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pmid: "21958598"
title: "Biogênese e montagem do núcleo catalítico da citocromo c oxidase eucariótica."
authors: "Soto IC, Fontanesi F, Liu J, Barrientos A"
journal: "Biochimica et biophysica acta"
pubdate: "2012 Jun"
doi: "10.1016/j.bbabio.2011.09.005"
source: "PMC Full Text"

Biogênese e montagem do núcleo catalítico da citocromo c oxidase eucariótica.

Autores

Soto IC, Fontanesi F, Liu J, Barrientos A

Periodico

Biochimica et biophysica acta (2012 Jun)

Conteudo

Biogenesis and Assembly of Eukaryotic Cytochrome c Oxidase Catalytic Core
A citocromo c oxidase (COX) eucariótica é a enzima terminal da cadeia respiratória mitocondrial. A COX é uma enzima multimérica formada por subunidades de dupla origem genética, cuja montagem é complexa e altamente regulada. O núcleo catalítico da COX é formado por três subunidades codificadas pelo DNA mitocondrial, Cox1, Cox2 e Cox3, conservadas na enzima bacteriana. Sua biogênese requer a ação de fatores específicos para mensageiros e subunidades que facilitam a síntese, inserção na membrana, maturação ou montagem das subunidades do núcleo. O estudo de linhagens de levedura e de linhagens de células humanas de pacientes portadores de mutações em subunidades estruturais e fatores de montagem da COX tem sido inestimável para identificar esses fatores auxiliares. Aqui, revisamos o estado atual do conhecimento sobre a biogênese e montagem do núcleo catalítico da COX eucariótica e discutimos o grau de conservação dos atores e mecanismos que operam desde a levedura até o ser humano.

1. Mais de cinquenta anos de montagem da citocromo c oxidase eucariótica
   A citocromo c oxidase (COX) mitocondrial é uma oxidase terminal multimérica de cobre-heme A que funciona como uma bomba de prótons acionada por elétrons e desempenha papéis fundamentais na respiração celular e na produção de energia aeróbica em eucariotos. A COX catalisa a transferência de elétrons do ferrocitocromo c para o oxigênio molecular através dos quatro cofatores metálicos redox ativos presentes em seu núcleo catalítico. Os elétrons entram na COX através de um centro de cobre dinuclear de valência mista, o sítio CuA, localizado na subunidade 2. Os elétrons são transferidos do CuA para um heme a de baixo spin localizado na subunidade 1 e subsequentemente transferidos intramolecularmente para o sítio ativo, onde um heme a3 de alto spin e CuBform um centro binuclear para ligação do oxigênio (revisado em). A reação de transferência de elétrons é acoplada à transferência de prótons da matriz para o espaço intermembranar ( e) contribuindo assim para a geração do gradiente de prótons que é subsequentemente utilizado pela ATPase mitocondrial F1F0 para impulsionar a síntese de ATP.
   Do ponto de vista histórico, a identificação dos componentes da subunidade e do grupo prostético, bem como a investigação de sua montagem em uma enzima funcional, começou no início do século XX e permanece no centro de estudos intensivos em andamento até os dias atuais.
   O teor de metal da COX já era conhecido em meados da década de 1950.
   No entanto, o isolamento da COX funcionalmente intacta, alcançado aproximadamente 50 anos atrás, abriu caminho para análises bioquímicas e biofísicas detalhadas da enzima.
   Logo se reconheceu que a COX era um complexo proteico e o número de polipeptídeos componentes foi posteriormente estabelecido.
   O conhecimento atual da composição das subunidades da COX e da montagem da enzima funcional tem suas bases em trabalhos realizados na levedura Saccharomyces cerevisiae.
   No final dos anos sessenta e início dos anos 1970, a ênfase foi colocada no estudo da origem biossintética da COX.
   A síntese proteica citoplasmática e mitocondrial da levedura foi diferenciada in vivo com antibióticos, fornecendo assim as primeiras pistas de que os complexos respiratórios, incluindo a COX, são contribuídos por duas maquinarias independentes de síntese proteica.
   Reconheceu-se então que os três maiores polipeptídeos da subunidade da COX são traduzidos pelos ribossomos mitocondriais e que possuem propriedades físicas e químicas diferentes das subunidades sintetizadas nos ribossomos citoplasmáticos.
   A sequência dos genes de levedura correspondentes foi logo divulgada.
   A publicação posterior da sequência completa e organização do genoma mitocondrial humano, com a localização dos genes COXI, COXII e COXIII, confirmou que, com poucas exceções em plantas, as três subunidades principais são de fato codificadas no DNA mitocondrial.
   De fato, a COX eucariótica é formada por 11-13 subunidades (11 na levedura Saccharomyces cerevisiae e 13 em mamíferos) de origem genética dupla.
   O núcleo de três subunidades é cercado por um conjunto de pequenas subunidades codificadas nuclearmente que são importantes tanto para a montagem e função da enzima quanto para sua dimerização (revisado em).
   Essas subunidades também servem para modular a atividade catalítica da enzima e proteger o núcleo de danos oxidativos.
   Uma lista de subunidades homólogas da COX em levedura e mamíferos é mostrada na Tabela 1.
   Em outro grande avanço na pesquisa eucariótica da COX, a estrutura da COX de mitocôndrias de coração bovino, determinada com resolução de ~2,8 Å, foi revelada no final dos anos 1990. Isso representou um marco importante na história da fosforilação oxidativa, pois a COX foi o primeiro complexo da cadeia respiratória a ter sua estrutura cristalina de alta resolução resolvida. Estudos estruturais sobre a COX bacteriana mais simples forneceram pistas sobre a associação dos centros metálicos catalíticos com subunidades principais homólogas específicas, que foram então confirmadas para a enzima mitocondrial. As estruturas também permitiram determinar com precisão os contatos de interface entre todos os componentes das subunidades e responder a questões sobre o acoplamento entre o transporte de elétrons e o bombeamento de prótons no nível atômico. A partir desses estudos, também se sabe que metais não catalíticos, como zinco, magnésio e sódio, estão ligados à enzima, embora, apesar dos avanços recentes, seus papéis permaneçam amplamente desconhecidos.
   O processo de montagem da COX tem sido objeto de investigações intensas nos últimos 50 anos, utilizando diferentes abordagens, e ainda é ativamente investigado atualmente. A biogênese da COX é considerada um processo linear, com as diferentes subunidades e cofatores sendo adicionados de maneira ordenada. O conceito de uma via de montagem caracterizada pela incorporação sequencial das subunidades da COX foi desenvolvido no início dos anos 1980 a partir de dados obtidos em estudos que utilizaram mitocôndrias de fígado de rato e acompanharam a incorporação de subunidades radiomarcadas no holocomplexo da COX. O modelo foi posteriormente confirmado por análises da enzima humana realizadas por eletroforese Blue-Native. Ao analisar a formação de intermediários de montagem, concluiu-se que a montagem se inicia em torno de uma semente formada pela subunidade 1 e prossegue com a formação de vários intermediários de montagem discretos, provavelmente representando etapas limitantes da taxa no processo. O estudo de intermediários de montagem em levedura tem sido menos produtivo, pois eles não parecem se acumular em quantidades detectáveis na maioria das linhagens defeituosas de COX, provavelmente devido à acentuada regulação negativa da síntese de Cox1 na ausência de COX totalmente montada. No entanto, submontagens foram detectadas em mutantes cox2 e pet100 de levedura e são semelhantes às observadas em células de mamíferos. Somando-se ao conceito de montagem linear, sabe-se que a biogênese das formas de membrana de pelo menos as duas principais subunidades catalíticas do núcleo 1 e 2 segue linhas relativamente independentes, com a participação de chaperonas específicas de subunidade (Figura 1 e revisado em,). Além disso, foi proposto que submontagens da COX podem interagir com outros componentes da cadeia respiratória nos estágios iniciais do processo de montagem de supercomplexos e que subunidades recém-importadas codificadas pelo DNA nuclear podem se integrar não apenas ao holoenzima COX, associando-se a subunidades pré-existentes, mas também a formas de supercomplexos, associando-se a complexos intermediários de montagem.
   A montagem da COX é um processo assistido por proteínas. A análise sistemática de mutantes de levedura deficientes na montagem da COX tem sido uma estratégia inestimável para identificar os fatores auxiliares não estruturais envolvidos na montagem da COX e, subsequentemente, tentar reconstruir as diferentes etapas da via de montagem. A triagem de mutantes nucleares deficientes na respiração foi uma estratégia inovadora no início dos anos 1970 e revelou a existência de um grande número de genes nucleares que codificam fatores acessórios que afetam seletivamente a expressão da COX em levedura. Suas funções, necessárias para todas as etapas do processo e significativamente conservadas de levedura a humanos, estão resumidas na Tabela 1 e foram previamente revisadas.

Nos últimos 20 anos, estratégias de triagem de mutantes também foram utilizadas em humanos, uma vez que a biogênese defeituosa da COX resulta em doenças mitocondriais humanas devastadoras que frequentemente envolvem tecidos do cérebro, músculo esquelético e coração (revisado em). Até o momento, com a dupla exceção de uma encefalomiopatia infantil causada por uma mutação na subunidade codificada nuclearmente COX6B1 e uma insuficiência pancreática exócrina causada por uma mutação no gene COX4I2, todos os distúrbios mendelianos que apresentam deficiência de COX foram atribuídos a mutações em fatores auxiliares. Especificamente, mutações foram encontradas em SURF1, necessário para a formação de intermediários iniciais de montagem, SCO1 e SCO2, necessários para a metalização da COX com cobre, COX10 e COX15, essenciais para a biossíntese do heme A, e finalmente em LRPPRC e TACO1, necessários para a expressão das subunidades da COX. Linhagens celulares de fibroblastos mutantes de pacientes que sofrem desses distúrbios têm sido usadas para estudar o acúmulo de intermediários de submontagem na ausência de fatores específicos de montagem da COX e obter informações sobre a etapa de montagem catalisada ou afetada pelo fator mutado. Esses estudos também forneceram informações sobre fatores biogenéticos específicos da COX em mamíferos, como TACO1, uma proteína evolutivamente conservada, embora funcione como um ativador traducional mitocondrial específico da COX1 em mamíferos.

Nos últimos dez anos, atenção particular foi dedicada à montagem do núcleo catalítico da COX, que é o foco desta revisão. Novos atores e vias regulatórias foram identificados, revelando níveis crescentes de complexidade. Nosso objetivo aqui é resumir o entendimento atual da biogênese e montagem do núcleo catalítico da citocromo c oxidase eucariótica em levedura e incluirá notas comparativas do processo conforme ocorre em células humanas.

2. Expressão das subunidades do núcleo catalítico da COX codificadas pelo DNA mitocondrial

2.1. Transcrição do gene mitocondrial da COX e processamento do mRNA em Saccharomyces cerevisiae
Em S. cerevisiae, os genes COX2 e COX3 para as subunidades 2 e 3, respectivamente, não possuem íntrons e os transcritos primários são transcritos individualmente e maturados pela maquinaria geral de transcrição mitocondrial e processamento 3′. A transcrição mitocondrial geral foi revisada recentemente em outro lugar.
Em contraste, o gene COX1 é transcrito como um RNA precursor policistrônico que inclui os genes COX1, ATP8, ATP6 e ENS2. Este transcrito é processado entre os cístrons COX1 e ATP8 para liberar o mRNA de COX1 (revisado em). Além disso, o gene COX1 contém múltiplos íntrons de dois tipos diferentes, grupo I (íntrons aI3, aI4, aI5α e aI5β) e grupo II (íntrons aI1, aI2 e aI5γ). A maturação do pré-mRNA da subunidade 1 depende de proteínas chamadas maturases (relacionadas a endonucleases de DNA para íntrons do grupo I e transcriptases reversas para íntrons do grupo II) cujos genes estão localizados nos íntrons do COX1. Além disso, um número crescente de produtos de genes nucleares foi descrito e também é essencial para a maturação do mRNA (veja a lista completa na Tabela I). Isso inclui a helicase de RNA Mss116, que é um fator geral de splicing mitocondrial que atua facilitando a reação de dobramento do RNA necessária para o autosplicing e a helicase de RNA Suv3, que é necessária para o processamento do íntron aI5β por meio da reciclagem do fator de splicing de íntron Mrs1. Pelo menos duas proteínas são necessárias para o splicing do íntron aI4 do COX1, Ccm1 e Nam2. Outras proteínas estão envolvidas, cujas funções específicas na maioria dos casos ainda precisam ser totalmente compreendidas, como o ativador traducional do mRNA de COX3 Pet54, Mrs1, Mne1 e Mss18, quatro proteínas necessárias para o processamento do íntron aI5β do COX1, e a recentemente identificada Cox24, necessária para o splicing dos íntrons aI2 e aI3 do COX1. Vários produtos de genes nucleares implicados no splicing mitocondrial parecem ter múltiplas funções, como sugerido pelo fato de que cepas de levedura com uma mutação nula em um desses genes e desprovidas de íntrons mitocondriais não recuperam a competência respiratória total. Esse é o caso de Cox24 e Pet54, que também parecem ser necessários para a síntese eficiente de Cox1. Nam2 é a leucyl-tRNA sintetase mitocondrial de levedura e também é necessária para a manutenção do DNA mitocondrial. Mss116 e Suv3 foram encontrados como parte do degradossomo, um complexo enzimático que participa da renovação dos RNAs mitocondriais. Além disso, Mss18 desempenha um segundo papel que ainda precisa ser identificado. Em contraste, tanto as cepas de levedura Δmrs1 quanto Δmne1 que carregam mtDNA sem íntrons recuperam a competência respiratória, indicando que Mrs1 e Mne1 são necessárias apenas para o splicing do pré-mRNA mitocondrial.
Como esperado, o processamento e splicing defeituosos do mRNA do COX1 resultam em tradução nula ou deficiente e um subsequente defeito na montagem do COX.
2.2. Fatores traducionais específicos do mensageiro mitocondrial COX em Saccharomyces cerevisiae
Em S. cerevisiae, a tradução de cada mRNA mitocondrial da COX depende de um ou mais ativadores da tradução codificados pelo núcleo (para revisão, ver). Esses fatores de tradução específicos do mRNA são proteínas integrais ou periféricas da membrana interna que reconhecem a região 5′ não traduzida (UTR) de seus transcritos alvo. Pelo menos duas proteínas, Mss51 e Pet309, são necessárias para a síntese de Cox1; Pet111 é necessária para a síntese de Cox2; e três produtos gênicos, Pet54, Pet122 e Pet494, governam a síntese de Cox3.

A maior parte do entendimento da interação desses ativadores da tradução com as líderes de RNA foi elucidada por estudos genéticos. Embora eles mostrem especificidade por sua sequência de RNA alvo, na maioria dos casos ainda precisa ser explorado se a interação é física e direta, ou se eles funcionam por meio de interações com o mitorribossomo e/ou proteínas não identificadas. Especulações atuais sugerem que os ativadores da tradução desempenham um papel na organização espacial e temporal da síntese de proteínas mitocondriais e, portanto, podem servir para acoplar a tradução à inserção dos produtos hidrofóbicos recém-sintetizados na membrana perto ou no local de sua montagem em complexos multissubunidades. A expressão e a estequiometria desses ativadores da tradução são importantes para manter um acúmulo equilibrado das subunidades da COX codificadas pela mitocôndria. Com exceção de Mss51 (veja abaixo), esses fatores foram encontrados interagindo entre si formando complexos de alto peso molecular, sugerindo algum nível de co-regulação na expressão das subunidades formadoras do núcleo da COX. A estabilidade desses complexos e a função dos diferentes fatores podem ser afetadas se a expressão de um dos componentes do complexo for alterada, possivelmente por sequestrar outras proteínas em um estado não funcional. Por exemplo, a superexpressão de Pet111 atenua a síntese de Cox1 e a montagem da COX e limita o crescimento respiratório das leveduras, um efeito que pode ser complementado pela superexpressão concomitante de Mss51 e Pet309. Interações também foram observadas entre um fator de transcrição mitocondrial, Nam1, e ativadores da tradução, incluindo Pet111, Pet309 e Pet494, levantando a possibilidade de que a transcrição mitocondrial pode ser acoplada à tradução.
2.3. Expressão do gene mitocondrial da COX em humanos
A maioria dos genes de levedura especificamente envolvidos na expressão das três proteínas codificadas pelo mtDNA que formam o núcleo da enzima parece estar ausente em humanos. Isso pode ser explicado por diferenças qualitativas entre as duas espécies em seu DNA mitocondrial e mRNA. Fatores de splicing não são necessários em humanos porque a COX1, como qualquer outro gene no genoma mitocondrial humano, não possui íntrons. A transcrição é policistrônica e os genes estruturais são flanqueados por tRNAs que servem como marcas para o processamento por RNAses específicas, liberando os transcritos individuais. Nas mitocôndrias de mamíferos, os mRNAs são subsequentemente poliadenilados. Informações detalhadas sobre a transcrição mitocondrial de mamíferos podem ser encontradas em revisões recentes.

Em relação à tradução, a existência de fatores traducionais específicos para mRNA nas mitocôndrias de mamíferos tem sido por muito tempo objeto de especulação. Os mRNAs mitocondriais de mamíferos carecem completamente de 5′UTRs. Assim, uma interação Shine/Dalgarno entre o mRNA e o rRNA 12S não é utilizada durante a tradução mitocondrial. Os mRNAs mitocondriais de levedura também carecem de um elemento Shine/Dalgarno típico. No entanto, em levedura, os ativadores traducionais específicos de mRNA podem estar envolvidos na localização da subunidade ribossômica menor próxima ao códon de início da tradução. Como a maioria dos aspectos da biogênese da COX é funcionalmente conservada filogeneticamente, sugere-se que tais fatores, se existirem em mamíferos, interajam com as regiões codificadoras dos mRNAs mitocondriais de mamíferos. Infelizmente, esses fatores de tradução são pouco conservados em nível de sequência primária, mesmo entre fungos, dificultando a identificação de seus ortólogos em genomas de mamíferos. Um avanço nessa área foi recentemente alcançado, mostrando que homólogos com sequências pouco conservadas ainda podem desempenhar funções relacionadas. Este é o caso do gene nuclear de levedura PET309 e seu homólogo humano LRPPRC. Mutações no LRPPRC são responsáveis pela forma canadense da síndrome de Leigh. Embora a similaridade de sequência entre seus produtos seja muito baixa (26%), o melhor hit recíproco do BLAST do LRPPRC encontrado em levedura é o PET309. O LRPPRC desempenha papéis na estabilização e no manuseio de todos os mRNAs, particularmente aqueles para as subunidades centrais da COX. Essa proteína também interage com o SLIRP, uma proteína de ligação a RNA em alça de haste, em um complexo de alto peso molecular que contém mRNAs mitocondriais maduros. No entanto, foi demonstrado que o LRPPRC não participa diretamente da tradução.
O TACO1, um ativador traducional específico da COXI humana, foi recentemente identificado por análise de ligação genômica em um paciente afetado pela síndrome de Leigh associada a uma deficiência isolada da COX. O TACO1 é uma proteína solúvel da matriz que poderia atuar garantindo um início preciso da tradução do mRNA da COXI ou estabilizando o polipeptídeo em elongação e assegurando a conclusão de sua tradução. A deleção do homólogo de levedura, YGR021W, não produz nenhum fenótipo de deficiência respiratória e seu papel não é claro. Espera-se que a identificação de ativadores traducionais específicos de mamíferos dos genes mitocondriais da COX e a caracterização de seu mecanismo de ação forneçam informações cruciais sobre como a tradução dos mRNAs mitocondriais de mamíferos é ativada.
3. Biogênese e montagem da Subunidade 1 da COX de levedura
3.1. Síntese de Cox1, inserção na membrana e estabilidade
3.1.1. Propriedades exclusivas dos ativadores traducionais específicos do mRNA da COX1
Os dois ativadores traducionais identificados como essenciais para a tradução do mRNA da COX1 em S. cerevisiae, Pet309 e Mss51, possuem propriedades estruturais e funcionais dignas de serem destacadas nesta seção.
Pet309 é o único ativador traducional mitocondrial identificado em S. cerevisiae que contém motivos PPR. Proteínas que contêm essas repetições de sequência em outros organismos geralmente estão envolvidas em etapas específicas do metabolismo do RNA. Elas estão implicadas na estabilidade e processamento do transcrito precursor, bem como na tradução. O pequeno número de proteínas PPR em S. cerevisiae contrasta com o número de membros da família em S. pombe, no qual nove proteínas PPR foram recentemente relatadas como reguladoras da expressão gênica mitocondrial, entre elas Ppr4, um suposto homólogo de Pet309, que afeta especificamente a tradução de Cox1. Prevê-se que Pet309 de S. cerevisiae contenha pelo menos sete motivos PPR localizados na porção central da proteína. Estudos envolvendo esses motivos mostraram que eles são necessários para a tradução do mRNA da COX1 por Pet309, mas não são necessários para a estabilidade do transcrito. Embora Pet309 tenha sido estabelecido como um ativador traducional específico de Cox1, também necessário para a estabilidade do transcrito de mRNA, resta explorar se Pet309 interage diretamente com a região 5′UTR do mRNA da COX1 e qual seria o papel dos motivos PPR nessa interação prevista.
Mss51 é único entre os ativadores traducionais relacionados à COX porque, além de sua exigência para a síntese de Cox1, desempenha papéis adicionais na estabilidade do peptídeo recém-sintetizado e sua incorporação em intermediários precoces da COX. Estudos genéticos mostraram uma interação de Mss51 com a 5′UTR do mRNA de COX1. No entanto, quando a 5′UTR do mRNA de COX1 foi trocada pela mesma região do mRNA de COX2, a tradução do mRNA quimérico de COX1 prosseguiu na ausência de Pet309, mas não em células que não possuíam Mss51. Esses resultados sugeriram que Mss51 tem um segundo papel na biogênese de Cox1 além de sua função na ativação traducional. Além de sua interação com a mensagem de COX1, descobriu-se que Mss51 interage com Cox1 recém-sintetizado. Foi proposto que tal interação poderia servir para facilitar o alongamento de Cox1 durante a síntese. Mostramos que Mss51 atua para estabilizar Cox1 e mantê-lo em um estado competente para montagem antes de prosseguir para as etapas de montagem a jusante. A dupla função de Mss51 fornece a base para um mecanismo regulatório que coordena a síntese de Cox1 com a montagem da COX, conforme explicado abaixo.

Apesar dos esforços em vários laboratórios para identificar o papel preciso de Mss51 na tradução de Cox1, várias questões básicas permanecem sem resposta. Por exemplo, ainda não foi estabelecido diretamente se e como ocorre uma interação física de Mss51 com a 5′UTR do mRNA de COX1 in vivo. Até agora, apenas estudos do sistema de três-híbridos de levedura forneceram algumas evidências para uma interação física entre uma região hidrofílica localizada nos 177 resíduos N-terminais da proteína Mss51 madura e um alvo na 5′-UTR do mRNA de COX1 dentro de 245 nucleotídeos a montante do códon de iniciação.

Notavelmente, relatamos evidências de tradução aberrante de espécies de mRNA de COX1 resultando em um polipeptídeo denominado mp15, na ausência de Mss51, mas não na ausência de Pet309. Muito provavelmente, mp15 é um produto de tradução truncado de um mRNA de COX1 parcialmente processado. Esses resultados sugerem que a ligação de Mss51 à 5′-UTR do mRNA de COX1 pode ser necessária para a iniciação ideal da tradução por Pet309, enquanto a interação de Mss51 com Cox1 recém-sintetizado pode regular o alongamento do polipeptídeo nascente, conforme proposto anteriormente.

3.1.2. Regulação traducional da síntese de Cox1, chaperonas de Cox1 e complexos de pré-montagem de Cox1
A montagem da COX requer o acúmulo de suas subunidades constitutivas em uma proporção estequiométrica definida. Estudos da última década levaram à noção de dois mecanismos responsáveis pelo acúmulo concertado das subunidades da COX em mitocôndrias de levedura. Primeiro, a maioria da subunidade 1 da COX não montada e as outras subunidades principais altamente hidrofóbicas 2 e 3 são muito eficientemente degradadas pós-traducionalmente pelas proteases AAA dependentes de ATP da membrana mitocondrial interna. Proteases adicionais foram recentemente descobertas para prevenir especificamente o acúmulo de Cox1 imaturo, incluindo a metalopeptidase conservada Oma1. A degradação ativa evitará o acúmulo de proteínas não montadas que poderiam ter tendência a se agregar e perturbar a homeostase da membrana ou formar espécies pró-oxidantes, conforme discutido abaixo.
Segundo, Cox1 está sujeito à autorregulação traducional controlada pela montagem. Esse tipo de regulação traducional foi inicialmente descoberto operando na montagem de complexos fotossintéticos em cloroplastos da alga Chlamydomonas reinardthii e em plantas superiores, sendo denominado controle por epistasia da síntese. Uma característica distintiva desses sistemas autorregulatórios traducionais organelares é o envolvimento de fatores ternários, ativadores traducionais específicos de mRNA, cuja disponibilidade seria regulada pelos produtos gênicos específicos. No caso da COX de levedura, o fator ternário é Mss51.
Mss51 interage dinamicamente com Cox1 e vários componentes do processo biogenético da COX. Durante a síntese de Cox1 nos mitorribossomos, Mss51 e Cox1 recém-sintetizado formam um complexo transitório que é estabilizado pelos fatores de montagem da COX Cox14 e Cox25 (também denominado Coa3) e adicionalmente contêm a chaperona mitocondrial Hsp70 Ssc1 e sua co-chaperona Mdj1. Foi demonstrado que Ssc1 e sua co-chaperona Mdj1 formam um complexo com cadeias polipeptídicas nascentes nos ribossomos mitocondriais, provavelmente para facilitar seu dobramento adequado durante a tradução. A presença de todas essas proteínas em um complexo traducional de COX1 aponta para a cooperação de chaperonas gerais e específicas no dobramento e estabilização de Cox1 recém-sintetizado.
Cox1 é uma proteína altamente hidrofóbica e atravessa 12 domínios transmembrana na membrana mitocondrial interna, conectados por pequenas alças hidrofílicas que se projetam para o espaço intermembrana mitocondrial ou para a matriz. À medida que Cox1 está sendo sintetizada, ela é inserida co-traducionalmente na membrana mitocondrial interna com o auxílio da maquinaria Oxa1, que interage com o microribossomo. Cox14 e Cox25/Coa3 são pequenas proteínas transmembrana únicas com uma extremidade C-terminal hidrofílica. Enquanto essa região de Cox14 reside no espaço intermembrana e é rica em glutamina, a extremidade C-terminal de Cox25 reside no ambiente da matriz e contém um domínio terminal rico em lisina carregado positivamente. As topologias de Cox14 e Cox25 sugerem que essas proteínas poderiam interagir com os domínios transmembrana de Cox1 e direcionar sua inserção na membrana interna. Definitivamente, elas servem para promover a estabilidade do complexo Cox1-Mss51-Ssc1 ao interagir com Cox1 e segurar o complexo tanto do lado do espaço intermembrana quanto do lado da matriz da membrana interna. De fato, na ausência de qualquer uma dessas proteínas, a Cox1 recém-sintetizada é rapidamente degradada.

Após a síntese e inserção na membrana de Cox1, um complexo de pré-montagem Ssc1-Mss51-Cox1-Cox14-Cox25 permanece estável até que Cox1 prossiga para as etapas de montagem a jusante. Esse complexo, abundante em células do tipo selvagem, poderia representar um complexo contendo Cox1 que serve como um reservatório de Cox1 estável, pronta para ser maturada e/ou progredir no processo de montagem da COX quando necessário. Postulamos que as interações de Mss51 dentro dos complexos traducionais e de pré-montagem regulam negativamente a síntese de Cox1 quando a montagem da COX está prejudicada, ao aprisionar Mss51 e limitar sua disponibilidade para a tradução do mRNA de COX1 (Figura 2). Os resíduos C-terminais de Cox1 foram recentemente demonstrados como essenciais para o sequestro de Mss51 e para estabilizar a interação Ssc1-Mss51-Cox14-Cox25.
De acordo com o modelo de regulação traducional (Figura 2), a liberação de Mss51-Ssc1 do complexo de pré-montagem e a disponibilidade de Mss51 para a síntese de Cox1 provavelmente ocorrem quando Cox1 adquire seus grupos prostéticos ou interage com outras subunidades da COX, uma etapa possivelmente catalisada por Shy1 (homólogo levedura do SURF1), uma proteína envolvida na maturação e/ou montagem de Cox1. Coa1, outro fator de montagem da COX, também poderia participar da maturação de Cox1 e estabilizar o complexo Cox1-Ssc1-Mss51-Cox14-Cox25 antes de sua interação com Shy1. Uma vez que Mss51 é liberada do complexo de pré-montagem de Cox1, Cox14 e Cox25 permanecem interagindo com intermediários de montagem da COX cada vez mais maduros. Coa1 e Shy1 são subsequentemente incorporados para interagir com submontagens contendo Cox1 a jusante dos papéis de Mss51 na biogênese da COX. Na ausência de Coa1, a síntese de Cox1 prossegue normalmente como no caso de mutantes cox14 ou cox25. No entanto, o complexo de pré-montagem de Cox1 é formado na ausência de Coa1 e agora é geralmente aceito que essa proteína não faz parte dos complexos contendo Mss51. Coa1 poderia desempenhar papéis na maturação de Cox1, talvez em colaboração com Shy1, uma etapa que poderia ser sincronizada com a incorporação das subunidades codificadas pelo núcleo Cox5a e Cox6 em intermediários precoces da montagem de Cox1 e acoplada à liberação de Mss51 do complexo de pré-montagem de Cox1.

A presença de Ssc1 no complexo de pré-montagem poderia servir para facilitar o dobramento adequado de Cox1 durante a inserção na membrana, como mencionado anteriormente, ou para apresentá-lo a sistemas proteolíticos localizados na matriz no caso de dobramento não produtivo que impediria a inserção na membrana. Alternativamente ou adicionalmente, poderia desempenhar um papel na coordenação da reciclagem de Mss51 de sua função pós-traducional para se tornar disponível para a tradução do mRNA da COX1. De fato, propusemos que quando Mss51 é liberada do complexo de pré-montagem, ela forma um complexo heterodimérico muito estável com Ssc1. Na ausência de mRNA de COX1 e/ou Cox1, todo o Mss51 está ligado a Ssc1 neste complexo binário, que parece ser o reservatório de Mss51 quando não está envolvido em suas funções na biogênese de Cox1. Este heterodímero pode ser a fonte de Mss51 competente para tradução. Apoiando essa possibilidade, a superexpressão de Mss51 ou mutações nulas em cox14 e cox25/coa3 resulta em níveis normais de síntese de Cox1, embora a proteína seja rapidamente degradada e Mss51 se acumule totalmente no complexo heterodimérico com Ssc1, evitando assim a armadilha em complexos de maior peso molecular, e esteja disponível para rodadas subsequentes de tradução. Entre as muitas questões em aberto restantes, parece importante saber se Mss51 é liberada do complexo de pré-montagem ligada a Ssc1 ou se uma nova molécula de Ssc1 se liga a Mss51 após sua liberação. Da mesma forma, explorar se Mss51 desempenha um papel na ativação traducional do mRNA da COX1 sozinha ou complexada a Ssc1 requer investigação adicional.
Além disso, se o sistema de regulação traducional de COX1 é conservado em eucariotos superiores permanece desconhecido. A síntese de Cox1 parece prosseguir normalmente em células de pacientes portadores de mutações que comprometem a montagem da COX. Pode-se afirmar que, nesses casos, os fatores mutantes sempre retêm alguma atividade residual que poderia prevenir a ativação do mecanismo regulatório. No entanto, a síntese de Cox1 não foi alterada em células de camundongos portadoras de um alelo nulo de cox10.
3.2. Maturação de Cox1 pela incorporação de seus grupos prostéticos metálicos
A Cox1 contém dois centros metálicos, o heme a e o centro binuclear formado por CuB e o heme a3 de alto spin, que são essenciais para a atividade catalítica da enzima. A incorporação desses grupos prostéticos é necessária para a maturação e o enovelamento correto do polipeptídeo Cox1. Quando e como os grupos metálicos são incorporados à Cox1 é de grande interesse na área, mas ainda não foi totalmente compreendido.
3.2.1. Biossíntese do heme a, incorporação na Cox1 e acoplamento à montagem da COX
O heme a é um grupo prostético presente na COX eucariótica e de algumas bactérias. A maioria das oxidases bacterianas contém heme b, uma espécie precursora do heme a. A COX é a única enzima mitocondrial que requer heme a como cofator. O heme a difere do protoheme (heme b) pelo fato de a cadeia lateral vinil no C2 ser substituída por uma hidroxifarnesila e o grupo metil ser oxidado a um grupo formil. A biogênese do heme a a partir de sua forma ancestral heme b é um processo gradual e foi revisada em outro lugar. A primeira reação é catalisada pela Cox10, a heme A:farnesiltransferase, e envolve a formação de um intermediário heme o que carrega um grupo hidroxifarnesila na posição C-2. A conversão do heme o em heme a requer a oxidação do substituinte metil na posição C-8 a um grupo formil, o que poderia ocorrer em duas etapas discretas de monooxigenase. Vários modelos foram propostos para explicar a conversão de heme o em heme a. Em um modelo, o grupo metil do heme o é primeiro hidroxilado pela oxigenase Cox15, que atua em conjunto com a ferredoxina Yah1 e a redutase da ferredoxina Arh1, enquanto a oxidação subsequente do metanol no C-8 a um grupo formil seria catalisada por uma enzima ainda não identificada. Em outro modelo, a Cox15 pode utilizar duas reações sucessivas de monooxigenase para gerar um diol geminal (que poderia então se desidratar espontaneamente). Em uma terceira alternativa, talvez menos provável, um mecanismo do tipo peroxidase pode ser invocado para gerar um aldeído diretamente a partir de um grupo metil, ou uma peroxidase poderia oxidar um intermediário álcool. Estudos em Bacillus subtillis forneceram fortes evidências apoiando que a Cox15 oxida o heme o a heme a por meio de reações sucessivas de monooxigenase. Em uma nota funcional, foi proposto que a farnesilação do heme pode ser importante para o enovelamento e empacotamento da Cox1, o que pode explicar a necessidade de conter heme a em vez de heme b.
Embora a hemilação da Cox1 seja essencial para a montagem da COX, pouco se sabe sobre os intervenientes e o mecanismo da inserção do heme a na Cox1. Devido à natureza reativa do grupo heme a, é provável que uma proteína de ligação ao heme auxilie a transferência do heme a do seu local de síntese para a Cox1. A Cox10 e a Cox15 são ambas proteínas integrais da membrana mitocondrial interna, o que poderia proporcionar proximidade entre a síntese do heme a e a inserção na Cox1. Devido à necessidade da incorporação do heme a na Cox1 para a sua estabilidade e enovelamento, foi sugerido que este evento poderia ocorrer co-traducionalmente ou durante a inserção da Cox1 na membrana. No entanto, foi recentemente demonstrado que os dois locais do cofator heme a na Cox1 se formam a jusante dos intermediários de pré-montagem e estabilização da Cox1 contendo Mss51 e Coa1. Estes intermediários da Cox1 formam-se normalmente em células com defeito na biossíntese do heme a ou em estirpes mutantes de cox1 com mutações na His axial do heme a. Além disso, análises do complexo de pré-montagem e estabilização da Cox1 contendo Mss51 purificado não detetaram quaisquer vestígios de heme a (nossos resultados não publicados), indicando assim que a inserção do heme ocorre claramente numa fase pós-traducional. Em contraste, o intermediário de montagem da Cox1 contendo Shy1, livre de Mss51, é perturbado na ausência de heme a, sugerindo assim que a incorporação do heme a na Cox1 ocorre dentro desta submontagem.
Shy1 é o homólogo de levedura de Surf1, um gene de mamíferos identificado na deficiência de COX que leva à síndrome de Leigh em humanos. Shy1 foi proposto como estando envolvido na formação ou estabilização do sítio heme a3. Essa hipótese foi inicialmente baseada na observação de que em um mutante nulo de surf1 de Rhodobacter sphaeroides, o sítio heme a3 não está totalmente povoado. Notavelmente, nesse mutante, o sítio heme a foi encontrado formado. Esse resultado levanta a questão da possível existência de duas heme a insertases. Embora não tenha havido nenhum relato de outras proteínas candidatas envolvidas na entrega de heme para Cox1, não é provável que Shy1/Surf1 seja a única proteína envolvida nesse processo devido aos 10-15% de atividade residual de COX detectada no mutante nulo de levedura e em células humanas mutantes de surf1. Dados recentes sobre isoformas de Surf1 de Paracoccus denitrificans mostraram que, quando coexpressas em Escherichia coli com enzimas para a síntese de heme a, elas têm a capacidade de ligar heme a em uma estequiometria de 1:1 com valores de Kd na faixa submicromolar. No entanto, essas descobertas ainda precisam ser confirmadas in vivo e em eucariotos. O estudo bacteriano também identificou uma histidina conservada como um resíduo crucial para a ligação do heme. COX10 é um supressor multicópia fraco de células Δshy1 de levedura, conectando assim Shy1 à biossíntese de heme. No entanto, mutações de qualquer um dos dois resíduos de His conservados em Shy1 de levedura não afetaram significativamente sua função. Alternativamente, a função de Shy1 pode aumentar a estabilização do sítio heme a3 em vez de desempenhar um papel direto na entrega de heme a. Um papel de Shy1 na incorporação de subunidades adicionais de COX em submontagens iniciais de Cox1 não foi totalmente descartado. Por exemplo, a superexpressão de Cox5a e Cox6 suprime significativamente o defeito respiratório de células Δshy1. Níveis aumentados dessas subunidades podem estabilizar Cox1 em células Δshy1, permitindo a progressão para estágios posteriores da montagem da COX. Poderíamos especular que, por exemplo, a adição de Cox5a, cuja hélice transmembranar está firmemente compactada contra Cox1, poderia contribuir para a estabilização dos centros metálicos em Cox1. No entanto, estudos de intermediários de montagem da COX em fibroblastos de pacientes humanos com mutações no SURF1 revelaram o acúmulo de Cox1 sozinha ou em um intermediário inicial contendo as subunidades IV e V humanas (subunidades 5a e 6 de levedura), o que sugeriu que SURF1 poderia desempenhar um papel na incorporação da subunidade II nesses intermediários nascentes. Em qualquer caso, a inserção do heme a no centro binuclear de Cox1 parece ocorrer antes da adição de Cox2, pois o grupo farnesil do heme a3 está localizado na interface entre as duas subunidades.
Devido à alta reatividade da porção heme a, parece lógico que sua síntese seja coordenada com sua incorporação em Cox1. De fato, foi demonstrado que a biossíntese do heme a é regulada por eventos posteriores no processo de montagem da COX. Na maioria dos mutantes de levedura para COX, há uma redução drástica nos níveis de estado estacionário do heme a. A superexpressão de COX15, particularmente quando co-superexpressa com a ferredoxina YAH1, atuou como um supressor do defeito de acúmulo de heme a em mutantes da COX, incluindo mutantes em que Cox1 não foi sintetizado. Essa observação sugeriu que a ausência de heme a nos mutantes não se deve a uma rápida renovação do cofator na ausência da subunidade 1 da COX, mas sim a uma regulação por retroalimentação da síntese de heme a quando o processo de montagem da COX é bloqueado. Esses resultados sugerem que a síntese de heme a pode prosseguir mesmo na ausência de peptídeo Cox1 estável. Além da baixa síntese de heme a, mutantes da COX, com a óbvia exceção de cox10, também mostram um acúmulo de heme o, indicando que este composto é estável. Os níveis de heme o também eram muito baixos em um mutante nulo de cox15, um fenótipo que não foi resgatado pela superexpressão de COX10. Essa observação sugeriu que a primeira etapa da biossíntese do heme a também é positivamente regulada de maneira dependente de Cox15. Resta testar se o aumento dos níveis de heme a pela superexpressão de COX15 na ausência de montagem da COX contorna a regulação negativa de Cox1. Nesse caso, poderia ser proposta uma conexão direta entre a tradução de COX1 e as regulações da biossíntese do heme a. No entanto, em um mutante nulo de cox14, no qual a síntese de Cox1 não é regulada negativamente devido à instabilidade do intermediário inicial Mss51:Cox1, os níveis de heme a são baixos e há um acúmulo significativo do intermediário heme o, em comparação com uma cepa do tipo selvagem, indicando assim que um aumento na síntese de Cox1 não estimula a biogênese do heme a.
A identidade do intermediário da montagem da COX que poderia operar na regulação da biossíntese do heme a ainda precisa ser identificada. Estudos recentes em leveduras identificaram um novo gene de montagem da COX, COA2, essencial para a montagem da COX, cuja ausência prejudica a maturação de Cox1 e induz uma rápida degradação de Cox1 recém-sintetizada. Foi demonstrado que Coa2 interage transitoriamente com Shy1. Coa2 foi associado à hemilação de Cox1 porque a deficiência respiratória de células coa2Δ é suprimida pela presença de um alelo mutante cataliticamente ativo de Cox10 (N196K). A atividade supressora dessa variante de Cox10 é, na verdade, dependente de sua função catalítica e da presença de Cox15. Notavelmente, Cox10 forma um complexo oligomérico de alta massa cuja estabilidade, aumentada pela mutação N196K, parece depender de Coa2. A oligomerização de Cox10 do tipo selvagem parece ser dependente do complexo Cox1 contendo Coa1, mas a proteína N196K pode oligomerizar na ausência de Coa1. Consistentemente, o oligômero de Cox10 não é formado em células Δcox14, onde Cox1 é sintetizado, mas não montado. No entanto, é improvável que a oligomerização de Cox10 seja necessária para sua função como heme o sintase, uma vez que o mutante nulo cox14 acumula altos níveis do intermediário heme o, conforme mencionado anteriormente.
As vias envolvidas na biossíntese do heme a são altamente conservadas de leveduras a humanos. A conservação de Cox10 e Cox15 ao longo da evolução é sublinhada pela complementação heteróloga de COX10 e COX15 humanos, embora fraca no primeiro caso, dos mutantes nulos de levedura cox10 e cox15, respectivamente. Mutações nos genes humanos COX10 e COX15 têm sido associadas a cardiomiopatia infantil grave e síndrome de Leigh em humanos. A análise de intermediários da montagem da COX sugere que o heme a é incorporado em COX1 em um estágio muito inicial da montagem da COX, antes da formação do complexo COX1-COX4-COX5a, que falha em se acumular em fibroblastos de pacientes. O sistema regulatório do heme a pode ser diferente em células de mamíferos. Análises do conteúdo de heme mitocondrial em fibroblastos deficientes em COX15 de um paciente humano sofrendo de cardiomiopatia hipertrófica mostraram níveis de heme o significativamente mais altos do que em fibroblastos controle.
3.2.2. Metabolismo do cobre e inserção em Cox1
Apesar de ser essencial para a vida, a alta atividade redox do cobre significa que ele pode ser extremamente tóxico e promover a formação de espécies reativas de oxigênio. Portanto, uma rede de transportadores controla estritamente o movimento do cobre em sistemas vivos. A maioria dos componentes da maquinaria homeostática do cobre e seus mecanismos de ação foram elucidados em S. cerevisiae e foram amplamente revisados em outro lugar. Nas mitocôndrias, duas enzimas, COX e mt-Sod1, recebem cobre no IMS. Isso requer uma via específica de transporte de cobre para essa organela. A matriz mitocondrial contém um pool de cobre ligado por um ligante não proteico ainda não totalmente caracterizado. Esse pool é a fonte de cobre para a metalização de COX e mt-Sod1. O ligante também foi encontrado no citoplasma e foi sugerido que ele pode recrutar cobre para as mitocôndrias no lugar de uma chaperona de cobre. Exatamente como o cobre faz seu caminho dos transportadores de cobre da membrana plasmática para a matriz mitocondrial e o IMS é de grande interesse para o campo e permanece a ser compreendido.

A metalização do cobre da COX envolve a metalochaperona do IMS Cox17, uma pequena proteína hidrofílica que contém um motivo de ligação ao cobre CCxC. O último cisteína no motivo é o primeiro em um motivo estrutural Cx9C gêmeo sobreposto. Uma vez que o cobre atinge a Cox17 dentro do IMS, aceita-se que essa proteína transfere íons de cobre para duas chaperonas, Sco1 e Cox11, que facilitam a inserção de cobre nos sítios Cox2-CuA e Cox1-CuB, respectivamente. Como o cobre atinge a Cox17 no IMS mitocondrial ainda é uma questão em aberto. Além da Cox17, o IMS abriga outras proteínas Cx9C conservadas cuja ausência produz efeitos heterogêneos na montagem e função da COX. Várias informações obtidas em S. cerevisiae sugerem que pelo menos algumas dessas proteínas poderiam fazer parte de uma via de transferência de cobre para a COX. Essas proteínas incluem Cox19, Cox23, Pet191, Cmc1 e Cmc2. Nós hipotetizamos que o cobre poderia ser transferido do pool da matriz através da membrana interna por um transportador não caracterizado para as proteínas ligadas à membrana Cmc1/2. Em um mecanismo de transferência em cadeia, o cobre seria sucessivamente transferido para as Cox19, Cox23 solúveis e, finalmente, para a Cox17 para entrega final à Cox11 e Sco1. Espera-se que esse mecanismo envolva a transferência tanto do potencial redutor quanto do Cu(I) para gerar proteínas reduzidas ligadas ao Cu(I). Esse mecanismo poderia ser útil para acumular um pequeno pool de cobre no IMS disponível para transferência regulada para a Cox17. Alternativamente, as pequenas proteínas CX9C poderiam desempenhar um papel na transferência de cobre para a Cox17 modulando o ambiente redox local dentro do IMS. Curiosamente, Cmc1 e Cmc2 não são apenas necessárias para a expressão completa da COX, mas modulam indiretamente a entrega de cobre para a mt-Sod1, sugerindo assim uma conexão entre as duas vias. Esses aspectos do metabolismo do cobre mitocondrial permanecem especulativos e foram extensivamente revisados recentemente.
Focando na metalização de cobre da Cox1, o sítio CuB é formado por um íon de cobre coordenado por três ligantes de histidina e presente em proximidade próxima à porção heme a3. A metalochaperona Cox11 é formada por um domínio transmembrana e um domínio globular de ligação ao cobre voltado para o espaço intermembrana onde ocorre a transferência de cobre. O domínio C-terminal solúvel da Cox11 forma um dímero que coordena um Cu(I) por monômero. Os dois íons Cu(I) no dímero existem em um aglomerado binuclear e parecem ser coordenados por três resíduos de cisteína conservados. O mecanismo pelo qual a Cox11 transfere cobre para o sítio CuB ainda precisa ser elucidado.

A metalização de cobre da Cox1 foi inicialmente imaginada como ocorrendo co-traducionalmente devido ao posicionamento do sítio CuB, profundamente enterrado abaixo da membrana mitocondrial interna. Tal hipótese foi apoiada por estudos que mostram que uma pequena porção da Cox11 pode interagir com ribossomos mitocondriais. No entanto, a análise funcional dos domínios da Cox11 de levedura sugere que a interação fraca com os ribossomos deve ser mediada por outra proteína, já que o domínio da matriz da Cox11 não é essencial. Por outro lado, em Schizosaccharomyces pombe, a Cox11 existe como uma proteína de fusão com Rsm22, um componente da subunidade pequena dos ribossomos mitocondriais e, em S. cerevisiae, a fusão sintética não clivável da Cox11 com Rsm22 é totalmente funcional. É tentador especular que a interação transiente com os ribossomos poderia servir para recrutar a Cox11 ao local da síntese de Cox1 para regular sua metalização de cobre uma vez que a Cox1 tenha sido inserida na membrana e estabilizada pela ligação às chaperonas Mss51, Cox14 e Cox25.

De fato, investigações mais recentes estabeleceram que a formação do sítio CuB não ocorre realmente enquanto a Cox1 recém-sintetizada está interagindo com Mss51, mas perto ou no intermediário de montagem da Cox1 contendo Shy1, talvez simultaneamente à incorporação da porção heme a3 no centro heterobimetálico. Esta conclusão foi apoiada pela detecção de uma interação transiente entre Cox11 e Shy1 e pela atenuação marcante da Cox1 contendo Shy1 em Δcox11, que foi parcialmente restaurada com um mutante não funcional da Cox11.
Ainda não está claro em que ordem específica o centro CuB-heme a3 é metalado. Estudos em um mutante nulo de cox11 de Rhodobacter sphaeroides mostraram que a porção heme a3 pode ser entregue a esse local na ausência de cobre. Estudos em levedura revelaram que mutantes nulos de cox11, bem como mutantes de sco1, apresentam maior sensibilidade ao peróxido de hidrogênio do que uma cepa selvagem, o que foi atribuído à presença de um intermediário Cox1-heme a3 altamente reativo. Foi proposto que, independentemente de sua função de ligação ao cobre, a Cox11 pode se ligar e estabilizar a Cox1 por meio de interações transitórias em um conformero de Cox1 que tem menor acessibilidade ao solvente para o heme a3. No entanto, uma interação direta Cox11-Cox1 não foi detectada. Além disso, a quantidade do intermediário Cox1 contendo Shy1 foi considerada marcadamente atenuada em Δcox11, conforme mencionado anteriormente, uma observação que sugeriria que seu acúmulo poderia produzir efeitos deletérios, mas ao mesmo tempo torna intrigante a pequena concentração limiar desse intermediário putativo que parece ser necessária para produzir tal efeito.
O metabolismo do cobre mitocondrial humano envolve elementos conservados. Homólogos dos genes de levedura COX11, COX17, SCO1, COX19, COX23, PET191, CMC1 e CMC2 foram identificados, mas na maioria dos casos suas funções permanecem mal caracterizadas. O homólogo humano de COX17 compartilha 48% de identidade de sequência com seu equivalente em levedura. No entanto, a depleção de COX17 por siRNA em células HeLa causa o acúmulo de intermediários de montagem da COX contendo COX1 e desprovidos de COX2, sugerindo que o papel do COX17 humano na metalação da COX2 pode ser mais essencial do que para COX1 (Oswald et al., 2009). No entanto, o conteúdo metálico da COX1 estável não foi relatado. Em outro aspecto, uma mutação homozigótica em C2orf64, o homólogo humano do gene PET191 de levedura, foi recentemente identificada em dois irmãos afetados por cardiomiopatia neonatal fatal associada a deficiência grave de COX. O acúmulo de um pequeno intermediário de montagem da COX contendo COX1, mas não COX2, COX4 ou COX5b, em fibroblastos de pacientes sugere que PET191 está envolvido em uma etapa inicial da montagem da COX.
4. Biogênese e montagem da Subunidade 2 da COX
4.1. Síntese, inserção na membrana e estabilidade da Cox2
A síntese de Cox2 requer a ação de Pet111, um ativador traducional específico para o mRNA de COX2 ligado à membrana. Pet111 interage com a região 5′-UTR do COX2 para promover a tradução e está presente nas membranas mitocondriais em baixa concentração, limitando assim a síntese de Cox2. Em um tipo diferente de regulação, sabe-se que a tradução do mRNA de COX2 é controlada por sinais antagônicos intrínsecos. A sequência de mRNA dos primeiros 14 códons de COX2, que especificam o peptídeo líder N-terminal do precursor Cox2 (pCox2) discutido abaixo, contém um elemento de ação positiva necessário para a tradução a jusante do mRNA de COX2. Três sequências adicionais localizadas na região N-terminal da proteína madura Cox2 foram descritas como tendo um papel inibitório na ausência do elemento positivo. Foi hipotetizado que a interação entre esses sinais durante a tradução pode garantir a coordenação da síntese de Cox2 e sua subsequente montagem no COX.

Cox2 é uma proteína integral de membrana contendo dois domínios transmembrana e apresenta uma topologia N-out C-out (ambas as extremidades se projetando no EIM). Cox2 é sintetizada como uma proteína precursora (pCox2) com uma extensão amino terminal clivável (Fig. 3). Antes da clivagem, pCox2 interage com a maquinaria Oxa1, que facilita a inserção na membrana do primeiro domínio transmembrana de pCox2 e a concomitante exportação de seu domínio N-terminal através da membrana interna. Esta etapa é necessária para a exportação da cauda C-terminal de pCox2. Oxa1 pertence a uma família conservada de proteínas conhecida como família YidC/Alb3/Oxa1, cujos membros bacterianos, mitocondriais e plastidiais auxiliam na inserção de proteínas na membrana. Oxa1 é uma proteína integral da membrana interna que contém cinco domínios transmembrana e apresenta orientação N-out C-in. A extremidade C-terminal de Oxa1 interage com a subunidade ribossômica grande em estreita proximidade com o túnel de saída do polipeptídeo, facilitando assim a inserção co-traducional dos peptídeos hidrofóbicos nascentes na membrana interna mitocondrial. Oxa1 coopera com a proteína de membrana Mba1, que atua como um receptor de ribossomos para recrutar ribossomos para a membrana interna e ajuda Oxa1 na orientação do local de saída do ribossomo em direção à maquinaria de inserção na membrana interna. No entanto, ambas as subunidades ribossômicas permanecem ligadas à membrana interna na ausência de Oxa1 e Mba1, indicando que outros fatores colaboram para a ancoragem dos ribossomos à membrana. A função de Oxa1 não se limita à inserção de Cox2, mas se estende à inserção de outras proteínas politópicas, como as proteínas Cox1 e Cox3 codificadas mitocondrialmente, conforme mencionado anteriormente. Independentemente da ausência de uma extremidade N-terminal clivável na Cox2 de mamíferos, o homólogo humano de Oxa1 (OXA1L) é capaz de substituir funcionalmente a proteína de levedura, levando a uma montagem correta do COX, sugerindo que ambas as proteínas desempenham um papel semelhante.
A exportação do C-terminal de Cox2 de S. cerevisiae depende do potencial de membrana interno, enquanto a exportação da extremidade N-terminal não depende, o que sugere que, embora ambos os processos dependam de Oxa1, eles envolvem mecanismos distintos. A jusante do papel de Oxa1, o produto de COX18 em conjunto com outras duas proteínas da membrana interna, Mss2 e Pnt1, foi proposto para promover subsequentemente a inserção do segundo domínio transmembrana de pCox2, proximal ao C-terminal. Cox18 se assemelha a alguns membros da família Oxa1, mas seu papel é específico para a translocação de Cox2. No entanto, uma interação direta entre Cox2 e Cox18 ainda não foi demonstrada. Cox18 interage fisicamente com Mss2 e Pnt1, sugerindo que eles formam um complexo de translocação, embora os mecanismos moleculares detalhados envolvidos na exportação da cauda C-terminal de Cox2 ainda precisem ser elucidados. Curiosamente, a ligação do cobre a Cox2 não é um requisito para a translocação da cauda C-terminal, uma vez que substituições de sentido trocado em dois dos resíduos de ligação ao cobre em Cox2 não impediram sua exportação. Apesar das semelhanças entre Oxa1 e Cox18, a superexpressão de OXA1 não é capaz de suprimir a deficiência respiratória de células Δcox18. No entanto, ela promove alguma translocação do domínio C-terminal de Cox2 através da membrana interna e aumento do acúmulo de Cox2, que permanece não montado. Essa observação sugeriu que, além de seu papel na translocação da cauda C-terminal, Cox18 é necessário para entregar Cox2 a um estado competente para a montagem do COX. Curiosamente, células Δcox18 que superexpressam Oxa1 recuperam a competência respiratória após adquirir mutações recessivas em Mgr1 e Mgr3, cujos produtos são conhecidos por serem subunidades do supercomplexo da protease AAA da membrana interna, onde se associam a Yme1 e participam da degradação de proteínas de membrana. No entanto, a ausência de Mgr1/3 não atua estabilizando Cox2, e foi proposto que Yme1 poderia provavelmente auxiliar no dobramento e/ou montagem de Cox2 exportado por Oxa1 nessas condições.
Após a exportação, a pCox2 interage com a chaperona específica de Cox2, Cox20, que apresenta a proteína precursora ao complexo de peptidase da membrana interna (IMP) de três subunidades, que catalisa a remoção proteolítica da sequência amino-terminal da pCox2. A interação Cox20-Cox2 provavelmente ocorre após a exportação do domínio N-terminal da Cox2 e antes da ação de Cox18, porque a sequência líder da pCox2 é clivada em células Δcox18. O complexo IMP é formado por três subunidades; Imp1 e Imp2 têm funções catalíticas com diferentes especificidades de substrato e Som1 estabiliza o complexo. Imp1 é responsável pela clivagem proteolítica da pCox2, mas sua função requer a presença estabilizadora das outras duas subunidades. Com base na similaridade de sequência, um putativo homólogo humano de IMP2 foi relatado, embora considerando a ausência de dados experimentais sobre sua função, permanece incerto se é um ortólogo verdadeiro. De qualquer forma, é improvável que possa estar relacionado à biogênese da Cox2, considerando que a Cox2 de mamíferos carece de qualquer extensão amino-terminal clivável.

Uma vez que a sequência líder da pCox2 é clivada, a Cox20 provavelmente permanece ligada à Cox2 madura, estabiliza a proteína e facilita sua montagem em intermediários de montagem da COX. O papel essencial da Cox20 como chaperona da Cox2 é apoiado por sua conservação ao longo da evolução. Um homólogo humano foi recentemente identificado por análises de sequência BLAST. Embora a proteína se localize nas mitocôndrias em células HeLa (nossos resultados não publicados), sua função como chaperona da Cox2 ainda precisa ser totalmente caracterizada.

2.2. Maturação da Cox2 pela inserção de seu grupo prostético de cobre
O centro binuclear CuA na Cox2 é coordenado por um motivo CxExCGx2Hx2M e existe como um complexo [Cu2+/Cu1+], conforme revelado por espectroscopia de EPR. A metalochaperona para a formação do centro CuA da Cox2 é o produto de SCO1.
Sco1 é ancorada à membrana interna mitocondrial através de uma hélice α transmembrana e expõe o sítio de ligação ao cobre no espaço intermembrana, onde ocorre a transferência de cobre. Experimentos in vitro mostraram que uma forma truncada solúvel de Sco1 é capaz de se ligar ao cobre doado pela Cox17. No entanto, ainda não está claro como ocorre a transferência de cobre, pois uma interação física entre Cox17 e Sco1 ainda não foi detectada, provavelmente devido à sua natureza transitória in vivo. Sco1 possui um motivo Cx3C de ligação a metal, análogo ao motivo de ligação ao cobre da Cox2, e esse motivo é essencial para sua função, conforme demonstrado por mutagênese sítio-dirigida. SCO1 foi originalmente identificado como um supressor multicópia de um mutante nulo de cox17 e demonstrou-se que interage diretamente com a Cox2. Além disso, como o centro CuA é formado por um íon Cu(I) e um íon Cu(II), permanece a ser elucidado se a Sco1 medeia a transferência de ambos os íons de diferentes valências ou, alternativamente, se dois Cu(I) são inseridos na Cox2 pela Sco1 e o sítio ativo é sucessivamente oxidado. Sco1 é capaz de ligar tanto Cu(I) quanto Cu(II), e estudos de RMN sugeriram que a Cox17 transfere potencial redutor e Cu(I) para permitir a metalação da Sco1. Além do papel de Sco1 na inserção de cobre, sua similaridade estrutural com redutases de dissulfeto sugeriu que ela poderia estar envolvida na redução de cisteínas no sítio de ligação ao cobre da Cox2, facilitando assim a incorporação de cobre. Sco1 pode formar complexos homodiméricos, o que poderia facilitar a realização de ambas as funções pela ação colaborativa de cada monômero.

A levedura SCO1 possui um homólogo altamente conservado, SCO2. Embora sua ausência não afete a montagem da COX, a superexpressão de Sco2 resgata parcialmente o defeito respiratório de células mutantes pontuais de sco1, bem como o defeito de mutantes de cox17 quando o meio de crescimento é suplementado com cobre. No entanto, sua função precisa permanece a ser revelada.

O sítio ativo CuA está localizado acima da superfície da membrana interna, em um domínio da Cox2 dobrado em um barril β e projetando-se para dentro do espaço intermembrana mitocondrial. A inserção de cobre mediada por Sco1 na Cox2 provavelmente ocorre após a extrusão do domínio de ligação ao cobre da Cox2 no espaço intermembrana e antes da incorporação desta subunidade a um intermediário de montagem da COX.

2.3. Papéis das chaperonas de inserção de cobre específicas da Cox2 em mamíferos

Semelhante à levedura, humanos têm duas proteínas Sco1, embora ambas sejam homólogas da Sco1 de levedura. Elas também foram denominadas SCO1 e SCO2. Ambas são essenciais para a montagem da COX e mutações em SCO1 e SCO2 resultam em distúrbios mitocondriais graves. As diferenças funcionais entre as duas isoformas de levedura e humanas são explicadas pelo fato de que os dois genes provavelmente se originaram de uma duplicação que ocorreu separadamente nos dois organismos.
Em contraste com as proteínas Sco de levedura, as SCO1 e SCO2 humanas demonstraram realizar funções independentes e cooperativas na montagem da COX. As proteínas Sco contêm um motivo de ligação ao cobre CX3C, essencial para sua função na biogênese da COX2. Além disso, tanto as proteínas SCO1 quanto SCO2 têm uma afinidade pelo cobre maior que a COX17 (Banci et al, 2010), o que permite a transferência quantitativa de Cu(I) da COX17 para SCO1 e SCO2. A proteína SCO1 existe como uma população mista de tióis oxidados e reduzidos, cuja proporção depende da presença de uma proteína SCO2 funcional. Esses dados, juntamente com a observação de que as proteínas Sco contêm um domínio tiorredoxina altamente conservado, levaram Leary e coautores a sugerir uma função de tiol-dissulfeto oxidorredutase para a proteína SCO2. Seguindo o modelo proposto, após a metalização da COX2 por SCO2 e a inserção de cobre simultânea ou sequencial dependente de SCO1, a SCO2 reoxida as cisteínas da SCO1, uma reação que permite reiniciar ambas as proteínas para novos ciclos de biogênese da COX2. Embora ambas as proteínas Sco sejam necessárias para a transferência de cobre para a COX2, a SCO2 é adicionalmente necessária para a síntese da COX2, pois a depleção de SCO2 diminui o acúmulo de COX2 recém-sintetizada em células de cultura. Essas funções específicas de cada proteína Sco durante a síntese de Cox2 e a formação do sítio CuA provavelmente servem para coordenar ambos os processos durante a montagem da COX.
Finalmente, em um processo independente da biogênese da COX, tanto SCO1 quanto SCO2 desempenham papéis adicionais na manutenção da homeostase celular do cobre, cooperando para regular o efluxo de cobre em condições de excesso de cobre celular.
5. Biogênese e montagem da Subunidade 3 da COX
5.1 Síntese de Cox3, inserção na membrana e estabilidade
Cox3, a terceira subunidade da COX codificada pelo DNA mitocondrial, completa o núcleo catalítico da COX. Semelhante a Cox1 e Cox2, Cox3 é uma proteína altamente hidrofóbica com 7 hélices transmembrana embutidas na membrana mitocondrial interna. Em contraste, Cox3 não contém grupos prostéticos e sua função permanece incerta. Foi proposto que Cox3 poderia estar envolvida na montagem e/ou estabilidade das subunidades 1 e 2 ou na modulação do acesso do oxigênio ao centro binuclear. No entanto, estudos realizados em COX bacteriana, formada exclusivamente pelas três subunidades principais, sugeriram que Cox3 poderia desempenhar um papel na modulação da transferência de prótons através das subunidades 1 e 2.
Em S. cerevisiae, a síntese de Cox3 requer a atividade de três ativadores traduccionais codificados pelo núcleo: Pet54, Pet122 e Pet494. A deleção de qualquer uma dessas proteínas reduz severamente a síntese de Cox3, evidenciando seu papel essencial e não redundante na biogênese de Cox3. Os ativadores traduccionais do mRNA de COX3 interagem entre si para formar um complexo ativador específico de COX3, que, através de Pet54, se liga diretamente à região 5′-UTR do mRNA de COX3 para promover a tradução. Pet54 desempenha múltiplos papéis na biogênese da COX. Ele não atua apenas como um ativador traduccional do mRNA de COX3, mas também é necessário para o splicing do íntron do grupo I aI5β no pré-mRNA de COX1. Em particular, foi demonstrado que o mRNA da região 5′-UTR de COX3 e o íntron do grupo I aI5β se ligam à mesma superfície ou a superfícies sobrepostas em Pet54. Além disso, os sítios de ligação de Pet54 no mRNA da região 5′-UTR de COX3 e no íntron do grupo I aI5β apresentam 56% de similaridade de sequência. Em última análise, o mRNA da região 5′-UTR de COX3 e o íntron do grupo I aI5β podem competir pela ligação de Pet54. Recentemente, com base na observação de que Pet54 é necessário para a síntese de Cox1 mesmo em uma linhagem de levedura portadora de mtDNA sem íntrons, foi proposto um papel adicional, ainda não definido, de Pet54 na biogênese de Cox1. Em conjunto, esses dados sugerem um nível adicional de co-regulação da expressão de Cox1 e Cox3.

Pet122 e Pet494 são proteínas integrais da membrana interna, enquanto Pet54 é uma proteína periférica associada à membrana mitocondrial interna. Acredita-se que, de forma semelhante à biogênese de Cox1 e Cox2, a ancoragem do aparato traduccional à membrana mitocondrial interna por esses ativadores traduccionais poderia facilitar a inserção co-traduccional dependente de Oxa1 na membrana da subunidade Cox3 recém-sintetizada, altamente hidrofóbica.

Em levedura, a Cox3 não montada é submetida a uma rápida renovação proteolítica. Cox3, similarmente às outras subunidades do núcleo (core), é um substrato do complexo protease matrix-AAA, que provavelmente reconhece o extremo N-terminal de Cox3 que se projeta na matriz mitocondrial.

5.2 Montagem de Cox3

Pouco se sabe sobre a adição de Cox3 nos intermediários de montagem da COX. Embora se espere que seja um processo assistido por proteínas, a identidade da suposta chaperona específica de Cox3 ainda não foi revelada. Acredita-se, no entanto, que a montagem de Cox3 ocorra uma vez que o complexo Cox1-Cox5a-Cox6 tenha sido formado e a Cox2 já tenha sido incorporada. A adição de Cox3 estabiliza o núcleo (core) porque, na ausência dessa subunidade, Cox1 e Cox2 não se acumulam nas membranas mitocondriais.
Em humanos, algumas mutações foram descritas na deficiência de COX associada à COX3. A breve lista inclui uma microdeleção de 15 pb em um paciente com mioglobinúria recorrente, uma mutação que também impediu a montagem da COX quando introduzida em leveduras. Em ambos os casos, Cox1 e Cox2 são rapidamente degradadas na ausência de Cox3. Também em Chlamydomonas, onde Cox3 é codificada por um gene nuclear e apresenta uma hidrofobicidade menor do que outras proteínas Cox3 codificadas mitocondrialmente, a falta dessa subunidade leva à ausência de COX. Esses resultados mostram que, independentemente de sua origem genética, o papel essencial de Cox3 na montagem ou estabilidade do núcleo catalítico da COX é conservado ao longo da evolução.

6. Considerações finais e questões em aberto
   Apesar dos esforços contínuos em vários laboratórios para compreender totalmente a biogênese e a montagem das subunidades do núcleo catalítico da COX mitocondrial e dos recentes avanços feitos em nossa compreensão dos mecanismos envolvidos, desvendar sua complexidade e como a biogênese da COX é regulada continua sendo um desafio notável. Embora o número de fatores acessórios da COX identificados continue aumentando, as funções específicas da maioria deles são apenas parcialmente caracterizadas. Funções específicas, como a montagem assistida por proteínas da Cox3, a atividade desidrogenase necessária para a última etapa da biossíntese do heme a, ou a chaperona de inserção do heme da Cox1, entre muitas outras, aguardam que uma proteína executora seja identificada e/ou designada. As vias regulatórias que coordenam a síntese das subunidades do núcleo da COX, a disponibilidade de cofatores, a maturação e a montagem também permanecem a ser totalmente caracterizadas. Um desafio final envolverá a identificação dos fatores de montagem da COX e das vias regulatórias conservadas de levedura a humanos e daquelas que evoluíram para se adaptar aos requisitos tecido-específicos de organismos multicelulares. Isso tem uma grande relevância biomédica, uma vez que lesões que afetam a expressão e a montagem das subunidades do núcleo catalítico da COX resultam em encefalomiopatias mitocondriais humanas graves.
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   Referências
   Modelagem da sequência de reações de transferência de elétrons no turnover único da citocromo c oxidase de mamíferos reduzida com oxigênio
   Investigando o mecanismo de transferência de elétrons para o centro binuclear em oxidases Cu-heme
   Citocromo c oxidase, ligantes e elétrons
   Transferência de elétrons acoplada a prótons impulsiona a bomba de prótons da citocromo c oxidase
   Mecanismo de bombeamento de prótons da citocromo c oxidase do coração bovino
   Controle de inventário: a montagem da citocromo c oxidase regula a tradução mitocondrial
   Montagem da citocromo c oxidase mitocondrial, um processo celular complicado e altamente regulado
   Citocromo oxidase na saúde e na doença
   Biogênese da citocromo oxidase – linhas de montagem sofisticadas na membrana mitocondrial interna
   Deficiência de citocromo c oxidase
   Tráfego de cobre para a mitocôndria e montagem de metaloenzimas de cobre
   Um método rápido para a preparação de citocromo oxidase altamente purificada
   Montagem do sistema de membrana mitocondrial. IX. Purificação, caracterização e estrutura de subunidades da citocromo oxidase de levedura e bovina
   Diferenciação in vivo da síntese de proteínas citoplasmática e mitocondrial de levedura com antibióticos
   Montagem do sistema de membrana mitocondrial. X. Síntese mitocondrial de três das proteínas subunidade da citocromo oxidase de levedura
   Citocromo c oxidase de fermento de pão. III. Caracterização física de subunidades isoladas e evidência química para duas classes diferentes de polipeptídeos
   Montagem do sistema de membrana mitocondrial. Estrutura e sequência de nucleotídeos do gene que codifica a subunidade 1 da citocromo oxidase de levedura
   Montagem do sistema de membrana mitocondrial. Sequência de DNA da subunidade 2 da citocromo oxidase de levedura
   Estrutura dos genes cox3 localizados no núcleo em Chlamydomonas reinhardtii e em seu parente próximo incolor Polytomella sp
   Mecanismos de supressão de defeitos de montagem da COX em levedura e humanos: insights sobre o processo de montagem da COX
   Estruturas dos sítios metálicos da citocromo c oxidase oxidada de coração bovino a 2,8 Å
   A estrutura completa da citocromo c oxidase oxidada de 13 subunidades a 2,8 Å
   Mudanças estruturais cristalinas acopladas a redox na citocromo c oxidase de coração bovino
   Estrutura a 2,8 Å de resolução da citocromo c oxidase de Paracoccus denitrificans
   Estrutura a 2,7 Å de resolução da citocromo c oxidase de duas subunidades de Paracoccus denitrificans complexada com um fragmento FV de anticorpo
   A caracterização e o papel da ligação de zinco na Cox4 de levedura
   Uma via de saída de água discreta na proteína de membrana citocromo c oxidase
   Evidência para a montagem sequencial de subunidades da citocromo oxidase em mitocôndrias de fígado de rato
   Montagem da citocromo-c oxidase em células humanas cultivadas
   Shy1p ocorre em um complexo de alto peso molecular e é necessário para a montagem eficiente da citocromo c oxidase em levedura
   Mss51p e Cox14p regulam conjuntamente a expressão de Cox1p mitocondrial em Saccharomyces cerevisiae
   Análise de mutantes COX2 revela submontagens da citocromo oxidase em levedura
   Um papel para Pet100p na montagem da citocromo c oxidase de levedura: interação com uma submontagem que se acumula em um mutante pet100
   Shy1 acopla a regulação translacional de Cox1 à montagem da citocromo c oxidase
   Montagem de subunidades codificadas pelo DNA nuclear no complexo IV mitocondrial, e sua integração preferencial em formas de supercomplexos em mitocôndrias de pacientes
   Montagem mitocondrial em mutantes deficientes em respiração de Saccharomyces cerevisiae. II. Efeito de mutações nucleares e extracromossômicas na formação da citocromo c oxidase
   Montagem do sistema de membrana mitocondrial: isolamento de mutantes nucleares e citoplasmáticos de Saccharomyces cerevisiae com defeitos específicos em funções mitocondriais
   Funções nucleares necessárias para a biogênese da citocromo c oxidase em Saccharomyces cerevisiae. Caracterização de mutantes em 34 grupos de complementação
   Genes PET de Saccharomyces cerevisiae
   Biogênese da citocromo c oxidase
   Biogênese da citocromo c oxidase: novos níveis de regulação
   Deficiência de citocromo c oxidase: da levedura ao humano
   Defeitos genéticos da montagem da citocromo c oxidase
   Montagem do sistema de fosforilação oxidativa em humanos: o que aprendemos ao estudar seus defeitos
   Encefalomiopatia infantil grave causada por uma mutação em COX6B1, uma subunidade codificada pelo núcleo da citocromo c oxidase
   Insuficiência pancreática exócrina, anemia diseritropoiética e hiperostose calvarial são causadas por uma mutação no gene COX4I2
   SURF1, que codifica um fator envolvido na biogênese da citocromo c oxidase, é mutado na síndrome de Leigh
   Mutações de SURF-1 na doença de Leigh associadas à deficiência de citocromo c oxidase
   Mutações do gene SCO1 na deficiência mitocondrial de citocromo c oxidase com insuficiência hepática neonatal e encefalopatia
   Cardioencefalomiopatia infantil fatal com deficiência de COX e mutações em SCO2, um gene de montagem da COX
   Mutações em SCO2 estão associadas a uma forma distinta de cardiomiopatia hipertrófica e deficiência de citocromo c oxidase
   Características diferenciais de pacientes com mutações em dois genes de montagem da COX, SURF-1 e SCO2
   Deficiência de citocromo c oxidase devido a uma nova mutação em SCO2 mimetiza a doença de Werdnig-Hoffmann
   Uma mutação no gene humano heme A: farnesiltransferase (COX10 ) causa deficiência de citocromo c oxidase
   Mutações em COX10 resultam em um defeito na biossíntese mitocondrial do heme A e são responsáveis por múltiplos fenótipos clínicos de início precoce associados à deficiência isolada de COX
   Mutações em COX15 produzem um defeito na via biossintética mitocondrial do heme, causando cardiomiopatia hipertrófica fatal de início precoce
   Identificação de um gene causador da deficiência humana de citocromo c oxidase por genômica integrativa
   Mutação em TACO1, que codifica um ativador traducional da COX I, resulta em deficiência de citocromo c oxidase e síndrome de Leigh de início tardio
   Submontagens da citocromo c oxidase em culturas de fibroblastos de pacientes portadores de mutações em COX10, SCO1 ou SURF1
   Defeitos tecido-específicos na montagem da citocromo c oxidase devido a mutações em SCO2 e SURF1
   Manutenção e expressão do genoma mitocondrial de S. cerevisiae – da genética à evolução e biologia de sistemas
   Regulação da expressão gênica mitocondrial em Saccharomyces cerevisiae
   Íntrons mitocondriais: uma visão crítica
   Sequência de íntrons e éxons flanqueadores em mutantes do tipo selvagem e box3 do citocromo b revela uma proteína de splicing entrelaçada codificada por um íntron
   Os íntrons mitocondriais aI1 e/ou aI2 são necessários para a deleção in vivo de sequências intermediárias
   O splicing mitocondrial requer uma proteína de uma nova família de helicases
   O splicing dos introns mitocondriais do grupo I e II em levedura requer uma proteína DEAD-box com função de chaperona de RNA
   Mecanismo da ATPase Mss116 revela diversidade funcional das proteínas DEAD-Box
   O splicing do intron do grupo I aI5beta em levedura requer SUV3 para reciclar MRS1 via degradação do ribonucleoproteína (RNP) do intron excisado promovida pelo degradossomo mitocondrial
   Ccm1p/Ygr150cp, uma proteína com repetições pentatricopeptídicas, é essencial para remover o quarto intron dos pré-mRNAs de COB e COX1 em Saccharomyces cerevisiae
   O gene nuclear de levedura NAM2 é essencial para a integridade do DNA mitocondrial e pode curar uma deficiência de RNA-maturase mitocondrial
   MSS18, um gene nuclear de levedura envolvido no splicing do intron aI5 beta do transcrito mitocondrial cox1
   Um sítio de ligação de RNA compartilhado na proteína Pet54 é necessário para ativação translacional e splicing de intron do grupo I em mitocôndrias de levedura
   Clonagem de um gene nuclear MRS1 envolvido na excisão de um único intron do grupo I (bI3) do transcrito mitocondrial COB em S. cerevisiae
   Mne1 é um novo componente do aparato de splicing mitocondrial responsável pelo processamento de um intron do grupo I de COX1 em levedura
   COX24 codifica uma proteína mitocondrial necessária para o processamento do transcrito de COX1
   A extremidade carboxi-terminal de Cox1 é necessária para a regulação por retroalimentação da montagem da síntese de Cox1 em mitocôndrias de Saccharomyces cerevisiae
   A leucyl-tRNA sintetase mitocondrial de levedura é um fator de splicing para a excisão de vários introns do grupo I
   A putative RNA helicase mitocondrial de levedura superexpressa Mss116 restaura parcialmente o metabolismo adequado de mtRNA em linhagens que não possuem a RNA helicase Suv3 mtRNA
   Dois introns mitocondriais do grupo I nos genes cob-box e coxI requerem o mesmo produto do gene nuclear MRS1/PET157 para o splicing
   Regulação da tradução mitocondrial em levedura
   O produto do gene MSS51 é necessário para a tradução do mRNA de COX1 em mitocôndrias de levedura
   O produto do gene nuclear PET309 é necessário para a tradução do mRNA maduro e estabilidade ou produção de RNAs contendo introns derivados do locus mitocondrial COX1 de Saccharomyces cerevisiae
   PET111 atua na região líder 5' do mRNA mitocondrial COX2 de Saccharomyces cerevisiae para promover sua tradução
   PET111, um gene nuclear de Saccharomyces cerevisiae necessário para a tradução do mRNA mitocondrial que codifica a subunidade II da citocromo c oxidase
   Pelo menos dois produtos de genes nucleares são especificamente necessários para a tradução de um único mRNA mitocondrial de levedura
   A ativação translacional específica por produtos de genes nucleares ocorre na região líder não traduzida 5' de um mRNA mitocondrial de levedura
   Interações entre três proteínas que ativam especificamente a tradução do mRNA mitocondrial COX3 em Saccharomyces cerevisiae
   Uma mutação pontual na região líder não traduzida 5' que afeta a ativação translacional do mRNA mitocondrial COX3
   Interações entre proteínas ativadoras da tradução específicas dos mRNAs de COX1, COX2 e COX3 na superfície interna da membrana mitocondrial interna de Saccharomyces cerevisiae
   Inserção co-traducional de proteínas codificadas mitocondrialmente na membrana
   Superexpressão do ativador da tradução de COX2, Pet111p, impede a tradução do mRNA de COX1 e a montagem da citocromo c oxidase em mitocôndrias de Saccharomyces cerevisiae
   Nam1p, uma proteína envolvida no processamento e tradução de RNA, está acoplada à transcrição por meio de uma interação com a RNA polimerase mitocondrial de levedura
   Paradigmas transcricionais na biogênese e função mitocondrial em mamíferos
   Transcrição mitocondrial e sua regulação em células de mamíferos
   LRPPRC e SLIRP interagem em um complexo ribonucleoproteico que regula a expressão gênica pós-transcricional em mitocôndrias
   A proteína Pet309 de Saccharomyces cerevisiae está inserida na membrana mitocondrial interna
   Propriedades de ligação ao RNA de HCF152, uma proteína PPR de Arabidopsis envolvida no processamento de RNA de cloroplasto
   Um estudo genômico amplo em levedura de fissão revela nove proteínas PPR que regulam a expressão gênica mitocondrial
   Imunoprecipitação de RNA e análise de microarranjos mostram que uma proteína de repetição pentatricopeptídica de cloroplasto está associada à região 5′ de mRNAs cuja tradução ela ativa
   As repetições pentatricopeptídicas presentes em Pet309 são necessárias para a tradução, mas não para a estabilidade do mRNA mitocondrial de COX1 em levedura
   Mss51p promove a síntese mitocondrial de Cox1p e interage com Cox1p recém-sintetizada
   Tradução aberrante de espécies de mRNA da subunidade 1 da citocromo c oxidase na ausência de Mss51p na levedura Saccharomyces cerevisiae
   Mss51 e Ssc1 facilitam a regulação traducional da biogênese da citocromo c oxidase
   Proteases AAA das mitocôndrias: controle de qualidade de proteínas de membrana e funções regulatórias durante a biogênese mitocondrial
   O papel de Coa2 na hemilação de Cox1 de levedura revelado por sua interação genética com Cox10
   Shy1p é necessária para a expressão completa de COX1 mitocondrial no modelo de levedura da síndrome de Leigh
   Cox25 se associa a Mss51, Ssc1 e Cox14 para regular a expressão e montagem da subunidade 1 da citocromo c oxidase mitocondrial em Saccharomyces cerevisiae
   Coa3 e Cox14 são essenciais para a regulação por feedback negativo da tradução de COX1 em mitocôndrias
   A biogênese e montagem de proteínas fotossintéticas em membranas tilacoides1
   Regulação da tradução gênica do cloroplasto controlada pela montagem
   A tradução da subunidade grande da Rubisco é autorregulada em resposta ao seu estado de montagem em cloroplastos de tabaco
   Papel do homólogo mitocondrial de DnaJ, Mdj1p, como chaperona para proteínas sintetizadas mitocondrialmente e importadas
   Oxa1p atua como uma maquinaria geral de inserção na membrana para proteínas codificadas pelo DNA mitocondrial
   Ativadores transcricionais HAP/NF-Y resgatam um defeito na citocromo c oxidase em células de levedura e humanas
   Coa1 liga a função pós-traducional de Mss51 à inserção do cofator de Cox1 na montagem da citocromo c oxidase
   Formação dos centros de cofatores redox durante a maturação da Cox1 na citocromo oxidase de levedura
   A citocromo c oxidase é necessária para a montagem/estabilidade do complexo I respiratório em fibroblastos de camundongo
   Heme A da citocromo c oxidase. Estrutura e propriedades: comparações com hemes B, C e S e derivados
   Montagem da citocromo c oxidase dentro da mitocôndria
   Envolvimento da ferredoxina mitocondrial e da Cox15p na hidroxilação do heme O
   Identificação de novos hemes gerados pela heme A sintase: evidência de duas reações de monooxigenase sucessivas
   Isolamento de um cDNA humano para heme A:farnesiltransferase por complementação funcional de um mutante cox10 de levedura
   A montagem da citocromo-c oxidase na ausência da proteína de montagem Surf1p leva à perda do heme do sítio ativo
   Surf1, associada à síndrome de Leigh em humanos, é uma proteína ligante de heme na biogênese da oxidase bacteriana
   Análise de mutações da síndrome de Leigh no homólogo SURF1 de levedura revela um novo membro da família de fatores de montagem da citocromo oxidase
   Caracterização da expressão de SURF-1 e da função de Surf-1p em condições normais e de doença
   Regulação da via biossintética do heme A em Saccharomyces cerevisiae
   Coa2 é um fator de montagem para a biogênese da citocromo c oxidase de levedura que facilita a maturação da Cox1
   Expressão funcional da CYP11B2 mitocondrial humana em levedura de fissão e identificação de uma nova proteína interna de transferência de elétrons, etp1
   Um equilíbrio delicado: controle homeostático da captação e distribuição de cobre
   Mecanismos para aquisição, distribuição e regulação do cobre
   Metabolismo do cobre mitocondrial e entrega para a citocromo c oxidase
   Leveduras contêm um pool não proteico de cobre na matriz mitocondrial
   Complexo de cobre da matriz mitocondrial usado na metalação da citocromo oxidase e da superóxido dismutase
   Caracterização do COX17, um gene de levedura envolvido no metabolismo do cobre e na montagem da citocromo oxidase
   Purificação, caracterização e localização da Cox17p de levedura, uma lançadeira de cobre mitocondrial
   Análise mutacional da metalochaperona de cobre mitocondrial Cox17
   Transferência específica de cobre da metalochaperona Cox17 para Sco1 e Cox11 na montagem da citocromo C oxidase de levedura
   SCO1 e SCO2 atuam como supressores de alto número de cópias de um defeito de recrutamento de cobre mitocondrial em Saccharomyces cerevisiae
   Cox11p é necessária para a formação estável dos centros Cu(B) e magnésio da citocromo c oxidase
   A Cox11 de levedura, uma proteína essencial para a montagem da citocromo c oxidase, é uma proteína ligante de Cu(I)
   Análise sistemática da família de proteínas twin cx(9)c
   Caracterização do fator de montagem da citocromo c oxidase Cox19 de Saccharomyces cerevisiae
   COX23, um homólogo de COX17, é necessário para a montagem da citocromo oxidase
   Sequência e localização cromossômica de dois genes PET necessários para a montagem da citocromo c oxidase em Saccharomyces cerevisiae
   Cmc1p é uma proteína mitocondrial twin Cx9C conservada envolvida na biogênese da citocromo c oxidase
   A proteína conservada mitocondrial twin CX9C Cmc2 é um homólogo de Cmc1 essencial para a biogênese da citocromo c oxidase
   Função e estado redox de proteínas ricas em cisteína localizadas na mitocôndria importantes na montagem da citocromo c oxidase
   Evidência para a associação de ribossomos mitocondriais de levedura com Cox11p, uma proteína necessária para a formação do sítio Cu(B) da citocromo c oxidase
   Análise funcional dos domínios em Cox11
   Evidência para um intermediário pró-oxidante na montagem da citocromo oxidase
   Uma mutação em C2orf64 causa montagem prejudicada da citocromo c oxidase e cardiomiopatia mitocondrial
   A tradução mitocondrial do mRNA de COX2 de Saccharomyces cerevisiae é controlada pela sequência de nucleotídeos que especifica o peptídeo líder da pré-Cox2p
   Sinais antagônicos dentro da sequência codificadora do mRNA de COX2 controlam sua tradução em mitocôndrias de Saccharomyces cerevisiae
   Translocação de membrana da Cox2p codificada mitocondrialmente: requisitos distintos para exportação dos terminais N e C e dependência da proteína conservada Oxa1p
   Oxa1p, um componente essencial da maquinaria de exportação de proteínas com cauda N em mitocôndrias
   Oxa1p medeia a exportação dos terminais N e C de pCoxII da matriz mitocondrial para o espaço intermembranar
   Papéis das translocases da membrana interna relacionadas a Oxa1 na montagem de complexos da cadeia respiratória
   A ligação do ribossomo ao complexo Oxa1 facilita a inserção co-traducional de proteínas em mitocôndrias
   A Oxa1 de levedura interage com ribossomos mitocondriais: a importância da região C-terminal de Oxa1
   Mba1, um receptor de ribossomo associado à membrana em mitocôndrias
   Clonagem de um gene humano envolvido na montagem da citocromo oxidase por complementação funcional de uma mutação oxa1 em Saccharomyces cerevisiae
   Clonagem e caracterização de COX18, um gene PET de Saccharomyces cerevisiae necessário para a montagem da citocromo oxidase
   Cox18p é necessário para a exportação da cauda C da Cox2p codificada mitocondrialmente em Saccharomyces cerevisiae e interage com Pnt1p e Mss2p na membrana interna
   Proteína periférica da membrana interna mitocondrial, Mss2p, necessária para a exportação da cauda C da Cox2p codificada mitocondrialmente em Saccharomyces cerevisiae
   Translocação de domínios de Cox2 sintetizados mitocondrialmente da matriz para o espaço intermembranar
   Translocação e montagem da subunidade Cox2 da citocromo c oxidase de Saccharomyces cerevisiae codificada mitocondrialmente por Oxa1 e Yme1 na ausência de Cox18
   Identificação de Cox20p, uma nova proteína envolvida na maturação e montagem da subunidade 2 da citocromo oxidase
   Som1, um terceiro componente do complexo peptidase da membrana interna mitocondrial de levedura que contém Imp1 e Imp2
   Reconhecimento de substrato por AAA+ ATPases: modos distintos de ligação de substrato na protease Yme1 dependente de ATP do espaço intermembranar mitocondrial
   COX16 codifica uma nova proteína necessária para a montagem da citocromo oxidase em Saccharomyces cerevisiae
   Uma protease mitocondrial com duas subunidades catalíticas de especificidades não sobrepostas
   Complexo mitocondrial Hsp70/MIM44 facilita importação de proteínas
   Disrupção de um novo gene (IMMP2L) por um ponto de quebra em 7q31 associado à síndrome de Tourette
   O sítio cúprico na óxido nitroso redutase contém um centro binuclear de valência mista [Cu(II),Cu(I)]: uma investigação por ressonância paramagnética eletrônica multifrequencial
   A natureza do centro CuA na citocromo c oxidase
   Domínio solúvel de ligação a CuA da citocromo c oxidase de Paracoccus
   Sco1 de levedura, uma proteína essencial para a função da citocromo c oxidase é uma proteína de ligação a Cu(I)
   Metabolismo mitocondrial do cobre em levedura: análise mutacional de Sco1p envolvida na biogênese da citocromo c oxidase
   Metabolismo mitocondrial do cobre em levedura: interação entre Sco1p e Cox2p
   Sco1 e Sco2 humanos funcionam como proteínas de ligação ao cobre
   Uma dica para a função do Sco1 humano a partir de diferentes estruturas
   Identificação de um interruptor de dissulfeto em BsSco, um membro da família Sco de proteínas de montagem da citocromo c oxidase
   Estrutura cristalina do Sco1 de levedura
   Fatores de montagem da citocromo c oxidase com um domínio de tiorredoxina são conservados entre procariotos e eucariotos
   A sequência completa de um fragmento de 33 kb no braço direito do cromossomo II de Saccharomyces cerevisiae revela 16 fases de leitura abertas, incluindo dez novas fases de leitura abertas, cinco genes previamente identificados e um homólogo do gene SCO1
   Identificação e caracterização de cDNAs humanos específicos para BCS1, PET112, SCO1, COX15 e COX11, cinco genes envolvidos na formação e função da cadeia respiratória mitocondrial
   SCO1 e SCO2 humanos têm funções independentes e cooperativas na entrega de cobre à citocromo c oxidase
   SCO2 humano é necessário para a síntese de CO II e como uma oxidoredutase de tiol-dissulfeto para SCO1
   Uma caracterização estrutural do SCO2 humano
   A transferência de cobre(I) mitocondrial de Cox17 para Sco1 é acoplada à transferência de elétrons
   Os fatores de montagem da citocromo c oxidase humana SCO1 e SCO2 têm papéis regulatórios na manutenção da homeostase celular do cobre
   Citocromo-c oxidase. Estrutura de subunidades e bombeamento de prótons
   Transdução de energia: transferência de prótons através dos complexos respiratórios
   A influência da subunidade III da citocromo c oxidase na via D, na via de saída de prótons e na inativação mecanística na subunidade I
   Identificação de um terceiro gene codificador de proteína nuclear necessário especificamente para a expressão pós-transcricional do gene mitocondrial COX3 em Saccharomyces cerevisiae
   A disrupção do gene nuclear PET54 de levedura bloqueia a excisão do íntron mitocondrial aI5 beta do pré-mRNA para a subunidade I da citocromo c oxidase
   O gene PET54 de Saccharomyces cerevisiae: caracterização de um gene nuclear que codifica um ativador traducional mitocondrial e localização subcelular de seu produto
   Proteínas ativadoras traducionais específicas do mRNA de COX3 estão associadas à membrana mitocondrial interna em Saccharomyces cerevisiae
   Uma microdeleção na subunidade III do citocromo c oxidase (COX) associada à deficiência de COX e mioglobinúria recorrente
   Mutações sítio-dirigidas nas subunidades I e III codificadas mitocondrialmente da citocromo oxidase de levedura
   Knock-down da expressão gênica de COX3 e COX17 do citocromo c oxidase na alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii
   Destaques

• O citocromo c oxidase (COX) é a enzima terminal da cadeia respiratória mitocondrial.
• O núcleo catalítico da COX é formado por três subunidades codificadas pelo DNA mitocondrial.
• Um grande número de fatores acessórios codificados pelo núcleo é necessário para a biogênese da COX.
• A síntese e maturação das subunidades do núcleo são pontos regulatórios chave durante a montagem da COX.
  Modelo simplificado do processo de montagem da COX
  Chaperonas gerais e ativadores de tradução específicos para RNA (não representados aqui, mas veja explicação no texto) são necessários para a síntese das subunidades codificadas pelo mtDNA que formam o núcleo. Após sua inserção na membrana interna, Cox1 e Cox2 são amadurecidas pela adição de cofatores metálicos. Em algum ponto, chaperonas específicas de substrato se ligam a Cox1 e Cox2 para mantê-las em um estado competente para montagem. Uma chaperona predita de Cox3 ainda não foi identificada. Após a maturação de Cox1, as subunidades Cox5 e Cox6 codificadas pelo DNA nuclear são adicionadas a Cox1 antes da incorporação das outras subunidades do núcleo e do restante das subunidades acessórias para formar a holoenzima.
  Coordenação da síntese de Cox1 com a montagem da COX
  O modelo descreve os papéis de Mss51, Cox14, Cox25 e da chaperona mtHsp70 Ssc1 na regulação da tradução da biogênese da COX (veja explicação no texto).
  Biogênese da Cox2
  O esquema descreve as várias etapas e proteínas envolvidas na síntese, topogênese, maturação e montagem da Cox2 (veja explicação no texto). IMM, membrana mitocondrial interna; IMS, espaço intermembranar.
  Subunidades homólogas da COX e fatores de montagem da COX na levedura Saccharomyces cerevisiae e humanos.
  LEVEDURA HUMANO FUNÇÃO GENE PROTEÍNA GENE PROTEÍNA Núcleo catalítico (subunidades estruturais codificadas pelo mtDNA) COX1 Cox1 MTCOXI COX1 Subunidades do núcleo catalítico COX2 Cox2 MTCOXII COX2 COX3 Cox3 MTCOXIII COX3 Escudo protetor do núcleo (subunidades estruturais codificadas pelo nDNA) COX4 Cox4 COXVb COX5b Subunidades necessárias para a montagem e função da COX COX5a Cox5a COXIV-1 COX4-1 COX6 Cox6 COXVa COX5a COX7 Cox7 COXVIIa COX7a COX8 Cox8 COXVIIc COX7c COX9 Cox7a COXVIc COX6c - - COXVIIb COX7b -- -- COXVIII COX8 COX12 Cox9 COXVIb COX6b Subunidades não essenciais COX13 Cox10 COXVIa COX6a Expressão das subunidades do núcleo catalítico MSS116 Mss116 - - Helicase envolvida no splicing de todos os íntrons de COX1 e COB Componente do degradossomo de RNA SUV3 Suv3 - - Helicase envolvida no splicing do íntron aI5β de COX1 Estabilidade dos transcritos de COX1 e COB contendo íntronsComponente do degradossomo de RNA MRS1 Mrs1 - - Necessário para o splicing do íntron aI5β de COX1Necessário para a excisão do íntron bI3 de COB MNE1 Mne1 - - Necessário para o splicing do íntron aI5β de COX1 MSS18 Mss18 - - Necessário para o splicing do íntron aI5β de COX1 Função adicional não identificada COX24 Cox24 - - Necessário para o splicing dos íntrons aI2 e aI3 de COX1 Necessário para a tradução do mRNA de COX1 NAM2 Nam2 - - Necessário para o splicing do íntron aI4 de COX1 CCM1 Ccm1 - - Necessário para o splicing do íntron aI4 de COX1 PET309 Pet309 Levedura: Ativador da tradução do mRNA de COX1 LRPPRC LRPPRC Humano: Estabilidade do mRNA mitocondrial MSS51 Mss51 - - Ativador da tradução do mRNA de COX1 Chaperona de Cox1 necessária para sua estabilidade/maturação/montagem YGR021w Ygr021w Levedura: Sem papel na biogênese da COX TACO1 TACO1 Humano: Ativador da tradução do mRNA de COX1 PET111 Pet111 - - Ativador da tradução do mRNA de COX2 PET54 Pet54 - - Ativador da tradução do mRNA de COX3 Necessário para o splicing e tradução do íntron aI5β de COX1 PET122 Pet122 - - Ativador da tradução do mRNA de COX3 PET494 Pet494 - - Ativador da tradução do mRNA de COX3 Inserção na membrana e processamento das subunidades do núcleo catalítico OXA1 Oxa1 OXA1 OXA1 Inserção na membrana das subunidades da COX, citocromo b eproteolipídio da ATPase COX20 Cox20 COX20 COX20 Chaperona de Cox2.
  Apresentação do precursor de Cox2 ao complexo IMP COX18 Cox18 COX18 COX18 Exportação da cauda C-terminal de Cox2 MSS2 Mss2 -- -- Exportação da cauda C-terminal de Cox2 PNT1 Pnt1 -- -- Exportação da cauda C-terminal de Cox2 IMP1 Imp1 -- -- Responsável pela maturação do precursor Cox2 IMP2 Imp2 IMMP2L IMMP2L Necessário para a estabilidade e atividade de Imp1 SOM1 Som1 -- -- Terceiro componente do complexo IMP de levedura. Pode desempenhar um papel no reconhecimento do substrato Metabolismo do Cobre e Inserção nas subunidades do núcleo catalítico COX17 Cox17 COX17 COX17 Fornecimento de cobre para Sco1 e Cox11 SCO1 Sco1 SCO1 SCO1 Transferência de cobre para COX e/ou redução de resíduos de cisteína SCO2 SCO2 na subunidade 2 COX11 Cox11 COX11 COX11 Formação estável dos centros CuB e Mg COX19 Cox19 COX19 COX19 Proteínas CX9C. Podem desempenhar papéis no controle redox e no tráfico de cobre no espaço intermembrana COX23 Cox23 COX23 COX23 PET191 Pet191 PET191 PET191 CMC1 Cmc1 CMC1 CMC1 CMC2 Cmc1 CMC2 CMC2 Biossíntese do Heme A COX10 Cox10 COX10 COX10 Farnesilação do proto-heme COX15 Cox15 COX15 COX15 Conversão do heme o em heme a YAH1 Yah1 FDX2 FDX2 Colabora com Cox15 na hidroxilação do heme o ARH1 Arh1 ADR ADR Colabora com Cox15 na hidroxilação do heme o Montagem / Desconhecido COX16 Cox16 COX16 COX16 Função desconhecida PET117 Pet117 - -- Função desconhecida PET100 Pet100 -- -- Formação de intermediários de montagem contendo Cox7, Cox8 e Cox9 SHY1 Shy1 SURF1 SURF1 Catalisa uma etapa de montagem envolvendo Cox1 COX14 Cox14 - - Liga-se a Cox1 e é necessário para sua estabilidade/maturação/montagem COA1 Coa1 -- -- Liga-se a Cox1 e é necessário para sua estabilidade/maturação/montagem COA2 Coa2 -- -- Necessário para estabilidade/maturação/montagem de Cox1 COA3/COX25 Coa3Cox25 -- -- Liga-se a Cox1 e é necessário para sua estabilidade/maturação/montagem CMC3/COA4 Cmc3Coa4 -- -- Proteína CX9C envolvida nos estágios finais da montagem de COX