o estado de uma molécula com concentração, modificação e/ou localização subcelular alterada no câncer pode ter um resultado terapêutico. Como discutido abaixo, pesquisas recentes mostraram que o citocromo c (cyt c) é um forte candidato a marcador prognóstico e a agente terapêutico.
Os citocromos foram descritos e nomeados pela primeira vez por David Keilin em 1925. Ele encontrou quatro bandas de absorção nos espectros de absorção de células de levedura e tecidos de animais e plantas. Ele reconheceu observações espectroscópicas semelhantes feitas por C. A. MacMunn, publicadas entre 1884 e 1887, mas recebidas com ceticismo. A partir dessas quatro bandas de absorção, Keilin identificou um ‘pigmento celular’, que ele nomeou ‘citocromo’. Ele propôs que fosse composto por três compostos, identificados como a′, b′ e c′. Seus papéis na cadeia respiratória mitocondrial foram atribuídos. O citocromo b é uma das subunidades da coenzima Q-cit c redutase (complexo III) e o citocromo a é uma das subunidades da cit c oxidase (complexo IV). A cit c é uma proteína monomérica localizada no espaço intermembrana mitocondrial, entre os complexos III e IV.
Ao longo das décadas, pesquisas extensas sobre a cit c contribuíram com percepções críticas não apenas sobre a respiração mitocondrial (revisado em), mas também sobre a apoptose, uma forma de morte celular programada. Sob estímulos pró-apoptóticos, a membrana externa mitocondrial é permeabilizada, desencadeando o efluxo da cit c do espaço intermembrana mitocondrial para o citoplasma. No citoplasma, a cit c se liga ao fator-1 ativador de protease apoptótica (Apaf-1), resultando em uma sequência de reações bioquímicas que causam a ativação de caspases, uma classe de proteases que executam a apoptose degradando componentes celulares. A apoptose é um processo da mais alta relevância no câncer. Primeiro, geralmente é inibida nas células cancerígenas. Segundo, a indução da apoptose em células cancerígenas possui um potencial terapêutico notável. A permeabilização da membrana externa mitocondrial é considerada um ponto sem retorno no desencadeamento da via intrínseca da apoptose. Uma de suas consequências diretas é o efluxo da cit c do espaço intermembrana mitocondrial para o citoplasma. Níveis diminuídos de cit c foram detectados em tecidos cancerígenos, sugerindo inibição da apoptose. Por exemplo, os níveis de cit c estavam diminuídos em tecidos de glioma em relação aos saudáveis, e diminuíam ainda mais em estágios mais avançados da doença. De acordo com isso, a superexpressão de cit c inibiu o crescimento tumoral em um modelo de camundongo de carcinoma de células renais de células claras. Por outro lado, o knockdown de cit c em uma linhagem celular de carcinoma de células renais de células claras aumentou sua proliferação, provavelmente através da inibição da apoptose. A superexpressão de cit c nessas células aumentou as taxas de apoptose. Além disso, diversas drogas quimioterápicas amplamente utilizadas induzem a apoptose promovendo o efluxo de cit c para o citoplasma (revisado em). Portanto, o aumento dos níveis citoplasmáticos de cit c se correlaciona com a capacidade de combater a doença.
Uma revisão recente discute as propriedades bioquímicas do cit c que permitem sua reutilização como um fármaco quimioterápico pró-apoptótico e descreve vários sistemas de entrega celular de cit c para terapia do câncer. O presente artigo visa complementar esse estudo. Aqui, discuto aspectos adicionais do cit c como ferramenta molecular no câncer. (1) Cit c sérico como biomarcador para prognóstico do câncer. (2) Biossensores para quantificação de cit c no soro humano, destacando suas sensibilidades de detecção. (3) Detalhes adicionais dos sistemas de entrega terapêutica de cit c, incluindo sistemas modelo nos quais foram testados e suas concentrações inibitórias. (4) O impacto de mutações pontuais, modificações pós-traducionais e estado redox do cit c em sua função pró-apoptótica. (5) Abordagens para aumentar a estabilidade térmica do cit c, para facilitar seu armazenamento e utilização terapêutica sob condições limitadas de refrigeração. Finalmente, discuto perspectivas futuras, incluindo o potencial do cit c no prognóstico de outras doenças.
Cit c sérico no prognóstico do câncer
O cit c citoplasmático pode evadir da célula. De forma consistente, em amostras de tumor de câncer de mama, o cit c foi liberado das células epiteliais para o lúmen do ducto canceroso. Devido à sua capacidade de evasão celular, o cit c pode atingir a corrente sanguínea. Portanto, sua quantificação no soro pode refletir seus níveis citoplasmáticos.
Níveis séricos diminuídos de cit c foram detectados em câncer. Em pacientes recém-diagnosticados com câncer de pulmão de células não pequenas, os níveis séricos de cit c foram cerca de três vezes menores do que em indivíduos saudáveis. Os níveis de cit c também foram diminuídos no soro de pacientes com carcinoma de células renais claras. Essas observações são consistentes com a falta de indução de apoptose no câncer devido a níveis insuficientes de cit c no citoplasma. No entanto, diferentes pacientes com câncer podem ter diferentes níveis séricos de cit c. Embora não tenha havido correlação evidente entre os níveis séricos de cit c e o estágio de diferenciação tumoral, pacientes com carcinoma de células renais claras com níveis mais altos de cit c apresentaram taxas de sobrevivência mais altas do que aqueles com níveis mais baixos da proteína. Em pacientes com outros tipos de câncer, níveis séricos aumentados de cit c também foram correlacionados com uma maior probabilidade de sobrevivência do paciente. Embora níveis elevados de cit c sérico também possam indicar aumento do conteúdo tumoral, seu aumento durante a terapia do câncer tem sido relacionado a prognósticos mais favoráveis.
Além de sua correlação com prognóstico favorável, os níveis séricos elevados de cyt c também podem refletir o aumento dos níveis de apoptose induzidos pela terapia antineoplásica. Em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas, o cyt c sérico aumentou pelo menos 13 vezes após o primeiro ciclo de quimioterapia. A quimioterapia também pode elevar os níveis séricos de cyt c em pacientes com neoplasias hematológicas, incluindo leucemia mieloide aguda e linfoma não Hodgkin. Pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas com níveis relativamente mais altos de cyt c antes da quimioterapia apresentaram um aumento maior de cyt c após esse tratamento. Essas observações indicam que a quimioterapia resultou em níveis aumentados de cyt c no soro do paciente e níveis aumentados de apoptose tumoral. Os fármacos quimioterápicos foram capazes de induzir a permeabilização da membrana externa mitocondrial e o efluxo de cyt c para o citoplasma e, além disso, para o meio extracelular, aumentando assim os níveis séricos de cyt c. Em pacientes com leucemia de células T do adulto, os níveis séricos de cyt c foram propostos como mais sensíveis do que os da lactato desidrogenase para acompanhar as alterações no estado tumoral. A resposta rápida dos níveis de cyt c citoplasmático à quimioterapia indutora de apoptose torna essa proteína um marcador conveniente para avaliar o resultado das terapias antineoplásicas.
Esses estudos mostram que a quantificação de cyt c no soro do paciente é útil para monitorar a resposta do paciente à quimioterapia. A diminuição dos níveis séricos de cyt c pode indicar inibição da apoptose e progressão tumoral (Figura 1A). Por outro lado, a terapia antineoplásica pró-apoptótica geralmente é capaz de aumentar os níveis de cyt c no soro (Figura 1B). Esses estudos antecipam o cyt c sérico como um marcador prognóstico não invasivo no câncer. Nesses estudos, o cyt c foi quantificado usando abordagens imunológicas, incluindo ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), imuno-histoquímica, Western blotting e imunoensaios de eletroquimioluminescência. A relevância da quantificação de cyt c no soro do paciente tem incentivado o desenvolvimento de abordagens inovadoras para a quantificação altamente sensível de cyt c em amostras biológicas, que serão descritas na seção seguinte.
Cyt c sérico no prognóstico do câncer
(A) A apoptose é inibida em tumores, correlacionando-se com níveis diminuídos de cyt c na corrente sanguínea. (B) A indução terapêutica de apoptose em tumores resulta em níveis aumentados de cyt c citoplasmático, que podem ainda atingir a corrente sanguínea. A detecção de níveis aumentados de cyt c no soro está correlacionada com um prognóstico favorável.
Biossensores para quantificação de cyt c sérico
Houve um amplo desenvolvimento de biossensores para quantificação de cit c em soro humano. Atualmente, o ELISA é provavelmente o método mais utilizado. No entanto, esta revisão está focada em abordagens técnicas mais recentes e inovadoras para o mesmo propósito (Tabela 1). Esses novos biossensores são livres de anticorpos e exploram diversos métodos de detecção. Em alguns desses sistemas, o cit c é reconhecido por meio de suas propriedades elétricas. Alguns biossensores são baseados na cit c oxidase associada a eletrodos, na qual a transferência de elétrons do cit c para a cit c oxidase gera ou afeta correntes elétricas (Figura 2A). Em outro biossensor eletroquímico, o encaixe do cit c em nanocavidades de reconhecimento específico reduz a corrente elétrica estabelecida entre uma solução eletrolítica e um eletrodo de ouro. Em outras abordagens, a ligação específica do cit c a um aptâmero tem sido utilizada para detecção baseada em voltametria de pulso diferencial, espalhamento Raman amplificado por superfície (SERS) e fluorescência. No biossensor de voltametria de pulso diferencial, o aptâmero de cit c é imobilizado na superfície de um eletrodo de carbono vítreo contendo nanofibras de carbono. Quando o cit c se liga ao aptâmero, seu heme transfere elétrons para o eletrodo, gerando um sinal elétrico (Figura 2B). No biossensor SERS, o aptâmero de cit c é hibridizado com um oligonucleotídeo marcado fluorescentemente ligado a uma nanopartícula de ouro imobilizada na superfície de papel filtro. A ligação do cit c ao aptâmero induz sua dissociação do oligonucleotídeo, diminuindo a intensidade do sinal SERS, devido ao aumento da distância até a nanopartícula de ouro (Figura 2C). No biossensor baseado em fluorescência, o aptâmero é adsorvido na superfície de uma nanofolha de nitreto de carbono grafítico, cuja fluorescência é suprimida. Após a ligação do cit c, o aptâmero se dissocia da nanofolha, aumentando sua fluorescência (Figura 2D). Outros biossensores utilizam pontos quânticos, cuja fluorescência é suprimida após a ligação do cit c (Figura 2E). Um desses sistemas é sensível à atividade da tripsina. A proteólise do cit c pela tripsina restaura a fluorescência dos pontos quânticos diminuída pela ligação do cit c. No outro biossensor, a diminuição da fluorescência associada à ligação do cit c é mais pronunciada em temperaturas mais altas. Há um biossensor adicional no qual a tripsina é imobilizada dentro de nanoestruturas porosas. A detecção do cit c resulta em sua proteólise pela tripsina e na consequente geração de um produto de reação que diminui a intensidade da luz refletida (Figura 2F). Esses sistemas exploram características específicas do cit c, como sua ligação a um aptâmero ou as correntes elétricas geradas a partir da transferência de elétrons proveniente de seu heme.
Biossensores para quantificação de cit c em soro humano
(A) Cyt c (representado em azul) pode ser detectado no soro através de sua transferência de elétrons para a cyt c oxidase, o que gera uma corrente elétrica mensurável. (B) Cyt c também pode ser detectado através da ligação a um aptâmero específico (representado em verde) imobilizado na superfície de um eletrodo. A transferência de elétrons do cyt c para o eletrodo gera um sinal elétrico. (C) Em um biossensor SERS, um aptâmero de cyt c é ligado a uma nanopartícula de ouro (representada em amarelo) imobilizada em papel filtro. O aptâmero também é hibridizado com um oligonucleotídeo complementar marcado fluorescentemente (representado em preto). A ligação do Cyt c ao aptâmero resulta em sua dissociação do oligonucleotídeo, cuja separação física da nanopartícula de ouro diminui seu sinal SERS. (D) Em um biossensor fluorescente, um aptâmero de cyt c é adsorvido em uma nanofolha, suprimindo sua fluorescência. A ligação do Cyt c ao aptâmero induz sua dissociação da nanofolha, que se torna fluorescente. (E) Pontos quânticos são intrinsecamente fluorescentes. Após a ligação do cyt c, sua fluorescência é suprimida. (F) Cyt c também pode ser detectado através de sua proteólise pela tripsina (representada em verde) imobilizada dentro de estruturas nanoporosas. A proteólise do Cyt c gera um produto de reação que diminui a intensidade da luz refletida pelas nanoestruturas porosas. Elementos não foram desenhados em escala. Para simplificar, alguns dos elementos desses biossensores foram omitidos. Em biossensores eletroquímicos, eletrodos de referência e auxiliares não são representados.
Biossensores para quantificação de cyt c no soro
Referência Ano de publicação Método de detecção Descrição do biossensor Mecanismo de detecção Recursos adicionais Faixa de detecção (μg/ml)1 Limite de detecção (μg/ml)1
2007 Voltametria de onda quadrada Citocromo c oxidase imobilizada em micelas de brometo de didodecildimetilamônio associadas a eletrodos de ouro A presença de citocromo c afeta a corrente elétrica resultante da transferência de elétrons entre citocromo c oxidase e eletrodos de ouro Contém um eletrodo auxiliar de fio de platina e um eletrodo de referência de prata/cloreto de prata 2,3–118 2,3 (em soro humano)
2020 Eletroquímica Citocromo c oxidase imobilizada em nanopartículas de óxido de grafeno depositadas em um eletrodo de grafite de lápis A transferência de elétrons do citocromo c para a citocromo c oxidase gera uma corrente elétrica através das nanopartículas de óxido de grafeno para o eletrodo de grafite de lápis Contém um eletrodo auxiliar de fio de platina e um eletrodo de referência de prata/cloreto de prata 0,04–0,18 0,04 (em solução)
2022 Voltametria de pulso diferencial Eletrodo de disco de ouro revestido com um polímero de poli-orto-fenilenodiamina contendo cavidades de reconhecimento do citocromo c imerso em uma solução de ácido ferrocenocarboxílico O encaixe do citocromo c dentro de suas cavidades de reconhecimento diminui a corrente elétrica gerada pela transferência de elétrons do ácido ferrocenocarboxílico para o eletrodo de ouro Contém um eletrodo contador de fio de platina e um eletrodo de referência de prata/cloreto de prata/cloreto de potássio. O poli-orto-fenilenodiamina fornece isolamento elétrico 1,3 × 10−6–4,1 × 10−5 4,2 × 10−8 (em soro humano diluído)
2022 Voltametria de pulso diferencial Aptâmero de ligação ao citocromo c imobilizado na superfície de um eletrodo de carbono vítreo modificado com nanofibras de carbono A ligação do citocromo c ao aptâmero induz a transferência de elétrons do citocromo c para o eletrodo, gerando um sinal elétrico A imobilização do aptâmero é aprimorada através da modificação da superfície do eletrodo com óxido de grafeno funcionalizado com aspartato. As nanofibras de carbono aumentam a condutividade elétrica do eletrodo de carbono vítreo
Também contém um eletrodo de referência de prata/cloreto de prata/cloreto de potássio e um eletrodo auxiliar de fio de platina 0.1175–1175 8.7 × 10−3 (em soro humano saudável) 2020 SERS Aptâmero de Cyt c hibridizado com um oligonucleotídeo marcado com cianina-5 ligado a nanopartículas de ouro imobilizadas em papel de filtro A ligação do Cyt c ao aptâmero dissocia seu oligonucleotídeo complementar; o sinal SERS do oligonucleotídeo diminui devido ao aumento da sua distância até a nanopartícula de ouro As nanopartículas de ouro possuem protuberâncias afiadas para aumentar seus campos magnéticos 1.79 × 10−6–10 1.79 × 10−6 (em soro de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas) 2017 Fluorescência Aptâmero ligante de Cyt c adsorvido na superfície de uma nanofolha de nitreto de carbono grafítico A fluorescência da nanofolha é suprimida pela adsorção do aptâmero. Após a ligação do Cyt c, o aptâmero muda sua estrutura e se dissocia da nanofolha, aumentando a fluorescência da nanofolha A faixa de detecção e o limite de detecção são comparados com os de outros biossensores 0.19–1.65 0.031 (em soro humano fortificado) 2019 Fluorescência Pontos quânticos de carboneto de titânio funcionalizados com ε-poli-L-lisina protetora A ligação do Cyt c aos pontos quânticos suprime sua fluorescência Também detecta atividade de tripsina; a proteólise do Cyt c pela tripsina restaura a fluorescência 2–470 2 × 10−3 (em solução) 2021 Fluorescência Pontos de carbono codopados com nitrogênio e flúor A ligação do Cyt c aos pontos de carbono suprime sua fluorescência Sensível à temperatura: o aumento da temperatura diminui a intensidade da fluorescência 6–294 2.9 (em solução) 2020 Espectroscopia de reflectância interferométrica Paredes de poros de alumina anódica nanoporosa funcionalizadas com tripsina através de um ligante de 3-aminopropil trimetoxi silano A digestão do Cyt c pela tripsina gera um produto de reação que diminui a intensidade da luz refletida A intensidade da luz diminui como uma função logarítmica da concentração de Cyt c 0.01–1 0.006 (em solução) 2020 Fluorescência Pontos de carbono codopados com N e S A ligação do Cyt c aos pontos de carbono suprime sua fluorescência Também detecta atividade de tripsina; a proteólise do Cyt c pela tripsina restaura a fluorescência 0.2–25 0.002 (em soro) 2020 Fluorescência Pontos quânticos de carbono preparados a partir de 1,4-diaminonaftaleno e ácido cítrico A ligação do Cyt c aos pontos de carbono suprime sua fluorescência A supressão é principalmente dinâmica (ou seja, via transferência de elétrons) 0.2–50 0.0032 (em soro) 2021 Fluorescência Nanoclusters de ouro com uma camada protetora de L-cisteína e glutationa A ligação do Cyt c aos nanoclusters de ouro suprime sua fluorescência Outras vantagens incluem biocompatibilidade e baixa toxicidade 0.08–90 0.004 (em soro humano) 2018 Eletroquímica Eletrodo de pasta de carbono modificado com um líquido iônico (brometo de 1-metil-3-butilimidazólio) e um filme de polivinilpirrolidona O Cyt c é reduzido eletroquimicamente na superfície do eletrodo: sua corrente de redução é medida Detecção voltamétrica, usando voltametria de onda quadrada e pulso diferencial 0.004–5.2 (por SWV); 0.003–6.1 (por DPV) 0.001 (em solução) 0.0035 (em urina humana) por SWV
Quando originalmente indicados na faixa de μM, os valores desses parâmetros foram convertidos para μg/ml por meio da multiplicação pelo peso molecular do cit c (11,749 kDa).
Bios sensores adicionais também foram desenvolvidos para a quantificação de cit c em lisados celulares, em soluções sem soro e/ou visualização em células vivas; no entanto, esses estudos não incluem validação para detecção de cit c em soro humano. Apesar disso, eles comprovam a possibilidade de projetar e construir uma vasta gama de sistemas de detecção de cit c altamente sensíveis.
Sistemas para liberação terapêutica de cit c para células cancerígenas
O cit c é passível de aplicações biotecnológicas no câncer não apenas por meio de sua quantificação em soro humano, mas também através de sua liberação terapêutica para células cancerígenas. A capacidade do cit c de induzir a apoptose de células cancerígenas inspirou o desenvolvimento de um conjunto diversificado de ferramentas moleculares para sua entrega e liberação no citoplasma de células cancerígenas. Muitos desses sistemas foram resumidos em uma revisão recente. Os sistemas de liberação de cit c podem ser geralmente divididos em sistemas baseados em proteínas de fusão e sistemas baseados em nanopartículas. Para evitar citotoxicidade generalizada, muitos deles contêm uma proteína ou peptídeo que reconhece uma proteína de membrana especificamente expressa na superfície de células cancerígenas. Essa modificação promove o reconhecimento seletivo e a endocitose do sistema de liberação de cit c por essas células. Para minimizar quaisquer possíveis efeitos citotóxicos, substâncias exógenas endocitadas podem ser rapidamente transferidas para lisossomos, resultando em sua degradação lisossomal. Esse mecanismo de proteção pode criar um obstáculo à ação terapêutica de um fármaco endocitado. Portanto, ao testar novos medicamentos, é conveniente avaliar se eles são capazes de evadir os endossomos e escapar da degradação lisossomal. Após a endocitose, muitos desses sistemas de liberação de cit c demonstraram evadir eficientemente os endossomos e evitar a degradação lisossomal (Tabelas 2–5), o que, de outra forma, exigiria doses mais altas para eficácia terapêutica. No citoplasma das células cancerígenas, a liberação de cit c induz a apoptose. Na farmacologia, o parâmetro IC50 corresponde à concentração do fármaco que induz 50% de sua resposta máxima. Aqui, IC50 é a concentração de cit c necessária para reduzir a viabilidade das células cancerígenas em cerca de 50%.
Sistemas de liberação de cit c baseados em proteínas de fusão
Referência Ano de publicação Descrição da proteína de fusão Características adicionais Fuga endossomal/lisossomal avaliada IC50 aproximado (μg/ml)1 Tipo(s) de câncer Sistemas modelo utilizados (exceto controles negativos) 2021 Três moléculas de citocromo c em tandem fundidas a um anticorpo de cadeia única anti-receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER-2) Aumentar o número de moléculas de citocromo c aumentou a eficácia anticancerígena. Carece de um ligante clivável Não 8.3 Câncer de mama HER-2 positivo SK-BR-3 e BT-474 (HER-2 positivo) e MDA-MB-231 e MCF-7 (HER-2 negativo); modelo de camundongo com xenoenxerto de células SK-BR-3 2018 Citocromo c fundido à transferrina através de uma ligação dissulfeto A ligação dissulfeto é clivada em ambiente citoplasmático redutor, liberando o citocromo c. Não tóxico para células pulmonares saudáveis MRC5 Sim 4000 Tipos de câncer que superexpressam o receptor de transferrina Células de câncer de pulmão A549, células de câncer cervical HeLa e células de leucemia mieloide crônica K562 2020 Citocromo c fundido à clorotoxina através de um sítio de clivagem da enterocinase Passível de purificação da clorotoxina Sim 300–400 Glioma; tipos de câncer que expressam o receptor de clorotoxina Células 9L/lacz e NIH/3T3 2014 Citocromo c fundido à albumina galactosilada através de uma ligação dissulfeto redutível A albumina é um substrato para modificação com galactose, o ligante reconhecido pelo receptor de asialoglicoproteína em células cancerígenas. A ligação dissulfeto é clivada em ambiente citoplasmático redutor, liberando o citocromo c Sim (Não estimado) Carcinoma hepatocelular positivo para receptor de asialoglicoproteína (também foi internalizado por células de carcinoma hepatocelular sem esse receptor) Células HepG2, Hep3B e Mahlavu
Os valores de IC50 originalmente listados em μM foram convertidos para μg/ml através da multiplicação pelo peso molecular (em kDa) da respectiva proteína de fusão.
Sistemas de entrega terapêutica baseados em nanopartículas onde o citocromo c é encapsulado no interior de cavidades moleculares
Referência Ano de publicação Descrição da nanopartícula Características adicionais Fuga endossomal/lisossomal avaliada IC50 (μg/ml) Tipo(s) de câncer Sistemas modelo utilizados (exceto controles negativos) 2019 Cyt c encapsulado dentro de ferritina humanizada de Archaeoglobus fulgidus Reconhece células que expressam CD71 em sua superfície Não (Não estimado) Leucemia promielocítica aguda Células NB4 2020 Cyt c encapsulado dentro de micelas à base de polipeptídeos Para tumores hipóxicos. A hipóxia promove a liberação de cyt c, que é mais lenta sob normóxia Sim 50 (sob hipóxia) Carcinoma hepatocelular Células HepG2 2016 Cyt c encapsulado dentro de um nanogel à base de ácido hialurônico contendo ligações dissulfeto cuja clivagem desestrutura o nanogel e libera cyt c Intrinsecamente fluorescente. O ácido hialurônico reconhece CD44 na superfície celular Não 36.1 (células MCF-7)1 Câncer de mama Células MCF-7 e U87; modelo de camundongo com xenoenxerto de células MCF-7 2021 Cyt c encapsulado dentro de um nanogel à base de poliglicerol contendo ligantes derivados de cistamina, cuja clivagem em condições redutoras libera cyt c 80% do cyt c encapsulado foi liberado dentro de 48 h Não 30 Câncer de pulmão, cervical e de mama Células A549, HeLa e MCF-7
O valor de IC50 originalmente indicado como 3.07 μM foi convertido para μg/ml através da multiplicação pelo peso molecular do cyt c de 11.749 kDa.
Sistemas de administração terapêutica onde cyt c é coprecipitado dentro de...
Referência Ano de publicação Descrição da nanopartícula Características adicionais Fuga endossomal/lisossomal avaliada IC50 (μg/ml) Tipo(s) de câncer Sistemas modelo utilizados (exceto controles negativos) 2014 Cit c precipitado em nanopartículas, posteriormente modificado com um polímero de ácido poli(láctico-co-glicólico). Sob um ambiente celular redutor, o ligante que conecta o polímero à proteína é clivado através de sua ligação dissulfeto, liberando cit c Induziu apoptose em células HeLa de forma mais eficiente do que cit c sozinho Sim 50 Câncer cervical Células HeLa 2020 Cit c precipitado em nanopartículas ainda decoradas com folato-polietileno glicol-ácido poli(láctico-co-glicólico)-tiol. No citoplasma, o ambiente redutor cliva a ligação dissulfeto entre cit c e o copolímero, liberando cit c Reconhece células cancerosas que expressam o receptor de folato Sim 49,2–70,1 Câncer cervical e carcinoma pulmonar de Lewis Células HeLa; células de carcinoma pulmonar de Lewis e modelo de camundongo 2022 Cit c precipitado em nanopartículas estabilizadas por reticulação reversível com ditiobis(succinimidil propionato), contendo ligações dissulfeto redutíveis Decorado com um polímero de ácido fólico-polietileno glicol, para reconhecer células cancerosas que expressam o receptor de folato; versão otimizada de Sim 47,46 Câncer cervical e carcinoma pulmonar de Lewis Células HeLa; células de carcinoma pulmonar de Lewis e modelo de camundongo 2012 Nanopartículas compostas por cit c conjugado com um peptídeo permeável à membrana, apolipoproteína A1, e os lipídios 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano e dioleoilfosfatidiletanolamina Modificadas adicionalmente com anisamida, um ligante que reconhece o receptor sigma em células de carcinoma pulmonar H460; demonstrou menor captação hepática em camundongos Sim (Não estimado) Câncer de pulmão de células não pequenas Células H460; modelo de xenoenxerto de células H460 em camundongos 2017 Complexo de nanopartículas de cit c e cardiolipina; a cardiolipina aumenta a permeabilidade da membrana A apoptose foi ainda estimulada através da produção de radicais lipoperóxidos pela nanopartícula; poderia induzir apoptose em células resistentes à doxorrubicina Não 270 ± 60; 460 ± 30 Carcinoma ovariano Células A2780 e A2780-Adr
Sistemas de administração terapêutica onde o cit c está ligado à superfície ou encapsulado dentro dos poros das nanopartículas
Referência Ano de publicação Descrição das nanopartículas Características adicionais Avaliação da fuga endossomal/lisossomal IC50 aproximada (μg/ml) Tipo(s) de câncer Sistemas modelo utilizados (exceto controles negativos) 2018 Cyt c quimicamente ligado à superfície de nanopartículas de óxido de ferro contendo um revestimento de ouro A combinação com nanopartículas de citocromo c potencializou os efeitos citotóxicos de doxorrubicina, paclitaxel, oxaliplatina, vimblastina e vincristina Sim (Estimado em combinação com fármacos quimioterápicos; amplamente variável) Carcinoma hepatocelular Células HepG2, Huh-7D e SK-hep-1 2013 Cyt c modificado com sulfosuccinimidil-6-[3′-(2-piridilditio)-propionamido]hexanoato e ligado a nanopartículas de sílica mesoporosa através de ligações dissulfeto sensíveis a redox. No citoplasma, as ligações dissulfeto são clivadas e o cyt c é liberado Quatro moléculas de lactose foram ligadas a cada cyt c, para evitar sua degradação Sim 40–50 Câncer cervical Células HeLa 2014 Cyt c e doxorrubicina encapsulados dentro de poros ampliados de nanopartículas de sílica mesoporosa selados com ligantes contendo ligações dissulfeto. Cyt c foi modificado com aptâmeros que reconhecem nucleolina (um marcador de membrana de tumorigênese e angiogênese). No citoplasma, o ambiente redutor cliva as ligações dissulfeto e libera doxorrubicina, cyt c e o aptâmero Efeito triplo: doxorrubicina bloqueia a replicação do DNA, cyt c induz apoptose e o aptâmero desestabiliza o reparo de DNA Sim (Não estimado) Carcinoma hepatocelular Células HepG2; modelo de camundongo com xenoenxerto HepG2 2021 Cyt c encapsulado dentro de poros ampliados de nanopartículas de sílica mesoporosa. Nanopartículas de ouro modificadas com polietileno glicol (PEG) amino-terminal selam os poros através de interações eletrostáticas, impedindo a liberação de cyt c. Dentro dos lisossomos, o pH ácido reverte sua carga elétrica, causando o desprendimento das nanopartículas de ouro e a liberação de cyt c Sensível ao pH; cyt c é liberado em pH 5,0 Sim 15,8 Câncer cervical Células HeLa; modelo de camundongo com xenoenxerto de células HeLa 2020 Cyt c com carga positiva carregado em poros ampliados com carga negativa de nanopartículas de sílica mesoporosa, através de interações eletrostáticas. Sob pH baixo, a carga da nanopartícula torna-se positiva e libera cyt c Sensível ao pH; cyt c é liberado em pH 5,0. A rugosidade da nanopartícula aumentou a captação celular e a apoptose Não 20 Câncer de ovário Células SKOV3 2010 Cyt c e um corante fluorescente encapsulados dentro das cavidades de nanopartículas poliméricas de polihidroxila hiperramificadas revestidas com folato. Cyt c foi ligado através de interações eletrostáticas entre aminoácidos lisina e grupos hidroxila do polímero Reconhece células cancerosas que expressam o receptor de folato. Sensível ao pH: cyt c é liberado em pH 4,0. Potencial teranóstico: o corante avalia o progresso da apoptose induzida por cyt c Não (Não estimado) Câncer de pulmão e mama Células A549 e MCF-7
Os sistemas de liberação de cyt c à base de proteínas consistem em cyt c fundido a uma proteína ou peptídeo específico. A proteína ou peptídeo fundido é o ligante de um receptor que é expresso na superfície de células cancerígenas específicas. Alguns desses sistemas contêm uma ligação dissulfeto que é clivada no citoplasma, devido ao seu ambiente químico redutor, liberando cyt c (Figura 3A e Tabela 2). O cyt c liberado desencadeia a apoptose da célula. Em um desses sistemas, o cyt c foi fundido a um anticorpo contra o receptor 2 do fator de crescimento epidérmico (HER-2), para direcionamento a células de câncer de mama HER-2-positivo. Em outro sistema, o cyt c foi fundido à transferrina, para direcionamento a tipos de câncer nos quais o receptor de transferrina é superexpresso, incluindo o câncer de pulmão. Para direcionamento a células de glioma, o cyt c foi fundido ao peptídeo neurotóxico clorotoxina, para promover a captação em células cerebrais. Em outro sistema de fusão, o cyt c foi conjugado com albumina galactosilada, que é reconhecida por receptores em células de carcinoma hepatocelular.
Sistemas para liberação terapêutica de cyt c para células cancerígenas
(A) Em sistemas de liberação baseados em proteínas de fusão, o cyt c (representado em azul) é conectado à sua proteína ou peptídeo conjugado através de um ligante contendo uma ligação dissulfeto. No citoplasma das células cancerígenas, o ambiente químico redutor induz a clivagem da ligação dissulfeto e a consequente liberação do cyt c. (B) Sistemas de liberação baseados em nanopartículas são geralmente revestidos com ligantes (representados em vermelho) que reconhecem células cancerígenas através de marcadores de superfície (representados em marrom). No citoplasma, eles liberam cyt c, que induzirá a apoptose da célula cancerígena. (C–F) Sistemas de liberação baseados em nanopartículas. Nestes sistemas, o cyt c é encapsulado dentro da nanopartícula ou ligado a ela (lado esquerdo de cada desenho). No citoplasma, o cyt c é liberado (lado direito de cada desenho). (C) O cyt c pode ser encapsulado dentro de um nanogel contendo ligantes redox-sensíveis (representados em preto), cujas ligações dissulfeto são clivadas no citoplasma das células cancerígenas, liberando cyt c. (D) O cyt c pode ser ligado a nanopartículas através de ligantes redox-sensíveis, cujas ligações dissulfeto são clivadas dentro do citoplasma das células cancerígenas, liberando cyt c. (E) Alternativamente, o cyt c pode ser encapsulado dentro de poros de nanopartículas ampliados e tampados com ligantes redox-sensíveis (representados em preto), cujas ligações dissulfeto (não representadas na figura) são clivadas no citoplasma, liberando cyt c. (F) No sistema descrito em (E), nanopartículas contendo cyt c podem ser alternativamente tampadas com nanopartículas de ouro (representadas em amarelo) que são deslocadas pela inversão de carga elétrica causada pelo baixo pH. Os elementos não foram desenhados em escala. Por simplicidade, alguns dos elementos destes sistemas de liberação foram omitidos.
Os sistemas de liberação de cyt c à base de nanopartículas são mais diversos, incluindo estruturas de bolsas de encapsulamento, nanopartículas com cavidades carregadas com cyt c e nanopartículas com cyt c em seu próprio interior.
Um desses grupos consiste em encapsular o cit c dentro de bolsas formadas por estruturas moleculares grandes que podem ter como alvo células cancerígenas e liberar o cit c no citoplasma, induzindo sua apoptose (Figura 3B). Essas grandes estruturas onde o cit c é encapsulado incluem ferritina (uma proteína de armazenamento de ferro), micelas de polipeptídeos e nanogéis. Para garantir seu direcionamento específico para as células cancerígenas, algumas dessas estruturas de bolsa foram modificadas em sua superfície com ligantes que se ligam a moléculas específicas na superfície das células cancerígenas, desencadeando sua endocitose (Tabela 3). O sistema de entrega por micelas de polipeptídeos é sensível à escassez de oxigênio nos tumores, liberando seu conteúdo mais rapidamente sob condições hipóxicas. Sistemas adicionais baseados em nanopartículas são nanogéis sensíveis ao ambiente químico redutor no citoplasma das células cancerígenas. O ambiente redutor causa a redução das ligações dissulfeto nos nanogéis e sua consequente ruptura, o que libera o cit c (Figura 3C).
Em outros sistemas baseados em nanopartículas, o cit c faz parte da composição das nanopartículas (Tabela 4). Em alguns desses sistemas, o cit c é coprecipitado com um reagente dessolvatante para formar as nanopartículas. Essas nanopartículas também contêm um polímero de reticulação com uma ligação dissulfeto. A ligação dissulfeto é clivada sob ambiente redutor, liberando o cit c no citoplasma. Em outros sistemas (Tabela 4), o cit c está associado a partículas lipídicas, na ausência ou presença de apolipoproteína A1. Os sistemas de partículas lipídicas geralmente não são sensíveis ao estado redox do citoplasma e aproveitam a permeabilidade lipídica celular para atingir o citoplasma.
Outros sistemas de entrega utilizam um tipo diferente de nanopartículas (Tabela 5). Em um desses sistemas, o cit c é quimicamente ligado à superfície de nanopartículas compostas de óxido de ferro e ouro. Em outro sistema, o cit c é quimicamente ligado à superfície de nanopartículas de sílica mesoporosa por meio de uma ligação dissulfeto redutível. Essa ligação é clivada em ambiente redutor e o cit c é liberado (Figura 3D). Em outros sistemas de entrega de nanopartículas de sílica mesoporosa, os poros são ampliados para acomodar moléculas de cit c. Essas cavidades são ainda seladas com ligantes contendo ligações dissulfeto. O ambiente químico redutor na célula cliva os ligantes, deixando os poros abertos para liberar o cit c (Figura 3E). Outras versões desse sistema utilizam interações eletrostáticas para ligar o cit c às cavidades, sendo sensíveis ao pH. Aqui, o cit c com carga positiva é ligado às partículas com carga negativa por meio de interações eletrostáticas. O pH ácido nas células cancerígenas inverte a carga elétrica das nanopartículas, causando a ruptura das interações eletrostáticas e consequente liberação do cit c. Em um desses sistemas, os poros carregados com cit c são revestidos com nanopartículas de ouro menores, ligadas por interações eletrostáticas. O ambiente ácido inverte a carga elétrica, causando o desprendimento das nanopartículas de ouro e a liberação do cit c (Figura 3F).
Esses sistemas de entrega são compostos por materiais biocompatíveis, que são eficazes em evitar reações imunológicas do hospedeiro. Reações imunológicas contra um sistema de entrega de cit c desencadeariam sua destruição e comprometeriam sua eficácia terapêutica. Para garantir ainda mais sua biocompatibilidade em células humanas, o cit c humano deve ser utilizado na preparação de seus sistemas de entrega.
Impacto de mutações, modificações pós-traducionais e estado redox do cit c na apoptose
Embora a entrega de cit c às células cancerígenas se mostre uma estratégia terapêutica promissora, atenção também deve ser dada à eficácia da interação do cit c com Apaf-1, uma etapa crítica no desencadeamento da apoptose. Mutantes de lisina do cit c demonstraram função deficiente do apoptossomo, inibindo a oligomerização do Apaf-1. Por outro lado, três variantes patogênicas do cit c, Gly41Ser, Tyr41His e Ala51Val, podem aumentar a eficiência da ativação do apoptossomo, possivelmente ao aumentar a flexibilidade do cit c e facilitar sua interação com Apaf-1.
Um conjunto extenso de modificações pós-traducionais foi descrito no cit c. A capacidade pró-apoptótica do cit c também depende do seu estado de fosforilação. As fosforilações do cit c inibem suas funções apoptóticas, sugerindo um papel citoprotetor. A mimetização da fosforilação do cit c na serina 47 teve um efeito protetor contra a apoptose no cérebro. A fosforilação do cit c na treonina 58 inibiu a apoptose no rim de rato. Além disso, a fosforilação do cit c nas tirosinas 48 ou 97 demonstrou diminuir sua atividade pró-apoptótica. Mutantes pontuais de cit c que mimetizam a fosforilação da tirosina 48 ou tirosina 97 mostraram reduções na ativação da caspase-3 de aproximadamente 60% e 26%, respectivamente.
Outras modificações do cit c também mostraram efeitos antiapoptóticos. A acetilação do cit c na lisina 53 promoveu a evasão da apoptose em xenoenxertos de câncer de próstata. As nitrações do cit c nas tirosinas 46 e 48 prejudicaram a formação de apoptossomos funcionais e podem até promover a degradação do cit c. A nitração da tirosina 74 mostrou bloquear a ativação da caspase-9, uma etapa crítica na indução da apoptose. Por outro lado, a N-homocisteinilação da lisina pode ser pró-apoptótica. Essa modificação foi relacionada ao aumento da atividade de peroxidase do cit c, que está associada ao seu efluxo para o citoplasma e ao subsequente desencadeamento da apoptose.
Além disso, apenas a forma oxidada (mas não a reduzida) do cit c poderia induzir a ativação de caspase e apoptose. Em concordância com a inibição da apoptose no câncer, o cit c tornou-se excessivamente reduzido em cânceres de cérebro e mama humanos, em comparação com o tecido saudável.
A partir do exposto, a versão do cit c a ser utilizada na preparação de sistemas de entrega terapêutica deve ser cuidadosamente escolhida. Embora mutações pontuais específicas e o estado oxidado do cit c possam melhorar sua função apoptótica, várias modificações pós-traducionais podem comprometê-la e devem ser evitadas.
Abordagens para melhorar a estabilidade térmica do cit c
Uma limitação crítica dos sistemas de entrega terapêutica baseados em proteínas é a estabilidade térmica da proteína, o que limita seu potencial real. Infelizmente, em países de baixa renda, que frequentemente têm climas quentes, ainda é desafiador manter os medicamentos em condições refrigeradas permanentes desde a produção até a administração ao paciente. Esta é uma questão frequentemente negligenciada. Os sistemas de entrega terapêutica do cit c baseados em nanopartículas provavelmente melhorarão a estabilidade da proteína em comparação com o cit c nu. No entanto, estratégias adicionais foram desenvolvidas para aumentar ainda mais a estabilidade térmica do cit c, incluindo PEGuilação, líquidos iônicos e B-DNA.
A PEGilação consiste na modificação química de uma molécula com PEG, um polímero composto por monômeros de etilenoglicol. O Cit c foi PEGilado com polímeros de PEG de 5 kDa ligados aos aminoácidos lisina. Esta modificação não causou grandes alterações nas estruturas secundária ou terciária da proteína. Usando este procedimento de modificação, cada molécula de Cit c foi ligada a quatro ou oito moléculas de PEG. A atividade de peroxidase foi medida como uma avaliação da estabilidade do Cit c. As moléculas de Cit c com oito moléculas de PEG ligadas foram as mais estáveis, retendo 30–40% mais atividade de peroxidase ao longo de 60 dias (armazenadas tanto a 4 quanto a 25°C) do que o Cit c não modificado. O Cit c não modificado teve uma meia-vida de cerca de 44 dias a 4°C e cerca de 24 dias a 25°C, enquanto sua modificação com quatro ou oito moléculas de PEG estendeu sua meia-vida para pelo menos 60 dias em ambas as temperaturas. Após 60 dias de armazenamento a 4°C, o Cit c modificado com quatro ou oito moléculas de PEG reteve 62% e 80% de sua atividade inicial de peroxidase, respectivamente; enquanto o Cit c não modificado mostrou apenas 43% de sua atividade inicial. A 25°C, o Cit c não modificado ainda tinha 27% de atividade de peroxidase, em contraste com pelo menos 53% de ambas as formas PEGiladas armazenadas na mesma temperatura. A PEGilação demonstrou aumentar a estabilidade térmica do Cit c, não apenas em solução, mas também como componente de biossensor. Em um biossensor baseado em Cit c, o Cit c foi modificado com moléculas de PEG de 2 kDa e permaneceu eletroquimicamente ativo após armazenamento de 2 meses a 40°C.
Para um aumento ótimo da estabilidade, as moléculas de PEG devem ser quimicamente ligadas a aminoácidos específicos do Cit c, em vez de serem apenas adicionadas à proteína. Interações inespecíficas nem sempre têm um efeito protetor na estabilidade da proteína. A interação inespecífica do Cit c com PEG de 10 kDa perturbou a estrutura do Cit c, enquanto o PEG de 20 kDa teve um efeito protetor. O efeito protetor do polímero de PEG de 20 kDa foi alcançado pelo efeito de volume excluído, que limitou as interações do Cit c com moléculas potencialmente desnaturantes. No entanto, a interação inespecífica do Cit c com altas concentrações de PEG de 4 kDa perturbou as estruturas secundária e terciária da proteína. Contudo, a interação entre o Cit c e os monômeros de etilenoglicol contribuiu para sua estabilização. A PEGilação com um número excessivo de moléculas de PEG por molécula de Cit c também deve ser evitada. A ligação específica de PEG de 0,4 kDa em altas concentrações afetou a estrutura terciária do Cit c e expôs regiões hidrofóbicas.
Além da PEGuilação, os líquidos iônicos também demonstraram grande valor na extensão da estabilidade térmica e do prazo de validade do citocromo c. Embora os compostos iônicos sejam geralmente sólidos, alguns deles possuem pontos de fusão abaixo de 100°C. Esses líquidos iônicos são sais nos quais o íon positivo é volumoso e orgânico, e o íon negativo é orgânico ou inorgânico. Suas propriedades físico-químicas podem ser moduladas por meio da escolha cuidadosa do(s) íon(s) positivo(s) e/ou negativo(s) e de suas modificações. Os líquidos iônicos demonstraram a capacidade de estabilizar proteínas durante a produção, o transporte e o armazenamento, tornando-os de grande valor na utilização de proteínas como ferramentas terapêuticas. Devido a essas propriedades, o interesse em torno do potencial dos líquidos iônicos cresceu consideravelmente.
Os líquidos iônicos à base de dihidrogenofosfato de colínio tendem a melhorar a estabilidade térmica das proteínas, um efeito que depende fortemente do seu íon negativo. Em tampões aquosos, o citocromo c é estável por apenas 1 semana, enquanto em uma solução tamponada de dihidrogenofosfato de colínio, seu prazo de validade pode ser estendido para até 6 meses. O citocromo c foi criopreservado em uma solução contendo nitrato de etilamônio e tiocianato de 1-butil-3-metilimidazólio. Embora essa solução tenha causado desnaturação do citocromo c, pelo menos 90% da estrutura e função do citocromo c foram recuperados após sua remoção da proteína. A estabilidade e a atividade do citocromo c também foram melhoradas por meio de líquidos iônicos à base de aminoácidos. A estabilidade e a dinâmica conformacional do citocromo c puderam ser moduladas utilizando líquidos iônicos de amônio com diferentes comprimentos de cadeia alquílica. Líquidos iônicos à base de aminoácidos também foram testados como solventes para armazenamento do citocromo c. Esses líquidos não alteram a estrutura do citocromo c. Os líquidos iônicos de imidazólio de cadeia longa, cloreto de 1-metil-3-octil imidazólio e cloreto de 1-decil-3-metilimidazólio, em concentrações inferiores a 1 mM, demonstraram aumentar a estabilidade do citocromo c durante seu armazenamento de longo prazo à temperatura ambiente por 6 meses. Outro líquido iônico, glutarato de colínio, também teve sucesso em estender a estabilidade e a atividade catalítica do citocromo c. O armazenamento à temperatura ambiente pôde ser estendido para 5 meses. O citocromo c também pôde ser recuperado desse líquido iônico sem comprometer suas propriedades. O empacotamento do citocromo c em nanopartículas de ouro revestidas com sais de líquidos iônicos aumentou a atividade do citocromo c e estendeu sua estabilidade térmica e armazenamento de longo prazo.
Em relação à estabilidade térmica do cit c, também é útil conhecer as propriedades que reduzem sua estabilidade térmica. Entre os líquidos iônicos, sais diluídos em água contendo os cátions imidazólio 1-etil-3-metilimidazólio ou 1-butil-3-metilimidazólio podem desestabilizar fortemente a estabilidade térmica (mas não a de pH) do cit c, especialmente o sal butílico. Eles desestabilizam através da ligação e da diminuição da tensão superficial do solvente. Existem algumas preocupações quanto à toxicidade dos líquidos iônicos; nanopartículas parecem ser mais seguras. Sua conjunção possui grande potencial para melhorar a estabilidade de medicamentos e, consequentemente, seu desempenho, já que os líquidos iônicos também podem melhorar a estabilidade térmica e química das nanopartículas. Por outro lado, os PEGs são considerados notavelmente seguros, qualidade que os torna frequentemente utilizados em produtos cosméticos. No entanto, deve-se ter em mente que a PEGuilação do cit c pode afetar sua interação com Apaf-1, que é uma etapa crítica na formação do apoptossomo. Como tal, a compatibilidade da PEGuilação do cit c com sua exploração anticancerígena deve ser cuidadosamente avaliada.
Além da PEGuilação e dos líquidos iônicos, o B-DNA (a conformação de DNA mais comumente encontrada) também é uma ferramenta potencialmente útil para melhorar a estabilidade do cit c. O empacotamento do cit c dentro de arcabouços de B-DNA aumentou sua atividade de peroxidase. Sua estabilidade sob alta temperatura, pH elevado, estresse oxidativo e agentes desnaturantes também foi aprimorada. Por outro lado, a adsorção eletrostática do cit c no DNA induziu a autoagregação da proteína. Portanto, o DNA como agente estabilizador do cit c também precisa ser utilizado com cuidado.
Essas abordagens são promissoras para estender a vida útil do cit c sob condições limitadas de refrigeração. Em relação à preparação da proteína, o cit c é geralmente purificado a partir de sistemas de expressão bacteriana recombinante, proporcionando alto rendimento e pureza. Além disso, novas abordagens altamente seletivas para a purificação do cit c a partir de extratos de mamíferos foram desenvolvidas. A conjunção da purificação altamente seletiva do cit c com melhor preservação em temperatura ambiente tem o potencial de estender a usabilidade dos sistemas de entrega terapêutica do cit c em ambientes com refrigeração limitada.
Discussão
A presente revisão destaca o potencial do cit c no câncer. O monitoramento de seus níveis no soro pode ser informativo sobre a resposta do paciente à quimioterapia (Figura 1), para o qual vários biossensores altamente sensíveis foram desenvolvidos (Figura 2 e Tabela 1). Além disso, o cit c pode ser um medicamento quimioterápico quando administrado em células cancerígenas, para o qual vários sistemas de entrega também foram desenvolvidos (Figura 3 e Tabelas 2–5). O potencial terapêutico do cit c sob condições limitadas de refrigeração pode ser ainda mais aprimorado através da PEGuilação e armazenamento em soluções de líquidos iônicos, que melhoram sua estabilidade térmica.
Os biossensores para quantificação de citocromo c no soro demonstram a versatilidade das metodologias disponíveis para detectar essa proteína em amostras biológicas. Biossensores adicionais foram validados em solução, lisados celulares ou mesmo para visualização em células vivas. Esses biossensores também poderiam ser testados para quantificação de citocromo c em soro humano. Diferentemente do câncer, o citocromo c está elevado no soro de pacientes com infarto do miocárdio, para os quais alguns biossensores de citocromo c também foram desenvolvidos. Níveis elevados de citocromo c no soro também foram detectados em pacientes com HIV recebendo terapia antirretroviral, indicando o citocromo c como um marcador de toxicidade antirretroviral em pacientes com HIV. O efluxo mitocondrial de citocromo c também foi relatado em doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Parkinson e doença de Huntington, nas quais extensa apoptose de células neuronais está implicada. No entanto, o citocromo c não consegue atravessar a barreira hematoencefálica, o que limita a possibilidade de quantificar o citocromo c liberado pelas células neuronais. Contudo, essas observações sugerem que a quantificação de citocromo c no soro do paciente também poderia ser útil para monitorar a resposta ao tratamento e o prognóstico de outras doenças nas quais a apoptose está inibida ou exacerbada.
Em relação aos sistemas de entrega terapêutica de citocromo c, muitos deles são equipados com ligantes de proteínas que são especificamente expressas em células cancerígenas, para evitar efeitos citotóxicos em tecidos saudáveis. Isso é uma vantagem sobre os fármacos quimioterápicos que induzem apoptose mais sistêmica, com efeitos graves para o paciente. Embora a entrega de proteínas nas células seja uma abordagem terapêutica valiosa, sua produção dentro das células do paciente surge como uma alternativa atraente. A terapia genética tem sido bem-sucedida na entrega de genes terapêuticos ao paciente, para produção in vivo de proteínas terapêuticas. Notavelmente, tipos de câncer incluindo lesões de melanoma foram tratados com terapia genética. Infelizmente, uma abordagem de terapia genética pode não ser eficaz para aumentar os níveis de citocromo c no citoplasma. Após sua tradução, o citocromo c é extensamente importado para as mitocôndrias. Seu enovelamento e fixação do heme ocorrem no espaço intermembranar mitocondrial. Portanto, a entrega de um gene recombinante codificando citocromo c nas células do paciente pode resultar em níveis aumentados de citocromo c nas mitocôndrias e não no citoplasma.
Além de desenvolver ferramentas terapêuticas inovadoras, garantir sua ampla disponibilidade aos pacientes também deve ser uma preocupação. Isso inclui pacientes de países de baixa renda, cujas instalações clínicas podem ter limitações em equipamentos de refrigeração. As estratégias para melhorar a estabilidade térmica do cit c, como PEGuilação e armazenamento em soluções de líquidos iônicos, devem agora ser testadas em sistemas de administração terapêutica de cit c. Importante, a PEGuilação do cit c pode bloquear sua ligação à Apaf-1 e subsequente formação do apoptossomo. Portanto, métodos diretos para a remoção de moléculas de PEG do cit c imediatamente antes da administração ao paciente podem ser necessários. Estratégias semelhantes para a remoção de líquidos iônicos usados no armazenamento do cit c também podem ser necessárias, devido às preocupações de segurança associadas a esses solventes. Se testados com sucesso, essas abordagens devem prolongar a vida útil à temperatura ambiente dos sistemas de administração terapêutica de cit c, tornando-os mais disponíveis para pacientes em instalações clínicas com condições limitadas de refrigeração.
Em conclusão, a quantificação sensível do cit c no soro do paciente surge como um biomarcador de prognóstico não invasivo para avaliar a eficácia da terapia do câncer. Além disso, a administração de cit c às células cancerígenas mostrou um potencial terapêutico promissor. Os sistemas de administração terapêutica de cit c podem se tornar mais amplamente disponíveis se sua estabilidade térmica puder ser estendida.
Interesses Concorrentes
O autor declara que não há interesses concorrentes associados a este estudo.
Financiamento
Este trabalho foi financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), através do COMPETE 2020—Programa Operacional para a Competitividade e Internacionalização e fundos nacionais portugueses via FCT—Fundação para a Ciência e a Tecnologia, no âmbito dos projetos UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020 e LA/P/0058/2020.
Contribuição do Autor CRediT
João Pessoa: Conceitualização, Curadoria de dados, Visualização, Escrita—rascunho original, Escrita—revisão e edição.
Abreviaturas
Apaf-1
fator-1 ativador de protease apoptótica
Cit c
citocromo c
ELISA
ensaio de imunoabsorção enzimática
HER-2
receptor 2 do fator de crescimento epidérmico
PEG
polietilenoglicol
SERS
espalhamento Raman amplificado por superfície
Referências
Sobre citocromo, um pigmento respiratório, comum a animais, leveduras e plantas superiores
Keilin, citocromo e a cadeia respiratória
Citocromo c: surfando fora da membrana mitocondrial no topo dos complexos III e IV
Prevenção da apoptose por Bcl-2: liberação de citocromo c das mitocôndrias bloqueada
A liberação de citocromo c das mitocôndrias: um local primário para a regulação da apoptose por Bcl-2
Bid, Bax e lipídios cooperam para formar aberturas supramoleculares na membrana mitocondrial externa
Apaf-1, uma proteína humana homóloga a CED-4 de C. elegans, participa da ativação dependente de citocromo c da caspase-3
A formação dependente de citocromo c e dATP do complexo Apaf-1/caspase-9 inicia uma cascata de proteases apoptóticas
Caspase-3, -6 e -7 executoras desempenham papéis distintos e não redundantes durante a fase de demolição da apoptose
Inibidores da apoptose: implicações clínicas no câncer
Apoptose: um alvo para terapia anticâncer
Regulação da apoptose na saúde e na doença: o equilíbrio das proteínas da família BCL-2
Citocromo C como potencial marcador clínico para diagnóstico e tratamento de glioma
O citocromo C inibe o crescimento tumoral e prediz prognóstico favorável no carcinoma de células renais de células claras
Citocromo c: usando conhecimento biológico para projetar um biodroga anticâncer otimizado
Dupla face do citocromo c em cânceres por imagem Raman
Citocromo c extracelular como biomarcador para monitorar eficácia terapêutica e prognóstico de pacientes com câncer de pulmão de não pequenas células
O citocromo c sérico indica apoptose in vivo e pode servir como marcador prognóstico durante a terapia do câncer
A liberação extracelular rápida de citocromo c é específica para apoptose e marca a morte celular in vivo
Citocromo c sérico para indicar a extensão da morte celular tumoral em andamento
Detecção de citocromo c sérico usando um biossensor de citocromo c oxidase
Detecção eletroquímica de citocromo c usando nanopartículas de óxido de grafeno como plataforma
Sensor eletroquímico molecularmente impresso para detecção ultrassensível de citocromo c
Ensaio de bio-código baseado em aptâmero para detecção de citocromo-c liberado de células apoptóticas
Um ensaio de bio-código baseado em aptâmero com amplificação por polimerase recombinase isotérmica para detecção de citocromo-c e triagem de fármacos anticâncer
Fabricação de um aptassensor eletroquímico sem marcação para detectar citocromo c no estágio inicial da apoptose celular
Detecção altamente sensível de citocromo c no soro de NSCLC usando um substrato de ouriço-do-mar de ouro em papel hidrofóbico
Um ensaio fluorométrico baseado em aptâmero para citocromo C usando nanofolhas de nitreto de carbono grafítico fluorescente
Pontos quânticos e suas aplicações: o que está por vir?
Pontos quânticos de MXene Ti(3)C(2) protegidos por ε-Poli-L-lisina com alto rendimento quântico para determinação fluorométrica de citocromo c e tripsina
Pontos quânticos de carbono verde co-dopados com nitrogênio e flúor como sonda sem marcação para determinação de citocromo c em soro e detecção de temperatura
Biossensor altamente sensível baseado em IRS para determinação de citocromo c como marcador de câncer usando alumina anódica nanoporosa modificada com tripsina
Ensaio fluorométrico sem marcação para citocromo c em células apoptóticas baseado em pontos quânticos de Ag(2)S no infravermelho próximo
Nanofios de níquel combinados com espectroscopia Raman amplificada por superfície: aplicação na detecção sem marcação de apoptose mediada por citocromo c
Detecção de células apoptóticas em estágio inicial baseada em ensaio de citocromo c sem marcação usando nanoclusters metálicos bioconjugados como sondas fluorescentes
Estruturas metalorgânicas luminescentes do tipo "batata frita" para determinação por fluorescência de citocromo c liberado por células apoptóticas e triagem de atividade de fármacos anticâncer
Nano sorvetes 3D de fosfato de cobalto-níquel funcionalizados com nanopartículas de ouro para fabricar biossensores estáveis e sensíveis para o ensaio de citocromo c
Biossensores eletroquímicos baseados em nanomateriais para citocromo c usando citocromo c redutase
Uma nova estratégia para detecção em tempo real e in situ de citocromo c e caspase-9 em células Hela durante a apoptose
Aptassensor baseado em comutador triplex para detecção de citocromo c por SERS
Compósito de pontos quânticos de CdTe e polímero molecularmente impresso como material sensor para citocromo c
Nanosensores de modo duplo de espalhamento Raman amplificado por superfície e fluorescência para detecção quantitativa de citocromo c em células vivas
Imagem de fluorescência sem marcação de citocromo c em sistemas vivos e triagem de fármacos anticancerígenos com pontos quânticos de carbono dopados com nitrogênio
Monitoramento fluorescente ativado simultaneamente por azoredutase e alvo para liberação de citocromo c sob hipóxia
Nanosensor de CdTe baseado em fluorescência para detecção sensível de citocromo C
Um novo biossensor aptamérico baseado em nanopartículas core@shell de upconversion@polidopamina para biossensoramento e imageamento de citocromo c dentro de células vivas
Fusão da proteína relacionada à apoptose citocromo c com anticorpo de cadeia única anti-HER-2 visa a supressão do câncer de mama HER-2+
Indução de morte celular in vitro em células cancerígenas pela entrega direcionada de citocromo c via um conjugado de transferrina
Uma proteína híbrida de citocromo c-clorotoxina como possível fármaco antiglioma
Entrega intracelular de citocromo c por albumina galactosilada para células de hepatocarcinoma
Nanoveículo de ferritina para entrega direcionada de citocromo C a células cancerígenas
Entrega intracelular de citocromo C usando micelas polipeptídicas responsivas à hipóxia para terapia eficiente do câncer
Nanogéis de ácido hialurônico fotoclicáveis, intrinsecamente fluorescentes e sensíveis a redox para entrega rastreável e direcionada de citocromo c a tumor mamário em camundongos
Nanogéis responsivos a redox à base de poliglicerol sintonizáveis para entrega eficiente de citocromo C
Ativação da apoptose dependente de caspase pela entrega intracelular de nanopartículas baseadas em citocromo c
Otimização e caracterização de nanopartículas proteicas para a entrega direcionada e inteligente de citocromo c ao carcinoma pulmonar de não pequenas células
Nanopartículas de citocromo c reticuladas decoradas com folato para direcionamento ativo do carcinoma pulmonar de não pequenas células (CPNPC)
A entrega intracelular direcionada da proteína citocromo C a tumores usando nanopartículas de lipídio-apolipoproteína
A ação citotóxica do nanocomplexo citocromo c/cardiolipina (Cyt-CL) em células cancerígenas em cultura
Efeito combinado de agentes anticancerígenos e nanopartículas híbridas decoradas com citocromo C para terapia do câncer hepático
Entrega de citocromo c quimicamente glicosilado imobilizado em nanopartículas de sílica mesoporosa induz apoptose em células cancerígenas HeLa
Nanopartículas de sílica mesoporosa com extremidades de citocromo c como veículos de entrega de fármacos responsivos a redox para terapia triplex direcionada a tumor hepático in vitro e in vivo
Nanocompósitos de sílica mesoporosa de poros grandes protegidos por nanopartículas de ouro para a entrega e liberação controlada do citocromo c
Erosão superficial hidrolítica de nanopartículas de sílica mesoporosa para a entrega intracelular eficiente do citocromo c
Nanopartículas teranósticas encapsulando citocromo C: um novo sistema bifuncional para a entrega direcionada de proteínas terapêuticas impermeáveis à membrana a tumores e imagem da terapia do câncer
Insights moleculares sobre a regulação do citocromo c e do nucleotídeo na função do apoptossomo e sua implicação no câncer
Estrutura e dinâmica alteradas de variantes patogênicas do citocromo c correlacionam-se com o aumento da atividade apoptótica
Modificações pós-traducionais do citocromo c na vida celular e na doença
Fosforilação do citocromo c: Controle do fluxo da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e da apoptose
Modificação da serina-47 específica do cérebro do citocromo c regula a atividade da citocromo c oxidase atenuando a produção de ROS e a morte celular: implicações para lesão de isquemia/reperfusão e sinalização de Akt
Regulação da respiração e apoptose pela fosforilação do citocromo c na treonina 58
Base estrutural da disfunção mitocondrial em resposta à fosforilação do citocromo c na tirosina 48
O estresse oxidativo é estritamente regulado pela fosforilação do citocromo c e fatores do respirossomo nas mitocôndrias
Acetilação da lisina 53 do citocromo c no câncer de próstata: metabolismo de Warburg e evasão da apoptose
Nitração específica das tirosinas 46 e 48 faz com que o citocromo c monte um apoptossomo não funcional
A nitração das tirosinas 46 e 48 induz a degradação específica do citocromo c após a mudança do estado do ferro do heme para spin alto
A nitração da tirosina 74 impede que o citocromo c humano desempenhe um papel fundamental na sinalização da apoptose ao bloquear a ativação da caspase-9
Modificação pela homocisteína tiolactona afeta o estado redox do citocromo C
Estado conformacional do citocromo c após N-homocisteinilação: Implicações para a liberação do citocromo c
Regulação da apoptose pelo estado redox do citocromo c
Desequilíbrio redox e alterações bioquímicas no câncer através da análise de citocromos mitocondriais sensíveis ao redox em imagem Raman de ressonância visível sem marcação
Avaliação da qualidade de instalações de armazenamento em cadeia fria para conformidade regulatória e de gestão da qualidade no contexto de um país em desenvolvimento
Citocromo c PEGuilado com lisina com estabilidade de prateleira aprimorada
Estabilidade aprimorada de um biossensor de citocromo c nanoestruturado por PEGuilação
Interação dependente do tamanho entre exclusão de volume e interações suaves: citocromo c em ambiente macromolecular lotado
Interação do polietilenoglicol com o citocromo c investigada via abordagens in vitro e in silico
Mudanças conformacionais no citocromo c direcionadas pelo etilenoglicol acompanhando a formação do complexo: interação preferencial proteína-solvente ou/ e efeito cosmotrópico
Formação do estado de glóbulo fundido no citocromo c de coração de cavalo sob condições fisiológicas: Importância das interações suaves e abordagem espectroscópica em ambiente lotado
Papel dos líquidos iônicos na estabilização de proteínas terapêuticas e proteínas modelo
Líquidos iônicos: uma breve história
Melhora inesperada na estabilidade e utilidade do citocromo c por solução em líquidos iônicos biocompatíveis
Criopreservação de proteínas usando líquidos iônicos: um estudo de caso do citocromo c
Líquidos iônicos à base de aminoácidos para a melhora na estabilidade e atividade do citocromo c: um estudo combinado experimental e de dinâmica molecular
Sobre a estabilidade e dinâmica conformacional do citocromo c em líquidos iônicos de amônio
Mecanismo e dinâmica da estabilidade de longo prazo do citocromo c conferida por líquidos iônicos de imidazólio de cadeia longa em baixa concentração
Empacotamento de proteínas a longo prazo em bio-líquidos iônicos: atividade catalítica melhorada e estabilidade aprimorada do citocromo C contra múltiplos estresses
Aprimoramento e preservação sem precedentes da atividade de peroxidase do citocromo-c empacotado com nanopartículas de ouro modificadas por líquido iônico, compensando estresses de temperatura e tempo
Efeito desestabilizador de sais de cátion imidazólio-ânion Hofmeister no citocromo c
Avaliação de segurança de compostos de polietilenoglicol (PEG) para uso cosmético
Apresentando o B-DNA como agente de aglomeração macromolecular para melhorar a eficácia do citocromo c sob vários estresses
Espectroscopia Raman de ressonância amplificada por superfície e estudo espectroscópico do equilíbrio conformacional induzido por redox do citocromo c adsorvido em eletrodo metálico modificado por DNA
Citocromo c como proteína modelo experimental
Fabricação de nanopartículas de impressão molecular superficial de citocromo C do tipo framboesa baseadas em compósitos de MOF para separação de proteínas de alto desempenho
Um novo compósito de estrutura metal-orgânica baseado em polioxometalato de Anderson-Evans para o isolamento e purificação altamente seletivos do citocromo C de coração suíno
Detecção de citocromo-c: um marcador diagnóstico para infarto do miocárdio
Sintomas de toxicidade e níveis plasmáticos de citocromo c em pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência humana recebendo terapia antirretroviral em Gana: um estudo transversal
Papel do citocromo c como estimulador da agregação de alfa-sinucleína na doença de corpos de Lewy
Expressão do citocromo C e da caspase-9 na doença de Huntington
Apoptose e suas implicações terapêuticas em doenças neurodegenerativas
Duas barreiras hematoencefálicas morfologicamente distintas impedindo a entrada do citocromo c no líquido cefalorraquidiano
Talimogene laherparepvec (T-VEC): uma imunoterapia intralesional do câncer para melanoma avançado
Formação de uma espécie semelhante ao iso-1-citocromo c contendo um grupo heme covalentemente ligado a partir da apoproteína por um sistema livre de células de levedura na presença de hemina