pmid: "39907650"
title: "Avaliação sem Eletrodos e sem Marcadores das Taxas de Disparo Eletrofisiológico através do Monitoramento do Citocromo C por Espectroscopia Raman."
authors: "Tentellino C, d'Amora M, Melikov R, Iachetta G, Bruno G, Tantussi F, Dipalo M, De Angelis F"
journal: "ACS sensors"
pubdate: "2025 Feb 28"
doi: "10.1021/acssensors.4c03133"
source: "PMC Full Text"

Avaliação sem Eletrodos e sem Marcadores das Taxas de Disparo Eletrofisiológico através do Monitoramento do Citocromo C por Espectroscopia Raman.

Autores

Tentellino C, d'Amora M, Melikov R, Iachetta G, Bruno G, Tantussi F, Dipalo M, De Angelis F

Periodico

ACS sensors (2025 Feb 28)

Conteudo

Avaliação Livre de Eletrodos e Marcadores das Taxas de Disparo Eletrofisiológico por meio do Monitoramento do Citocromo C via Espectroscopia Raman

A neurotoxicologia in vitro visa avaliar e prever os efeitos colaterais de substâncias químicas exógenas no cérebro humano. Dentre as abordagens exploradas, as técnicas eletrofisiológicas se destacam pela alta resolução espaço-temporal e sensibilidade, sendo o patch clamp considerado a técnica padrão ouro para tais fins. No entanto, a toxicidade estrutural e os efeitos metabólicos podem escapar da detecção quando apenas a atividade elétrica é medida, destacando a necessidade de integrar registros eletrofisiológicos com abordagens complementares, como métodos ópticos. Neste estudo, descrevemos uma plataforma integrada para registrar a atividade elétrica neuronal e realizar análises químicas com uma imagem óptica não invasiva e sem marcadores, a espectroscopia Raman. Especificamente, desenvolvemos um protocolo que maximiza a relação sinal-ruído, evitando a interferência cruzada das leituras elétricas e espectroscópicas e qualquer fototoxicidade associada à exposição ao laser. Medições óptico-elétricas síncronas e sequenciais foram realizadas e comparadas, sendo a abordagem sequencial mais adequada para a investigação longitudinal e correlação da atividade elétrica neuronal com o conteúdo intracelular de citocromo C reduzido, lipídios, proteínas e ácidos nucleicos. A análise de dados mostra uma forte correlação entre o status metabólico das células individuais e a taxa geral de disparo neuronal, sugerindo a avaliação livre de eletrodos e marcadores das taxas de disparo neuronal por meio do monitoramento do citocromo C via espectroscopia Raman quando dispositivos de matriz de multieletrodos com alto ruído elétrico e impedância são utilizados. Por outro lado, a taxa de disparo neuronal e o conteúdo de citocromo C reduzido não foram correlacionados com lipídios, proteínas e ácidos nucleicos. Assim, este estudo demonstra a interferência cruzada entre a taxa de disparo neuronal e o citocromo C reduzido como características a jusante e a montante da atividade metabólica neuronal e que, por meio do monitoramento da síntese de novo de lipídios, proteínas e ácidos nucleicos, a espectroscopia Raman fornece informações adicionais para uma avaliação mais precisa da neurotoxicidade aguda e crônica.
Até o momento, o desenvolvimento de esferoides e organoides cerebrais auto-organizáveis baseados em células-tronco pluripotentes induzidas de animais e humanas, que recapitulam a complexa citoarquitetura do cérebro, tem sido amplamente utilizado para desvendar a neurotoxicidade. Isso é exemplificado por Nzou et al., que reproduziram com sucesso a barreira hematoencefálica em um esferoide de córtex humano, e Takayama et al., que reproduziram com sucesso um sistema nervoso autônomo in vitro, permitindo o controle dos batimentos dos cardiomiócitos por meio da estimulação de neurônios simpáticos e parassimpáticos.

Embora os modelos neuronais estejam avançando muito rapidamente, as técnicas comercialmente disponíveis para a investigação da neurotoxicidade ainda sofrem de limitações significativas. Nesse sentido, o desenvolvimento de métodos que forneçam uma leitura não destrutiva e longitudinal das alterações bioquímicas neuronais que ocorrem em eventos fisiológicos e citotóxicos seria extremamente benéfico para aumentar a confiabilidade e a precisão.

Em neurotoxicologia, as avaliações de toxicidade de medicamentos comumente exploram uma variedade de medições elétricas e ópticas, sendo o patch clamp e a microscopia de fluorescência as técnicas de referência em cada campo. No entanto, essas leituras são perturbadoras para as amostras biológicas, incapazes de realizar medições longitudinais e geralmente realizadas separadamente. Assim, seu poder preditivo é reduzido, ao mesmo tempo em que aumentam o tempo e os custos. Com essas premissas, o desenvolvimento de uma ferramenta de investigação multivariável longitudinal e sinérgica que permita a correlação de diferentes características biológicas em resposta ao tratamento medicamentoso representaria uma tecnologia pioneira e provavelmente permitiria desvendar a neurotoxicidade anteriormente “oculta”. Claramente, isso requer o uso de métodos não destrutivos e com perturbação mínima ou ausente das condições fisiológicas. Os dispositivos de matriz de microeletrodos (MEA) permitem a leitura elétrica não invasiva de longo prazo de redes celulares com alta resolução espaço-temporal, com a principal desvantagem representada pelo alto ruído elétrico e impedância quando tamanhos de eletrodos pequenos (diâmetro = <5 μM) são usados.
Da mesma forma, a espectroscopia Raman é uma técnica de imageamento óptico livre de marcadores que oferece uma leitura sobre fenótipos celulares, vias metabólicas e estresse celular até o nível molecular. Portanto, a combinação da espectroscopia Raman com gravações de MEA forneceria uma ferramenta formidável para a investigação de culturas neuronais, integrando leituras elétricas em tempo real e livres de marcadores com insights biomoleculares, permitindo o monitoramento simultâneo e em tempo real das respostas bioquímicas e das mudanças na atividade neuronal. A espectroscopia Raman também pode monitorar a dinâmica do citocromo C, uma biomolécula endógena que contribui para a fosforilação oxidativa (OxPhos) e a síntese de trifosfato de adenosina (ATP), a fonte de combustível das células, atuando como uma lançadeira de elétrons entre o terceiro e o quarto complexo da cadeia de transporte de elétrons (ETC). Vale notar que a citocromo C oxidase, o quarto complexo enzimático da ETC, é um biomarcador bem estabelecido da saúde neuronal. Consequentemente, a atividade elétrica neuronal, uma característica eletrofisiológica associada a culturas neuronais saudáveis, depende estritamente da OxPhos e modula alostericamente a atividade enzimática da citocromo C oxidase, a enzima limitante da taxa da ETC, sugerindo assim que um conteúdo aumentado de citocromo C reduzido pode refletir a atividade neuronal geral e representa um biomarcador para acompanhar a atividade e o estado de saúde neuronal.
Até o momento, a implementação de meios eletrofisiológicos e da espectroscopia Raman para a avaliação de culturas neuronais tem sido prejudicada por desafios técnicos como (i) o meio biológico fluorescente avassalador que interfere na coleta do espalhamento Raman originado da amostra após sua exposição à luz visível; notavelmente, a seção de choque total do espalhamento Raman é de cerca de 10–30 cm² por ligação química, indicando como um nível mínimo de fluorescência pode facilmente obscurecer o espalhamento Raman; (ii) a relação de quarta potência entre o comprimento de onda de excitação e o espalhamento Raman, "forçando" o uso de fontes visíveis em vez de fontes NIR para a extração de características Raman com uma alta relação sinal-ruído; (iii) a fototoxicidade mediada pela absorção de luz visível por bioespécimes, restringindo a exploração do laser de 532 nm para estudos biológicos; (iv) o longo tempo para aquisição de imagens devido à baixa seção de choque do espalhamento Raman; (v) um fundo fluorescente ruidoso associado ao material de isolamento da MEA, como o nitreto de silício, que prejudica um imageamento elétrico e Raman integrado; (vi) desafios adicionais correspondentes à personalização de qualquer instrumento dependendo da instrumentação disponível. No entanto, como mostraremos neste trabalho, o caminho para a combinação de MEA e espectroscopia Raman é de fato possível.
Aqui, combinamos com sucesso o monitoramento da atividade eletrofisiológica usando MEA e medições de Raman em células primárias neuronais de rato, fornecendo assim a primeira plataforma integrada "comprovação de conceito".
Demonstramos uma correlação estreita entre as taxas de disparo neuronal e os níveis intracelulares de citocromo C reduzido, monitorados em nível de célula única por espectroscopia Raman. Essa descoberta estabelece uma base para um método óptico sem marcadores e sem eletrodos para avaliar a atividade de disparo neuronal.
Para este fim, implementamos um novo protocolo baseado em aquisições síncronas e sequenciais repetidas de dados eletrofisiológicos e espectros Raman para explorar qualquer interferência cruzada entre as duas leituras.
Apesar da utilização de um laser energético, como a excitação no comprimento de onda de 532 nm, o protocolo limita com sucesso a fototoxicidade celular induzida pelo laser, maximizando ao mesmo tempo a qualidade do sinal e a consistência entre os conjuntos de dados.
A interferência cruzada peculiar entre a atividade neuronal e o conteúdo de citocromo C reduzido foi ainda validada pela comparação com diferentes bioespécimes, como lipídios, proteínas e ácidos nucleicos. Notavelmente, a dinâmica de lipídios, proteínas e ácidos nucleicos após o tratamento químico de culturas neuronais pode ser uma característica adicional para correlacionar com o tratamento medicamentoso, destacando as informações adicionais fornecidas pela integração de uma leitura óptica e eletrofisiológica.
Seção Experimental
Composições de Meio de Cultura e Cultura de Células
Neurônios hipocampais primários de rato foram adquiridos da Lonza (R-HI-501, Lonza Walkersville, Estados Unidos). O meio recomendado para esta linhagem celular é o PNGM Primary Neuron Growth Medium BulletKit (Lonza, Lonza Walkersville, Estados Unidos). Como para as medições de Raman era necessário um meio sem vermelho de fenol, o meio Neurobasal A sem vermelho de fenol da Thermo Fisher Scientific foi escolhido. O meio Neurobasal A sem vermelho de fenol foi suplementado com o Suplemento B27 sem antioxidantes (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA), L-glutamina (2 mM), gentamicina (50 μg/mL), anfotericina (37 ng/mL) e fator sérico neural 1 (NSF1, 2%) (dos Suplementos de Crescimento SingleQuots PNGM da Lonza).
Brevemente, os chips foram esterilizados sob exposição UV por 30 min em uma capela de cultura celular. Após a esterilização, a área de superfície de cultura dos MEAs foi revestida com uma solução de poli-D-lisina (30 μg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e laminina (2 μg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH = 7,4, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) por 1 h à temperatura ambiente para aumentar a adesão e proliferação celular nos chips. Em seguida, os dispositivos foram lavados três vezes com água estéril (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e secos dentro da capela antes do plaqueamento celular. Neurônios primários do hipocampo de rato foram plaqueados nos dispositivos e incubados (37 °C, 5% CO2, 95% de umidade) por 4 h. Após a adesão, uma porção do meio foi suavemente removida, e um meio fresco e pré-aquecido foi introduzido. A cultura celular foi mantida por 3 semanas. No dia 5, 50% do meio foi substituído por um meio fresco e pré-aquecido, e a mesma troca de meio foi realizada a cada 3–4 dias.
Espectroscopia Raman
Um instrumento Renishaw inVia foi utilizado para imageamento Raman. As amostras foram imageadas usando um comprimento de onda de excitação de 532 nm, uma potência de laser de 13 mW na objetiva, uma objetiva de lente de imersão em água de 60× (NA = 1), um centro de pico configurado em 1200 cm–1, um tempo de integração de 0,4 s, 1 acumulação, um tamanho de passo de aquisição de 1,5 ou 3 μm, e modo de alta confocalidade. O tamanho dos mapas Raman coletados na análise sequencial eletrofisiológica–espectroscópica foi de 30 × 30 μm2. O tempo necessário para registrar um mapa Raman de 30 × 30 μm2 foi de 2,5 min.
Processamento de Dados
Os dados de Raman foram coletados e processados em duas etapas, e o pré-processamento ocorreu usando WiRE 5.5 e prosseguiu da seguinte forma: truncamento, remoção de raios cósmicos, filtragem de ruído, subtração de linha de base e suavização. O truncamento foi realizado mantendo o espectro Raman de 500 a 1720 cm–1. A remoção de raios cósmicos foi realizada em duas etapas: (i) usando um método de detecção com o parâmetro de largura e parâmetro de altura definidos como 3 e 15 e (ii) usando o algoritmo do vizinho mais próximo com o nível de ruído definido como 0,89 e um fator de escala de 10, bem como a altura do espectro definida como 6,63 e um fator de escala de 50%. A filtragem de ruído foi baseada em um algoritmo de análise de componentes principais do WiRE 5.5, que resulta na geração de uma interface de software na qual os componentes (expressos como loadings) podem ser selecionados manualmente para discriminar o ruído dos sinais Raman. A subtração da linha de base ocorreu usando uma ordem polinomial e tolerância de ruído de 12 e 1,5, respectivamente. Finalmente, os espectros Raman foram suavizados usando o filtro Savitzky–Golay com uma janela de suavização e ordem polinomial definidos como 9 e 3, respectivamente.
Em seguida, os dados processados foram importados para o MATLAB, onde foram processados adicionalmente. O script MATLAB utilizado foi escrito implementando um já existente. Brevemente, para o mapa Raman de alta resolução ilustrado na Figura 3, o mapa Raman foi obtido removendo o ruído associado ao substrato e ao meio. Isso foi alcançado usando uma abordagem de limiar que conta o número de pixels por ponto e, em seguida, imagens em falsa cor foram geradas normalizando a intensidade Raman de interesse pelo pico da fenilalanina (cerca de 1004 cm–1). Para a análise Raman, o intervalo interquartil para cada conjunto de dados foi calculado e o agrupamento (binning) dos espectros Raman fora desse intervalo foi realizado. O conjunto de dados pré-processado foi então utilizado para calcular a mediana correspondente a cada mapa Raman. A precisão no cálculo do espectro Raman mediano para cada mapa Raman dependia, portanto, do nível de limiar de agrupamento e da distribuição do intervalo interquartil. Em seguida, as medianas associadas a uma gravação longitudinal foram calculadas em média para gerar um espectro Raman representativo da amostra ao longo do tempo.

Condições Biocompatíveis
Foi dada atenção especial para manter as condições fisiológicas da amostra durante a medição. Enquanto a temperatura (ajustada a 37 °C) foi gerenciada diretamente pelo Multi Channel System (MCS GmbH), outros parâmetros como CO2 e umidade exigiram o desenvolvimento de uma câmara personalizada para ser integrada entre o microscópio Raman e o Multi Channel System (MCS GmbH). Esta câmara especialmente projetada e concebida permite a entrada do objetivo de observação pela parte superior e, pela parede lateral, o fluxo de uma mistura aquecida e umidificada de 5% CO2–ar (fornecida por um sistema Okolab; Okolab-Stage Top-Digital Gas (). As pequenas perdas da câmara foram compensadas pelo baixo fluxo de gás de entrada, de modo que uma condição adequada para uma gravação de longo prazo foi estabelecida de forma confiável. Mais detalhes estão disponíveis nas Informações de Suporte.

Microscopia de Fluorescência
O ensaio live–dead (L3224, Invitrogen) foi realizado seguindo as instruções do fabricante. Brevemente, ao final de cada experimento, as células neuronais de rato foram incubadas com calceína AM (concentração final de cerca de 2 μM) e homodímero de etídio-1 (concentração final de cerca de 2,5 μM) por 30 min à temperatura ambiente e imageadas sem qualquer tentativa de lavagem. A microscopia de fluorescência foi realizada usando um sistema de imagem EVOS Floid. As células neuronais de rato foram focadas usando uma objetiva de 20×, enquanto as medições exploraram fontes de luz LED fixas verde e vermelha integradas com filtros de leitura apropriados. Os dados coletados foram importados para o ImageJ para gerar imagens em falsa cor. A intensidade da barra de escala foi ajustada de 0 a 4095 U.A., e o tamanho da barra de escala foi definido como 125 μm.

Medidas Eletrofisiológicas
As medições eletrofisiológicas foram realizadas utilizando um MEA2100 (MEA2100-LITE-System) empregando TiN MEA com diâmetro do eletrodo de 30 μm e espaçamento de 200 μm. Os filtros passa-alta e passa-baixa foram configurados em 100 Hz (2ª ordem) e 3500 Hz (4ª ordem), enquanto a taxa de amostragem foi configurada em 25 kHz. As gravações de dados foram posteriormente processadas utilizando código Python personalizado, permitindo o cálculo de métricas como a frequência de disparo, a forma de onda média dos spikes extracelulares e a contagem de spikes em um eletrodo de interesse previamente escolhido. No eletrodo de interesse escolhido, a detecção dos spikes individuais foi realizada utilizando um valor de limiar que excede 3 vezes o desvio padrão do nível de ruído de fundo. Assim, a precisão da taxa de disparo na seção “A Definição de um Protocolo para as Aquisições Repetidas de Dados Eletrofisiológicos e Espectros Raman” depende do nível de limiar escolhido. A atividade neuronal considerando todos os eletrodos ativos foi calculada através do analisador multicanal e utilizando as opções padrão de detecção e análise de spikes. Especificamente, a detecção dos spikes individuais foi baseada na fase negativa do spike neuronal e foi realizada utilizando um valor de limiar de 5 vezes o desvio padrão do nível de ruído de fundo. Assim, a precisão da taxa de disparo na seção “Informações Adicionais e Validação através da Integração da Eletrofisiologia e Espectroscopia Raman” depende deste nível de limiar padrão. A gravação eletrofisiológica foi realizada por 60 s, e as taxas de disparo calculadas refletem o número de spikes por minuto.
Soluções Adotadas para Integrar Medições Elétricas e Ópticas
O desenvolvimento de um meio personalizado transparente baseado no uso do meio neurobasal A suplementado com B27 sem antioxidantes, l-glutamina (2 mM), gentamicina (50 μg/mL), anfotericina (37 ng/mL) e NSF1 (2%) nos permitiu superar o ruído de fluorescência associado ao meio de crescimento de neurônios primários PNGM BulletKit disponível comercialmente da Lonza.
A fraqueza geral na dispersão Raman foi superada focando no citocromo C, um cromóforo que é excitado eletronicamente usando o laser de 532 nm. Notavelmente, a excitação do laser de 532 nm corresponde à diferença de energia entre os estados excitado e relaxado do citocromo C na transição eletrônica da banda Q.
O fundo de fluorescência associado às medições Raman no plano focal dos eletrodos foi contornado realizando imageamento Raman focado. Isso também nos permitiu minimizar o aquecimento local e a interferência cruzada entre as medições elétricas e ópticas, bem como preservar os eletrodos da degradação.
Medições Raman termoestáveis foram realizadas utilizando imageamento fora de foco e uma câmara para condições de imageamento “biocompatível para células vivas” (37 °C e 5% CO2). Isso minimizou as flutuações dos espectros Raman dependentes das mudanças de temperatura no ponto focal.
A fototoxicidade devido à absorção de luz visível de bioespécimes foi evitada graças a cálculos prévios sobre a redundância de informações provenientes dos mapeamentos Raman. A definição de (i) o mínimo de espectros Raman a adquirir e área a mapear, bem como o maior tamanho de passo a utilizar sem perda de informações significativas, nos permitiu minimizar a absorção de luz e o aquecimento local. Isso é claramente refletido pela presença de atividade elétrica neuronal ao final de cada medição longitudinal. Notavelmente, a atividade neuronal é uma assinatura bem conhecida de células neuronais primárias vivas de rato.

O potencial interferência cruzada das medições elétricas e ópticas foi superado ao explorar uma abordagem sequencial na qual o registro elétrico e a imagem Raman foram realizados em momentos diferentes, em vez de simultaneamente.

Resultados e Discussão
A Definição de um Protocolo para as Aquisições Repetidas de Dados Eletrofisiológicos e Espectros Raman

O espalhamento Raman é um fenômeno raro e resulta inversamente relacionado à quarta potência do comprimento de onda de excitação, daí o desafiador uso de lasers NIR, como 785 e 1064 nm, para qualquer leitura Raman biológica. Devido a essas desvantagens e ao aumento do espalhamento Raman do citocromo C associado à sua transição eletrônica da banda Q, utilizamos um laser de 532 nm para a investigação da dinâmica em tempo real de células vivas por espectroscopia Raman. Modos vibracionais acoplados à transição eletrônica são grandemente intensificados na espectroscopia Raman ressonante; no nosso caso, isso ofereceu uma leitura mais rica sobre a estrutura do estado excitado do citocromo C. A seção de choque do espalhamento Raman na espectroscopia Raman ressonante é comumente maior em várias ordens de magnitude. Notavelmente, o desenvolvimento de um novo protocolo nos permitiu limitar com sucesso a fototoxicidade celular induzida por laser, maximizando a qualidade do sinal e a consistência entre os conjuntos de dados (mais detalhes na próxima seção).

Para ler com precisão as características eletrofisiológicas e espectroscópicas de neurônios do hipocampo de rato, primeiro desenvolvemos um protocolo para monitorar repetidamente as características eletrofisiológicas e espectroscópicas (Figura 1). Com este objetivo, adquirimos espectros Raman tanto síncronos quanto sequenciais em relação às aquisições elétricas.

Desenvolvimento
de um protocolo para aquisição repetida (A) sequencial ou (B) síncrona
de dados eletrofisiológicos e espectroscópicos.
Conforme mostrado na Figura 1, o protocolo utilizado neste trabalho adota dois cenários de monitoramento: (Figura 1A) o registro eletrofisiológico por 1 min antes ou após a aquisição de dados Raman e (Figura 1B) o registro eletrofisiológico por 1 min durante a aquisição de dados Raman. Notavelmente, o protocolo explora essas duas abordagens diferentes, pois o efeito da iluminação do laser de 532 nm na área vizinha de um eletrodo ativo e, portanto, sobre a atividade elétrica neuronal, deve ser caracterizado. Dessa forma, realizamos aquisições eletrofisiológicas repetidas de forma sequencial (Figura 1A) ou síncrona (Figura 1B) para revelar o efeito do laser de 532 nm sobre a atividade elétrica de uma cultura de células neuronais medida em um eletrodo ativo previamente escolhido. A plataforma utilizada para tais medições é ilustrada na Figura S1. Os valores absolutos medidos das atividades elétricas neuronais ao longo do tempo, na abordagem síncrona ou sequencial, são relatados na Tabela S1. Para avaliar o efeito do laser de 532 nm sobre a atividade neuronal nos eletrodos selecionados, realizamos um teste de Mann–Whitney entre os valores de atividade neuronal antes ou após a iluminação do laser (Wo) e seus valores durante a exposição ao laser (W) (Figura 2). Por outro lado, para excluir qualquer potencial fototoxicidade induzida pela exposição ao laser, realizamos um teste de Mann–Whitney entre as atividades neuronais inicial e final nos eletrodos de referência selecionados, NBAs e NFAs, respectivamente (Figura 2).
Efeito da iluminação do laser na taxa de disparo neuronal.
A taxa de disparo neuronal antes (Wo1), durante (W2) e após (Wo2) a exposição ao laser (532 nm). A taxa de disparo neuronal foi medida no início do lapso de tempo e, em seguida, antes de qualquer exposição ao laser (NBA) e a taxa de disparo neuronal após 10 exposições ao laser (NFA).
A Atribuição de Bandas Raman Vibracionais em Células Neuronais de Rato

Os valores p singulares são relatados na Tabela S2 e indicam as diferenças geralmente não estatisticamente significativas da atividade neuronal nos eletrodos selecionados durante a iluminação do laser, antes ou após a iluminação do laser e entre os valores de NBA e NFA das culturas de células neuronais, indicando que as leituras eletrofisiológicas e espectroscópicas não apresentam diafonia e que as condições utilizadas para a aquisição Raman não induzem qualquer fototoxicidade. Essas observações apoiaram nossas escolhas quanto ao uso de MEAs transparentes comercialmente disponíveis como sendo responsáveis por absorção de luz desprezível e formação de aquecimento local. O aquecimento local também foi contornado pela iluminação do laser nas proximidades dos eletrodos, e não sobre o próprio eletrodo, que é conhecido por absorver luz visível e produzir aquecimento, e ainda evitado pela imagem fora de foco realizada durante as medições Raman, cerca de +10 μm acima do plano focal dos eletrodos e do substrato de nitreto de silício, ou seja, uma menor densidade de energia do laser no ponto focal dos eletrodos. Uma menor densidade de energia também preservou os eletrodos da degradação devido à alta exposição ao laser. Nessa perspectiva, Altangerel et al. relataram o uso de uma fina camada de ouro durante a exposição contínua ao laser para facilitar a dissipação de energia térmica. No entanto, essa abordagem não é aplicável aos nossos dispositivos MEA, pois a aplicação de uma camada de ouro entre os eletrodos impediria a leitura espacial da sinalização elétrica neuronal devido ao curto-circuito entre os eletrodos. No geral, o protocolo desenvolvido não afeta a atividade elétrica neuronal que pretendemos monitorar, apoiando a possível integração da microscopia Raman e da eletrofisiologia para a investigação do comportamento funcional e estrutural em células neuronais de rato. No entanto, para excluir qualquer possível interação ou artefatos entre a atividade neuronal e o laser, optamos pela abordagem mais cuidadosa: o registro sequencial da atividade elétrica e vibracional neuronal. Dessa forma, as aquisições de atividade elétrica e espectroscópica subsequentes foram registradas de forma sequencial, salvo especificação em contrário.
Células neuronais primárias de rato eletrogênicas foram cultivadas e medidas nos dias in vitro (DIV) 21–25. Como a coleta de espalhamento Raman é dificultada em meios fluorescentes coloridos, como o meio enriquecido com vermelho de fenol fornecido pelo fabricante de células (Lonza), um meio personalizado para o R-HI-501 (Lonza) foi desenvolvido utilizando meio neurobasal A suplementado (meio transparente) adequado para neurônios de cérebro pós-natal e adulto de longo prazo (mais detalhes na seção de métodos e materiais). O espalhamento Raman e a fluorescência se originam em uma escala de tempo diferente, o que reflete as diferenças na energia das transições. De fato, métodos como a espectroscopia Raman com porta temporal podem discriminar os dois sinais; no entanto, é bastante cara em relação à espectroscopia Raman convencional. Esta última, especialmente quando se utiliza um comprimento de onda de excitação na faixa visível, como 532 ou 633 nm, fornece espectros emaranhados nos quais a fluorescência frequentemente sobrecarrega o sinal Raman. Esse fenômeno também foi observado em nossos experimentos, onde a imagem Raman de células vivas foi inicialmente realizada em um meio enriquecido com vermelho de fenol (Lonza). Por essas razões, optamos por usar o meio celular transparente personalizado descrito acima. Impressões digitais Raman de células neuronais de rato foram adquiridas usando um comprimento de onda de excitação de 532 nm, potência do laser de 13 mW no objetivo, objetiva de lente imersão em água de 60× com NA = 1, centro do pico definido em 1200 cm–1, tempo de integração de 0,4 s, 1 acumulação, tamanho de passo de aquisição de 1,5 μm e modo de alta confocalidade (Figura 3).

Impressões digitais Raman de células neuronais de rato em relação aos ambientes subcelulares. (A) Mapa Raman indicativo de mitocôndrias e associado à razão Raman 750/1004 cm–1, (B) Mapa Raman indicativo do citoplasma e associado à razão Raman 1450/1004 cm–1, e (C) Mapa Raman indicativo do núcleo e associado à razão Raman 782/1004 cm–1.
A Figura 3 mostra as impressões digitais Raman normalizadas de células neuronais de rato. Notavelmente, os espectros Raman foram normalizados para a fenilalanina (cerca de 1004 cm⁻¹), um aminoácido onipresente comumente usado para quantificação relativa. A quantificação relativa à fenilalanina foi escolhida por duas razões principais: (i) o sinal da amida I (cerca de 1660 cm⁻¹), comumente associado a proteínas, que foi observado como o sinal Raman mais forte, incluía uma contribuição mínima proveniente do revestimento de poli-d-lisina-laminina no ponto focal dos eletrodos, que era desprezível em cerca de 1004 cm⁻¹; (ii) o espalhamento Raman de lipídios, especificamente o estiramento CH₂ (cerca de 1450 cm⁻¹), mostrou-se sensível a mudanças sob pressão química ou processos fisiológicos e, portanto, também foi excluído para normalização relativa.

Na microscopia Raman, a normalização vetorial é fundamental para ignorar mudanças nos espectros Raman devido a diferentes focagens celulares e é uma prática comum antes de qualquer análise de dados. A Figura 3 mostra que a imagem Raman rationétrica sem marcação permite a distinção de características vibracionais associadas ao núcleo, citoplasma e mitocôndrias. Ou seja, o espalhamento Raman de bases nitrogenadas ocorre em 782 cm⁻¹, o espalhamento Raman principalmente relacionado a lipídios associados ao estiramento −CH₂ ocorre em 1450 cm⁻¹, e o modo de respiração do pirrol (ν15) no citocromo C ocorre em 750 cm⁻¹. A banda Raman em cerca de 750 cm⁻¹ é uma assinatura espectral estabelecida associada ao citocromo C e às mitocôndrias em células não apoptóticas, conforme exemplificado anteriormente por Yamakoshi et al. Notavelmente, um espalhamento Raman fraco ocorrendo em 750 cm⁻¹ também pode ser observado na região intranuclear, e é mais provavelmente relacionado à presença de citocromo C acima ou abaixo do plano focal nuclear, de acordo com as observações relatadas por Okada et al.

Uma vez que a assinatura Raman do citocromo C foi estabelecida, resultando em um forte espalhamento em 750, 1127, 1316 e 1583 cm⁻¹, prosseguimos para minimizar a exposição ao laser e à área para estudos de lapso de tempo. A redundância de informações Raman nas células foi investigada passando de mapas Raman de alta resolução para mapas Raman de baixa resolução criados artificialmente, considerando a mesma área de varredura. Notavelmente, diferenças desprezíveis foram observadas ao passar de um mapa Raman com tamanho de passo de 1,5 μm para 3 e 4,5 μm, sugerindo redundância de informações (dados produzidos usando células HeLa, não incluídos).
Portanto, optamos por usar 3 μm como tamanho do passo de aquisição e uma área mínima de 30 × 30 μm². Consequentemente, a potência do laser e o tempo de aquisição para cada espectro foram minimizados para 13 mW no objetivo e 0,4 s, respectivamente. Essas precauções devem ser consideradas nas medições Raman, pois os espectros Raman dependem da temperatura e, portanto, minimizar a exposição neuronal espaço-temporal é a chave para uma medição confiável. A atribuição das bandas Raman em células neuronais de ratos nos permitiu avançar na integração da leitura elétrica e espectroscópica, que, como mencionamos acima, adotaria uma imagem Raman fora de foco para minimizar a formação de aquecimento local e preservar a integridade dos eletrodos. A imagem e coleta fora de foco são fundamentais por mais duas razões: (i) excluir alterações Raman desencadeadas pela própria exposição ao laser devido à alta densidade de energia do laser no ponto focal e (ii) excluir qualquer fundo óptico do material do dispositivo MEA (eletrodos, trilhas e isolante). Nossa plataforma minimizou ainda mais as alterações Raman correspondentes à flutuação de temperatura, realizando medições Raman termoestáveis. De fato, a imagem Raman foi realizada usando uma câmara de células personalizada para imagem de células vivas (37 °C, 5% CO2).
Informações Adicionais e Validação por meio da Integração de Eletrofisiologia e Espectroscopia Raman
A integração elétrica e óptica sem marcadores pode abrir caminho para grandes melhorias na toxicidade funcional e estrutural e, de modo geral, na caracterização muito mais aprofundada de modelos biológicos. Enquanto a atividade elétrica das células neuronais de rato reflete a comunicação celular em nível celular e de rede, a leitura fenotípica Raman nas proximidades do eletrodo de interesse atinge uma resolução subcelular, permitindo o monitoramento de dinâmicas intracelulares como vias metabólicas, estresse oxidativo, apoptose e muito mais. Como prova de conceito, células neuronais de rato foram cultivadas em um MEA de TiN disponível comercialmente, e medições sequenciais elétrico-espectroscópicas foram realizadas de acordo com o protocolo relatado na Figura 1B. Especificamente, coletamos espectros Raman “fora de foco” na forma de mapas Raman de 30 × 30 μm² entre aquisições eletrofisiológicas. Notavelmente, a análise dos dados eletrofisiológicos foi realizada considerando todos os eletrodos ativos do dispositivo MEA. Os mapas Raman foram coletados usando um laser de excitação de comprimento de onda de 532 nm, uma potência de 13 mW no objetivo, uma lente objetiva imersiva 60× Nikon com NA = 1, um tempo de integração de 0,4 s, um centro de pico definido em 1200 cm⁻¹, um tamanho de passo de 3 μm e condições de alta confocalidade. Os espectros Raman associados a cada mapa foram processados usando WiRE 5.5, importados no MATLAB e normalizados pelo pico interno correspondente à fenilalanina (1004 cm⁻¹). O intervalo interquartil para cada conjunto de dados foi calculado, e o binning dos espectros Raman fora desse intervalo foi realizado. O conjunto de dados pré-processado foi então usado para calcular a mediana correspondente a cada mapa Raman. As taxas de disparo e os espectros Raman medianos de cada lapso de tempo foram extraídos e calculados como médias, conforme relatado nas Figuras S2 e S3, respectivamente. A extensão das mudanças moleculares associadas a uma taxa de disparo neuronal diferente é exemplificada na Figura 4, onde dois espectros Raman representativos (Figura 4A) são plotados em relação às suas respectivas taxas de disparo neuronal (Figura 4B).
Mudanças moleculares associadas à taxa de disparo
neuronal. (A)
Espectros Raman médios longitudinais representativos associados a
uma taxa de disparo neuronal alta e baixa plotados em relação a (B) suas respectivas
taxa de disparo neuronal; ilustramos a amostra representativa para
a taxa de disparo neuronal alta e baixa em vermelho e azul, respectivamente.
O processamento e a análise dos dados foram realizados de acordo com as Figuras S2 e S3. (C) Matriz de correlação entre
a taxa de disparo neuronal, o conteúdo de citocromo C reduzido (750 cm⁻¹), proteínas (1660 cm⁻¹), lipídios
(1450 cm⁻¹) e conteúdo de ácido nucleico (782 cm⁻¹). Em cores quentes e cores azuis, expressamos os
valores de correlação de Pearson alta e baixa, respectivamente. A correlação
é calculada em sete diferentes medições e mais de três
diferentes culturas de células neuronais.
Uma vez calculadas a taxa de disparo média e o espectro Raman para cada lapso de tempo, correlacionamos as características biológicas disponíveis utilizando nossa plataforma integrada, a saber, a taxa de disparo neuronal (Hz) e o citocromo C reduzido (750 cm⁻¹), proteínas (1660 cm⁻¹), lipídios (1450 cm⁻¹) e conteúdo de ácidos nucleicos (782 cm⁻¹). A matriz de correlação dessas características biológicas é mostrada na Figura 4C.
A Figura 4A,B ilustra a extensão das alterações moleculares associadas à alta e baixa taxa de disparo neuronal em células neuronais de rato. Especificamente, a alta taxa de disparo foi acompanhada por um conteúdo geral mais elevado da bioamostra, sugerindo que uma maior atividade metabólica em nível de célula única pode refletir a atividade eletrofisiológica em toda a cultura celular. Para revelar ainda mais quaisquer padrões de correlação entre as variáveis biológicas, realizamos uma análise de correlação dentro do conjunto de dados completo. A Figura 4C mostra uma correlação fortemente positiva entre as taxas de disparo neuronal e os conteúdos de citocromo C reduzido (valor de Pearson = 0,84, valor de p = 0,019). Essa correlação pode ser explicada pela alta dependência da atividade neuronal da síntese de ATP produzida pela OxPhos. Portanto, isso sugere o uso da microscopia Raman ressonante e do monitoramento longitudinal do citocromo C reduzido como ferramentas alternativas para uma avaliação livre de eletrodos e livre de marcadores da taxa de disparo eletrofisiológica e do estado geral de saúde de culturas de células neuronais na presença de ruído elétrico e alta impedância elétrica, bem como para o monitoramento livre de marcadores da taxa de disparo eletrofisiológica em nível de célula única antes e após exposição a fármacos. Especulamos que uma alta atividade neuronal diminui a razão (ATP/ADP) intracelular, o que impulsiona a modulação positiva da ETC e, mais especificamente, da citocromo C oxidase. Em apoio a essa hipótese, a citocromo C oxidase é um biomarcador bem estabelecido da saúde neuronal.
Ao contrário do conteúdo de citocromo C reduzido, lipídios, proteínas e ácidos nucleicos não mostram qualquer correlação com a taxa de disparo neuronal. Enquanto proteínas e lipídios se correlacionam fortemente entre si (valor de Pearson = 0,99, valor de p = 6 × 10⁻⁶), os ácidos nucleicos não se correlacionam com nenhuma característica biológica monitorada. A correlação de características estabelece a base para uma abordagem alternativa à taxa de disparo eletrofisiológica via espectroscopia Raman e o monitoramento da síntese de novo de lipídios, proteínas e ácidos nucleicos para elucidar as dinâmicas induzidas por fármacos em nível de célula única. Claramente, as vantagens na integração da leitura elétrica e espectroscópica na avaliação da neurotoxicidade estrutural e funcional são demonstradas. Além disso, a resolução de célula única da medição espectroscópica também permite avaliar a diferente responsividade a fármacos de células únicas após diferentes acúmulos intracelulares de fármacos ou fenótipos celulares.
Para confirmar ainda mais a “biocompatibilidade” da nossa técnica, um ensaio de células vivas/mortas após as 10 medições sequenciais foi realizado em algumas das amostras (Figuras S4–S6). Notavelmente, a coloração com calceína AM e homodímero de etídio-1 indicou que nem o tempo no estágio nem a excitação a 532 nm desencadearam morte celular, sendo que as células mortas mais prováveis nas amostras correspondiam à impossibilidade de centrifugação das células antes da semeadura celular e estavam de acordo com a atividade neuronal ininterrupta observada ao final de cada lapso de tempo.

No geral, a implementação de técnicas eletrofisiológicas com uma análise de imagem óptica como a espectroscopia Raman abre caminho para uma triagem de neurotoxicidade mais precisa dentro do pipeline de desenvolvimento de medicamentos, com potencial tradução para clínicas usando fibras ópticas e dispositivos implantáveis biocompatíveis, bem como na investigação de transtornos do neurodesenvolvimento ou doenças neurodegenerativas. A integração das duas abordagens provavelmente permite acompanhar a dinâmica da neurotoxicidade em qualquer um dos casos: (a) alterações na atividade eletrofisiológica em baixo ruído elétrico e impedância, (b) alterações na atividade eletrofisiológica em alto ruído elétrico e impedância monitorando o conteúdo reduzido de citocromo C, e (c) a dinâmica induzida por fármacos sobre a síntese de novo de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos.

Próximos passos deste trabalho serão explorar esta nova tecnologia para (i) induzir alterações na atividade elétrica das células neuronais de ratos e comparar a precisão na avaliação da neurotoxicidade usando apenas medições eletrofisiológicas, medições Raman e, finalmente, a plataforma integrada, (ii) induzir estresse oxidativo nas culturas de células neuronais para verificar se a perda de correlação de características pode ser uma ferramenta válida para avaliação precoce de neurotoxicidade induzida, (iii) o monitoramento da atividade elétrica e Raman em estudos de longo prazo, e (iv) o uso de fármacos marcados com Raman para correlacionar as várias características biológicas com a captação geral do fármaco. Também vislumbramos a integração da espectroscopia Raman coerente e técnicas eletrofisiológicas, com claras vantagens dependentes do uso de comprimentos de onda mais longos e das oscilações coerentes em fase dos fótons, resultando em maior sensibilidade de detecção, menor chance de induzir efeitos fototóxicos e menor dispersão de luz ao longo da distância, permitindo uma investigação aprofundada em amostras biológicas 3D.
Aqui, descrevemos uma nova ferramenta para investigar longitudinalmente a atividade eletrofisiológica e Raman em monocamadas de células eletrogênicas. Esta abordagem abre caminho para novas capacidades de investigações multiplexadas e longitudinais de cultura de células neuronais e neurotoxicidade. Notavelmente, o método é livre de marcadores e não destrutivo e, em perspectiva, pode encontrar aplicações naqueles campos em que a administração de corantes ou marcadores não é recomendada, como na descoberta e desenvolvimento de medicamentos. O método proposto possibilita uma melhor compreensão das dinâmicas biológicas em testes de medicamentos, relacionando a citotoxicidade dos medicamentos às mudanças na atividade eletrofisiológica da amostra e o acompanhamento da atividade metabólica e de espécimes biológicos ao longo da amostra para caracterização aprofundada e estudos de desenvolvimento. Demonstramos as vantagens desta nova tecnologia, evidenciando a forte correlação entre as características upstream e downstream do OxPhos, o citocromo C reduzido e a taxa de disparo neuronal. Assim, isso prova que as taxas de disparo eletrofisiológico podem ser monitoradas em nível de célula única por meio de espectroscopia Raman média, livre de eletrodos e marcadores. Uma abordagem chave está na presença de alto ruído elétrico e impedância durante as medições. Além disso, demonstramos as vantagens da integração das medições de MEA e Raman pela coleta do espalhamento Raman não correlacionado originado de lipídios, proteínas e ácidos nucleicos, o que abre a possibilidade de monitorar a síntese de novo de bioespécimes como uma perspectiva adicional sobre neurotoxicidade. Avanços adicionais desta tecnologia podem ser alcançados aproveitando a espectroscopia Raman coerente ou espectroscopias com portão temporal, embora exijam custos muito mais elevados.
Informações de Suporte Disponíveis
Materiais e métodos, instrumentação utilizada para este trabalho, processamento de dados, análise e detalhes experimentais (PDF)
As Informações de Suporte estão disponíveis gratuitamente em https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssensors.4c03133.
Material Suplementar
Contribuições dos Autores
CT e RM realizaram as medições eletrofisiológicas e Raman integradas. CT e RM escreveram o código MATLAB e Python para analisar os dados. CT realizou tanto a análise e interpretação dos dados eletrofisiológicos quanto Raman, bem como a coleta e análise de dados de fluorescência. MdA, CT e GI projetaram o meio biológico para as medições Raman-eletrofisiológicas integradas. MdA realizou a cultura de células neuronais. CT e FT projetaram as condições de câmara "biocompatível" para as medições Raman-eletrofisiológicas integradas. GB forneceu feedback sobre a análise de dados. CT e FDA conceituaram e projetaram os experimentos. MD, FT e FDA supervisionaram o projeto. FDA foi responsável pelo financiamento. O manuscrito inicial foi escrito por CT. Todos os autores revisaram e, finalmente, contribuíram para o manuscrito final.
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa e Inovação H2020 da União Europeia, projeto “TOX-Free” (número do acordo de concessão 964518).
Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.
Abreviações
MEA
matriz de multieletrodos
TiN
nitreto de titânio
DIV
dias in vitro
PNGM
meio de crescimento de neurônios primários
NSF1
fator sérico neural 1
PBS
solução salina tamponada com fosfato
ETC
cadeia de transporte de elétrons
OxPhos
fosforilação oxidativa
Referências
Derivação eficiente de células semelhantes a micróglias a partir de células-tronco pluripotentes humanas
Micróglia aumentam respostas inflamatórias em Esferas Cerebrais Humanas Derivadas de iPSC
Incorporação de astrócitos derivados de células-tronco em organoides neuronais para permitir interações neuro-gliais em estudos toxicológicos
Organoides do SNC: uma ferramenta inovadora para modelagem de doenças neurológicas e triagem de neurotoxicidade de drogas
Células-tronco para Testes de Toxicidade de Próximo Nível no Século 21
Esferoide de Córtex Humano com Barreira Hematoencefálica Funcional para Triagem de Neurotoxicidade de Alto Rendimento e Modelagem de Doenças
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