pmid: "22172738"
title: "Comporta e regulação da bomba de prótons do citocromo c oxidase."
authors: "Ferguson-Miller S, Hiser C, Liu J"
journal: "Biochimica et biophysica acta"
pubdate: "2012 Apr"
doi: "10.1016/j.bbabio.2011.11.018"
source: "PMC Full Text"
Comporta e regulação da bomba de prótons do citocromo c oxidase.
Autores
Ferguson-Miller S, Hiser C, Liu J
Periodico
Biochimica et biophysica acta (2012 Apr)
Conteudo
Regulação e Controle da Bomba de Prótons da Citocromo c Oxidase
Como consumidora de 95% do oxigênio que respiramos, a citocromo c oxidase desempenha um papel fundamental no balanço energético da célula. A regulação de sua atividade de redução de oxigênio e bombeamento de prótons é, portanto, crítica para a função fisiológica na saúde e na doença. A localização e a estrutura das vias para prótons necessárias para suportar a atividade da citocromo c oxidase ainda estão em debate, com respeito aos seus requisitos para resíduos-chave e águas fixas, e como são controladas para prevenir (ou permitir) o refluxo de prótons. Estruturas recentes de alta resolução de formas bacterianas e de mamíferos revelam sítios conservados de ligação de lipídios e esteroides, bem como mudanças conformacionais ligadas ao redox que fornecem novos insights sobre potenciais ligantes reguladores e modos de controle. A interpretação mecanicista dessas descobertas é discutida e sua importância para a compreensão da regulação energética.
Introdução
A função de bombeamento de prótons da citocromo c oxidase (CcO) tem sido objeto de intenso estudo e controvérsia por muitos anos, começando com a questão de se a CcO bombeia prótons de fato. Embora a questão do bombeamento não esteja mais em disputa e muito progresso tenha sido feito na definição do mecanismo subjacente da redução de oxigênio, ainda não está claro como esse processo exergônico impulsiona a translocação de prótons através de uma membrana. Parte da dificuldade em abordar a questão está relacionada ao papel aparentemente crítico da água em facilitar e controlar o movimento dos prótons. Mutagênese e cristalografia são ferramentas poderosas para determinar as características estruturais importantes para a função proteica, mas são menos incisivas quando se trata de detectar as posições e os papéis das moléculas de água. Resíduos podem ser mutados, mas a água não, e estruturas cristalinas de altíssima resolução são necessárias para rastrear de forma confiável o paradeiro da água. Obter a resolução necessária (geralmente melhor que 2,5 Å) com uma proteína de membrana é um desafio. A esse respeito, algum sucesso foi alcançado com a CcO isolada de fontes bovinas e bacterianas, esclarecendo alguns aspectos do processo de bombeamento, mas levando a conclusões conflitantes em relação a outros.
Uma importante questão fisiológica que impulsiona a busca pelo entendimento do mecanismo de bombeamento é: como a eficiência do processo é controlada? Como consumidora de 95% do oxigênio que respiramos e membro terminal da cadeia de transferência de elétrons mitocondrial, a citocromo c oxidase é uma peça-chave no equilíbrio energético dos organismos, contribuindo para o balanço entre produção de ATP e calor, exercendo controle sobre o nível do metabolismo aeróbico e afetando a produção a montante de espécies reativas de oxigênio. A eficiência intrínseca da bomba de prótons da CcO tem sido proposta como regulada pela taxa de refluxo de prótons através da proteína, possivelmente via reversão da via normal de saída para prótons bombeados. No entanto, nem a via de saída nem a de refluxo foram localizadas, embora várias rotas sejam postuladas. É claro que definir as vias de prótons e entender quais características estruturais determinam as taxas de fluxo, durante a captação, saída e refluxo, é de fundamental importância para compreender o balanço energético e o controle metabólico na saúde e na doença.
Esta revisão resumirá os insights obtidos a partir de estudos sobre a enzima de Rhodobacter (RsCcO), com foco nas evidências da importância de sítios conservados de ligação de lipídios e esteroides na estrutura e regulação, e para um papel da mudança conformacional e do posicionamento da água no controle das vias de prótons.
Sítios Conservados de Ligação de Lipídios
A estrutura cristalina original da RsCcO (; PDB ID: 1M56) revelou seis fosfolipídios embutidos na estrutura, dois enterrados em uma fenda na subunidade III e quatro ao redor da hélice transmembranar única da subunidade IV, em um arranjo que quase separou completamente esta última subunidade da interação com o resto da proteína (FIGURA 1). A estrutura foi inédita em sua demonstração do envolvimento significativo de lipídios na integridade estrutural de uma proteína de membrana.
Também impressionantes foram as imagens de lipídios associados à enzima bovina: quando estruturas foram obtidas com resolução de 1,8 Å, um total de 13 lipídios diferentes por monômero de 13 subunidades foram resolvidos e cada sítio de ligação era específico para um lipídio particular (PDB ID: 2DYR). (FIGURA 2)
A importância de associações lipídicas específicas foi ainda mais enfatizada quando uma segunda estrutura da enzima de Rhodobacter (ID PDB: 2GSM) foi obtida em maior resolução (2,0 Å). Essa estrutura continha as duas subunidades centrais I e II, mas estava sem as subunidades III e IV, que inicialmente eram vistas como tendo as principais interações lipídicas. Na nova estrutura, cadeias alquílicas são vistas embutidas no domínio de membrana da superfície da proteína, algumas com grupos cabeça definidos dos detergentes contendo açúcar usados na purificação e outras sem um grupo cabeça resolvido. Curiosamente, os sítios ocupados por lipídios e detergentes na estrutura da RsCcO sobrepuseram-se precisamente com posições ocupadas por lipídio ou detergente tanto na CcO de Paracoccus quanto na bovina. A análise dos resíduos que criavam os sulcos que seguravam as cadeias alquílicas também mostrou um alto nível de conservação em todas as três estruturas, enfatizando a importância dos sítios de ligação de lipídios. Tais sítios conservados também foram observados em outras proteínas de membrana. O que esses lipídios especificamente ligados contribuem para as propriedades estruturais e funcionais de proteínas intrínsecas de membrana ainda precisa ser esclarecido. Uma possibilidade é que eles possam atuar como calafetagem flexível entre subunidades e hélices, protegendo canais de água internos enquanto permitem mudança conformacional. De fato, ambas as vias de captação de prótons, D e K, quando inibidas pela remoção de uma carboxila em sua entrada, podem ser resgatadas quimicamente pela adição de níveis μmolar de moléculas lipídicas com um grupo carboxila, indicando um sítio de ligação de lipídio nas proximidades.
Outra faceta interessante de sítios de ligação lipídica específicos definidos cristalograficamente é a observação de que certos detergentes, particularmente detergentes à base de açúcar, são capazes de substituir moléculas lipídicas nesses sítios. O posicionamento dos grupos cabeça de açúcar indica que eles são substitutos particularmente bons porque se empilham e formam ligações de hidrogênio efetivamente com os resíduos aromáticos que estão concentrados na região da proteína na interface da membrana. Essa interação estável pode explicar seu sucesso incomum na purificação e cristalização de proteínas de membrana.
Um sítio conservado de ligação de esteroides
De importância ainda maior com relação à função e regulação da CcO é a descoberta de que um dos sítios de ligação de esteroides/sais biliares primeiramente reconhecido na estrutura cristalina bovina e atribuído a possível ligação de nucleotídeos, também é conservado na enzima bacteriana. Em ambos os casos, os sais biliares ligados nesse sítio parecem influenciar a atividade da CcO ao interagir com um resíduo de carboxila (E101II em Rs, E62 II em bovino) na entrada de uma rota chave de captação de prótons, a via K (FIGURA 3).
Pistas iniciais sobre a existência desse sítio em RsCcO vieram de estudos de um mutante no qual o carboxil conservado, E101II, é substituído por uma alanina, resultando em uma forma fortemente inibida (5% da atividade do tipo selvagem). Certos sais biliares em níveis μM foram encontrados para resgatar o mutante, aumentando sua atividade em mais de 10 vezes, para 50% do tipo selvagem. O resgate químico mais potente foi fornecido pelo desoxicolato, e uma estrutura cristalina de RsCcO determinada em sua presença resolveu um único desoxicolato com seu grupo carboxil em estreita proximidade com o de E101II (PDB ID: 3DTU), como previsto por sua capacidade ativadora.
Uma descoberta inesperada, não prevista pelos efeitos de ativação na via K, foi que o desoxicolato em RsCcO ocupava um sítio que se alinhava estreitamente com o de uma molécula de colato na estrutura da CcO bovina. Esse sítio de colato foi anteriormente observado como estando associado à subunidade 6a da CcO bovina na interface do dímero, e não com as subunidades I e II do monômero alternativo, mas na verdade ambos os esteroides mostram uma forte interação com os carboxis homólogos na boca do canal K (FIGURA 4). Embora seja conhecido há muito tempo que certos detergentes, incluindo sais biliares e Triton X100, inibem a CcO bovina, essa nova descoberta sugeriu que o efeito inibitório do colato sobre a enzima bovina se deve à sua capacidade de comprometer a via K; uma conclusão semelhante foi alcançada por outros investigadores que estudaram a inibição da CcO bovina pelo Triton X100. Em contraste, o efeito estimulatório sobre o mutante E101II aparentemente se deve à capacidade do ácido biliar de se ligar e substituir o carboxil necessário, restaurando assim parte da capacidade de captação de prótons da via K. O mutante E101IIA fornece, portanto, um ensaio sensível para a ligação de ligantes no sítio, permitindo a medição da capacidade de um composto de ativar ou inibir a forma mutante, ou competir com um ativador ou inibidor conhecido.
No decorrer dos estudos utilizando este sistema, descobriu-se que existe uma competição complexa entre ligantes no sítio. Notavelmente, o nível de atividade do mutante E101IIA é influenciado não apenas por compostos contendo carboxila, mas também por certos detergentes utilizados para ensaios de rotina, mesmo nas baixas concentrações que suportam a atividade máxima do tipo selvagem (ex.: 0,06% de dodecilmaltosídeo). Os resultados indicam que a bolsa de ligação no mutante E101IIA possui alta afinidade por vários detergentes que, quando ligados, aumentam o bloqueio do caminho K para além da própria mutação; quando esses detergentes não iônicos são deslocados por sais biliares ou outras moléculas que fornecem uma carboxila, a atividade é parcialmente restaurada. Essa competição entre detergente/ligante não parece afetar tão marcadamente a RsCcO do tipo selvagem, presumivelmente porque a bolsa é menos hidrofóbica no tipo selvagem devido ao posicionamento estratégico da carboxila conservada. As descobertas levantam questões sobre quais propriedades da região de entrada do caminho K são mais importantes no controle da captação de prótons: a própria carboxila ou a capacidade da carboxila de criar um ambiente mais hidrofílico que permita a organização da água na região de entrada e impeça que ligantes hidrofóbicos a ocupem. A especificidade da bolsa de entrada do caminho K para ligar certos ligantes lipídicos também pode explicar achados experimentais conflitantes sobre os efeitos de mutações nesta região, provavelmente devido a diferentes condições experimentais ou de purificação, ou a diferentes propriedades estruturais de várias formas de CcO.
Vários compostos parecem competir no sítio de ligação de esteroides, como evidenciado por seus efeitos no mutante E101IIA. Afinidades na faixa de concentração micromolar foram determinadas para vários sais biliares, colesterol-hemissuccinato, protoporfirina IX, bilirrubina, ácido fitânico, ácido araquidônico e alguns detergentes. É importante notar que os sítios de ligação de colato na CcO bovina foram postulados como representando sítios de ligação de nucleotídeos regulatórios; no entanto, não conseguimos demonstrar experimentalmente um efeito de nucleotídeos em nosso sistema sob uma variedade de condições, incluindo pré-incubação prolongada, embora a modelagem computacional do sítio suporte essa possibilidade.
De modo geral, a estimulação do mutante E101IIA ocorre quando a molécula efetora possui caráter hidrofóbico e certas características estruturais que permitem sua ligação, bem como um grupo carboxila ou alguma capacidade de facilitar a captação de prótons para o caminho K, como a organização da água. A inibição ocorre quando o composto consegue se ligar, mas interfere na captação de prótons. Notável nesse aspecto é o fato de que, em todas as estruturas cristalinas obtidas da CcO nativa de bactérias ou fontes bovinas, nem detergente nem lipídio são resolvidos no sítio esteroide, apenas água ou colato ou desoxicolato quando presentes. Isso pode ser uma indicação de que o sítio é projetado para estar aberto, permitindo o acesso de prótons por meio de cadeias de água. A competição entre ativadores e inibidores de E101IIA sugere que eles estão se ligando ao mesmo sítio que os sais biliares, mas o significado fisiológico de qualquer uma dessas moléculas e a natureza precisa de sua influência na conformação proteica ou na organização da água no interior ou nas proximidades do caminho K permanecem incertos. Uma pista de possível importância clínica vem de um relato de que a bilirrubina, em níveis encontrados na icterícia neonatal, tem um efeito inibitório direto sobre a CcO neuronal, um efeito que é neutralizado pelos sais biliares. Como ambos são ligantes que competem pelo sítio esteroide do caminho K, é tentador pensar que este possa ser o sítio de interação responsável pela resposta celular observada.
A análise computacional e os estudos cristalográficos visam atualmente compreender os detalhes moleculares das interações envolvidas e identificar outros ligantes, incluindo nucleotídeos, que possam ser capazes de se ligar ao sítio e exercer efeitos regulatórios fisiológicos.
Mudança conformacional e água conservada
Uma visão prevalente do mecanismo da CcO é que o bombeamento de prótons não depende de quaisquer mudanças conformacionais significativas além de rearranjos das posições das cadeias laterais e moléculas de água. Em contraste, no caso da CcO bovina, mudanças estruturais nas proximidades do heme a foram observadas em cristais reduzidos e interpretadas como estando envolvidas em um mecanismo de bombeamento associado a uma via de prótons designada caminho H, mas nem a via nem as mudanças conformacionais eram aparentes na enzima bacteriana. No entanto, estruturas cristalinas recentes da CcO de Rhodobacter em estados reduzido por ditionito em comparação com estados oxidados revelaram mudanças conformacionais que diferem em alguns aspectos daquelas observadas na CcO bovina, envolvendo um deslocamento na posição do heme a3 e de regiões intimamente associadas da estrutura.
Essas novas estruturas fornecem evidências para o envolvimento de mudança conformacional em um mecanismo de comporta que permite que a abertura do caminho K para prótons substrato seja correlacionada com o fechamento do caminho D que transporta prótons bombeados. Na estrutura oxidada, a entrada de prótons do caminho K no sítio ativo heme a3-CuB parece estar bloqueada por uma ligação de hidrogênio forte (2,6 Å) entre o OH do ligante His-Tyr de CuB e o OH do grupo farnesil do heme a3 (FIGURA 5). Na estrutura reduzida de RsCcO, o movimento do anel de porfirina do heme a3 para longe de CuB quebra a ligação e cria uma abertura maior (4,1 Å) na parte inferior do sítio ativo. A formação de uma cadeia de águas que levam à fenda heme a3 – CuB é observada no cristal reduzido, sugerindo um caminho para a captação de prótons do caminho K abaixo. Um deslocamento na hélice VIII e no resíduo T359 do caminho K parece estar associado ao rearranjo da água. Além disso, o cristal reduzido mostra a perda de uma água de uma posição próxima a CuB (; W301) que foi invocada como parte de uma conexão entre o topo do caminho D e o sítio ativo. Essa mudança sugere um mecanismo para permitir acesso alternado de prótons dos caminhos K e D, uma característica necessária do mecanismo de bombeamento da CcO.
Essa descoberta é particularmente interessante porque se encaixa com um mecanismo previamente proposto para o bombeamento de prótons que prevê que a redução de CuB desencadeará a perda da forte ligação de hidrogênio na parte inferior da fenda do heme a3, como realmente observado na estrutura cristalina reduzida. No modelo, a redução de CuB seguida pelo movimento de um próton do caminho D para a vizinhança de seu ligante His334 enfraqueceu a ligação de CuB ao ligante His-Tyr, resultando em rearranjos eletrônicos internos dentro desse par reticulado único. O rearranjo interno, por sua vez, causou a quebra da ligação de hidrogênio His-Tyr-OH com o farnesil–OH, abrindo o acesso a moléculas de água e prótons do caminho K. Além de dar uma nova perspectiva sobre o papel desse ligante incomum de CuB como uma comporta importante para o caminho K, o modelo e a estrutura reduzida enfatizam a função crítica do posicionamento da água na formação e quebra dos caminhos de prótons.
É importante notar que essas mudanças conformacionais também são observadas em cristais da RsCcO de quatro subunidades e, portanto, não dependem do tipo de cristal. Além disso, os efeitos da redução são reversíveis: quando um cristal é reduzido e depois reoxidado, ele retorna à conformação oxidada. No entanto, existem outras preocupações quanto ao significado das mudanças estruturais observadas na CcO de Rs e bovina, uma vez que elas diferem em vários aspectos.
Uma preocupação em relação a todas as estruturas cristalinas de metaloproteínas redox ativas é a conhecida capacidade dos raios X de alta intensidade de liberar elétrons da proteína e do solvente, de modo que os centros metálicos em um cristal oxidado podem se reduzir durante a coleta de dados. Para abordar essa questão, examinamos os espectros de cristais congelados de RsCcO durante a exposição aos raios X e encontramos o resultado notável de que, embora o heme a pareça ser rapidamente reduzido mesmo a 70 °K, o espectro observado não é o da CcO reduzida nativa, mas mostra um pico dividido em 589 e 610 nm na região da banda alfa. Quando o cristal é brevemente recozido (aquecido por alguns segundos), o espectro então se torna o de um heme a reduzido normal em 606 nm (Figura 6). Essa descoberta sugere que o cristal congelado retém a estrutura proteica da forma oxidada mesmo quando o centro metálico é reduzido, levando a uma configuração "distorcida" no centro metálico que dá origem ao espectro alterado. Essa descoberta explica por que diferenças conformacionais podem ser observadas entre as formas reduzida e oxidada, mas pode implicar que não estamos vendo toda a extensão da mudança. Um teste ainda mais rigoroso foi aplicado por Yoshikawa e colegas, trabalhando com a CcO bovina. Usando 400 cristais e alguns segundos de exposição cada, eles mostraram que a mesma estrutura oxidada era obtida como quando coletavam dados por períodos muito mais longos em um único cristal.
É importante notar que existem alguns pontos em comum entre as estruturas reduzidas de Rs e bovina: a CcO bovina mostra o mesmo movimento significativo de resíduos na hélice X entre os dois hemes que a RsCcO (FIGURA 5) e um deslocamento semelhante, embora menor, no anel de porfirina do heme a3 na forma CN/reduzida. Mas as estruturas diferem no grau de movimento do heme a3 e na consequente abertura da parte inferior da fenda do sítio ativo, bem como no movimento da hélice VIII. A RsCcO também não mostra alterações nas proximidades do equivalente à via H (próximo à posição de Asp 51, numeração bovina). Essas inconsistências e a ausência de mudanças encontradas na CcO de Paracoccus e na oxidase ba3 termofílica ainda precisam ser resolvidas, mas podem muito bem ser o resultado de diferenças na completude da redução e desoxigenação, diferenças no conteúdo de água e/ou restrições impostas por contatos cristalinos distintos.
Conclusões
O mecanismo e a regulação do acoplamento entre a transferência de elétrons e o bombeamento de prótons na citocromo c oxidase continua sendo um problema complexo não resolvido de grande importância fisiológica, dado o papel central desta enzima no metabolismo energético aeróbico. A capacidade de obter estruturas de alta resolução nas quais as posições de lipídios e água podem ser observadas e as mudanças conformacionais dependentes do estado redox detectadas, está fornecendo novos insights sobre possíveis modos de comporta de prótons e ligantes reguladores. A captura cristalográfica de novos intermediários catalíticos e a descoberta de novas formas cristalinas, com ligantes lipídicos e aquosos melhor resolvidos, serão fundamentais para iluminar ainda mais esse processo sutil e intrincado.
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Citocromo c oxidase de Rhodobacter sphaeroides (RsCcO) mostrando lipídio associado. Quatro subunidades: I, verde; II, amarelo; III, laranja; IV, vermelho. Lipídio, fosfatidiletanolamina (PE), indicado como esferas cinza escuro. Desenho criado no Chimera (UCSF) a partir do PDB ID: 1M56.
Dímero da citocromo c oxidase bovina a 1,8 Å mostrando lipídios associados (esferas cinza escuro). Desenho criado no Pymol a partir do PDB ID: 2DYR.
Forma de duas subunidades da RsCcO (PDB ID: 3DTU) mostrando a posição do desoxicolato (cinza claro) próxima à via de prótons K. Subunidade I, verde; Subunidade II, ciano. Os resíduos marcados são aqueles com papel na via K. O cádmio está localizado na entrada da via, ligado a E101, His96, desoxicolato e água (não mostrado). Desenho criado no Pymol pela Dra. Ling Qin.
Sobreposição da CcO bovina (PDB 2DYR) e da RsCcO (PDB 3DTU) mostrando a proximidade dos sítios de ligação para colato (bastões vermelhos) e desoxicolato (bastões cinza). Lipídios associados são mostrados: PE em bovino (amarelo) e decil maltosídeo em Rhodobacter (roxo). A subunidade VIa do outro monômero no dímero bovino é mostrada (trigo). Subunidade I (verde). Subunidade II (ciano). Desenho criado no Pymol pela Dra. Ling Qin.
Sobreposição das estruturas cristalinas das formas oxidadas (PDB ID: 2GSM) e reduzida (PDB ID: 3FYE) da RsCcO de duas subunidades. Vermelho indica reduzido e amarelo indica oxidado, para CuB, Tyr288, Thr359, Met424 e Ser425 onde movimento significativo é observado. Os comprimentos das ligações de hidrogênio entre a Tyr288-OH e o heme a3 farnesil-OH são indicados por linhas pontilhadas, 2,6 Å (amarelo, oxidado) e 4,1 Å (vermelho, reduzido). Heme a3 é ciano e verde (reduzido), azul (oxidado). A hélice central X é renderizada em turquesa (oxidado) e azul escuro (reduzido). O desenho é uma seção transversal vista do interior da membrana, criado no Pymol.
Espectros de cristais de RsCcO tipo selvagem durante irradiação com raios-X a 100 K. O tempo de exposição e os comprimentos de onda de pico são indicados no gráfico. Um pico duplo a 589 e 610 nm desenvolve-se durante 10 minutos de radiação. Um pico a 606 nm é observado após recozimento. Resultados semelhantes foram obtidos com cristais de quatro subunidades do tipo selvagem. Desenho criado no PLOT.
Destaques
- A citocromo c oxidase é um ator crítico na regulação do metabolismo aeróbico
- Sítios de ligação de lipídios são conservados, indicando papéis estruturais e funcionais
- A mudança conformacional está envolvida na regulação da captação de prótons na via K
- Cristais congelados mantêm a estrutura mesmo quando reduzidos por raios-X