pmid: "37627298"
title: "Interações Moleculares entre Neuroglobina e Citocromo"
authors: "Semenova MA, Chertkova RV, Kirpichnikov MP, Dolgikh DA"
journal: "Biomolecules"
pubdate: "2023 Aug 10"
doi: "10.3390/biom13081233"
source: "PMC Full Text"

Interações Moleculares entre Neuroglobina e Citocromo

Autores

Semenova MA, Chertkova RV, Kirpichnikov MP, Dolgikh DA

Periodico

Biomolecules (2023 Aug 10)

Conteudo

Interações Moleculares entre Neuroglobina e Citocromo c: Possíveis Mecanismos de Defesa Antiapoptótica em Células Neuronais

A neuroglobina, que é uma proteína heme da família das globinas predominantemente expressa no tecido nervoso, pode promover a sobrevivência neuronal. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à função neuroprotetora da Ngb permanecem pouco compreendidos até hoje. As interações entre a neuroglobina e o citocromo c mitocondrial podem servir como pelo menos um dos mecanismos de neuroproteção mediada pela neuroglobina. Curiosamente, a neuroglobina e o citocromo c podem possivelmente interagir com ou sem transferência de elétrons tanto no citoplasma quanto dentro das mitocôndrias. Esta revisão fornece um panorama geral das interações moleculares entre neuroglobina e citocromo c com base no trabalho experimental e computacional recente sobre as interações entre neuroglobina e citocromo c.

1. Introdução

A neuroglobina (Ngb) é uma proteína heme hexacoordenada da família das globinas predominantemente expressa no tecido nervoso. As concentrações intracelulares de Ngb variam de 100 μM nos neurônios do hipotálamo e nas células da retina a 1 μM nos outros neurônios. Além disso, há um aumento médio de 2 a 5 vezes na expressão do gene NGB em resposta a vários sinais de estresse (por exemplo, hipóxia ou estresse oxidativo). A Ngb é uma proteína citoplasmática, embora haja evidências de localização da Ngb não apenas próxima às mitocôndrias, mas também dentro das mitocôndrias. No entanto, a Ngb não possui uma sequência alvo mitocondrial, e o mecanismo exato que regula a localização mitocondrial da Ngb ainda não está claro.

A Ngb é um monômero com peso molecular de cerca de 17 kDa, consiste em oito α-hélices (A-H) e possui um enovelamento globínico típico três-sobre-três. A Ngb contém um grupo heme e, na ausência de ligantes exógenos, as posições de coordenação axial do heme são ocupadas por dois resíduos de histidina (His64-Fe-His96). A Ngb humana apresenta três resíduos de cisteína (Cys46, Cys55 e Cys120), dois dos quais formam uma ponte dissulfeto intramolecular (Cys46–Cys55). A formação de outras pontes dissulfeto intramoleculares na Ngb envolvendo Cys120 e Cys46 ou Cys55 é considerada estericamente impossível. A importância da ponte dissulfeto Cys46–Cys55 é determinada pelo seu efeito na conformação da alça CD (a região entre as α-hélices C e D) e na modulação da funcionalidade da Ngb. Após a clivagem dessa ponte dissulfeto, a ligação entre o ferro heme e a His64 é fortalecida, resultando em uma diminuição de dez vezes na taxa de dissociação da His64. Como consequência, a afinidade da Ngb por ligantes exógenos é reduzida, pois a dissociação da His64 do heme é uma etapa necessária e determinante da taxa para a ligação de ligantes exógenos à Ngb. No entanto, sugere-se que, in vivo, mais de 88% das moléculas de Ngb estejam na forma desoxi ferrosa sem uma ponte dissulfeto.
Semelhante à hemoglobina e à mioglobina, a Ngb liga-se reversivelmente ao O2 e a outros pequenos ligantes gasosos. A Ngb catalisa a reação de desoxigenação do NO, produzindo assim NO3−, bem como a geração de NO a partir de NO2− (atividade de nitrito redutase).

Foi demonstrado que a Ngb promove a sobrevivência neuronal em condições como isquemia, hipóxia, doenças de Alzheimer e Huntington, estresse oxidativo, acidente vascular cerebral, lesão medular, degeneração retiniana, envenenamento por arsênio, etc., em numerosos estudos in vitro e in vivo. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à função neuroprotetora da Ngb permanecem pouco compreendidos até hoje. Como a Ngb pode se ligar ao O2, inicialmente assumiu-se que a Ngb, assim como a mioglobina, atua como um depósito e transportador de O2 sob hipóxia. No entanto, concentrações celulares relativamente baixas de Ngb e uma autoxidação muito rápida contradizem essa suposição.

Hipóteses recentes sugerem que a neuroproteção mediada pela Ngb baseia-se em seu envolvimento em várias cascatas bioquímicas da célula. A Ngb pode desintoxicar espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, e há evidências do envolvimento da Ngb na via Wnt/β-catenina, bem como na via de sinalização PI3K/Akt/MAPK. Além disso, as interações proteína-proteína entre a Ngb e os canais aniônicos dependentes de voltagem (VDACs), subunidades α da proteína G heterotrimérica, e o citocromo c mitocondrial (Cyt c) também podem contribuir para a neuroproteção mediada pela Ngb. Esta revisão está focada nas interações moleculares entre a Ngb e o Cyt c.

O Cyt c mitocondrial, uma proteína heme multifuncional, desempenha um papel crucial como transportador de elétrons na cadeia respiratória. Durante a ativação da apoptose, o Cyt c transloca-se das mitocôndrias para o citoplasma, onde amplifica o sinal apoptótico externo ou inicia a cascata de caspases pela via intrínseca (tornando-a dependente do Cyt c). Além do papel fisiológico da apoptose no tecido nervoso, ela também está associada a condições patológicas, como doenças neurodegenerativas, acidentes vasculares cerebrais, isquemia, hipóxia, etc. Além disso, o início da apoptose ocorre sob a influência de vários estímulos de estresse, incluindo patógenos, radiação, drogas quimioterápicas, estresse oxidativo, etc., que causam disfunção mitocondrial.

O evento-chave da via apoptótica intrínseca é a permeabilização da membrana mitocondrial externa, que leva à liberação de vários fatores pró-apoptóticos, incluindo o Cyt c, no citoplasma. Além disso, a ativação da cascata de caspases depende da eficiência da ligação do Cyt c ao fator 1 ativador de protease apoptótica (Apaf-1), levando assim à montagem do apoptossomo. Deve-se notar que apenas o Cyt c férrico pode se ligar ao Apaf-1, ativando assim a montagem do apoptossomo e desencadeando a cascata de caspases.
A hipótese sobre a interação entre Ngb e Cyt c foi proposta com base nos estudos cinéticos da reação redox entre Ngb(Fe2+) e Cyt c(Fe3+): essa reação foi inicialmente observada por espectroscopia de absorbância sob condições anaeróbicas. De acordo com essa hipótese, o Ngb(Fe2+) reage com o Cyt c(Fe3+) quando este se transloca para o citoplasma durante a ativação da via apoptótica intrínseca. Essa reação impede que o Cyt c(Fe3+) interaja com Apaf-1 e, portanto, previne a montagem do apoptossomo e, em última análise, bloqueia o início da apoptose. Posteriormente, foi hipotetizado que o Ngb pode interagir potencialmente com o Cyt c(Fe3+), independentemente de seu estado redox.
Portanto, o Ngb pode proteger neurônios da apoptose ao reduzir a concentração de Cyt c(Fe3+) citosólico, que pode aumentar sob condições que causam disfunção mitocondrial e durante a função mitocondrial normal (reduzindo a liberação "acidental" de Cyt c).
O objetivo desta revisão é resumir os dados existentes e fornecer uma visão geral das interações moleculares entre Ngb e Cyt c que fundamentam pelo menos um dos mecanismos de neuroproteção mediada por Ngb.
2. Transferência de Elétrons entre Neuroglobina Ferrosa e Citocromo c Férrico
A investigação das interações entre Ngb e Cyt c começou com a observação da transferência de elétrons muito rápida do Ngb(Fe2+) murino recombinante para o Cyt c(Fe3+). A constante de velocidade de segunda ordem para a reação (k = 2 × 10^7 M^−1 s^−1) está próxima das constantes de velocidade das reações redox do Cyt c fisiologicamente significativas conhecidas, por exemplo, a redução da citocromo c oxidase ou a oxidação do citocromo b5. Deve-se notar que, ao contrário do Ngb humano, o Ngb murino não possui a ponte dissulfeto devido à substituição de Cys46 por Gly. Portanto, pode-se concluir que a presença da ponte dissulfeto do Ngb não afeta a transferência de elétrons do Ngb(Fe2+) para o Cyt c(Fe3+).
No entanto, um estudo recente chegou a conclusões um tanto controversas. A transferência de elétrons entre o Ngb(Fe2+) humano recombinante e o Cyt c(Fe3+) foi estudada usando um eletrodo de ouro nanoporoso. A imobilização do Ngb na superfície do eletrodo permitiu a rápida redução do heme do Ngb, após o que o Cyt c(Fe3+) foi adicionado à solução, e sua redução a Cyt c(Fe2+) foi observada. No caso do mutante Ngb C55S sem a ponte dissulfeto (Cys46–Cys55), quase não houve alterações no voltamograma após a adição de Cyt c(Fe3+). Assim, concluiu-se que a ponte dissulfeto tem importância para a transferência de elétrons entre Ngb(Fe2+) e Cyt c(Fe3+). Esses resultados são inconsistentes com os dados obtidos anteriormente sobre a transferência de elétrons entre Ngb(Fe2+) murino e Cyt c(Fe3+). Supõe-se que a formação da ponte dissulfeto do Ngb sob condições de estresse oxidativo é potencialmente capaz de modular a funcionalidade do Ngb. Por exemplo, podemos considerar a transferência de elétrons para o Cyt c(Fe3+) em resposta a mudanças redox na célula.
A transferência de elétrons entre Ngb(Fe2+) e Cyt c(Fe3+) também foi detectada por espectroscopia de fluxo interrompido, enquanto a Ngb humana recombinante foi reduzida com excesso de ditionito de sódio, o que muito provavelmente também levou à clivagem da ponte dissulfeto.

Com base nos dados mencionados, duas hipóteses sobre a interação entre Ngb(Fe2+) e Cyt c(Fe3+) in vivo foram formuladas. De acordo com uma delas, a Ngb(Fe2+) na forma desoxi ferroso, que normalmente prevalece nas células, reduz moléculas de Cyt c(Fe3+) ao sair das mitocôndrias para o citoplasma, convertendo-as em Cyt c(Fe2+), prevenindo assim a montagem do apoptossomo e o desencadeamento da apoptose pela via dependente de Cyt c (Figura 1, I). Deve-se notar que tal mecanismo ocorre sob condições celulares normais, prevenindo assim as consequências da liberação "acidental" de Cyt c(Fe3+) das mitocôndrias, que é um processo constitutivo associado à abertura transitória dos poros VDAC. Embora a liberação "acidental" de Cyt c(Fe3+) seja um processo em pequena escala, o Cyt c(Fe3+) pode se ligar aos receptores de inositol-1,4,5-trifosfato no retículo endoplasmático, causando assim a liberação de Ca2+ para o citoplasma. Um aumento no nível de Ca2+ citosólico estimula ainda mais a liberação de Cyt c(Fe3+) das mitocôndrias, estabelecendo assim um sinal de amplificação contínua da liberação inicial de Cyt c(Fe3+). Portanto, a existência de um mecanismo de reajuste para o nível limiar de Cyt c(Fe3+), por exemplo, via reação redox com Ngb(Fe2+), é altamente provável. Essa hipótese também explica a localização predominante da Ngb em neurônios e células da retina em altas concentrações. Essas células altamente especializadas e metabolicamente ativas experimentam fluxos elevados e frequentes de Ca2+ celular durante seu funcionamento fisiológico normal. Como resultado, esses tipos celulares podem ter uma tendência a sofrer morte celular programada como consequência da liberação "acidental" de Cyt c(Fe3+) no citoplasma. Portanto, concentrações celulares mais altas de Ngb são necessárias para proteger essas células da apoptose. Essa hipótese é ainda apoiada pelos dados sobre a localização da Ngb nas proximidades das mitocôndrias. É importante notar que, de acordo com esse mecanismo, a Ngb pode suprimir o desencadeamento do processo apoptótico por meio da liberação "acidental" de Cyt c(Fe3+), enquanto ainda permite que a morte celular programada comprometida ocorra sob circunstâncias apropriadas.
De acordo com outra hipótese, a transferência de elétrons do Ngb(Fe2+) para o Cyt c(Fe3+) ocorre apenas na presença da ponte dissulfeto na estrutura do Ngb, o que corresponde às condições de estresse oxidativo. Em apoio a essa ideia, a expressão do gene NGB é regulada positivamente em resposta a vários sinais de estresse. Além disso, embora a concentração celular de Ngb seja primariamente alta apenas em neurônios e células da retina, ela pode aumentar em outros tipos celulares sob condições de estresse celular a um nível suficiente para a proteção mediada por Ngb contra a apoptose. Essa hipótese contradiz a descrita acima, mas não vice-versa. É bastante provável que a transferência de elétrons do Ngb(Fe2+) para o Cyt c(Fe3+) seja possível em ambos os casos: do Ngb(Fe2+) com a ponte dissulfeto e do Ngb(Fe2+) com cisteínas reduzidas. Nesse caso, a ponte dissulfeto pode desempenhar um papel crucial na modulação dessa reação de transferência de elétrons sob as condições redox correspondentes. Deve-se notar que, sob condições de estresse oxidativo, não apenas os resíduos de cisteína, mas também o heme do Ngb podem ser oxidados, o que levará à incapacidade do Ngb de atuar como doador de elétrons para o Cyt c. Além disso, um sistema redutor do Ngb in vivo ainda é desconhecido, embora várias tentativas tenham sido feitas para identificá-lo. Portanto, no caso da oxidação do heme do Ngb, a interação com o Cyt c é interrompida ou segue outros mecanismos sem transferência de elétrons.

Assim, os estudos sobre a transferência de elétrons entre Ngb(Fe2+) e Cyt c(Fe3+) são bastante inconsistentes e limitados. Essa inconsistência surge das dificuldades experimentais, como a preparação de Ngb ferroso puro sem um agente redutor como consequência da alta taxa de auto-oxidação do Ngb (0,23 ± 0,03 min⁻¹). As moléculas do agente redutor podem competir com o Ngb(Fe2+) pela redução das moléculas de Cyt c(Fe3+) na solução; portanto, surge a possibilidade de resultados falso-positivos. Outro desafio é a impossibilidade de usar uma estratégia clássica para o estudo da transferência de elétrons entre citocromos e hemoglobinas. Essa estratégia utiliza a diferença na ligação ao CO entre citocromos hexacoordenados e hemoglobinas pentacoordenadas, que não pode ser usada devido à natureza hexacoordenada do Ngb. É evidente que são necessários mais estudos da transferência de elétrons entre Ngb(Fe2+) e Cyt c(Fe3+) com abordagens alternativas.

3. Interações entre Neuroglobina e Citocromo c sem Transferência de Elétrons
   Devido ao fato de os estudos de transferência de elétrons Ngb(Fe2+)-Cyt c(Fe3+) serem desafiadores, as interações entre as formas férricas de Ngb e Cyt c também foram investigadas. Diversas técnicas, incluindo calorimetria de titulação isotérmica (ITC), RMN de 1H, ressonância de plásmons de superfície (SPR) e nanopipetas de quartzo, foram empregadas para examinar a formação de um complexo transiente Ngb–Cyt c. A constante de dissociação de equilíbrio para este complexo foi relatada na faixa de 10 a 45 µM. Esses valores são comparáveis às constantes de dissociação de equilíbrio conhecidas para o complexo redox Cyt c–citocromo c peroxidase. Essas descobertas suportam a formação de um complexo redox Ngb–Cyt c de curta duração. Além disso, verificou-se que um aumento na força iônica da solução causa um aumento na constante de dissociação de equilíbrio (em até 120 µM). Essa dependência da força iônica da solução indica o envolvimento de interações eletrostáticas entre as proteínas no processo de formação do complexo Ngb–Cyt c. Ademais, em pH neutro, a Ngb (pI 4,6) possui carga negativa, enquanto a Cyt c (pI 10,2) possui carga positiva, confirmando ainda mais o papel das interações eletrostáticas na formação do complexo Ngb–Cyt c.
   Deve-se notar que a presença da ponte dissulfeto da Ngb não afeta a estabilidade do complexo Ngb–Cyt c, uma vez que não há diferenças entre as constantes de dissociação de equilíbrio para os complexos de Cyt c com Ngb humana e de rato recombinantes.

A maioria dos estudos sobre a interação entre Ngb férrica e Cyt c tem se concentrado na confirmação da formação do complexo transiente Ngb–Cyt c para a transferência de elétrons de Ngb(Fe2+) para Cyt c(Fe3+), em vez da demonstração de uma interação fisiologicamente significativa entre as formas férricas dessas proteínas. No entanto, foi levantada a hipótese de que a interação entre Ngb(Fe3+) e Cyt c(Fe3+) pode ser suficiente para inibir o início da apoptose pela via dependente de Cyt c (Figura 1, II). Esta hipótese baseia-se nos resultados obtidos por um modelo quantitativo que simulou eventos apoptóticos. Verificou-se que a interação de Ngb(Fe3+) e Cyt c(Fe3+) poderia bloquear a via de apoptose intrínseca. No entanto, os autores enfatizaram que concentrações intracelulares mais altas de Ngb são necessárias neste caso em comparação ao cenário onde ocorre uma reação redox entre Ngb(Fe2+) e Cyt c(Fe3+). Esta ideia é ainda apoiada pelos dados computacionais sobre o envolvimento da Lys72 da Cyt c na formação do complexo Ngb(Fe3+)–Cyt c(Fe3+). A Lys72 da Cyt c também é um resíduo chave envolvido na formação do complexo Cyt c(Fe3+)–Apaf-1. Portanto, sugere-se que Ngb e Apaf-1 competem pela interação com Cyt c(Fe3+), o que pode reduzir a quantidade de apoptossomos montados e interferir no desencadeamento de eventos apoptóticos posteriores.
Deve-se enfatizar que a constante de dissociação de equilíbrio determinada experimentalmente para o complexo Ngb–Cyt c é cinco ordens de grandeza maior que a constante de dissociação de equilíbrio do complexo Cyt c com Apaf-1 (10−10 M). Nesse sentido, se Ngb e Apaf-1 se ligarem competitivamente ao Cyt c, a probabilidade de formação de complexos Cyt c–Apaf-1 é maior. Além disso, na ausência da transferência de elétrons entre Ngb e Cyt c, este último não perderá suas propriedades pró-apoptóticas como resultado dessa interação. Portanto, pode-se considerar improvável que a interação entre as formas férricas de Ngb e Cyt c possa efetivamente prevenir o desencadeamento da apoptose. No entanto, as afinidades de ligação determinadas apenas com proteínas isoladas podem não representar a verdadeira natureza das interações no ambiente celular. Vários outros fatores, como sítios de ligação, a quantidade de Cyt c liberado e as concentrações celulares de Ngb e Apaf-1, podem desempenhar papéis importantes nas interações proteína–proteína. Assim, é possível que a interação entre a Ngb férrica e o Cyt c contribua para a funcionalidade da Ngb como uma proteína antiapoptótica; no entanto, essa contribuição provavelmente é menor.

Assim, a interação entre Ngb e Cyt c parece ser composta por duas etapas: (1) a convergência das moléculas de proteína e a formação do complexo de curta duração, principalmente devido a interações eletrostáticas; (2) a transferência de elétrons de Ngb(Fe2+) para Cyt c(Fe3+), seguida pela dissociação do complexo.

4. Interações entre Neuroglobina e Citocromo c como um Mecanismo de Bloqueio para a Via Intrínseca da Apoptose

As interações entre Ngb e Cyt c como um dos mecanismos da função neuroprotetora da Ngb implicam o bloqueio do desencadeamento da apoptose pela via intrínseca. Portanto, a eficácia desse mecanismo pode ser avaliada pela redução de eventos de morte celular programada e pela diminuição da atividade de caspase. Foi demonstrado que a superexpressão do gene NGB na linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y (com uma concentração celular de Ngb de cerca de 5 μM) aumentou sua resistência à apoptose induzida pela inibição das proteínas Bcl-2 em comparação com a linhagem celular selvagem. Vale notar que a inibição das proteínas Bcl-2 sugere o desencadeamento da apoptose especificamente pela via intrínseca. Experimentos in vitro mostraram que a adição de Ngb e Cyt c(Fe3+) a um lisado celular contendo componentes principais do apoptossomo (dATP, Apaf-1 e procaspase 9) levou a uma diminuição significativa na atividade da caspase 9 em comparação com o experimento em que apenas Cyt c(Fe3+) foi adicionado. Esses achados destacam a função neuroprotetora da Ngb na inibição da via intrínseca da morte celular apoptótica.

A análise por espectrometria de massas revelou a interação entre Ngb e Cyt c em lisado celular neuronal murino (HN33) hipóxico, enquanto nenhuma interação desse tipo foi observada em lisado celular normóxico.
Apesar de um grande número de estudos experimentais e computacionais sobre a interação entre Ngb e Cyt c, a questão da localização subcelular desse processo não é totalmente compreendida. A Ngb pode ser localizada não apenas nas proximidades das mitocôndrias, mas também dentro das mitocôndrias. Além disso, sob privação de oxigênio e glicose (OGD), ocorre um aumento relativo nas concentrações mitocondriais de Ngb (em comparação com as concentrações citosólicas) em neurônios corticais murinos cultivados primários e nas células SH-SY5Y. A OGD leva ao desencadeamento da apoptose através da via dependente de Cyt c. Além disso, a superexpressão do gene NGB sob OGD levou a uma diminuição nas concentrações citosólicas de Cyt c (em comparação com a linhagem celular selvagem), o que indica a inibição da liberação de Cyt c das mitocôndrias. Por um lado, esses resultados podem ser explicados pela interação da Ngb com VDACs (Figura 1, III). Por outro lado, é possível que a interação Ngb–Cyt c no espaço intermembranar também seja causal para a diminuição da liberação de Cyt c das mitocôndrias (Figura 1, I e II). Em apoio a esta última, após a OGD de células SH-SY5Y, foi demonstrada a colocalização de Ngb e Cyt c nas mitocôndrias.
A realocação da Ngb para as mitocôndrias sob a influência do hormônio esteroide sexual 17β-estradiol também foi relatada durante a apoptose induzida por H2O2 em neuroblastoma humano SK-N-BE cells. A associação de Ngb e Cyt c dentro das mitocôndrias e uma diminuição nos níveis citosólicos de Cyt c, juntamente com uma diminuição na atividade da caspase 3, foram observadas sob tais condições.
Portanto, a interação entre Ngb e Cyt c pode ocorrer não apenas no citoplasma nas proximidades das mitocôndrias, mas também no espaço intermembranar mitocondrial, evitando assim a liberação de Cyt c das mitocôndrias. Vale ressaltar que essa localização da interação Ngb–Cyt c permite evitar a competição pela ligação ao Apaf-1 no citoplasma.
5. Modelagem do Complexo Neuroglobina–Citocromo c
Complexos de proteínas redox são caracterizados por constantes de dissociação relativamente altas e, consequentemente, existem por um curto período de tempo. Assim, o isolamento e a determinação da estrutura de tais complexos são desafiadores. Embora muitos processos de transferência intermolecular de elétrons tenham sido identificados, poucos complexos redox foram isolados, nem suas estruturas foram determinadas. Nesse sentido, métodos computacionais são amplamente utilizados para identificar as estruturas putativas de complexos de proteínas redox.
Em particular, o docking molecular foi empregado para modelar a estrutura do complexo Ngb–Cyt c, conforme relatado em diversas publicações. Além disso, a predição do AlphaFold2 e a dinâmica molecular foram utilizadas. Em alguns estudos, métodos computacionais foram combinados com técnicas experimentais como SPR, ITC e espectroscopia de fluxo interrompido. Especificamente, foram investigadas interações entre variantes mutantes de Ngb ou peptídeos da sequência de Ngb (com e sem mutações) e Cyt c do tipo selvagem, bem como vice-versa. Essa abordagem permitiu a identificação de resíduos de aminoácidos da superfície de interação proteína–proteína. Os resultados desses estudos são apresentados na Tabela 1.
Os resíduos de aminoácidos de Ngb presumivelmente envolvidos em sua interação com Cyt c pertencem às α-hélices E e F que circundam o grupo heme (Figura 2). A maioria dos resíduos de aminoácidos de Cyt c da putativa superfície de interação com Ngb pertencem ao sítio de ligação universal de Cyt c, que é um aglomerado de resíduos de Lys na superfície localizados ao redor da cavidade do heme, ou ao loop Ω vermelho (70–85).
Os achados da modelagem das superfícies de ligação e a identificação de resíduos de aminoácidos-chave nas superfícies de Ngb e Cyt c corroboram a noção de que as interações eletrostáticas são cruciais para a formação do complexo transiente Ngb–Cyt c, conforme relatado anteriormente. Particularmente, os resíduos de aminoácidos carregados negativamente de Ngb Glu60, Asp63, Asp73 e Glu87, bem como os resíduos de aminoácidos carregados positivamente de Cyt c Lys25, Lys27 e Lys72, estão envolvidos na interação. Notavelmente, a Lys72 de Cyt c é o resíduo-chave envolvido na formação do complexo Cyt c(Fe3+) com Apaf-1, com o resíduo periférico Lys25 também contribuindo para a formação do complexo. Assim, o envolvimento desses resíduos de aminoácidos de Cyt c na formação do complexo transiente Ngb–Cyt c pode sugerir a inibição competitiva da formação do complexo Cyt c(Fe3+)–Apaf-1 por Ngb.
Além disso, interações hidrofóbicas, envolvendo a Ile81 de Cyt c, e ligações de hidrogênio, como Thr77(Ngb)–Lys7(Cyt c) e Val99(Ngb)–Gln16(Cyt c), também provavelmente contribuem para a estabilização do complexo Ngb–Cyt c.
Assim, a suposta superfície de interação Ngb–Cyt c foi determinada por uma combinação de métodos computacionais e empíricos. No entanto, são necessários estudos adicionais para esclarecer a superfície real de interação Ngb–Cyt c, os quais incluem estudos como aqueles sobre as interações entre Ngb e Cyt c utilizando variantes mutantes de proteínas. Até o momento, apenas alguns estudos investigaram a contribuição de resíduos individuais da Ngb para a formação do complexo Ngb/Cyt c usando variantes mutantes da Ngb ou peptídeos da sequência de aminoácidos da Ngb (com e sem mutações). Além disso, o envolvimento de apenas um resíduo (Ile81) da Cyt c na formação do complexo transitório Ngb–Cyt c foi investigado. A determinação da superfície de interação Ngb–Cyt c, bem como a identificação dos principais resíduos envolvidos nessa interação, são necessárias para compreender os mecanismos subjacentes à função neuroprotetora da Ngb.
6. Conclusões
Esta revisão apresenta um resumo abrangente dos dados disponíveis sobre as interações moleculares entre Ngb e Cyt c, que são duas proteínas heme. O conjunto de evidências existentes apoia fortemente a interação in vivo entre Ngb e Cyt c, a qual representa pelo menos um mecanismo subjacente à função neuroprotetora da Ngb. No entanto, são necessárias investigações adicionais para elucidar a estrutura do complexo redox Ngb–Cyt c, bem como para esclarecer a importância da reação de transferência de elétrons para uma neuroproteção eficaz. Além disso, o papel da ponte dissulfeto da Ngb na modulação de sua interação com Cyt c, que envolve a localização subcelular dessa interação, bem como a contribuição desse mecanismo para a função neuroprotetora da Ngb em comparação com outros mecanismos conhecidos, requerem exploração adicional. A compreensão dos mecanismos subjacentes à neuroproteção mediada pela Ngb é crucial para avançar em direção a aplicações práticas potenciais, incluindo o design racional de medicamentos baseados na Ngb visando a terapia de várias doenças associadas à morte apoptótica de células neuronais.
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Contribuições dos Autores
Conceituação, R.V.C., M.A.S. e D.A.D.; recursos, D.A.D., M.P.K. e R.V.C.; preparação do rascunho original, M.A.S. e R.V.C.; redação — revisão e edição, M.A.S., R.V.C. e D.A.D.; visualização, M.A.S.; supervisão, D.A.D. e M.P.K.; administração do projeto, R.V.C.; aquisição de financiamento, R.V.C. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Comitê de Revisão Institucional
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Esta revisão sistematizou e analisou dados de pesquisa publicamente disponíveis e previamente publicados.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Uma globina de vertebrado expressa no cérebro
Como o olho respira? Evidências do suprimento de oxigênio mediado pela neuroglobina na retina de mamíferos
A distribuição divergente em retinas de mamíferos vasculares e avasculares liga a neuroglobina à respiração celular
Expressão de neuroglobina no cérebro: Uma história de preservação da homeostase tecidual
Neuroglobina na neurodegeneração retiniana: Um alvo potencial em abordagens terapêuticas
Identificação de proteínas que interagem com a neuroglobina usando triagem de duplo-híbrido em levedura
Distribuição mitocondrial da neuroglobina e sua resposta à privação de oxigênio-glicose em neurônios corticais de camundongo em cultura primária
A regulação positiva da neuroglobina induzida por 17β-estradiol sequestra o citocromo c nas mitocôndrias prevenindo a apoptose induzida por H2O2 em células de neuroblastoma
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PDGF-BB preserva a morfologia mitocondrial, atenua a produção de ROS e regula positivamente a neuroglobina em um modelo astrocítico sob estímulo de rotenona
Conectando os pontos na rede de interação neuroglobina-proteína de um modelo de neuroblastoma sem estresse e com morte celular ferroptótica
Doença de Alzheimer prodrômica: Regulação positiva constitutiva da neuroglobina previne o início da patologia de Alzheimer
Peróxido de hidrogênio induz degradação do heme e agregação proteica na neuroglobina humana: Papéis da ponte dissulfeto e das ligações de hidrogênio na cavidade distal do heme
Neuroglobina regula a via de sinalização Wnt/β-catenina e NFκB através de Dvl1
Neuroglobina promove neurogênese através da via de sinalização Wnt
Neuroglobina protege células astrogliais do estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio e da morte celular apoptótica
Papel compensatório da neuroglobina em células cancerosas nervosas e não nervosas em resposta à privação de nutrientes
A superexpressão de neuroglobina inibe a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial induzida pela privação de oxigênio-glicose em neurônios corticais de camundongos cultivados primariamente
A neuroglobina humana oxidada atua como um inibidor de dissociação de nucleotídeo guanina da proteína Gα heterotrimérica
Base molecular da atividade inibidora de dissociação de nucleotídeo guanina da neuroglobina humana por ligação cruzada química e espectrometria de massas
A função neuroprotetora da neuroglobina humana está correlacionada com sua atividade inibidora de dissociação de nucleotídeo guanina
A reação da neuroglobina com potenciais parceiros proteicos redox citocromo b5 e citocromo c
Citocromo c: Funções além da respiração
Citocromo c: O calcanhar de Aquiles na apoptose
Citocromo c multifuncional: Aprendendo novos truques de um velho cão
Citocromo c: Uma proteína extremamente multifuncional com um papel fundamental no destino celular
Morte celular
A reunião da família BCL-2
Estresse oxidativo na morte celular e doenças cardiovasculares
Regulação da apoptose pelo estado redox do citocromo c
Um papel neuroprotetor antiapoptótico para a neuroglobina
A neuroglobina protege as células nervosas da apoptose ao inibir a via intrínseca de morte celular
Investigando interações moleculares entre neuroglobina oxidada e citocromo c
Novas perspectivas sobre o mecanismo de transferência de elétrons no citocromo c mitocondrial
Eletrodos de base de ouro nanoporoso para estudos eletroquímicos de neuroglobina humana
Cargas superficiais negativas na neuroglobina modulam a interação com o citocromo c
O poro de transição de permeabilidade mitocondrial na morte celular: Uma bioarquitetura promissora para ligação de fármacos
Direcionando o poro de transição de permeabilidade mitocondrial para prevenir danos celulares associados à idade e neurodegeneração
O poro de transição de permeabilidade mitocondrial—Conhecimento atual de sua estrutura, função e regulação, e métodos otimizados para avaliar seu estado funcional
O citocromo c se liga aos receptores de inositol (1,4,5) trisfosfato, amplificando a apoptose dependente de cálcio
Neuroglobina e citoglobina como potencial enzima ou substrato
Falha do fator indutor de apoptose em atuar como neuroglobina redutase
A ligação do citocromo c à neuroglobina: Um estudo de docking e ressonância plasmônica de superfície
Estudo quantitativo das interações proteína-proteína por nanopipetas de quartzo
Caracterização do mecanismo molecular da ligação da neuroglobina ao citocromo c: Um estudo de ressonância plasmônica de superfície e calorimetria de titulação isotérmica
Complexo citocromo c/citocromo c peroxidase: Efeito das mutações no sítio de ligação na termodinâmica da formação do complexo
Complexo citocromo c peroxidase−citocromo c: Localização do segundo domínio de ligação na citocromo c peroxidase com mutagênese sítio-dirigida
Variação interespecífica nas consequências funcionais da mutação do citocromo c
Ligação do citocromo c ao Apaf-1: Os efeitos do dATP e da força iônica
Interatômica proteica comparativa da neuroglobina e mioglobina
A hemina protege contra a ativação da apoptose induzida por privação de oxigênio-glicose via neuroglobina em células SH-SY5Y
Neuroglobina como regulador da apoptose dependente de mitocôndrias: Uma análise bioinformática
Investigação computacional do complexo de transferência de elétrons entre neuroglobina e citocromo c
Mutação I81N naturalmente ocorrente no citocromo c humano regula tanto a atividade intrínseca de peroxidase quanto as interações com a neuroglobina
Estrutura tridimensional de alta resolução do citocromo c cardíaco de cavalo
Possíveis mecanismos moleculares da neuroproteção mediada por Ngb através de interações diretas ou indiretas com Cyt c: I—reação de transferência de elétrons, resultando em Cyt c incapaz de formar apoptossomo via sua interação com Apaf-1; II—formação de complexo entre as formas férricas de Ngb e Cyt c; III—prevenção da liberação de Cyt c no citoplasma via interação de Ngb com VDACs.
Superfície de interação putativa de Ngb (a) (ID PDB: 4MPM) e Cyt c (b) (ID PDB: 1HRC). Os resíduos de aminoácidos de Ngb e Cyt c são mostrados codificados em cores de acordo com a escala da imagem. Ela expressa o número de publicações onde esses resíduos de aminoácidos foram indicados como envolvidos na interação Ngb–Cyt c. Partes da sequência proteica de Ngb (c) e Cyt c (d) com esses aminoácidos também são mostradas. A imagem foi gerada com o programa PyMOL.
Resíduos de aminoácidos envolvidos na formação do complexo Ngb–Cyt c. Vários resíduos em uma proteína que estabelecem contato interfacial com outra proteína são separados por vírgula nas mesmas linhas. Os resíduos identificados em três ou mais estudos estão em negrito.
Resíduos de Ngb Resíduos de Cyt c Métodos Ref. E60 K72 Docking molecular (BiGGER) E87 K25 R66 D50 E60 K72 Docking molecular (ZDOCK, PatchDock, GRAMM-X, PDBePISA) E87 K25 E87 K27 S84 P76 Docking molecular (ZDOCK) D73 K73 heme K72 R66 Q16 heme K79 V99 Q16 Docking molecular (ZDOCK), dinâmica molecular (GROMACS) E87, Y88, S91 Q16 Docking molecular (ZDOCK), dinâmica molecular (NAMD) E87 K27 S84 T28 L70, D73, T77 K72 T77, N78 K79 K67, L70, V71, A74, L85, Y88, heme I81 L70 F82 K67, L70 A83 L85, Y88 heme D73 K72 Docking molecular (ZDOCK), dinâmica molecular (NAMD), RPS (Cyt c e peptídeos da sequência de Ngb (com e sem mutações) E87 K27 T77 K72 D73, D63, E60, E87 Espectroscopia de fluxo interrompido (Cyt c e mutantes de Ngb) L70, Y88, K67, K95 Docking molecular (ZDOCK) baseado em dados de espectroscopia de fluxo interrompido K25, K27, K72 D73 K72 Predição do Alphafold2 D63 K86 S91 Q16 K95 Q16 L70, V71, A74, L85, Y88 I81 Predição do Alphafold2, ITC (Ngb e Cyt c mutante)