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pmid: "36557884"
title: "Interações Heme-Proteína e Deformações do Heme Funcionalmente Relevantes: O Caso do Citocromo c."
authors: "Schweitzer-Stenner R"
journal: "Molecules (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2022 Dec 09"
doi: "10.3390/molecules27248751"
source: "PMC Full Text"

Interações Heme-Proteína e Deformações do Heme Funcionalmente Relevantes: O Caso do Citocromo c.

Autores

Schweitzer-Stenner R

Periodico

Molecules (Basel, Switzerland) (2022 Dec 09)

Conteudo

Interações Heme–Proteína e Deformações do Heme Relevantes para a Função: O Caso do Citocromo c

Sabe-se que as proteínas heme desempenham uma infinidade de funções biologicamente importantes. Este artigo revisa trabalhos realizados em diversas proteínas citocromo c da classe I ao longo de um período de quase 50 anos. O artigo foca na relevância das interações heme–proteína que reduzem a simetria e que afetam a função da proteína de transferência de elétrons citocromo c. O artigo fornece uma visão geral de vários estudos, em sua maioria espectroscópicos, que exploraram a estrutura eletrônica do grupo heme nessas proteínas e como ela é afetada por deformações que reduzem a simetria. Além de discutir uma grande variedade de estudos espectroscópicos, o artigo apresenta uma base teórica que deve permitir uma compreensão abrangente da físico-química que fundamenta a função não apenas do citocromo c, mas de todas as proteínas heme.

1. Introdução
   A família das proteínas heme desempenha um papel peculiar e muito proeminente entre a multitude de proteínas identificadas e caracterizadas até agora. Elas realizam um conjunto diversificado de funções bioquímicas, como ligação e transferência de ligantes (mioglobina, hemoglobina, citoglobina, neuroglobina), transferência de elétrons (coenzima Q, citocromo c, citocromo c oxidase, centros de reação) e reações enzimáticas de vários tipos (peroxidase de rábano-silvestre, guanilato ciclase, citocromo P450 e peroxidase de lignina como representantes canônicos das peroxidases, ciclases, mono-oxigenases e ligninases). Essas proteínas diferem em termos de composição da estrutura secundária e estruturas terciárias (e às vezes quaternárias) adotadas, mas têm em comum sítios ativos muito semelhantes, nomeadamente porfirinas de ferro, que diferem principalmente em relação aos seus substituintes periféricos. Três exemplos representativos são mostrados na Figura 1. A hemo- e a mioglobina contêm protoporfirina IX (heme b, Figura 1) como sítio ativo que exibe um arranjo assimétrico de grupos metila, ácido propiônico e vinila, cada um dos quais interage não covalentemente com a respectiva porção proteica. Em ambos os casos, o grupo imidazol da chamada histidina proximal coordena-se com o ferro do heme. O sexto sítio de coordenação pode ser ocupado por ligantes externos como O2, CO, NO, OH, CN e H2O, dependendo do estado de oxidação do ferro. Outro representante proeminente da família do grupo heme é o heme c, que pode ser encontrado em todas as proteínas da família altamente diversa do citocromo c (Figura 1). Nessas proteínas, os dois grupos vinila da protoporfirina IX estão covalentemente ligados a cisteínas por meio de pontes tioéter. Na maioria dos casos, as duas cisteínas pertencem a um motivo altamente conservado CxxCH, onde x representa uma variedade de resíduos de aminoácidos. A histidina terminal do motivo coordena-se com o ferro do heme. Em alguns casos, este motivo contém mais de dois resíduos x. Em casos raros, apenas uma única ponte tioéter é formada. Em proteínas citocromo c de classe I, o sexto ligante é fornecido pelo átomo de enxofre de uma cadeia lateral de metionina, e o grupo heme está localizado próximo ao N-terminal. O citocromo c mitocondrial canônico é um membro desta família. As classes de citocromo c diferem em termos de suas estruturas secundárias e terciárias e do número de grupos heme incorporados. O terceiro tipo de grupo heme, mostrado na Figura 1, é o heme a, um grupo funcional em, por exemplo, citocromo c oxidase. Aqui, um dos grupos metila do heme b é oxidado a um grupo formila. Um dos substituintes vinila é substituído por um grupo hidroxietilfarnesila. Existem dois grupos heme a na citocromo c oxidase, denominados heme a e a3. Juntamente com CuB, este último constitui um centro binuclear que catalisa a redução de O2. As coordenadas axiais do heme a na citocromo c oxidase são fornecidas por duas histidinas, enquanto o estado de repouso do heme a3 é pentacoordenado, com uma cadeia lateral de imidazol como ligante axial.
   A função biológica das proteínas está frequentemente ligada a mudanças estruturais. Um exemplo proeminente é a ligação do oxigênio à hemoglobina, que desencadeia uma alteração na estrutura terciária da subunidade respectiva. Isso produz uma incompatibilidade entre as duas estruturas quaternárias que reduz a diferença de energia de Gibbs entre elas. A ligação consecutiva de oxigênio, portanto, produz uma alternância entre um estado T de baixa afinidade e um estado R de alta afinidade. Em comparação, as mudanças estruturais induzidas pela redução/oxidação do ferro heme no citocromo c mitocondrial são moderadas e envolvem principalmente alterações no comprimento da ligação Fe-S(M), ligações de hidrogênio inter-resíduos e orientações da água no bolsão do heme. No entanto, a situação é diferente quando a proteína se liga a superfícies aniônicas, como a membrana interna das mitocôndrias, pois isso causa uma mudança conformacional que envolve a substituição do ligante metionina pela cadeia lateral do imidazol de uma histidina e, assim, uma diminuição significativa no potencial de redução. Nesse estado, a proteína adquire alguma atividade de peroxidase moderada. Pelo contrário, as mudanças estruturais que envolvem interações entre o citocromo c e a citocromo c oxidase e as subsequentes reações redox nesta última são moderadas e bastante limitadas.
   Embora alterações relacionadas à função na estrutura da proteína heme tenham sido o foco das atividades de pesquisa desde que as ferramentas experimentais necessárias se tornaram disponíveis (difração de raios X e, posteriormente, RMN multidimensional, espectroscopia Raman ressonante e dicroísmo circular), as mudanças no macrociclo porfirínico receberam pouca atenção por um período mais longo. Apesar do arranjo assimétrico dos substituintes periféricos e de uma infinidade de contatos heme–proteína, o macrociclo de, por exemplo, hemes b e c era geralmente assumido como sendo planar e exibindo uma simetria D4h. Isso parecia justificável em vista de seu caráter aromático e da suposta falta de interações eletrônicas substituinte–macrociclo. O único desvio da regra era o chamado deslocamento do ferro para fora do plano de grupos heme pentacoordenados, com seu metal no estado reduzido (Fe2+). A ligação de um segundo ligante axial era geralmente assumida como eliminando esse deslocamento. A representação esquemática dessa deformação na Figura 2 mostra que se supunha que ela envolvesse apenas o átomo de metal. No entanto, estruturas de raios X de ambos os estados de oxidação de proteínas do citocromo c mitocondrial e dos dois tipos de subunidades da hemoglobina oxigenada revelam claramente que essa visão é excessivamente simplista. Nesta última, o grupo heme mantém parte da estrutura abobadada que assume no estado ferroso desoxigenado da proteína. Em ambos os estados redox do iso-1-citocromo c da levedura, o grupo heme exibe um alto grau de não planaridade (vide infra). Evidências adicionais de um desvio de uma simetria D4h ideal vêm de dados de ressonância magnética nuclear (RMN) e ressonância paramagnética eletrônica (RPE), que, para o citocromo c, são claramente diagnósticos de uma distribuição de spin altamente assimétrica e deformações rômbicas do campo cristalino do metal. A dispersão Raman ressonante e a espectroscopia de dicroísmo circular visível revelaram claramente a presença de perturbações eletrônicas indutoras de deformação e vibracionais.
   Em um contexto biofísico, surge a questão de saber se essas deformações redutoras de simetria do grupo heme são funcionalmente relevantes.
   Embora várias linhas de evidência apontassem nessa direção para porfirinas modelo em solução, o significado funcional, particularmente o das deformações fora do plano, só foi revelado mais recentemente pelo trabalho de Bren, Walker e seus respectivos associados.
   Esta revisão coloca suas realizações em um contexto mais amplo.
   Por questões de brevidade e legibilidade, focarei no citocromo c, que tem sido um fundamento laboratorial para a pesquisa biofísica desde o trabalho pioneiro de Theorell e Åkesson na década de 1940 do século passado.
   Neste contexto, a revisão focará principalmente nos citocromos de classe I.
   A seguir, a Seção 2 começa com um modelo mecânico-quântico simples que descreve a estrutura eletrônica dos grupos heme na presença de perturbações redutoras de simetria.
   Na Seção 3, os primeiros resultados de EPR são descritos e interpretados em termos da simetria do campo ligante do metal.
   Será mostrado que a EPR é uma ferramenta adequada para investigar as deformações no plano do grupo heme.
   Na Seção 4, a revisão volta-se para a espectroscopia Raman de ressonância e mostra como essa técnica pode ser utilizada para determinar as deformações no plano e fora do plano do grupo heme.
   Na Seção 5, foco no método de decomposição da estrutura de modos normais, por meio do qual Shelnutt e colaboradores obtiveram deformações fora do plano a partir das estruturas cristalinas de proteínas heme (cf. e referências lá citadas).
   A Seção 6 do artigo discute o trabalho de Bren e colegas, que exploraram a relação entre as deformações do heme, os deslocamentos químicos de RMN e os potenciais redox de derivados do citocromo c (cf. e referências citadas lá).
   O Resumo e Perspectivas encerra esta revisão.

2. Perturbações Redutoras de Simetria Induzidas por Proteínas

A seguir, utilizo um macrociclo de porfirina ideal em simetria D4h como sistema de referência.
A forma mais geral da equação de Schrödinger independente do tempo pode ser escrita como: onde o Hamiltoniano contém as energias cinéticas e potenciais eletrônicas e vibracionais.
denota as i-ésimas autofunções, que dependem de um conjunto de coordenadas eletrônicas e nucleares, que denoto coletivamente como r e q.
Estas últimas podem ser identificadas com as coordenadas normais do sistema.

Para uma abordagem de ordem zero, invoco a aproximação de Born–Oppenheimer bruta, que nos permite separar as funções de onda eletrônicas e vibracionais e expressar as primeiras para a geometria de equilíbrio do macrociclo heme.
Portanto, a equação de Schrödinger eletrônica pode ser escrita como: onde q0 representa o conjunto de coordenadas normais no equilíbrio, e o subscrito el indica que apenas contribuições eletrônicas são levadas em consideração.
O modelo clássico de quatro orbitais de Gouterman descreve a estrutura eletrônica do macrociclo da porfirina em termos de dois HOMOs de simetria A1u e A2u (no que se segue, usarei letras maiúsculas para denotar simetrias (representações irredutíveis de grupos de ponto), enquanto letras minúsculas indicam um orbital molecular específico) e um LUMO de simetria Eg (Figura 3). Em um sistema de referência de ordem zero, os dois HOMOs são acidentalmente degenerados, mas a interação configuracional elimina essa degenerescência por uma quantidade substancial. O modelo ignora os orbitais d do átomo de ferro central, que são discutidos principalmente no contexto das teorias de campo cristalino ou de campo ligante. Conforme mostrado na Seção 2, Seção 3 e Seção 4, tal separação é inconsistente com dados de EPR e, particularmente, de RMN. Para formular uma abordagem mais holística, primeiro lembro ao leitor a teoria do campo ligante para simetria de Fe2+ e Fe3+, que é ilustrada na Figura 4. Em um campo ligante octaédrico, os cinco orbitais d, que são degenerados na ausência de desdobramento de campo zero, se dividem em dois grupos de simetria Eg (energia mais alta) e T2g (energia mais baixa). A energia de desdobramento Δ0 depende da força do campo ligante. Se a simetria é reduzida para D4h, ocorre um desdobramento orbital adicional, embora em grau diferente. O orbital eg de maior energia se divide em seus componentes (A1g) e (B1g), enquanto o orbital t2g de menor energia se divide em (, Eg) e (B2g). A hierarquia respectiva depende do campo ligante. A Figura 4 mostra o diagrama de níveis de energia geralmente obtido para campos ligantes em derivados de citocromo c de classe I. O orbital - exibe a energia mais alta. Os orbitais - duplamente degenerados são de energia mais alta que .

Como mostrarei abaixo, os orbitais d do ferro podem se misturar com os orbitais da porfirina na presença das deformações fora do plano desta última. Na simetria D4h assumida até agora, os orbitais eg do macrociclo e do ferro heme podem se misturar. Com relação ao primeiro, os orbitais 3eg ocupados e os orbitais 4eg não ocupados (LUMO) se enquadram nesta categoria. Entre os orbitais d, o par apresenta simetria Eg. Dados de RMN forneceram evidências de alguma mistura de 3eg (Figura 3) e , que produzem densidade de spin nos anéis pirrólicos do macrociclo. Em contraste, as interações entre e o LUMO 4eg são desprezíveis. Com base nessas descobertas, o modelo clássico de quatro orbitais do anel de porfirina deve ser ligeiramente estendido para produzir o seguinte conjunto base de configurações eletrônicas:
Aqui, as notações 3eg − e 3eg + indicam simplesmente uma combinação fora de fase e em fase dos dois orbitais. O sobrescrito na frente do ket indica que todos esses estados são dubletos. Os estados foram numerados de modo a se alinharem com o aumento esperado em suas autoenergias. Estados quadrupletos, que envolvem a transição de um elétron de para ou , podem ter uma energia alta demais para serem termicamente populados à temperatura ambiente.
Deve-se notar que este modelo ainda é um tanto simplista por duas razões. Primeiro, ele ignora a mistura dos orbitais d do metal com os orbitais π dos ligantes axiais. No caso do citocromo c, negligenciamos assim a mistura com os orbitais π da imidazola e o par isolado do enxofre da metionina (vide infra), que pode ter uma influência mensurável nas autoenergias de e . Em segundo lugar, ignora a influência do acoplamento spin-órbita, que mistura os orbitais e . Dentro do conjunto de base definido por…., o Hamiltoniano eletrônico pode ser escrito como segue: onde os elementos diagonais são as autoenergias das funções de onda da Equação (3) na ausência das interações configuracionais (IC) δ. Os diferentes subscritos de δ indicam que a IC pode ser diferente para configurações com diferentes ocupações eletrônicas de 3eg − , 3eg + ou . Devido ao caráter de bloco da matriz Hamiltoniana, a diagonalização é direta e leva ao seguinte novo conjunto de base. Aqui, deve-se atentar para o fato de que os elementos da matriz de interações configuracionais são integrais de dois elétrons. Consequentemente, eles acoplam (a2u,egx) com (a1u,egy), e vice-versa. Com isso em mente, e negligenciando os estados muito elevados –, obtém-se o seguinte novo conjunto de base:
Por uma questão de brevidade, uso apenas os orbitais não totalmente ocupados e excitados na notação para as configurações eletrônicas dos estados considerados. O parâmetro de mistura ν relaciona-se com o elemento de matriz de energia de acoplamento da seguinte forma:
Aparentemente, se E4 = E5 (ou seja, 3a1u e 3a2u são acidentalmente degenerados), νij = π/4. Na literatura, esse estado é frequentemente escolhido como estado de referência. Qualquer levantamento da degenerescência é então atribuído a uma perturbação do tipo A1g.
Os espectros de absorção do citocromo c e de outras proteínas heme (Figura 5) contêm uma banda muito intensa na região entre 410 e 430 nm e uma banda fraca na região de 550 nm. A primeira é chamada de banda Soret ou B, e a segunda é uma superposição das chamadas bandas α e β, que são denominadas Q0 e Qv na literatura espectroscópica. Essas duas bandas são claramente resolvidas no espectro do ferrocitocromo c, mas se fundem em uma única banda óptica larga no espectro da proteína oxidada. No entanto, como mostrado por Dragomir et al., elas ainda são distinguíveis no respectivo espectro de dicroísmo circular. A banda B é geralmente atribuída a uma transição , enquanto a banda Q0 é entendida como resultado de . Ambas as transições são eletricamente permitidas por dipolo (vide infra). A intensidade muito mais fraca da banda Q0 resulta da interação configuracional entre os estados e na Equação (3). A banda Qv resulta do acoplamento vibrônico entre e , que envolve a excitação de estados vibracionais em . A banda B possui uma banda lateral vibracional Bv, que se sobrepõe à banda B0. Ela se origina principalmente de transições do tipo Franck-Condon para o primeiro estado vibracional de modos porfirínicos totalmente simétricos.
Tradicionalmente, no âmbito do modelo de quatro orbitais, as transições eletrônicas e são descritas como A1g(a1u2, a2u2)→Eu(a1u1,eg1,a2u2) e A1g(a1u2, a2u2)→Eu(a1u2,eg1,a2u1). Ambas as transições singleto são electronicamente permitidas. Se, em vez disso, considerarmos a configuração eletrônica estendida acima, o estado fundamental é um dubleto e se transforma da mesma forma que Eg em D4h. A simetria da configuração do estado excitado poderia ser escrita como Eg × Eg = A1u + A2u + B1u + B2u. Como o estado fundamental se transforma da mesma forma que Eg, o momento de dipolo da transição eletrônica tem simetria Eu, como no caso do modelo de quatro orbitais.

Agora, considero um cenário mais realista, onde um termo de perturbação eletrônica é adicionado à equação de Schrödinger 2, que agora é escrita como: onde Γ denota a simetria de uma representação irredutível em D4h. Assim, assume-se que o potencial perturbador pode ser decomposto nas simetrias deste grupo pontual. A representação matricial do Hamiltoniano é a seguinte:
Aparentemente, a matriz do Hamiltoniano contém apenas perturbações de simetria gerade, que levam à deformação no plano do macrociclo heme. Devido à mistura dos orbitais 3eg da porfirina com o orbital triplamente ocupado , a configuração do estado fundamental eletrônico exibe simetria Eg, que é típica de muitos sistemas férricos de baixo spin. Isso permite que os elementos de matriz de contenham elementos de matriz não nulos no estado fundamental. Isso será relevante para a discussão dos resultados de EPR no citocromo oxidado.

Os elementos de matriz de dos estados excitados merecem alguns comentários adicionais. O modelo de quatro orbitais dita que as perturbações eletrônicas de simetria A1g, B1g, B2g e A2g podem misturar os estados Q e B, já que Eu × Eu = A1g + B1g + B2g + A2g. Enquanto deformações B1g e B2g podem produzir acoplamento intraestado (entre os dois estados Q e os dois estados B, respectivamente) e acoplamento interestado (entre os estados Q e B), perturbações A2g misturam apenas os estados Q e B. Este esquema parece se tornar inválido para este conjunto de base, descrito na Equação (5), uma vez que a configuração do estado excitado não mais se transforma na forma de Eu. No entanto, se considerarmos apenas as perturbações que afetam a estrutura eletrônica do macrociclo, os elementos de matriz de podem ser simplificados da seguinte forma. Em um primeiro passo, as expressões para Q e B podem ser reescritas como se segue:
Agora, os elementos de matriz de têm as formas: onde representam as quatro configurações eletrônicas canônicas do modelo de quatro orbitais na ausência de deformações do tipo A1g. Este estado é geralmente caracterizado como mistura 50:50. Os subscritos i e j representam x e y. A função orbital mista heme-ferro não aparece na Equação (10) devido à sua ortonormalidade.
Se a perturbação eletrônica também afetar o orbital porfirina-ferro, pode-se proceder da seguinte forma. As autofunções do Hamiltoniano na Equação (8) podem ser obtidas diagonalizando os dois blocos formados pelos estados do subespaço e , respectivamente. Alternativamente, se o acoplamento entre estados for fraco, pode-se diagonalizar blocos bidimensionais formados pelos estados degenerados e tratar o restante da matriz Hamiltoniana com a teoria de perturbação de Rayleigh–Schrödinger. Para ambos os procedimentos, assume-se que as perturbações consideradas afetam apenas os quatro orbitais da porfirina na configuração de estado excitado (cf. Equações (9) e (10)). Em seguida, considera-se o subconjunto de estado excitado das autofunções obtidas, que agora são aumentadas pelo orbital porfirina-ferro previamente excluído. onde αQQ,ij (i,j=x,y) são os autovetores dos novos autoestados. A Equação (11) reflete o fato de que, na simetria D4h, o orbital 3eg + e os quatro estados eletrônicos excitados da porfirina compartilham o mesmo sistema de coordenadas, com x e y ao longo das ligações Fe-N e z perpendicular ao plano do heme. Algumas das perturbações de redução de simetria consideradas na Equação (9) (isto é, aquelas de simetria B2g e A2g) causam uma rotação do sistema de coordenadas. Omito a multiplicidade na Equação (11), pois a configuração eletrônica exata depende da hierarquia dos dois orbitais dπ + 3eg.

Consideremos agora as contribuições para VΓ, que afetam apenas o orbital . Neste caso, é suficiente considerar o seguinte conjunto de base bidimensional:
Observe que a Equação (12) é formulada para o sistema de coordenadas da porfirina não perturbada. A matriz do Hamiltoniano que leva em conta o potencial perturbador pode, portanto, ser escrita como:
Discutirei a relevância do formalismo acima quando apresentar os dados de EPR, dicroísmo circular de RMN e ressonância Raman abaixo. Aqui, indico apenas que perturbações do tipo B1g dividem tanto a transição da banda Q quanto a da banda B. Perturbações A2g e B2g podem fazer o mesmo se ocorrerem juntas. Além disso, perturbações B1g eliminam a degenerescência de e .

Até agora, discuti exclusivamente como um potencial assimétrico, produzido por ligantes e pelo ambiente proteico, pode afetar a estrutura eletrônica de todo o grupo heme. Como Zgierski e Pawlikowski apontaram há quase 40 anos, perturbações eletrônicas devem ser distinguidas de perturbações vibrônicas, que serão discutidas em mais detalhes abaixo. Elas devem ser ainda distinguidas de deformações de redução de simetria do grupo heme, que serão brevemente discutidas abaixo.
A discussão atual sobre deformações do heme (porfirina) baseia-se no conceito fundamentado em modos normais desenvolvido por Shelnutt, Jentzen e colaboradores há quase 25 anos. É chamado de decomposição estrutural de coordenadas normais (NCD). Esses autores focaram principalmente em deformações fora do plano, mas, claramente, é igualmente adequado para deformações no plano. Uma abordagem semelhante foi introduzida anteriormente por Schweitzer-Stenner, Dreybrodt e seus colegas associados para a interpretação da dispersão da razão de despolarização de bandas Raman de ressonância (vide infra). Até que o trabalho de Shelnutt e Jentzen aparecesse, esses autores focavam inteiramente em deformações no plano.

A abordagem NCD baseia-se na suposição de que qualquer deformação do grupo heme que não seja excessivamente grande pode ser entendida como uma combinação linear de deformações ao longo de coordenadas normais: onde i denota a coordenada normal considerada, e Γ é a representação irredutível em uma simetria D4h ideal. Um macrociclo de porfirina de 24 átomos possui 21 modos fora do plano e 45 modos no plano. As simetrias dos primeiros são A1u, B1u, B2u, A2u e Eg, enquanto os modos no plano podem ser classificados em termos de A1g, B1g, B2g, A2g e Eu. À primeira vista, o grande número de coordenadas normais pode desencorajar uma decomposição baseada na Equação (14) devido ao grande número de opções que se espera que um conjunto de base tão grande ofereça. No entanto, um olhar mais atento à origem dessas distorções revela que as opções são bastante restritas. Uma distorção ao longo das coordenadas normais de uma dada simetria no estado eletrônico fundamental pode ser calculada da seguinte forma:

O denominador contém o valor esperado do operador de acoplamento vibroeletrônico para o k-ésimo modo de simetria Γ em D4h e número de onda no estado eletrônico fundamental |g>. A Equação (15) revela que o deslocamento individual ao longo de um dado modo normal escala com o inverso do quadrado de seu número de onda no estado fundamental. Portanto, apenas modos de baixo número de onda contribuem significativamente para as deformações do macrociclo de uma dada simetria. Com relação aos modos fora do plano, considerar a vibração de menor número de onda de uma representação geralmente é suficiente para descrever a deformação do heme (porfirina).

No âmbito do modelo canônico de quatro orbitais, o estado fundamental se transforma na forma de A1g. No entanto, a mistura dos orbitais dxz/dyz com 3eg produz um estado fundamental de simetria Eg. Na simetria D4h, os modos B1g e B2g podem induzir acoplamento do tipo Jahn–Teller (JT) que produz distorções Jahn–Teller da mesma simetria. Aparentemente, modos A1g também podem produzir distorções, mas obviamente eles não alterariam a simetria do macrociclo.

Aparentemente, o acoplamento JT no estado eletrônico fundamental deve envolver predominantemente vibrações do heme com amplitude nos nitrogênios dos pirróis (modos no plano não envolvem o metal). Conforme mostrado abaixo, os modos de baixo número de onda dos modos A1g, B1g e B2g atendem a esse requisito.
As considerações acima se aplicam à primeira parte do Hamiltoniano eletrônico (i.e., ) descrita na Equação (8), que se transforma como A1g em D4h. Portanto, a simetria das vibrações determina a simetria do operador de acoplamento vibônico. No entanto, se considerarmos o segundo termo na Equação (8), os elementos de matriz correspondentes são:
Em termos de teoria de grupos, todas as combinações de Γ e Γ' para as quais a representação produto é gerade são permitidas. Isso inclui a combinação Γ=Γ' = Eu. Seguindo Ziergski e Pawlikowski, denomino a derivada na Equação (16) como perturbação vibônica. Na presença de perturbações eletrônicas fora do plano (Γ = A1u, B1u, B2u, A2u e Eg), todos os modos fora do plano podem, em princípio, contribuir para o elemento de matriz na Equação (16). As respectivas deformações escalam, novamente, com o inverso do quadrado de seu número de onda no estado fundamental eletrônico, de modo que apenas modos de baixo número de onda podem ser esperados contribuir significativamente para a deformação total do grupo heme.

A Figura 6 exibe as deformações associadas aos modos de menor número de onda das simetrias A1g, B1g, B2g, Eu, A1u, A2u, B1u, B2u e Eg. Desconsidero o respectivo modo A2g devido ao seu número de onda relativamente alto. Sigo Jentzen et al. usando a seguinte terminologia para essas deformações: respiração (A1g), estiramento (B2g), translação (Eu), hélice (A1u), domo (A2u), sela (B2u), franzido (B1u) e ondulação (Eg). Para B1g, prefiro o termo rômbica de modo a conectá-lo à interpretação dos resultados de RPE (vide infra).

3. RPE em Ferricitocromo c
   Ao longo dos últimos 60 anos, um grande número de artigos relatou resultados de medições de RPE de proteínas heme, em geral, e derivados do citocromo c, em particular. Este não é o lugar para uma revisão abrangente dessa vasta quantidade de literatura. Aqui, concentro-me em alguns artigos representativos que elucidam as deformações do campo ligante do metal nos derivados do citocromo c.
   Começo com o estudo clássico de Salmeen e Palmer sobre o ferricitocromo c do coração bovino. Como tanto o estado reduzido quanto o oxidado do metal são de baixo spin, apenas o último possui um elétron desemparelhado e pode ser investigado por RPE. Os autores mediram o espectro de RPE a 20 K com a frequência da banda X. Suas medições revelaram três valores diferentes para os elementos do tensor g diagonal, a saber, 1,24, 2,24 e 3,06. A anisotropia indicada sugere fortemente que a influência das deformações axial e rômbica não apenas divide o estado 2T2g de baixa energia (t2g5) da simetria octaédrica em três dupletos de Kramers. Em uma primeira etapa, os autores propuseram um esquema de energia no qual distorções axiais reduzem a simetria para D4h (ou C4h, se os dois ligantes são diferentes) e dividem os orbitais t2g (Figura 4). Salmeen e Palmer deduziram de seus dados um orbital dxy (B2g) de maior energia e um conjunto duplamente degenerado de orbitais dxz e dyz de menor energia, o que produziria um estado fundamental 2B2g. No entanto, ao final de seu artigo, eles revisaram sua hierarquia energética à luz dos resultados dos cálculos semiempíricos de Zerner et al., que colocam os dois orbitais dπ acima do dxy para produzir um estado fundamental 2Eg (vide supra), como mostrado na Figura 4. Além das distorções axial e rômbica, os autores consideraram o acoplamento spin-órbita dos três orbitais ocupados, o que, até certo ponto, lhes permitiu reproduzir teoricamente os valores experimentais do tensor g.
   Em um estudo posterior, Brautigan et al. mostraram que os valores do tensor g são indicativos de deformações rômbicas no citocromo c oxidado de coração de cavalo e iso-1 de levedura. O objetivo principal de seu estudo foi a avaliação do campo cristalino em função do pH. No estado oxidado, o citocromo c pode adotar cinco a seis conformações diferentes se o pH for alterado entre 1 e 12. Como essas mudanças estão associadas a alterações no sexto ligante axial (M80), os valores g dessas conformações são substancialmente diferentes.
   Passo agora a um estudo mais recente de Andersson e colaboradores, que utilizaram EPR para investigar o ambiente do ferro heme no citocromo c de Pseudimonas aeruginosa (Pa c551) e Nitrosomonas europaea (Ne c552), que são ambas proteínas citocromo c de classe I. Além dos respectivos tipos selvagens, diversos mutantes foram investigados, os quais se esperava que afetassem o ligante metionina do grupo heme. As duas proteínas são monoméricas, com alto teor de hélice e potenciais de redução positivos (Figura 7). Pa c551 doa elétrons para o citocromo cd1 na respiração de nitrito e nitrato, tornando sua função análoga à do citocromo c mitocondrial discutido até agora. Ne c552 é um doador de elétrons para a citocromo oxidase e uma peroxidase di-heme, enquanto recebe elétrons do citocromo c554 tetra-heme. Os estudos mutantes visaram explorar a influência de N64 e seus vizinhos em Pa c551. Ambas as proteínas diferem em relação à sua respectiva posição 50, ou seja, G em Ne c-552 e N em Pa c552. A mutação dos autores substituiu o G por um N na primeira e o N por um G na segunda.
   Os espectros de EPR desses citocromos (Figura 8) têm em comum que todos indicam três valores-g diagnósticos de um ambiente metálico sujeito a deformações rômbicas. A Figura 4 representa o esquema energético de acordo com o qual os dados foram interpretados. Ela ilustra a redução da simetria de octaédrica para tetragonal e depois para rômbica (D4h). A deformação axial no campo tetragonal divide o orbital t2g de menor energia nos orbitais dxz/dyz de maior energia e no orbital dxy de menor energia, por uma energia Δ. Com relação à deformação rômbica que elimina a degenerescência entre dyz e dxz (energia de interação V), os autores seguiram Walker ao distinguir dois tipos de complexos heme–ligante. Espectros com um sinal gmax grande (tipo I) são diagnósticos de hemes de baixo spin altamente anisotrópicos (HALS: highly axial low-spin). O tipo II representa valores de gmax abaixo de 3,2, uma pequena anisotropia e uma deformação rômbica mais significativa (cf. os valores V/Δ na Figura 4). O valor V/Δ derivado dos valores-g de Pa c-551 é 0,37, o que o coloca mais próximo do tipo II do que do tipo I. Para o respectivo mutante N64V, a razão é 0,55, que está mais próxima do domínio do tipo II, indicando assim um campo rômbico mais forte. N interage com o ligante metionina 61. Essa interação é abolida no mutante. Ne c-552 tem um valor V/Δ de 0,24, o que o atribui ao tipo I. A deleção de N64 aumenta significativamente essa razão para 0,5, movendo-a para mais perto do tipo II. Curiosamente, uma substituição da valina adjacente não causa alterações significativas na razão energética. Esses valores devem ser comparados com a razão de 0,58 obtida para o citocromo c de coração de cavalo, o que o torna uma proteína claramente do tipo II com forte deformação rômbica. Uma substituição G50N com deleção V65 para Ne c-552 mantém a proteína no domínio do tipo I (V/Δ = 0,23). Uma substituição N50G combinada com uma inserção V65 também é inconsequente em relação ao valor V/Δ. Curiosamente, os autores não conseguiram obter nenhuma correlação entre as alterações em V/Δ e a orientação de M61.
   Um estudo subsequente desse grupo de mutações do citocromo c552 de Hydrogenhobacter thermophilus e do c551 de Pseudomonas aeruginosa teve como objetivo explorar a influência de mutações na respectiva região CxxCH no espectro de EPR. Sabia-se que essas mutações alteravam a deformação de ondulação do heme. Os resultados não revelaram nenhuma correlação clara entre ondulação e V/Δ. Verificou-se que os tipos selvagens e seus mutantes estavam todos mais próximos da região do tipo I, com variações mínimas em seu valor.
   Em conjunto, todos os estudos de EPR discutidos acima são indicativos de um ambiente hêmico rômbico. O caráter de baixo spin da configuração eletrônica coloca o elétron desemparelhado no orbital dπ de maior energia, que, de acordo com Zoppellaro et al., é dyz. Conforme discutido abaixo, deformações de enrugamento causam um deslocamento para cima do dxy, mas em citocromos classe I, essa mudança não faz com que ele se torne o orbital de maior energia. Somente na presença de ligantes muito fortes aceptores de elétrons π o orbital dxy pode ser desestabilizado a tal ponto. Embora a rombicidade de complexos férricos de baixo spin tenha sido bem estabelecida por múltiplos experimentos de EPR, sua origem e influências nas propriedades funcionais (ligação de ligantes, transferência de elétrons) raramente são discutidas na literatura. Conforme apontado por Walker, a simetria do heme depende da orientação dos dois ligantes axiais (Figura 9). Se ambos são planares e orientados paralelamente um ao outro, a simetria efetiva é D2h. Se eles são perpendiculares um ao outro, a simetria é D2d. A cadeia lateral da metionina não é verdadeiramente planar, mas sua ligação SH se alinha com uma das linhas Fe-N tanto na configuração R quanto na S (Figura 9). Isso corresponderia a uma simetria D2d. O último caso de redução de simetria envolve uma perturbação da simetria B1u, que elimina o centro de inversão e corresponde a uma deformação de enrugamento. Isso não causaria o ambiente rômbico do ferro do heme. Um candidato muito melhor é o acoplamento JT estático (vide infra). O principal candidato é o modo de baixo número de onda ν24 de simetria B1g (Figura 6), que foi encontrado a 228 cm−1 no espectro Raman de ressonância da ferri-citocromo c de coração de cavalo. Este modo envolve vibrações de estiramento fora de fase da ligação N-Cα, com amplitudes significativas dos quatro nitrogênios (Figura 6). Este modo seria ideal para levantar a degenerescência dos orbitais mistos (3eg − dπ) e (dπ − 3eg). Causaria uma deformação rômbica ao longo da coordenada normal de ν24 e produziria um campo ligante que possui uma componente B1g. Este efeito de redução de simetria estaria presente mesmo se não houvesse outras perturbações do heme induzidas pela proteína. Este obviamente não é o caso. Em princípio, a projeção do ligante metionina tanto na R quanto na S sobre o heme (Figura 10) reduz sua simetria para Cs por meio de perturbações B1g e Eu. Conforme mostrado abaixo, as duas pontes tioéter do heme c são instrumentais para impor uma deformação de enrugamento ao grupo heme, mas é provável que também produzam deformações no plano (vide infra).

4. Espectroscopia de Absorção, Dicroísmo Circular e Raman de Ressonância
   Os espectros de Raman ressonante, absorção e dicroísmo circular dos cromóforos estão inter-relacionados, uma vez que os processos físicos subjacentes envolvem todos o acoplamento vibriônico, ou seja, a mudança no hamiltoniano eletrônico pelas vibrações nucleares ao longo de coordenadas normais. Para as porfirinas, isso leva a uma ruptura da aproximação de Born–Oppenheimer, que afeta particularmente o espalhamento Raman ressonante na região da banda Q devido a complexos efeitos de mistura multimodo. A teoria canônica adiabática de Albrecht do espalhamento Raman ressonante, embora amplamente popular, não explica adequadamente os perfis de excitação ressonante na região da banda Q.

Descrições teóricas detalhadas da relação entre absorção, dicroísmo circular e espalhamento Raman ressonante foram fornecidas em artigos de revisão anteriores, aos quais o leitor interessado é aqui remetido. Aqui, limito-me a uma discussão mais qualitativa. Conforme mencionado anteriormente, os espectros de absorção óptica de ambos os estados redox do citocromo c mitocondrial podem ser entendidos em termos de transições eletrônicas do estado fundamental para os estados eletrônicos excitados de Q e B (Equações (6) e (10)). A transição do estado Q de menor energia é muito menos intensa devido ao empréstimo de intensidade do estado B da transição do estado Q por uma interação de configuração. Se os dois orbitais do estado fundamental 3a1u e 3a2u fossem acidentalmente degenerados, a força do oscilador efetiva da banda Q seria zero ou muito fraca. Sua absortividade molar integrada aparente é uma medida de desmistura, onde o parâmetro ν na Equação (10) se afasta de π/4. Para o ferrocitocromo c, é aproximadamente 0,13. A chamada banda Qv, que é claramente resolvida no lado de alta energia da banda Q0 no espectro do ferrocitocromo c, deriva predominantemente do acoplamento vibriônico entre os estados Q e B. Em primeira ordem, isso pode ser explicado pela teoria de perturbação de Rayleigh–Schrödinger independente do tempo, que leva a:

Esta é a chamada expansão de Herzberg-Teller. Ela descreve a mistura do primeiro estado excitado da k-ésima vibração nos estados Q excitados com o respectivo estado vibracional fundamental dos estados eletrônicos B excitados. Os subscritos i e j representam x e y. EBi e EQj são as autoenergias dos estados Bi e Qj na unidade de cm−1 na ausência de acoplamento vibriônico. O operador de acoplamento vibriônico já foi introduzido na Equação (15). é o número de onda do k-ésimo modo vibracional no estado Q excitado, que geralmente não é idêntico ao número de onda no estado eletrônico fundamental. Os números 1 e 0 nos bras denotam números quânticos vibracionais. Deve-se notar que, por uma questão de brevidade, o acoplamento com os estados B vibracionais mais elevados foi omitido na Equação (17).
Acoplamento de Herzberg–Teller, conforme descrito na Equação (17), transfere força do oscilador da transição para a transição , que, apesar da grande diferença de energia entre os estados Q e B, torna-se significativa devido à grande força do oscilador subjacente à transição da banda B. Na simetria D4h, todos os modos no plano, exceto os modos Eu, podem contribuir para a banda lateral vibronica da transição Q. Como mostrado por Levantino et al., as contribuições dominantes surgem de modos do tipo A2g de alto número de onda devido à sua grande força de acoplamento vibronico.

Em princípio, o acoplamento de Herzberg–Teller também contribui para as transições para os estados , mas o empréstimo de intensidade de é insignificante devido à fraca força do oscilador das transições da banda Q. A banda lateral vibronica (não espectroscopicamente) resolvida da transição da banda B é governada pelo acoplamento Franck–Condon intraestado e, em menor grau, pelo acoplamento Jahn–Teller. Enquanto o primeiro requer simetria A1g em D4h, o último envolve modos de simetria B1g e B2g. Se o deslocamento do estado B ao longo dos respectivos modos normais for pequeno (como é o caso de grandes sistemas de anéis aromáticos), pode-se novamente empregar a teoria de perturbação de Raleigh–Schrödinger para obter:

Esta abordagem segue Garozzo e Galluzi por manter a função vibracional do estado fundamental e tratar o deslocamento do estado excitado ao longo da coordenada qk como acoplamento intraestado entre componentes do estado B. Conforme mostrado anteriormente, os modos A1g, B1g e B2g podem contribuir para o elemento de matriz de acoplamento vibronico na Equação (18). Para A1g, trata-se de acoplamento do tipo Franck–Condon, enquanto os modos B1g e B2g produzem acoplamento Jahn–Teller. Uma abordagem semelhante pode ser usada para a banda Q. No entanto, devido ao momento de dipolo de transição fraco da transição correspondente, as respectivas contribuições para a banda Qv são fracas. A situação é bastante diferente para o espalhamento Raman de ressonância na região da banda Q (vide infra).
Como as perturbações que reduzem a simetria afetam o espectro de absorção? Devido à grande largura das bandas espectroscópicas, a resolução espectral é baixa, o que dificulta a identificação dessas perturbações. Para o ferrocitocromo c, esse problema pode ser contornado medindo-se a absorção da banda Q em baixas temperaturas (10 K) em misturas de glicerol/água. Os espectros correspondentes do citocromo c de coração de cavalo e de levedura são mostrados na Figura 10. A banda Q0 do citocromo c de coração de cavalo está visivelmente dividida. Diferentes contribuições vibrônicas (Equação (17)) para a banda Qv são assim resolvidas, e componentes identificáveis podem ser reproduzidos por dupletos de bandas Voigtianas. A divisão é menos pronunciada para o citocromo c de levedura, mas sua existência ainda pode ser inferida a partir da forma assimétrica da banda Q0 (Figura 10, painel inferior). A análise espectral de Levantino et al. resultou em divisões da banda Q0 de 116 e 77 cm⁻¹ para o citocromo c de coração de cavalo e de levedura, respectivamente. Medições anteriores da divisão da banda Q resultaram em valores entre 100 e 120 cm⁻¹ para outros derivados reduzidos do citocromo c mitocondrial (atum, frango, bovino, suíno). Essa divisão é claramente diagnóstica da remoção da degenerescência de Q0x e Q0y. A assimetria do perfil da banda reflete os diferentes momentos de dipolo de transição dos dois componentes.

Em um estudo anterior, Manas et al. atribuíram a divisão à influência do campo elétrico (bastante forte) que a proteína e os substituintes periféricos produzem no plano do heme. O efeito de primeira ordem de um campo elétrico cujo vetor não coincide exatamente com uma linha Cm-Fe-Cm causa diferentes deslocamentos para o azul das autoenergias de Qx0 e Qy0 por meio de um efeito Stark quadrático e, assim, a remoção da degenerescência x,y. No entanto, embora esse efeito seja significativo para o estado B (vide infra), devido ao grande momento de dipolo de transição, ele é insuficiente para reproduzir a divisão da banda Q. Com base em cálculos eletrostáticos, Manas et al. sugeriram que a divisão é causada, em vez disso, pelo momento quadrupolar do campo elétrico. Como argumentado por Levantino et al., o elemento de matriz de acoplamento responsável por tal efeito pode ser descrito como o acoplamento eletrônico intraestado do tipo , onde é um potencial de perturbação eletrônica do tipo introduzido na Equação (7). Embora esse tipo de perturbação eletrônica possa dividir o estado Q, ele não explica os diferentes momentos de dipolo de transição de e . Para chegar a uma descrição consistente da divisão e assimetria da banda, Levantino et al. consideraram o acoplamento interestadual na presença de perturbações assimétricas. Isso os levou ao seguinte conjunto de equações para as autoenergias em segunda ordem:
As equações (19) e (20) implicam que a divisão da banda Q requer a presença simultânea de perturbações A1g e B1g e/ou A2g e B2g. No âmbito do modelo de quatro orbitais, o acoplamento eletrônico intraestado e interestado não são independentes (cf. Equação (10)).

Levantino et al. descobriram que, para o citocromo c de coração de cavalo, o valor que emergiu de sua análise do perfil da banda Q estava muito próximo daquele derivado de uma estimativa do acoplamento quadrupolar por Manas et al. Isso os levou à conclusão de que a divisão da banda Q realmente resulta predominantemente do momento quadrupolar do campo elétrico no plano do heme, que eles estimaram ser predominantemente produzido pelas cargas nos dois ligantes e nos substituintes do ácido propiônico.

Além das contribuições eletrônicas descritas acima, uma reprodução quantitativa dos perfis da banda Q na Figura 10 requer a consideração de perturbações vibriônicas, que são brevemente descritas a seguir. Conforme mostrado por Zgierski e colegas, as perturbações vibriônicas podem ser contabilizadas usando o Hamiltoniano na Equação (7) para o operador de acoplamento vibriônico:

Enquanto o primeiro termo do lado direito se transforma como a representação de qk, o segundo termo (perturbação vibriônica) se transforma como o produto Γk × Γ. Portanto, a simetria dos operadores de acoplamento vibriônico é lida como uma soma de representações de simetria D4h. Para ilustrar o significado das perturbações vibriônicas, consideremos um modo B1g. Isso poderia contribuir para o acoplamento Jahn–Teller entre os estados Q e B, respectivamente. Seria contabilizado pelo elemento de matriz na Equação (18), que se transformaria à maneira de B1g. Na presença de perturbações do tipo B1g (vide supra), a simetria B1g × B1g = A1g seria misturada com o operador de acoplamento, o que adicionaria atividade Franck–Condon ao modo considerado qk.
A importância das perturbações vibracionais pode ser melhor ilustrada por uma análise mais detalhada dos espectros de dicroísmo circular na região do visível. A Figura 11 (esquerda) mostra os espectros de CD e absorção do citocromo c oxidado de coração de cavalo na região da banda B (banda de Soret). O perfil de CD pode ser descrito como um dubleto negativo. No contexto do modelo de quatro orbitais, sua própria existência é indicativa de uma separação entre Bx e By, com forças rotacionais opostas das respectivas transições eletrônicas. Os espectros correspondentes dos citocromos reduzidos são ligeiramente mais complexos (Figura 11, direita). Schweitzer-Stenner utilizou um modelo de acoplamento vibracional para reproduzir a forma de três dubletos e as correspondentes bandas de absorção representadas para três diferentes citocromos c mitocondriais. O autor descobriu que, enquanto a contribuição das perturbações vibracionais para a separação da banda B é pequena (41 cm⁻¹ adicionados a 505 cm⁻¹ para coração de cavalo e vaca, e 12 cm⁻¹ a 380 cm⁻¹ para levedura), a situação é bastante diferente para o ferricitocromo c, onde as perturbações vibracionais adicionam 390 cm⁻¹ a 126 cm⁻¹ para coração de cavalo, 127 cm⁻¹ a 186 cm⁻¹ para vaca e 25 cm⁻¹ a 217 cm⁻¹ para levedura. Enquanto Bx se encontra em energias mais baixas que By nas proteínas oxidadas, no ferrocitocromo c ela está em energias mais altas. As perturbações vibracionais têm uma influência ainda mais pronunciada nas bandas laterais vibracionais de Bx e By. A razão subjacente se reflete nos elementos da matriz de acoplamento vibracional: onde perturbações vibracionais do tipo B1g adicionam força de acoplamento a uma banda lateral e a reduzem para a outra. Como consequência, as bandas laterais vibracionais de Bx e By podem parecer bastante diferentes na presença das perturbações B1g do grupo heme. Deve-se notar, neste contexto, que essa influência das perturbações vibracionais na forma das bandas de absorção foi discutida há mais de 30 anos por Bersuker e Stavrov. Sua contribuição foi, em sua maioria, ignorada na literatura sobre porfirinas/proteínas heme. Mais recentemente, Schweitzer-Stenner et al. invocaram o esquema de acoplamento vibracional acima para explicar a dispersão da razão de absorção polarizada observada para os monocristais de cianeto de mioglobina por Eaton e Hochstrasser.
Encerro este capítulo com uma discussão sobre como perturbações eletrônicas e vibriônicas afetam o espalhamento Raman ressonante. Como mencionado anteriormente, a absorção e o espalhamento Raman ressonante estão inter-relacionados, uma vez que os modos ativos de Franck–Condon, Jahn–Teller e Herzberg–Teller também são ativos no Raman ressonante. No nível mais elementar, isso pode ser explicado inserindo a expansão nas Equações (17) e (18) na equação de Kramers–Heisenberg–Dirac. O leitor interessado pode inferir detalhes em artigos de revisão anteriores. Em uma simetria D4h ideal, os modos A1g, B1g, B2g e A2g são ativos no Raman ressonante. Enquanto bandas atribuíveis aos modos A1g dominam espectros obtidos com excitação na banda B, modos não simétricos e antissimétricos dominam espectros obtidos na região da banda Q. Na simetria D4h, esses modos podem ser identificados por suas razões de despolarização, ou seja, 0,125 para modos A1g, 0,75 para B1g e B2g e infinita para modos A2g, independentemente do comprimento de onda de excitação. Os valores experimentais foram de fato encontrados próximos a esses valores esperados para a porfina de Ni(II). A situação é completamente diferente para o citocromo c. A Figura 12 mostra a razão de despolarização e a intensidade de espalhamento normalizada do modo ν4 do ferrocitocromo c de coração de cavalo em função do número de onda de excitação. Enquanto o valor de 0,14 na região de pré-ressonância da banda B está próximo do valor D4h, ele aumenta em direção à região da banda Q para valores bastante elevados de cerca de 20. Em outras palavras, a banda torna-se inversamente polarizada entre as posições Q0 e Q1 correspondentes, onde os dados exibem mínimos locais. As linhas sólidas nas duas figuras resultam de um ajuste autoconsistente, descrito em detalhes em. A dispersão da despolarização só pôde ser reproduzida por uma mistura de acoplamento vibriônico de simetria A1g, B1g e A2g. Schweitzer-Stenner et al. interpretaram o resultado como indicativo de perturbações vibriônicas redutoras de simetria de simetria B1g e A2g. Uma análise da razão de despolarização e dos perfis de excitação de outros modos ativos no Raman levou a uma conclusão semelhante. A validade desses dados foi questionada por Hu et al. com base em uma comparação dos espectros Raman polarizados de hemes isotopicamente substituídos em ferrocitocromo c. Os espectros foram medidos em temperaturas criogênicas. Os autores alegaram que os desvios relatados das razões de despolarização em relação aos valores esperados para D4h refletem exclusivamente a sobreposição das bandas originadas do macrociclo e dos substituintes periféricos. Em resposta a Hu et al., Schweitzer-Stenner realizou uma análise espectral mais detalhada dos espectros de ferrocitocromo, que reproduziu a dispersão de despolarização do ν4 relatada anteriormente.
Diferentemente do caso do citocromo c oxidado, não pode haver qualquer distorção induzida por JT no estado reduzido devido ao estado eletrônico fundamental do tipo 1A1g. No entanto, a ocorrência de deformação B1g pode ser facilmente compreendida como sendo causada pelos dois ligantes axiais (vide supra). Enquanto a razão de despolarização de ν4 revela claramente uma contribuição antissimétrica ao seu tensor Raman, é improvável que as deformações de simetria A2g por uma perturbação vibroônica da mesma simetria sejam dominantes devido ao número de onda comparativamente alto do modo A2g mais baixo (243 cm−1, comparado com 168 cm−1 (B1g) e 144 cm−1 (B2g) para Ni(II)-octaetilporfirina). Uma interpretação muito mais sensata pode ser fornecida se invocarmos uma combinação de deformações fora do plano com base no raciocínio da teoria de grupos abaixo. Para isso, reescrevo a Equação (21) da seguinte forma: onde o segundo termo na Equação (21) é substituído por uma expansão de Taylor de segunda ordem do operador de acoplamento vibroônico em relação às deformações das coordenadas normais δQ. A segunda derivada da expansão se transforma na forma da representação produto Γk × Γl. Ela leva em conta a contribuição de todas as deformações no plano para o operador de acoplamento vibroônico. A terceira derivada se transforma na forma da representação tripla produto Γk × Γl × Γm′. Ela pode ser usada para descrever a influência da combinação de duas deformações fora do plano. Como discutido em mais detalhes abaixo, as deformações fora do plano dominantes do grupo heme no citocromo c são o enrugamento (ruffling) e o selamento (saddling) (Figura 5). Como as simetrias correspondentes são B1u e B2u, a simetria do produto para um modo A1g seria A2g. A atribuição da contribuição antissimétrica ao tensor Raman de ν4 a essa combinação de deformações fora do plano é consistente com a ocorrência de uma contribuição antissimétrica igualmente grande para o modo ν4 da Ni-octaetiltetrafenil-porfirina, que é predominantemente selada, com algumas contribuições menores de deformações de enrugamento e com contribuições muito menos pronunciadas no caso de outras proteínas heme, como mioglobina e hemoglobina.
Conforme declarado acima, o heme do citocromo c reduzido não pode estar sujeito a distorções JT do estado fundamental. Uma vez que tal distorção supostamente existe no ferricitocromo c, espera-se um desvio mais pronunciado dos valores D4h da razão de despolarização, particularmente com comprimentos de onda de excitação nas regiões de pré-ressonância e ressonância da banda B. A Figura 13 exibe as razões de despolarização de ν4 (A1g, 0,125) e ν10 (B1g, 0,75) do citocromo c de coração de cavalo oxidado em função do número de onda de excitação na região entre Q e B. Os dados abrangem a região de ressonância da respectiva excitação Qv (a 19.500 cm−1). Com excitação de 442 nm (22.624 cm−1), a despolarização para ν4 e ν10 é de 0,2 e 0,58, respectivamente, bem acima e abaixo de seus respectivos valores D4h. Conforme mostrado por Alessi et al., esses valores são diagnósticos da deformação substancial B1g do macrociclo heme, que excede em muito a do ferrocitocromo c. Deformações dessa simetria adicionam simetria B1g ao tensor Raman de ν4 através do segundo termo na expansão de Taylor da Equação (23). Para modos B1g, no entanto, o termo de perturbação correspondente se transforma na forma de B1g × B1g = A1g, o que leva a uma redução na razão de despolarização do valor D4h de 0,75. Deve-se notar que uma deformação B1g dominante semelhante foi obtida anteriormente para o estado férrico de baixo spin do cianeto de mioglobina, que também possui um estado fundamental 2Eg, mas não para outros derivados da mioglobina.

Em conjunto, a análise combinada da absorção óptica (a baixa temperatura), do dicroísmo circular da banda B e dos dados de Raman ressonante mostra inequivocamente que o macrociclo heme do ferri- e ferrocitocromo c está sujeito a deformações no plano B1g (rômbica) e fora do plano B1u (ruffling) e B2u (saddling). Em linha com os resultados de estudos de RPE (vide supra), a deformação B1g na proteína oxidada, que pode ser predominantemente atribuída a uma distorção rômbica ao longo da coordenada ν24, elimina a degenerescência dos orbitais dπ, bem como dos orbitais 3eg, do macrociclo heme. A mistura dos dois orbitais confere densidade de spin ao macrociclo heme e produz um estado fundamental 2Eg do grupo heme (macrociclo + ferro). Deformações adicionais de redução de simetria do grupo heme em ambos os estados redox são conferidas ao heme por perturbações eletrônicas produzidas pelas cargas nos dois ligantes e nas duas cargas do ácido propiônico. Ao contrário da suposição de Manas et al., não é certo que ambos os substituintes do ácido propiônico estejam protonados. O trabalho de Bowler e colaboradores indica que um dos dois grupos possui valores de pK excepcionalmente altos.
Enquanto este capítulo focou nas deformações produzidas pelos componentes no plano de perturbações eletrônicas e vibracionais, deformações fora do plano foram brevemente discutidas depois que foram inferidas a partir das contribuições antissimétricas ao tensor Raman do modo ν4 totalmente simétrico. Elas serão tratadas com mais detalhes nas seções subsequentes deste artigo.

5. Deformações Fora do Plano Inferidas das Estruturas Cristalinas do Citocromo c
   Th exploração e determinação das deformações (principalmente) fora do plano de metaloporfirinas em solução e em proteínas heme foi pioneiramente realizada por Jentzen e Shelnutt. Embora o trabalho em porfirinas modelo tenha indicado a relevância funcional dessas deformações, levou algum tempo e o trabalho de Bren e colaboradores para mostrar que elas afetam os potenciais redox, a cinética de transferência de elétrons e as propriedades de ligação de ligantes. Nesta seção, reviso os resultados da análise estrutural de derivados do citocromo c. O trabalho de Bren e colaboradores é descrito na seção subsequente.
   A Equação (14) descreve a deformação total da porfirina na qual as contribuições de todas as simetrias são somadas. Geralmente, Jentzen et al. distinguiram entre deformações de diferentes simetrias. Eles mostraram que um conjunto de base mínimo de modos de baixo número de onda é frequentemente suficiente para reproduzir um certo tipo de deformação. A Figura 14 mostra os resultados de sua análise do ferrocitocromo c de levedura e alguns de seus mutantes. Observe que o citocromo c de levedura C102T é geralmente considerado como o tipo selvagem. A mutação indicada apenas impede a formação de dímeros de proteína através das pontes dissulfeto entre os resíduos C102.
   O ruffling é a deformação dominante (0,8 Å), seguida por uma deformação de saddling negativa (−0,3 Å). O waving é pequeno, mas ainda significativo (0,2 Å). Observe que é a coexistência entre ruffling e saddling que explica a contribuição antissimétrica ao tensor Raman do modo ν4.
   Os mutantes investigados estão todos no bolso do heme próximo ao ligante M80, o que pode alterar as interações entre os resíduos (Y67F, N52I), bem como as interações entre as moléculas de água no bolso do heme. No entanto, em contraste com o que se poderia esperar, essas substituições têm influências muito limitadas sobre a distribuição das deformações fora do plano. Este resultado deve ser contrastado com os observados nos estudos de Raman ressonante e absorção a baixa temperatura de alguns desses mutantes, que revelam mudanças substanciais nas deformações no plano, particularmente deformações B1g.
   Um quadro diferente surge se compararmos as deformações fora do plano de diferentes proteínas de citocromo c mitocondrial (Figura 14, coluna direita). Comparado com o citocromo c de coração de cavalo, o citocromo de atum reduzido exibe menos ruffling e mais saddling. Uma comparação dos citocromos mitocondriais com os derivados de citocromo c' e citocromo c2 revela diferenças importantes. Para três representantes do primeiro, particularmente para o citocromo c' de R. molischianum, Jentzen et al. observaram uma dominância da deformação de saddling. Entre as três formas investigadas de citocromo c2, apenas o grupo heme de R. rubrum apresenta deformações notáveis fora do plano (principalmente ruffling). Os autores também investigaram as estruturas cristalinas das proteínas de citocromo c oxidadas e as encontraram semelhantes às do estado reduzido. Como mostrado acima, isso obviamente não é verdade para as deformações no plano, que afetam mais a proteína oxidada do que a reduzida.
   Alguma luz é lançada sobre o que pode ser considerado como determinantes estruturais das deformações fora do plano pelas deformações fora do plano dos quatro grupos heme do citocromo c3 de D. gigas, D. vulgaris, D. desulfuricans e Desulfomicrobium baculatum (Figura 15). Os Hemes 1 e 2 estão predominantemente sujeitos a ruffling. A contribuição de saddling varia entre as proteínas. As contribuições de doming e waving são menores, mas não insignificantes. O quadro é totalmente diferente para a maioria dos cromóforos heme 3 e heme 4 investigados, onde saddling é a deformação fora do plano dominante. Uma exceção à regra é o heme 4 de Desulfomicrobium baculatum, que é predominantemente ruffled. Jentzen et al. explicaram esta última descoberta com base nas diferenças entre os segmentos proteicos flanqueados pelas duas cisteínas ligadas covalentemente ao grupo heme, que é do tipo CxxC para o heme 4, mas abrange quatro resíduos no heme 4 nas outras espécies de citocromo c3 investigadas. Contudo, o quadro fornecido pelo conjunto de dados completo é equívoco, pois os hemes 1 e 3 contêm ambos o segmento CxxC clássico do citocromo c mitocondrial, mas exibem deformações fora do plano bastante diferentes. As contribuições das duas ligações tioéter e dos resíduos de aminoácidos entre as duas cisteínas são elucidadas no contexto de estudos de RMN sobre os vários derivados do citocromo c, que são descritos na próxima seção.
   Diferenças entre o citocromo c e outras proteínas heme merecem menção. A desoxi-hemoglobina A está principalmente sujeita a doming, que foi originalmente descrito como deslocamento do ferro para fora do plano. Essa deformação é reduzida no estado oxigenado. Na hemoglobina oxidada, o grupo heme é ligeiramente distorcido ao longo de quase todas as deformações fora do plano. Os hemes em peroxidases, como a clássica peroxidase de rábano, são dominantemente saddled.
6. Deformações Fora do Plano Investigadas por Espectroscopia de RMN
   Atualmente, a espectroscopia de RMN é geralmente empregada usando as versões bidimensional e tridimensional para investigar as estruturas de proteínas em solução. Em relação a proteínas como o citocromo, a RMN demonstrou competir com a análise canônica de estrutura por raios-X, que depende da disponibilidade de cristais de proteína. Aqui, concentro-me (principalmente) na RMN unidimensional de 1H e 13C de grupos heme em derivados do citocromo c. A aplicabilidade dessas técnicas resulta de modificações nos deslocamentos químicos devido à presença de orbitais moleculares com um único elétron que Bren denominou SOMO. No contexto do modelo clássico de quatro orbitais, onde o heme e os orbitais metálicos estão bem separados, o elétron desemparelhado de um heme férrico de baixo spin reside exclusivamente no orbital dπ ou dxy. No entanto, conforme descrito acima, a mistura dos orbitais 3eg e dπ confere densidade de spin ao macrociclo porfirínico no estado fundamental eletrônico. Como mostrado abaixo, deformações do tipo ruffling fornecem outro modo de mistura orbital porfirina-metal que pode modificar a densidade de spin do grupo heme.

Como delineado por Bren, sistemas paramagnéticos como os hemes Fe3+ dão origem ao chamado deslocamento hiperfino: onde é o deslocamento químico observado experimentalmente de um núcleo interagindo com um elétron desemparelhado, enquanto é o deslocamento correspondente esperado para o sistema diamagnético. O deslocamento hiperfino é geralmente atribuído a três fontes aditivas, ou seja, o deslocamento de contato de Fermi, cujo sinal reflete o componente z do spin do elétron SOMO (positivo ou negativo), o deslocamento pseudocontato, que reflete a anisotropia paramagnética, e um deslocamento pseudocontato centrado no ligante. O deslocamento pseudocontato é uma função bastante complexa das coordenadas nucleares e do tensor de susceptibilidade magnética do complexo heme-ligante. Detalhes podem ser encontrados no artigo bastante esclarecedor de Banci et al..
Antes de discutir a relação entre deformações fora do plano e deslocamentos químicos, gostaria de chamar a atenção do leitor para a influência dos ligantes axiais, em particular a metionina. Como mencionado acima, a orientação tanto da metionina quanto das cadeias laterais da imidazol reduz a simetria do grupo heme ao induzir deformações no plano. No estado oxidado, uma distorção JT ao longo da coordenada ν24 deve ser adicionada ao quadro. O Hamiltoniano de perturbação na Equação (13) representa uma interação que causa a mistura dos dois estados ferro-porfirina, que pode ser descrita como uma combinação linear da função de onda na Equação (13): onde β é o ângulo de rotação do sistema de coordenadas x,y, que diagonaliza o Hamiltoniano na Equação (13). A Equação (25) é equivalente à apresentada por Banci et al., com uma notação ligeiramente diferente. Karplus e Fraenkel mostraram que o ângulo racional β determina não apenas a separação de energia entre os estados polarizados em x e y (que decorre, é claro, da mecânica quântica elementar), mas também a distribuição da densidade de spin dos carbonos do heme. Conforme delineado por Banci et al., os deslocamentos hiperfinos de prótons e 13Cs são diferentes para o citocromo c de coração de cavalo oxidado, pois os sinais dos prótons metílicos deslocam-se para campo baixo, enquanto os do carbono deslocam-se para campo alto. A dependência da temperatura da contribuição paramagnética para o deslocamento químico geralmente não obedece à lei de Curie, pois não atinge zero a uma temperatura infinita e exibe inclinações positivas e negativas.
Antes de entrar em uma discussão sobre como as deformações fora do plano alteram o deslocamento químico dos núcleos do tema, a influência do ligante metionina é brevemente discutida. A Figura 16 mostra a região de campo baixo dos espectros de 1H RMN de cinco derivados diferentes de citocromo c férrico: Pa-cyt551 (A), citocromo c de coração de cavalo mitocondrial (B), Hydrogenobacter thermophilus (Ht) cyt551, Pa-cyt551 em uma solução contendo 20% CD3OD (D) e Ht-cyt551, também em uma mistura binária de água e metanol deuterado. Aqui, concentro-me em uma comparação dos espectros A–C, que diferem na sequência dos sinais de prótons metílicos. Todos esses sinais exibem o mesmo deslocamento químico na ausência de qualquer anisotropia eletrônica. As diferenças entre os espectros de A e B foram atribuídas a duas orientações diferentes da cadeia lateral da metionina (denominadas A e B por Zhong et al. (Figura 17). A notação foi posteriormente substituída por R e S (vide supra)). O espectro de Ht cyt551 é diagnóstico de um equilíbrio dinâmico entre R e S. Zhong et al. atribuíram este último à ausência de ligação de hidrogênio envolvendo a cadeia lateral da metionina e a efeitos estruturais causados pela cadeia lateral Q64.
A influência do enrugamento do heme nos deslocamentos químicos do grupo heme foi investigada por Kleingardner et al. utilizando mutantes de PA cit551 e Ht cit551. Em relação ao primeiro, eles mediram os espectros de RMN de um mutante F7A cujas mutações são conhecidas por aumentar a deformação por enrugamento sem afetar significativamente a deformação ao longo das outras coordenadas fora do plano. Para Ht cit551, eles investigaram os mutantes M13V, K22M e o respectivo mutante duplo. Todas essas mutações foram mostradas como aumentando o enrugamento. A Figura 17 (esquerda) mostra os gráficos de Curie para os deslocamentos paramagnéticos dos carbonos α e β isotopicamente marcados (13C) da PA cit551 do tipo selvagem. A maioria dos gráficos se aproxima de valores acima de zero para T -> ∞, o que é indicativo de comportamento hiper-Curie. Isso reflete o fato de que estados eletrônicos excitados de maior energia (ou seja, (dxy)1(dπ − eg)4) podem se tornar populados à temperatura ambiente.
Uma comparação dos tipos selvagens e mutantes investigados revelou o quadro a seguir. No mutante PA cit551 F7A (aumento do enrugamento), os deslocamentos médios dos grupos metila do heme (H e 13C) aumentaram, enquanto os deslocamentos dos carbonos do pirrol diminuíram. Em Ht cit551, a mesma mutação diminuiu o enrugamento. Como consequência, o respectivo deslocamento químico exibiu o comportamento oposto.
A Figura 17 (direita) mostra os gráficos dos deslocamentos médios de 13C e H dos derivados de Ht cit551 em função do termo de energia axial decrescente Δ/λ, inferido a partir dos experimentos de EPR. Δ denota a divisão de energia entre os orbitais t2g e eg causada pela redução da simetria do campo ligante do metal de octaédrica para tetragonal, enquanto λ denota a energia de acoplamento spin–órbita (até agora não considerada explicitamente). Can et al. deduziram a partir de experimentos de EPR na mesma proteína que um aumento no enrugamento resulta em uma diminuição em Δ. Portanto, a abcissa na Figura 17 pode ser lida como representando o enrugamento do heme. Os dados ali representados mostram claramente como os deslocamentos químicos de hemes oxidados de baixo spin podem ser utilizados para investigar o enrugamento do heme. No geral, os dados demonstram que o enrugamento afeta significativamente a distribuição de spin desemparelhado do macrociclo, o que é um indicador de mistura entre os orbitais do heme e do ferro.
Detalhes sobre como o enrugamento altera a deslocalização do spin sobre carbonos pirrólicos, carbonos metílicos e prótons metílicos podem ser inferidos a partir do estudo muito completo de Kleingardner et al.. Os autores também forneceram uma desconstrução detalhada dos deslocamentos paramagnéticos em contribuições individuais. Aqui, concentro-me em como o enrugamento altera a mistura entre o ferro heme e os orbitais da porfirina. No sistema de referência D4h escolhido, o enrugamento se transforma como B1u. Assim, no nível orbital, o enrugamento pode misturar o orbital dxy (B1g) do metal com o orbital 3a2u do macrociclo, uma vez que A2u × B1g = B1u. Levando em conta essa mistura orbital, deve-se aumentar o conjunto de estados eletrônicos descritos na Equação (5). Aqui, deve-se levar em conta o fato de que, ao contrário da mistura dos orbitais dπ e 3a2u, a mistura de dxy e 3a2u ocorre na simetria mais baixa D2d, onde ambos os orbitais exibem simetria D2d e se transformam na forma de B2.
Observe que, por questões de brevidade, apenas os orbitais desemparelhados são listados na descrição dos estados Q0 e B0. A mistura de dxy em orbitais b2 diminui a energia do estado fundamental, enquanto estados com orbitais (dxy + b2) se aproximam de (dπ + 3e). Isso torna a ocupação térmica do estado |g1> mais provável. A diminuição da energia do estado fundamental leva ao desvio para o vermelho observado experimentalmente no espectro óptico das metaloporfirinas enrugadas.
Embora estejamos focados no efeito do enrugamento aqui, deve-se notar que perturbações de selamento (B2u) podem misturar orbitais dxy com 3a1u (B1 em D2d), levando assim a uma desestabilização adicional dos primeiros. O abaulamento tem simetria A2u e, portanto, pode misturar orbitais dπ e 3a2u (B2 em D2d). Isso é irrelevante para complexos férricos de baixo spin, mas torna-se relevante em todos os sistemas de alto spin, independentemente de estarem no estado férrico ou ferroso.
Como todas essas perturbações afetam o potencial redox e as propriedades de transferência de elétrons dos derivados do citocromo c? Começo com a discussão do ruffling do heme. A respectiva deformação reduz a simetria do macrociclo de D4h para D2d. Para o ferricitocromo c, o estado fundamental |g0> exibe simetria 2E. A simetria do primeiro estado excitado |g1> torna-se 2A2, que é menor em energia do que em D4h, uma vez que o ruffling desestabiliza o dxy, de modo que é necessária menos energia para mover um elétron para dπ. Ignoro estados de quarteto nesta discussão. No caso do ferrocitocromo c, a simetria do estado fundamental é 1A1g, que se torna 1A em D2d, pois não há buraco através do qual a simetria possa ser afetada. O primeiro estado excitado, que envolve uma transferência de elétrons de para , transforma-se como 1Eg em D4h e E em D2d. Espera-se que a transferência de elétrons envolva um elétron que ocupa o orbital dπ de maior energia (muito provavelmente dyz). Portanto, do ponto de vista da teoria de grupos, o ruffling não deveria afetar a energia de ionização do ferrocitocromo c na ordem zero, uma vez que nem o ruffling nem o saddling podem misturar dπ com os orbitais ocupados da porfirina em um referencial D4h. No entanto, a situação é diferente em D2d, onde os orbitais dπ e o terceiro orbital mais alto da porfirina se transformam como E. Como o produto direto dos dois orbitais pode ser escrito como A1 + A2 + B1 + B2, praticamente qualquer deformação com uma representação unidimensional pode misturar os dois orbitais. Dentro do sistema de referência D4h, tal efeito de primeira ordem pode ser atribuído aos elementos de matriz de operadores de acoplamento vibônico do tipo . Qualquer combinação de perturbações eletrônicas ungerade e modos vibracionais permitirá a mistura de orbitais Eg. Em conjunto, esse raciocínio de teoria de grupos sugere que o ruffling ou qualquer outra deformação fora do plano desestabiliza o estado reduzido, porque a quantidade de energia ganha ao preencher o buraco nos estados |g0> e |g1> é diminuída mais do que a energia necessária para remover um elétron do estado fundamental do heme reduzido. Portanto, o potencial de redução diminui, o que está de acordo com observações experimentais de Bren e colaboradores. Cálculos DFT apoiados por resultados de RMN chegaram a uma conclusão semelhante, na medida em que seus resultados sugerem uma desestabilização de todos os orbitais ‘t2g’ pelo ruffling, embora em graus diferentes. Como seria de se esperar a partir do raciocínio acima, o efeito é dominante para o dxy.
Conforme descrito acima, a perturbação eletrônica B1g causa uma separação dos orbitais (dxz + 3egx) e (dyz + 3egy) e, portanto, do estado fundamental Eg da proteína oxidada. Se escolhermos D2d como sistema de referência (ou seja, levando em conta a influência do enrugamento), os dois orbitais são denotados como (dxz + 3ex) e (dyz + 3ey). Juntos, eles exibem simetria E. A perturbação eletrônica agora exibe simetria B1 e reduz a simetria do heme de D2d para D2. Neste novo grupo de pontos, os orbitais acima devem ser escritos como (dxz + 3b2) e (dyz + 3b3). Essa separação pode ser substancial. No citocromo c de coração de cavalo, por exemplo, ela atinge quase 60% da separação do campo axial (cerca de 440 cm−1). Assim, o estado de maior energia (geralmente, o estado |g0y> contendo (dyz + 3b3)) situa-se 220 cm−1 acima do nível da simetria D4h não perturbada. O primeiro estado eletrônico excitado |g1> exibe simetria B2 em D2d. A perturbação rômbica não pode misturar |g0> e |g1>. No estado reduzido, o estado fundamental é um singleto de simetria A1, enquanto o primeiro estado excitado exibe simetria E (vide supra), que se divide em B2 e B3 em D2. Qualquer ocupação deste estado à temperatura ambiente deve ser muito baixa. Consequentemente, nem as perturbações eletrônicas B1 nem B2 de um heme em simetria D2d afetam o estado fundamental do heme reduzido. No total, essas perturbações, portanto, desestabilizam o estado oxidado, aumentando assim o potencial redox.

A perturbação vibriônica pode afetar os estados eletrônicos de maneira diferente. Como se pode ler na Equação (17), a perturbação vibriônica ao longo de uma coordenada normal qk pode afetar praticamente todos os estados eletrônicos na presença de uma perturbação eletrônica da mesma simetria, uma vez que o respectivo operador se transforma na forma de A1g em D4h. Mesmo que os respectivos elementos de matriz possam ser diagonais no conjunto de base eletrônica pura, eles são não diagonais em uma base vibriônica, pois o operador deve ser multiplicado pelo operador , que reflete a mistura dos estados vibracionais (que pode envolver vários estados para modos normais de baixos números de onda). Portanto, a contribuição de energia é de segunda ordem. Como os elementos de matriz de podem estar na faixa dos, ou até exceder, os números de onda vibracionais, essas perturbações não podem ser tratadas com a teoria de perturbação de Rayleigh–Schrödinger. Obviamente, essas perturbações levam ao colapso da aproximação de Born–Oppenheimer. A perturbação vibriônica mais proeminente que afeta o estado fundamental é a de simetria B1, e isso causa uma distorção JT do estado fundamental da ferricitocromo desde que sua simetria seja 2E. Como a perturbação eletrônica acima é da mesma simetria, ela se soma à separação do estado fundamental e, portanto, a uma desestabilização do estado oxidado, aumentando assim o potencial redox.
Eu complemento esta seção mencionando brevemente que os resultados dos estudos combinados de RMN e DFT sugerem que as deformações de enrugamento diminuem o acoplamento eletrônico entre o citocromo c e seus parceiros redox. Como se espera da teoria canônica de Marcus, isso reduz a taxa de transferência de elétrons. A redução na energia de acoplamento resulta de uma diminuição na densidade de spin do elétron desemparelhado e, portanto, de uma maior deslocalização da densidade eletrônica do átomo de ferro. Este é um resultado interessante, pois sugere que a mistura de dπ com 3eg é, até certo ponto, neutralizada pela mistura de dxy com 3a2u.
7. Resumo e Perspectivas
O objetivo deste artigo de revisão foi fornecer uma visão geral das perturbações induzidas por proteínas e ligantes que afetam o grupo heme de proteínas do tipo citocromo c. Por um longo período, as estruturas eletrônicas do macrociclo heme e do átomo de ferro central foram discutidas de forma independente. O modelo de quatro orbitais de Gouterman baseou-se em dados de absorção óptica, enquanto o ferro heme foi explorado através de espectroscopia EPR e Mössbauer. Embora os primeiros estudos de EPR do citocromo c e de outras hemeproteínas tenham revelado que o campo ligante do ferro heme possui uma absorção de simetria rômbica, os dados de ressonância Raman foram geralmente interpretados dentro da estrutura de um macrociclo heme exibindo simetria D4h, mesmo que as dispersões da razão de despolarização tenham mostrado claramente que essa noção está incorreta. Na verdade, a invalidade da abordagem de alta simetria já havia se tornado aparente a partir dos experimentos de RMN de Wüthrich e colaboradores, que revelaram como a orientação do ligante metionina afeta a distribuição de spin do macrociclo heme. Os trabalhos mais recentes de Walker, Bren e colaboradores devem ser creditados não apenas por chegarem a uma imagem mais abrangente da estrutura eletrônica dos derivados do citocromo, mas também por demonstrarem que deformações de quebra de simetria são biologicamente relevantes.
Embora o trabalho de Bren e colaboradores tenha se concentrado em deformações fora do plano, que foram bem caracterizadas em nível quantitativo pelo trabalho pioneiro de Jentzen e Shelnutt, esta revisão argumentou que as deformações no plano merecem alguma consideração também. Este artigo invocou argumentos da teoria de grupos para fornecer uma compreensão abrangente da estrutura eletrônica (vibriônica) do grupo heme em derivados do citocromo c. Foi dada ênfase à elucidação das relações entre os potenciais perturbadores eletrônicos e as distorções induzidas do heme.
Por fim, gostaria de me referir brevemente ao artigo de Galianto et al. que não foi discutido até agora. Esses autores utilizaram a espectroscopia de ressonância vibracional nuclear para explorar espectros vibracionais envolvendo os movimentos do ferro heme, que escapam dos métodos de espectroscopia tradicionais, como Raman e IV. O principal resultado deste estudo foi que os modos normais na verdade não estão restritos ao grupo heme, mas envolvem, em particular, vibrações do ligante CxxCH e dos ligantes de ferro. Essas vibrações cobrem a região entre 250 e 500 cm−1. É muito provável que a dinâmica vibracional revelada por este estudo seja de grande relevância, ajudando a promover uma compreensão aprofundada dos respectivos processos de transferência de elétrons.
Este artigo focou no citocromo c, mas vários estudos de outras proteínas heme revelaram as influências das deformações no plano e fora do plano sobre, por exemplo, a atividade de peroxidase e a ligação de ligantes. No entanto, um relato completo e abrangente das maneiras pelas quais as deformações do heme modulam as atividades biológicas ainda precisa ser desenvolvido.
Nota do Editor: A MDPI permanece neutra em relação a alegações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Não aplicável.
Conflitos de Interesse
O autor declara não haver conflito de interesses.
Referências
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Transdução de Energia por Complexos de Citocromo na Respiração Mitocondrial e Bacteriana: A Enzimologia do Acoplamento de Reações de Transferência de Elétrons à Translocação Transmembrana de Prótons
Transferência de Elétrons de Longo Alcance em Proteínas Heme
Citocromo c Oxidase. Estrutura e Espectroscopia
O Centro de Reação Fotossintética da Bactéria Púrpura Rhodopseudomonas Viridis
Estruturas de Peroxidase e Citocromo P450
Determinação da Estrutura Cristalina da Peroxidase Clássica de Rábano-Silvestre na Resolução de 2,15 Å
Mudança Conformacional Terciária da Hemoglobina na Ligação de Ligantes: Seu Papel no Mecanismo Cooperativo
Citocromo c Multifuncional: Aprendendo Novos Truques de um Velho Cão
Conformações Alternativas do Citocromo c: Estrutura, Função e Detecção
A Química e a Bioquímica do Heme c: Bases Funcionais para a Ligação Covalente
Distorções do Grupo Prostético Induzidas por Ligação Alostérica em Proteínas Heme, conforme Derivado pela Interpretação Teórica da Razão de Despolarização no Espalhamento Raman Ressonante
Detecção das Perturbações do Heme Causadas pela Transição Quaternária R----T na Oxiemoglobina Truta IV por Espalhamento Raman Ressonante
Estrutura, Dinâmica e Reatividade na Hemoglobina
A Ligação Cooperativa de Oxigênio pela Hemoglobina é Realmente Compreendida?
A Influência de Variações Estruturais na Hélice F e FG da Subunidade β da OxiHb-NES Modificada na Estrutura do Heme Detectada por Espectroscopia Raman de Ressonância
Um Modelo Matemático para Relações Estrutura-Função na Hemoglobina
Uma Abordagem Geral para Cooperatividade e sua Aplicação ao Equilíbrio de Oxigênio da Hemoglobina e seus Efetores
Estrutura em Solução do Citocromo C de Coração de Cavalo Reduzido
Monitoramento da Flexibilidade Conformacional do Citocromo c em Baixa Força Iônica por Espectroscopia de RMN de 1H
Refinamento de Alta Resolução da Iso-1-Citocromo C de Levedura e Comparações com Outros Citocromos C Eucarióticos
Mudanças Conformacionais Dependentes do Estado de Oxidação no Citocromo C
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Espectroscopia Raman de Ressonância como Sonda da Estrutura e Dinâmica de Proteínas Heme
Atribuição do Espectro Raman de Ressonância do Protoheme por Marcação do Heme na Mioglobina
Atribuição Completa dos Espectros Raman de Ressonância do Citocromo c via Reconstituição Enzimática com Hemes Marcados Isotopicamente
Influência da Estrutura da Globina no Estado do Heme. I. Desoxiemoglobina Humana
Estereoquímica dos Efeitos Cooperativos na Hemoglobina
Estrutura da Oxiemoglobina Humana a 2,1 Å de Resolução
Ressonância Paramagnética Eletrônica da Ferricitocromo C de Coração de Boi
A Estrutura Espacial da Metionina Ligada Axialmente em Conformações em Solução da Ferrocitocromo c de Cavalo e da Ferrocitocromo c 551 de Pseudomonas Aeruginosa por RMN de 1H
Múltiplas Formas de Baixo Spin do Ferrihemocromo do Citocromo c
Modulação da Anisotropia do Campo Ligante em uma Série de Mutantes de Citocromo c de Baixo Spin Férrico Derivados da Citocromo c-551 de Pseudomonas Aeruginosa e da Citocromo c-552 de Nitrosomonas Europaea: Uma Ressonância Magnética Nuclear e Ressonância Paramagnética Eletrônica
Análise Multimodo da Dispersão da Razão de Depolarização e Perfis de Excitação de Sete Fundamentais Raman do Grupo Heme na Ferrocitocromo C
Divisão de Bandas Ópticas e Perturbações Eletrônicas do Cromóforo Heme no Citocromo c à Temperatura Ambiente, Investigadas por Espectroscopia de Dicroísmo Circular Eletrônico Visível
Campo Elétrico Interno no Citocromo C Explorado por Espectroscopia de Dicroísmo Circular Eletrônico Visível
Deformações no Plano do Grupo Heme no Citocromo c Oxidado Nativo e Não Nativo, Investigadas por Espectroscopia de Dispersão Raman de Ressonância
Efeito do Deslocamento do Ferro para Fora do Plano da Porfirina nos Espectros Raman de Ressonância de Proteínas Heme e Porfirinas de Ferro
Estudos Espectroscópicos Magnéticos (EPR, ESEEM, Mössbauer, MCD e RMN) de Centros de Ferriheme de Baixo Spin e Suas Proteínas Heme Correspondentes
Análise da Dependência da Temperatura dos Deslocamentos Isotrópicos de 1H e 13C do Ferricitocromo c de Coração de Cavalo: Explicação da Dependência da Temperatura Curie e Anticurie e Deslocamentos Pseudo-Contato Não Lineares em um Quadro Comum de Dois Níveis
Mobilidade do Motivo de Ligação do Heme Regula o Potencial Redox do Citocromo c
Investigação por RMN e DFT do Enrugamento do Heme: Implicações Funcionais para o Citocromo C
Estudos sobre Citocromo c. III. Curvas de Titulação
Porfirinas Não Planares e Sua Significância em Proteínas
Seguindo o Fluxo de Elétrons: Estrutura Eletrônica do Heme e Transferência de Elétrons no Citocromo C
Simetria e Ligação em Metaloporfirinas. Uma Implementação Moderna para Análises de Ligação de Complexos de Ferro(III)-Porfirina de Alto Spin com Coordenação Cinco e Seis por Cálculo de Funcional de Densidade e Espectroscopia de RMN
Fluidez da Metionina Axial do Heme no Citocromo C552 de Hydrogenobacter thermophilus
Estudo dos Efeitos da Substituição nos Espectros de Absorção da Porfina
Espectroscopia de Dispersão Raman de Ressonância Polarizada em Metaloporfirinas
Aplicação da Teoria de Transformação aos Perfis de Excitação Raman de Ressonância na Região Soret do Citocromo-C
Movimentos Proteicos Anarmônicos e Deformações do Heme em Cianeto de Mioglobina, Investigados por Espectroscopia de Absorção e Raman de Ressonância
Espectroscopia Óptica
Os Espectros de Excitação Raman e o Espectro de Absorção de uma Metaloporfirina em um Ambiente de Baixa Simetria
Curvas de Dispersão de Despolarização de Fundamentos Raman de Ressonância de Metaloporfirinas e Metaloftalocianinas Sujeitas a Perturbações Assimétricas
Acoplamento Vibracional em Ni(II) Porfina Derivado de Perfis de Excitação Raman Ressonante
Conformações Planares e Não Planares de (Meso-Tetrafenilporfinato)Níquel(II) em Solução, Inferidas por Espectroscopia Raman em Solução e Estado Sólido
Conservação da Conformação do Macrociclo Porfirínico em Hemoproteínas
Distorções Não Planares Conservadas do Heme em Citocromos C
Origem dos Desvios para o Vermelho nas Bandas de Absorção Óptica de Tetraalquilporfirinas Não Planares
Perfis de Excitação e Razões de Despolarização de Algumas Linhas Raman Proeminentes em Oxiemoglobina e Ferrocitocromo c na Região Pré-ressonante e Ressonante da Banda Q
Espectroscopia de Dispersão Raman na Nickel(II)-Octaetiltetrafenilporfirina Altamente Selada Revela a Simetria das Distorções Não Planares e a Força de Acoplamento Vibracional dos Modos Normais
Propriedades Conformacionais da Nickel(II) Octaetilporfirina em Solução. 1. Perfis de Excitação de Ressonância e Dependência da Temperatura de Linhas Raman Sensíveis à Estrutura
Campo de Força Consistente para Porfirinas. 2. Atribuições dos Modos Esqueléticos e de Substituintes da Nickel Octaetilporfirina a partir de Deslocamentos Isotópicos Raman e Infravermelho de 15N, Meso-D4 e Metileno-D16
Porfirinas—VIII. Cálculos de Hückel Estendido em Complexos de Ferro
Compensação Entalpia-Entropia Quase Exata Governa o Desdobramento Térmico dos Estados de Protonação do Citocromo C Oxidado
Transições Conformacionais Alcalinas do Ferricitocromo c Estudadas por Espectroscopia Raman de Ressonância
Modelo Estrutural para uma Forma Alcalina do Ferricitocromo C
A Estabilidade do Arcabouço do Citocromo c Revelada por Espectroscopia de RMN
Resolvendo os Componentes Individuais de uma Mudança Conformacional Induzida por pH
Modulação dos Parâmetros de Campo Ligante pelo Enrugamento do Heme em Citocromos c Revelada por Espectroscopia de EPR
Investigação do Acoplamento Heme—Proteína e da Heterogeneidade Estrutural em Mioglobina e Hemoglobina por Espectroscopia Raman de Ressonância
Espectros Raman de Ressonância da Tetrafenilporfirina de Cobre: Efeitos do Forte Acoplamento Vibracional nos Perfis de Excitação e no Espectro de Absorção
Estabilidade Conformacional do Citocromo C Sondada por Espectroscopia Óptica
A Importância das Perturbações Vibracionais nos Espectros do Ferrocitocromo c: Uma Reavaliação das Propriedades Espectrais Baseada em Absorção Óptica a Baixa Temperatura, Raman de Ressonância e Simulações de Dinâmica Molecular
Usando ferramentas espectroscópicas para sondar a deformação da porfirina e as interações porfirina-proteína
Uma Comparação entre Diferentes Abordagens para a Teoria Vibracional das Intensidades Raman
Interferência entre Acoplamentos Intra e entre Manifold em Espectros Raman de Ressonância de Metaloporfirinas
A Influência do Ambiente Proteico na Espectroscopia Eletrônica a Baixa Temperatura do Citocromo Substituído por Zn
Curvas de Dispersão de Despolarização de Alguns Fundamentais Raman em Ferrocitocromo c e Oxi-hemoglobina
Estrutura e Propriedades de Metaloporfirinas e Hemoproteínas: A Abordagem Vibracional
Espectros de Monocristal de Complexos de Ferrimioglobina em Luz Polarizada
Espectros Raman de Ressonância de Hemoproteínas. Efeitos do Estado de Oxidação e de Spin
Dispersão da Razão de Despolarização Revisitada de Fundamentais Raman do Heme c em Ferrocitocromo c Confirma que Perturbações Assimétricas Afetam a Estrutura Eletrônica e Vibracional do Macrociclo do Cromóforo
Substituições Semelhantes às Humanas no Laço Ω D do Iso-1-Citocromo c de Levedura Afetam Apenas Modestamente a Dinâmica e a Atividade de Peroxidase
Matriz Proteica e Efeito Dielétrico no Citocromo C
Perturbações Induzidas por Campo Elétrico Funcionalmente Relevantes do Grupo Prostético de Mutantes do Ferrocitocromo c de Levedura Obtidas a partir de uma Análise Vibracional de Espectros de Absorção a Baixa Temperatura
Interpretação Teórica das Interações Hiperfinas de Carbono-13 em Espectros de Ressonância de Spin Eletrônico

A Influência do Enrugamento do Heme nas Densidades de Spin em Ferrocitocromos c Investigada por RMN de 13C do Núcleo do Heme

Acoplamentos Vibracionais Heme-Proteína no Citocromo c Fornecem uma Ligação Dinâmica que Conecta o Ferro do Heme e a Superfície da Proteína

Estrutura do heme b ((protoporfirina IX, (A)), heme c (B) e heme a (C). Reimpresso com permissão de, 2008, Royal Society of Chemistry.

Representação esquemática do deslocamento do ferro para fora do plano do grupo heme na desoxi-mioglobina e na desoxi-hemoglobina. Reimpresso com permissão de, 1993, Elsevier.

Orbitais de fronteira de uma porfirina metálica em simetria D4h. Os orbitais 3a1u, 3a2u e 3eg estão preenchidos com elétrons. O orbital antiligante 4eg é o LUMO. Enquanto 3a1u e 3a2u sempre estão em energias mais altas que 3eg, a hierarquia dos primeiros depende de substituintes periféricos e ligantes axiais. Em um sistema de referência idealizado, assume-se que sejam acidentalmente degenerados. Reimpresso com permissão de, 2003, American Chemical Society.

Diagrama de energia e ocupação orbital de um ferro férrico em um campo ligante forte que estabiliza uma configuração de baixo spin. Para facilitar a legibilidade, a influência das distorções que reduzem a simetria de cúbica para rômbica é mostrada apenas para os orbitais ocupados. Observe que a hierarquia representada assume que os orbitais dπ exibem energias mais altas que o orbital dxy. Este é geralmente o caso para os derivados de citocromo c mais proeminentes. HALS denota um heme ferro de baixo spin altamente axial. Deformações rômbicas do núcleo do heme são discutidas em detalhes no texto. Reimpresso com permissão de, 2008, American Chemical Society.

Espectros de absorção UV-Vis de citocromo c oxidado e reduzido. Reimpresso com permissão de, 2012, Elsevier.

Representação das deformações fora do plano (direita) e no plano (esquerda) associadas ao modo normal de menor número de onda de diferentes simetrias em uma simetria D4h. Reimpresso com permissão, 1997, American Chemical Society.

Estrutura de (A) Pa-cyt551 (código PDB 351c) e (B) Ne cyt552 (código PDB 1A56). Os resíduos de aminoácidos coloridos em vermelho nas sequências representadas indicam mutações pontuais. Reimpresso com permissão de, 2008, American Chemical Society.

Espectros de EPR de (A) Pa cyt551, (B) cyt551 N64V, (C) Pa cyt551 N64Q, (D) Pa cyt551 N50G/V65ins, (E) Ne cyt551 clonado, (F) Ne cyt551 N64Δ, (G) cyt551 NeG50N/V65Δ e (H) Ne cyt551 V65Δ em tampão HEPES 50 mM (pH 7,5), registrados a 10,0 K. As linhas tracejadas representam envelopes de EPR simulados. O asterisco indica o sinal de Cu2+ (g ~ 2) resultante de uma impureza. As condições experimentais podem ser inferidas a partir do artigo de Zoppellaro et al., do qual esta figura foi reimpressa com permissão de, 2008, American Chemical Society.
Representação esquemática das orientações axiais M do heme (formato ball and stick) e dos padrões de deslocamento químico do metil 1H NMR do heme correspondentes observados em citocromos c. O plano do resíduo axial H é mostrado como uma haste preta em negrito. (A) Orientação M em PA cyt551 (R), (B) orientação M em citocromos c mitocondriais (S), (C) ilustração da fluxionalidade M com amostragem M, com as conformações mostradas nos painéis (A) e (B). As hastes abaixo das estruturas representam o respectivo padrão de deslocamento metílico. Reimpresso com permissão de, 2008, American Chemical Society.

Região das bandas Q e Qv dos espectros de absorção de coração de cavalo (a) e ferrocitocromo c de levedura (b) registrados a 10 K em uma mistura água-glicerol. A decomposição espectral leva em conta o desdobramento observado das transições vibronicas. As contribuições da banda lateral vibronica podem ser atribuídas a vibrações do macrociclo heme. O resíduo exibido no topo de ambas as figuras reflete a qualidade do ajuste realizado. Retirado de Levantino et al. com permissão, 2005, AIP Publishing.

Dicroísmo circular (figuras superiores) e absorção da banda Soret (figuras inferiores) do citocromo c de coração de cavalo oxidado (esquerda) e reduzido (direita). As linhas sólidas resultam de um ajuste de um modelo de acoplamento vibronico com os perfis de banda correspondentes. Detalhes da teoria podem ser inferidos de. Reimpresso com permissão de, 2008, American Chemical Society.

Dispersão da razão de despolarização (esquerda) e perfis de excitação de ressonância (direita) do modo ν4 do tipo A1g do marcador de oxidação do ferrocitocromo c de coração de cavalo. As linhas sólidas nas figuras resultam de ajustes de um modelo de acoplamento vibronico que considera perturbações de redução de simetria e mistura multimodo. Detalhes podem ser inferidos de. As posições de ressonância da excitação Raman são indicadas no topo das figuras em relação à ocupação dos estados vibracionais. A figura foi reimpressa com permissão da referência, 1991, Wiley & Sons.

Dispersão da razão de despolarização do marcador de oxidação ν4 (esquerda) e do marcador de spin ν10 (direita) do ferricitocromo c de coração de cavalo nas regiões de pré-ressonância das bandas Qv e B obtidas nos valores de pH indicados. Reimpresso com permissão de, 2001, Wiley & Sons.

Diagrama de barras representando as deformações fora do plano do grupo heme no ferrocitocromo de levedura e nos mutantes indicados. O diagrama, no topo, exibe as deformações do mutante C102T, que é geralmente considerado como o tipo selvagem. Esta mutação serve unicamente ao propósito de evitar a formação de pontes dissulfeto entre proteínas. A figura foi retirada e ligeiramente modificada, com permissão da Ref., 1997, American Chemical Society.
Diagramas de barras representando as deformações fora do plano indicadas dos quatro grupos heme das proteínas citocromo c3 indicadas. As referências às respectivas estruturas de raios-X e aos artigos nos quais foram publicadas podem ser inferidas a partir da legenda da Figura 7 de Jentzen et al., da qual a figura foi retirada com permissão, 1998, Elsevier.

Regiões de campo baixo dos espectros de 1H RMN dos seguintes citocromos oxidados: (A): Pa cyt551 em solução aquosa, (B): citocromo c de coração de cavalo, (C): Ht cyt c552 em solução aquosa, (D): Pa cyt551 em solução contendo 20% vol. de CD3OD, (E): Ht cyt55s em solução contendo 20% col. de CD3OD. Detalhes experimentais são fornecidos no artigo de Zhong et al., do qual a figura foi retirada (acesso aberto). A numeração 5,3 representa dois sinais sobrepostos.

Esquerda: (a) Dependência da temperatura dos três deslocamentos de 13C da β-pirrol atribuídos de Pa cyt551 WT (quadrados pretos) em comparação com aqueles dos dois picos com atribuições ambíguas (losangos azuis, triângulos vermelhos). (b) Dependência da temperatura dos sete deslocamentos de 13C da α-pirrol atribuídos de Pa cyt551 WT (círculos pretos) em comparação com aqueles dos dois picos com atribuições ambíguas (losangos azuis, triângulos vermelhos). Direita: Mudanças nos deslocamentos químicos indicados causadas pelas mutações indicadas de Ht cyt552, plotadas em função dos termos de energia axial determinados por experimentos de EPR. (a) Deslocamentos de 13C dos carbonos pirrólicos. O deslocamento HH da cadeia lateral do H17 é mostrado para comparação. (b) Deslocamentos de 13C dos carbonos metil e meso, (c) Deslocamentos de 1H dos grupos meso e metil em comparação com o deslocamento do grupo terminal CH3 do M71. Reimpresso com permissão de, 2013, American Chemical Society.