pmid: "38475449"
title: "Alterações transcricionais em cultura de células em suspensão de Rosa Damascena reveladas por sequenciamento de RNA."
authors: "Cho WK, Choi H, Kim SY, Kim E, Paek SH, Kim J, Song J, Heo K, Min J, Jo Y, Lee JH, Moh SH"
journal: "Plants (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2024 Feb 22"
doi: "10.3390/plants13050602"
source: "PMC Full Text"

Alterações transcricionais em cultura de células em suspensão de Rosa Damascena reveladas por sequenciamento de RNA.

Autores

Cho WK, Choi H, Kim SY, Kim E, Paek SH, Kim J, Song J, Heo K, Min J, Jo Y, Lee JH, Moh SH

Periodico

Plants (Basel, Switzerland) (2024 Feb 22)

Conteudo

Alterações Transcricionais em Cultura de Células em Suspensão de Rosa-damasco Reveladas por Sequenciamento de RNA

Rosas-damasco (Rosa x damascena) são amplamente utilizadas em cosméticos e produtos farmacêuticos. Aqui, estabelecemos uma cultura de células em suspensão in vitro para calos derivados de pétalas de rosa-damasco. Analisamos transcriptomas de células em suspensão de rosa obtidos em dois pontos de tempo diferentes por sequenciamento de RNA para revelar alterações transcricionais durante a cultura de células em suspensão de rosa. Dos 580 RNAs codificadores (1,3%) altamente expressos nas células de rosa em suspensão, 68 codificavam proteínas associadas à parede celular. No entanto, a maioria dos RNAs codificados por cloroplastos e mitocôndrias não é expressa. Muitos RNAs codificadores altamente expressos estão envolvidos na tradução, catalisando a síntese de peptídeos nos ribossomos. Além disso, o processo metabólico de amidas que produz alcaloides de ocorrência natural foi o processo metabólico mais abundante durante a propagação das células de rosa em suspensão. Durante a propagação das células de rosa, os RNAs codificadores envolvidos na resposta ao estresse foram regulados positivamente em um estágio inicial, enquanto os RNAs codificadores associados à desintoxicação e ao transporte transmembrana foram regulados positivamente no estágio final. Utilizamos análises de transcriptoma para revelar processos biológicos importantes e mecanismos moleculares durante a cultura de células em suspensão de rosa. A maioria dos RNAs não codificadores (ncRNAs) não foi expressa nas células de rosa em suspensão, mas alguns ncRNAs com funções desconhecidas foram altamente expressos. A expressão dos ncRNAs e seus RNAs codificadores alvo foi altamente correlacionada. Em conjunto, revelamos processos biológicos e mecanismos moleculares significativos que ocorrem durante a cultura de células em suspensão de rosa usando análises de transcriptoma.

1. Introdução

A roseira é uma planta lenhosa com flor pertencente ao gênero Rosa e à família Rosaceae. As roseiras são famosas por suas flores, que apresentam cores variadas, como branco, amarelo e vermelho. A família Rosaceae consiste em 90 gêneros e mais de 3000 espécies, enquanto o gênero Rosa inclui 308 espécies. A maioria das espécies do gênero Rosa é originária da Ásia, com exceção de algumas espécies nativas de outros continentes.

Diferentes espécies do gênero Rosa podem ser facilmente hibridizadas. Portanto, inúmeras cultivares de roseiras foram desenvolvidas por suas flores, e a maioria das roseiras ornamentais são híbridas. As roseiras são cultivadas em jardins, mas também são consumidas como flores de corte, frequentemente cultivadas em estufas. Além disso, a roseira é famosa por seu óleo, que contém uma mistura de óleos voláteis extraídos de pétalas de rosa trituradas por destilação a vapor. A água de rosas, conhecida como óleo de rosas, é usada para diversos fins, como cosméticos, medicamentos e culinária. As rosas-damasco (Rosa x damascena), um híbrido de rosa derivado da rosa-gálica (Rosa gallica) e da rosa-mosqueta (Rosa moschata), são comumente usadas para produzir água de rosas no Irã e na Europa.
R. damascena possui uma ampla gama de propriedades farmacêuticas, incluindo efeitos antioxidantes, anticancerígenos, antimicrobianos, antifúngicos, anti-inflamatórios e analgésicos. Portanto, extratos de R. damascena têm sido tradicionalmente utilizados para o tratamento de dores no peito e abdômen, fortalecimento do coração, sangramento menstrual, distúrbios digestivos e constipação. Os principais componentes químicos de R. damascena são citronelol, nonadecano, geraniol, nerol e álcool feniletílico, dependendo do material vegetal e do método de extração.
Um calo pode ser definido como uma massa celular não organizada que pode ser induzida por estresse, incluindo ferimentos ou infecção por patógenos. Calos podem ser gerados a partir de uma única célula diferenciada que possui capacidade totipotente de regenerar todo o corpo da planta. Calos podem ser gerados artificialmente in vitro usando dois hormônios vegetais, auxina e citocinina. Portanto, os calos estão sendo agora utilizados em uma ampla gama de áreas de pesquisa, bem como para fins industriais. Por exemplo, culturas de células vegetais em suspensão são iniciadas usando calos como uma forma eficiente de obter metabólitos vegetais, em vez de obter metabólitos diretamente de plantas maduras, o que é caro e demorado.
A análise do transcriptoma usando sequenciamento de RNA é uma abordagem popular para revelar os processos biológicos e mecanismos moleculares que ocorrem em determinados tecidos ou condições. Vários estudos anteriores conduziram análises de transcriptoma associadas a calos de diversas espécies de plantas, como Arabidopsis, trigo, sorgo e milho. Por exemplo, a formação de calos embriogênicos em resposta ao estresse salino em cevada e duas espécies de Gossypium foi relatada. Diferenças moleculares entre calos vermelhos e amarelo-esverdeados de Cyclocarya paliurus foram reveladas usando sequenciamento de RNA. Além disso, dois transcriptomas diferentes de melão derivados de calos embriogênicos e não embriogênicos foram previamente comparados.
Os genomas vegetais codificam uma ampla gama de pequenos RNAs que desempenham papéis importantes no desenvolvimento, reprodução e mecanismos de defesa das plantas contra patógenos. Os pequenos RNAs mais conhecidos são os microRNAs (miRNAs), siRNAs secundários e siRNAs heterocromáticos, com tamanhos variando de 21 a 24 nucleotídeos. Além disso, miRNAs e pequenos RNAs foram identificados em calos embriogênicos de arroz.
Neste estudo, geramos calos a partir de pétalas de rosa, que são matérias-primas úteis para a extração de metabólitos vegetais. Células de rosa em suspensão foram colhidas em dois momentos diferentes e submetidas ao sequenciamento de RNA para revelar processos biológicos e mecanismos moleculares significativos durante o cultivo de células de rosa em suspensão com base em mudanças transcricionais de RNAs codificadores e não codificadores (nc).
2. Materiais e Métodos
2.1. Amostra de Rosa e Geração de Calo de Rosa
As pétalas da rosa-damasco (Rosa x damascena) foram utilizadas para induzir a formação de calos. Primeiro, os botões de rosa foram lavados com EtOH 70% por 30 s e esterilizados com NaClO 0,3% por 20 min. Os botões foram então lavados três vezes com água destilada e mantidos em condições assépticas. Os botões esterilizados foram cortados e as pétalas separadas com um bisturi. As pétalas de rosa foram então transferidas para um meio Murashige e Skoog (MS) (Duchefa, Haarlem, Países Baixos) (Cat. No. M0222) contendo 9,04 µM de ácido diclorofenoxiacético (2,4-D) (Duchefa) (Cat. No. D0911) e 0,46 µM de cinetina (Duchefa) (Cat. No. K0905) e incubadas no escuro a 25 °C para indução de calos. Os explantes cultivados primariamente foram subcultivados a cada duas semanas no mesmo meio. Os calos induzidos foram então transferidos para uma nova placa de Petri a cada duas semanas para propagação de calos.
2.2. Cultura de Células em Suspensão de Calo de Rosa
A linhagem de calo de rosa selecionada foi utilizada para cultura de células em suspensão em biorreatores no Instituto de Pesquisa Antienvelhecimento da BIO-FD&C Co., Ltd., em Incheon, República da Coreia. Realizamos quatro subculturas em suspensão diferentes de 0,5, 3, 5 e 10 L a cada duas semanas. Finalmente, 2,2 kg de células foram transferidos para biorreatores de 10 L. Dois litros de meio MS recém-preparado suplementado com 30 g/L de sacarose e 1 mg/L de 2,4-D (pH 5,8) foram adicionados a cada biorreator, e 3 biorreatores independentes foram utilizados. As células de rosa foram cultivadas adicionalmente por seis dias e oito dias, respectivamente, no escuro. Na cultura de células vegetais, o período de colheita é tipicamente determinado após o período de estabilização, quando o acúmulo de metabólitos secundários começa, e antes do período de redução, quando o crescimento diminui ou para. Neste experimento, as células de rosa foram inoculadas a uma densidade de 1,1 kg/L para atingir o período máximo de divisão 5 dias após a inoculação, aumentando a densidade crítica. Em nosso estudo, amostras foram coletadas durante o período de estabilização (dia 6) e o período de redução (dia 8) para comparar alterações transcricionais. As células em suspensão de rosa apresentam um tempo de duplicação celular de sete dias, com uma taxa de crescimento de 0,0991.
2.3. Extração de RNAs Totais e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento de RNA
As células de rosa foram cultivadas continuamente em um biorreator, e 100 mL da cultura foram amostrados com o meio. Após a remoção do meio usando um tecido não tecido, as células de rosa amostradas foram pesadas, e a contagem celular foi determinada usando o método de Laurence Lamboursain e Mario Jolicoeur. Células com massa de 1 mg foram separadas ao máximo possível e submetidas a tratamento enzimático para facilitar a fragmentação em entidades celulares menores, e o número de células foi medido usando um hemocitômetro. Em dois pontos temporais, seis dias (6D) e oito dias (8D), 100 mL de células de rosa cultivadas contendo células e meio líquido foram coletados. As células de rosa foram isoladas por centrifugação e depois congeladas em nitrogênio líquido. As células de rosa foram homogeneizadas usando almofariz e pistilo em nitrogênio líquido. Os RNAs totais foram extraídos usando o RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) (Cat. No. 74904), de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade dos RNAs totais extraídos foi medida usando um 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Utilizamos RNAs totais com valores de número de integridade do RNA (RIN) maiores ou iguais a 7 para o preparo das bibliotecas. Usando o TruSeq RNA Library Prep Kit v2 (Illumina, San Diego, CA, EUA) (Cat. No. RS-122-2001), de acordo com as instruções do fabricante, preparamos seis bibliotecas que foram posteriormente sequenciadas paired-end (101 bp × 2) usando o sistema Illumina HiSeq X (Illumina). Os dados brutos de sequenciamento de RNA foram depositados no banco de dados Sequence Read Archive (SRA) do National Center for Biotechnology Information (NCBI).

2.4. Preparação do Transcriptoma de Referência, Trimming de Qualidade e Alinhamento dos Dados Brutos

Para estabelecer um transcriptoma de referência para as análises do transcriptoma da rosa, utilizamos dados do genoma da variedade Rosa chinensis ‘Old Blush’ () (acessado em 3 de dezembro de 2022). O transcriptoma de referência é composto por quatro conjuntos de dados transcriptômicos diferentes, incluindo 45.548 RNAs codificantes, 4.969 RNAs não codificantes (nc), 72 RNAs mitocondriais (GenBank CM009589) e 77 RNAs cloroplastídicos (GenBank CM009590). Os dados brutos adquiridos passaram por controle de qualidade, onde bases com pontuação de qualidade Phred abaixo de 20 e leituras com menos de 50 pb foram eliminadas. Este processo foi realizado usando o programa BBDuk v.37.33 com base no guia do usuário do programa () (acessado em 4 de dezembro de 2022). Os dados brutos limpos obtidos como arquivos FASTQ para cada biblioteca foram mapeados no transcriptoma da rosa, que inclui 50.666 sequências de RNA, usando o programa BBMap (Versão 39.01) () (acessado em 4 de dezembro de 2022).

2.5. Cálculo da Expressão de RNA Individual e Identificação de RNAs Diferencialmente Expressos
A ferramenta BBMap calcula o número de reads mapeados, a cobertura de reads por quilobase de transcrito por milhão de reads mapeados (RPKM) e os fragmentos por quilobase de transcritos por milhão de reads mapeados (FPKM) para cada RNA (transcrito). Para a expressão de RNA individual (transcrito), utilizamos o valor de FPKM. Para identificar RNAs diferencialmente expressos, incluindo RNAs codificadores e ncRNAs, as informações associadas ao número de reads em cada RNA foram submetidas aos algoritmos DESeq2 implementados no DEBrowser versão 1.24.1. Comparamos o transcriptoma obtido em oito dias (8D) com o obtido em seis dias (6D). Usando fold change > quatro vezes e valor-p ajustado < 0,01, selecionamos os RNAs diferencialmente expressos.
2.6. Análises de Enriquecimento Gênico
Para identificar funções enriquecidas nos RNAs codificadores selecionados, realizamos a análise de enriquecimento de ontologia gênica (GO) utilizando o ShinyGO 0.76.3 () (acessado em 4 de dezembro de 2022) contra o genoma de Rosa chinensis. Os números de acesso de acordo com a anotação do Ensembl () (acessado em 4 de dezembro de 2022) para os RNAs selecionados foram submetidos à análise de enriquecimento GO. Usando um FDR < 0,5, identificamos os termos GO enriquecidos em cada conjunto de RNA. Os principais termos GO enriquecidos foram visualizados usando a análise de rede fornecida pelo ShinyGO.
2.7. Identificação de RNAs Codificadores Alvo para ncRNAs
Para identificar RNAs codificadores alvo para ncRNAs, as sequências de nucleotídeos de todos os ncRNAs de rosa foram submetidas a uma busca BLASTN contra todas as sequências de RNA codificadores de rosa. Usando um E-value < 1 × 10−10 como ponto de corte, identificamos RNAs codificadores potenciais que mostraram forte similaridade de sequência com o RNA codificador alvo.
2.8. Geração de Rede de Interação entre ncRNAs e RNAs Codificadores
Para visualizar as interações dos ncRNAs com os RNAs codificadores alvo, geramos uma rede de interação usando o Cytoscape versão 3.9.1. As mudanças de expressão convertidas em Log2 para a expressão dos RNAs codificadores também foram fornecidas na rede de interação por diferentes cores, como regulação positiva (cor vermelha) e regulação negativa (cor verde).
2.9. Predição de Localização Subcelular para Proteínas Codificadas por RNAs de Rosa
As sequências de proteínas codificadas por 580 RNAs codificadores foram analisadas usando o TargetP versão 2.0 () (acessado em 5 de dezembro de 2022). Com base na presença de peptídeos N-terminais, as proteínas foram categorizadas como proteínas secretadas com peptídeos sinal (SP), proteínas mitocondriais com peptídeos de trânsito mitocondrial e proteínas de cloroplasto com peptídeos de trânsito de cloroplasto. Proteínas sem peptídeos N-terminais foram consideradas como direcionadas para localização subcelular desconhecida.
2.10. RT-PCR Quantitativo em Tempo Real
Calos cultivados foram colhidos e prontamente transferidos para nitrogênio líquido para melhor isolamento de RNA antes de serem armazenados a −80 °C até a extração do RNA. A extração do RNA utilizou o RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen), seguida pela quantificação do mRNA usando um Espectrofotômetro DeNovix (DeNovix Inc., Wilmington, NC, EUA). As etapas subsequentes envolveram a síntese de DNA complementar (cDNA) com o ReverTra AceTM qPCR RT Master Mix (Toyobo, Tsuruga, Japão) conforme o protocolo do fabricante. Para a RT-PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR), as misturas de reação consistiram em 10 μL de THUNDERBIRDTM Next SYBR® qPCR Mix (Toyobo), 1 μL de cada primer direto e reverso (10 pmol/μL e 10 pmol/mL, respectivamente), 7 μL de Água Livre de Nucleases e 1 μL de cDNA em uma placa de PCR. A amplificação utilizou o Sistema Rotor-Gene Q 6plex (Rotor-Gene Q, Qiagen) envolvendo 40 ciclos: desnaturação a 95 °C por 15 s, anelamento a 62 °C por 1 min e extensão a 72 °C por 1 min. Cada placa continha no mínimo três repetições. A normalização da expressão do gene alvo foi realizada em relação ao gene de controle endógeno (RhEF1) usando o primer direto GGGTAAGGAGAAGGTTCACATC e o primer reverso CAGCCTCCTTCTCAAACCTCT mencionados anteriormente. As expressões relativas foram calculadas usando a fórmula R = 2−[ΔCt amostra − ΔCt controle].

3. Resultados
   3.1. Cultura de Células em Suspensão de Calos de Rosa Derivados de Pétalas de Rosa de Damasco e Sequenciamento de RNA
   Pétalas de rosa de Damasco foram usadas para indução de calos (Figura 1A–D). Os calos gerados foram transferidos para um meio líquido para cultura de células em suspensão. As células em suspensão subcultivadas foram transferidas para biorreatores (Figura 1E). Células de rosa em suspensão foram propagadas no escuro (Figura 1F). Três réplicas biológicas independentes foram usadas para a cultura de células em suspensão. As células de rosa em suspensão foram colhidas em dois momentos distintos: seis dias (6D) e oito dias (8D). As culturas celulares foram colhidas e os RNAs totais foram extraídos. Os RNAs totais extraídos foram usados para a preparação das bibliotecas. Finalmente, seis bibliotecas dos dois momentos foram sequenciadas em pares. Os dados brutos foram usados para análises do transcriptoma.
   3.2. Análises do Transcriptoma de Células de Rosa em Suspensão
   As leituras brutas foram mapeadas no transcriptoma de referência da rosa, que continha 50.666 sequências de RNA. A quantidade de dados brutos obtidos variou de 39.300.478 reads (8D_R3) a 48.707.778 reads (6D_R3) (Tabela S1). A proporção de reads mapeados no transcriptoma de referência variou de 94,45% (8D_R2) a 94,83% (6D_R2) (Tabela S1). Examinamos o número de reads mapeados em seis conjuntos de dados transcriptômicos diferentes (Tabela S2). A maioria dos reads sequenciados foi derivada de RNAs codificadores. A proporção de reads mapeados nos RNAs codificadores variou de 98,04% (6D_R2) a 98,5% (8D_R2). Em contraste, o número de reads mapeados em ncRNAs variou de 1,5% (8D_R2) a 1,95% (6D_R2). Além disso, um número muito pequeno de reads foi mapeado na mitocôndria (570 reads de seis bibliotecas) e nos cloroplastos (1.376 reads de seis bibliotecas).
   3.3. Expressão de RNAs Codificadores em Células em Suspensão de Rosa
   Calculamos os níveis de expressão de 45.548 RNAs codificadores com base nos valores de FPKM. Os valores de FPKM de seis bibliotecas foram combinados para cada RNA codificador. Os 5.283 RNAs codificadores não foram expressos, enquanto os valores de FPKM dos seis RNAs codificadores foram superiores a 10.000 (Figura 2). Mais da metade dos RNAs codificadores (24.948 RNAs codificadores) não foram expressos (FPKM = 0) ou foram fracamente expressos (FPKM < 10). Os RNAs codificadores mais altamente expressos codificam uma proteína rica em glicina, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, GTPase de síntese proteica, alérgeno tipo Bet v I, proteína tumoral controlada traducionalmente e uma proteína hipotética (Tabela S3).
   Selecionamos 580 RNAs codificadores com níveis de expressão muito altos (FPKM > 1000) (Tabela S4). Examinamos as funções enriquecidas de 580 RNAs codificadores usando análise de enriquecimento de ontologia gênica (GO). Identificamos 165 termos GO para processos biológicos, 25 para componentes celulares e 74 para funções moleculares (Tabela S5). Dos 165 termos GO enriquecidos de acordo com processos biológicos, muitos RNAs codificadores foram associados à tradução (108 RNAs), biossíntese de amidas (108 RNAs), metabolismo de peptídeos (113 RNAs) e biossíntese de compostos organonitrogenados (120 RNAs) (Figura 3). Além disso, os termos GO para processos metabólicos de carboidratos (36 RNAs), processos metabólicos de pequenas moléculas (45 RNAs), alongamento da tradução (13 RNAs) e enovelamento de proteínas (16 RNAs) foram altamente enriquecidos (Figura 3).
   Dos 25 termos GO enriquecidos de acordo com componentes celulares, três termos GO associados a organelas não ligadas à membrana (125 RNAs), ribossomos (110 RNAs) e organelas intracelulares não ligadas à membrana (125 RNAs) foram altamente enriquecidos (Figura 3B). Subunidades ribossômicas (30 RNAs), complexos contendo proteínas (56 RNAs), complexos ribonucleoproteicos (32 RNAs), subunidades ribossômicas grandes (18 RNAs) e citosol (18 RNAs) também foram identificados (Figura 3B).
   Dos 74 termos GO identificados de acordo com função molecular, os constituintes estruturais dos ribossomos (100 RNAs), atividade de molécula estrutural (103 RNAs) e ligação a RNA (55 RNAs) foram significativamente enriquecidos (Figura 3C).
   3.4. Localização Subcelular de Proteínas Codificadas por 580 RNAs Codificantes da Rosa
   Células em suspensão de calos de plantas têm sido usadas para identificar proteínas secretadas (proteínas associadas à parede celular) em vários estudos proteômicos. As proteínas secretadas contêm uma sequência de peptídeo sinal (SP) em sua região N-terminal. As sequências proteicas codificadas por 580 RNAs codificantes da rosa foram submetidas à predição de localização subcelular usando o TargetP ver. 2.0. Das 580 proteínas, 68 continham peptídeos sinal (SPs), enquanto 20 possuíam peptídeos de trânsito (TPs) direcionados a cloroplastos ou mitocôndrias (Tabela S6 e Figura 4). As proteínas secretadas por SPs estavam envolvidas na biogênese da parede celular, incluindo o processo metabólico de xiloglucano (seis proteínas), o processo metabólico de hemicelulose (seis proteínas), o processo metabólico de glucano (sete proteínas), o processo metabólico de polissacarídeos (oito proteínas), o processo metabólico de carboidratos (10 proteínas), proteólise (10 proteínas) e enovelamento de proteínas (quatro proteínas).
   3.5. Expressão de ncRNAs em Células em Suspensão de Rosa
   A expressão de 4969 ncRNAs foi calculada. Em comparação com os RNAs codificantes, a expressão dos ncRNAs foi muito baixa (Figura 5). Por exemplo, o valor de FPKM para 1829 ncRNAs foi zero (Figura 5). Além disso, cerca de 76% dos ncRNAs (FPKM < 100) não foram expressos ou foram fracamente expressos. A expressão de 169 ncRNAs variou de 100 a 1000 com base nos valores de FPKM. Em particular, a expressão de 16 ncRNAs foi muito alta (Tabela S7). Destes, EPlT00050199787 (RchiOBHm_Chr3g0497641) codifica RNAs ribossômicos 18S, enquanto outros ncRNAs não possuem funções conhecidas.
   Em seguida, identificamos os RNAs codificantes alvo dos 16 ncRNAs. Dos 16 ncRNAs, 12 mostraram forte similaridade de sequência com 21 RNAs codificantes conhecidos da rosa (Figura S1). Quatro ncRNAs, EPlT00050201685, EPlT00050201483, EPlT00050200345 e EPlT00050199787, têm como alvo um único RNA codificante. EPlT00050199773 teve como alvo três RNAs codificantes: PRQ44826, PRQ45980 e PRQ57720. EPlT00050200668 tem como alvo cinco RNAs codificantes. Alguns RNAs codificantes são alvo de múltiplos ncRNAs. Por exemplo, PRQ18666 é alvo de cinco ncRNAs, incluindo lT00050199292, EPlT00050200307, EPlT00050201105, EPlT00050201527 e EPlT00050201938. Examinamos os papéis funcionais de 21 RNAs codificantes que eram alvo de 12 ncRNAs selecionados. Dos 21 RNAs codificantes, 12 codificavam proteínas hipotéticas com funções desconhecidas. Quatro RNAs codificantes, PRQ38310, PRQ38315, PRQ38316 e PRQ38317, codificam antocianidina 3-O-glicosídeo 5-O-glicosiltransferases. PRQ38482 e PRQ38489 codificam proteínas contendo domínio G-patch. Além disso, outros quatro RNAs codificam proteínas associadas à proteína ribossômica 40S S8, crocetina glicosiltransferase e DNA polimerase direcionada por RNA. ncRNAs e seus RNAs codificantes alvo foram altamente expressos. Por exemplo, o valor de FPKM para EPlT00050200345 foi 1047, enquanto que para seu RNA codificante alvo (PRQ38290) foi 2329.
   3.6. Identificação de RNAs Diferencialmente Expressos entre Dois Pontos de Tempo Diferentes
   Descobrimos que numerosos RNAs foram altamente expressos na cultura de células em suspensão de rosa. Podem haver RNAs expressos diferencialmente (REDs) durante a cultura de células em suspensão de rosa. Para isso, comparamos o transcriptoma dos oito dias (8D) com o dos seis dias (6D). Com base no ponto de corte de mudança de expressão (fold change, FC) > 4 e valor de p ajustado < 0,01, identificamos 680 REDs, conforme visualizado no gráfico de vulcão (Figura S2). Os 680 REDs foram posteriormente divididos em 390 RNAs regulados positivamente e 290 regulados negativamente (Figura S3A). Dos 390 RNAs regulados positivamente, 378 eram RNAs codificadores e 12 eram ncRNAs (Tabela S8). Dos 290 RNAs regulados negativamente, 258 eram RNAs codificadores e 32 eram ncRNAs (Tabela S9). Em seguida, examinamos os papéis funcionais dos REDs usando análise de enriquecimento de termos de ontologia gênica (GO). Identificamos 47 termos GO enriquecidos a partir de RNAs regulados positivamente e 11 termos GO enriquecidos a partir de RNAs regulados negativamente (Figura S3B). O número de termos GO enriquecidos para RNAs regulados positivamente foi mais de quatro vezes o dos RNAs regulados negativamente.

Nos 390 RNAs regulados positivamente, os termos GO para transporte transmembrana (24 RNAs), resposta celular a estímulo químico (12 RNAs), resposta a substância tóxica (sete RNAs), desintoxicação (sete RNAs) e desintoxicação celular a oxidantes (sete RNAs) foram termos GO altamente enriquecidos de acordo com processos biológicos (Tabela S10 e Figura S4A). Além disso, descobrimos que alguns RNAs regulados positivamente estavam associados ao transporte de íons fosfato (três RNAs), à reação escura da fotossíntese (dois RNAs) e à resposta à privação de nutrientes (três RNAs) (Figura S4A). De acordo com a função molecular, muitos termos GO em RNAs regulados positivamente estavam envolvidos na atividade de dioxigenase (13 RNAs), atividade de álcool desidrogenase (NAD+) (seis RNAs), atividade de liase carbono-carbono (oito RNAs), atividade de peroxidase (sete RNAs), atividade antioxidante (sete RNAs) e atividade de oxidoredutase (sete RNAs) (Tabela S10 e Figura S4B).

Os termos GO enriquecidos de acordo com processos biológicos em RNAs regulados negativamente estavam envolvidos em várias respostas ao estresse, como regulação da resistência sistêmica adquirida, regulação do processo do sistema imunológico, regulação da resposta a estímulo biótico, regulação da resposta a estímulo externo e regulação da resposta imune (Tabela S11). Além disso, o processo biossintético de DNA (sete RNAs) e a organização da parede celular (sete RNAs) também foram enriquecidos nos RNAs regulados negativamente. Os RNAs regulados negativamente codificam proteínas que são componentes da parede celular (sete RNAs) e de estruturas encapsulantes externas (sete RNAs). Muitos RNAs regulados negativamente têm funções moleculares relacionadas à atividade de poligalacturonase (cinco RNAs).
Em seguida, examinamos RNAs codificadores que eram alvos de 12 ncRNAs regulados positivamente. Dos 12 ncRNAs regulados positivamente, seis mostraram forte similaridade de sequência com 24 RNAs codificadores (Tabela S12 e Figura S5). Dois ncRNAs, EPlT00050198817 e EPlT00050201092, podem regular sete RNAs codificadores (Figura S5). Dos sete RNAs codificadores que são alvos do EPlT00050198817, três codificam a proteína prenilada de aceitação rab PRA1, e um é membro da família de dedo de zinco, tipo SWIM, FHY3/FAR1. No caso dos RNAs codificadores para EPlT00050201092, quatro são membros da família proteína quinase RLK-Pelle-WAK, localizados no cromossomo 5. A expressão da maioria dos RNAs codificadores para os dois ncRNAs também foi altamente regulada positivamente, exceto por um RNA (PRQ29694) (Tabela S12). EPlT00050201463 regula cinco RNAs codificadores. Destes, três (PRQ55122, PRQ58177 e PRQ19642) codificam GMP sintases. No entanto, a expressão desses três RNAs foi regulada de forma diferencial. Por exemplo, PRQ58177 e PRQ19642 foram regulados negativamente, enquanto PRQ55122 foi regulado positivamente durante o cultivo de células em suspensão. EPlT00050200048 regula três RNAs codificadores (PRQ33420, PRQ33440 e PRQ45464). PRQ33420 codifica 4-cumarato—CoA ligase, enquanto PRQ33440 codifica sintetase/ligase dependente de AMP. Dois ncRNAs (EPlT00050201641 e EPlT00050200618) regulam a expressão de RNAs codificadores com funções desconhecidas.
O número de ncRNAs significativamente regulados para baixo foi muito maior do que o de ncRNAs regulados para cima. Além disso, o número de RNAs codificadores alvo (179 RNAs codificadores) para os 20 ncRNAs regulados para baixo foi muito maior do que (24 RNAs codificadores) para os ncRNAs regulados para cima (Tabelas S12 e S13). Visualizamos 179 RNAs codificadores alvo para os 20 ncRNAs regulados para baixo por interação de rede usando o programa Cytoscape (Figura S6). Identificamos 526 interações entre os 20 ncRNAs e 179 RNAs codificadores (Tabela S13 e Figura S6). Curiosamente, o número de RNAs codificadores alvo para os 20 ncRNAs regulados para baixo foi muito alto, variando de 78 a um RNA codificador (Figura 6A). O número de RNAs codificadores alvo para os 12 ncRNAs foi superior a 20 (Figura 6A). Por exemplo, dois ncRNAs (EPlT00050199249 e EPlT00050199409) podem regular 78 RNAs codificadores. Interessantemente, ambos os ncRNAs compartilham a mesma lista de RNAs codificadores. A maioria dos RNAs codificadores alvo para os dois ncRNAs são proteínas hipotéticas com funções desconhecidas. Alguns RNAs codificadores codificam proteína contendo domínio de nuclease derivado de transposase (PRQ56094), alfa-L-fucosidase (PRQ59950), fator de transcrição da família Homeobox-WOX (PRQ49397, PRQ49564 e PRQ49807), superfamília da álcool desidrogenase quinoproteína (PRQ49445), hidrolase de nucleosídeo trifosfato contendo alça P (PRQ50598), subunidade Med10 do complexo mediador (PRQ24541), proteína carreadora mitocondrial (PRQ17477) e subunidade B do fator de iniciação da tradução eucariótica 3 (PRQ20012). Com base no ponto de corte usando fold change > 2, 14 RNAs codificadores que são alvos de dois ncRNAs foram significativamente regulados para baixo. Muitos RNAs codificadores também são regulados pelos ncRNAs identificados. Visualizamos a posição cromossômica dos RNAs codificadores regulados por 20 ncRNAs regulados para baixo (Figura 6B) e descobrimos que alguns RNAs codificadores foram enriquecidos em regiões específicas, como o cromossomo 2.
3.7. Confirmação dos Resultados do Sequenciamento de RNA por RT-PCR Quantitativo
Para validar os achados do sequenciamento de RNA, a RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) foi conduzida em dois RNAs codificadores (PRQ60100 e PRQ19294) e dois ncRNAs (EPLT00050199897 e EPLT00050198817) que apresentaram expressão diferencial entre oito dias (8D) e seis dias (6D) (Tabela S14). Enquanto PRQ19294 é anotado como uma proteína de transporte e organização do Golgi, as funções dos outros três RNAs permanecem desconhecidas. De acordo com os dados do sequenciamento de RNA, EPLT00050198817 e PRQ19294 mostraram regulação para cima, enquanto EPLT00050199897 e PRQ60100 exibiram regulação para baixo (Tabela S14). A análise de qRT-PCR confirmou a regulação para cima de EPLT00050198817 e PRQ19294, bem como a regulação para baixo de EPLT00050199897 e PRQ60100 (Figura 7). No entanto, os fold changes observados via sequenciamento de RNA foram notavelmente maiores do que os determinados por qRT-PCR. Por exemplo, PRQ19294 exibiu aproximadamente um fold change de oito vezes no sequenciamento de RNA, enquanto a qRT-PCR indicou uma alteração de cerca de 2,3 vezes. Importantemente, todos os achados tanto do sequenciamento de RNA quanto da qRT-PCR produziram resultados estatisticamente significativos.
4. Discussão
A rosa-damasco é uma famosa espécie de rosa perfumada e uma rosa economicamente importante em muitas indústrias, como cosméticos, medicina, alimentos e fins ornamentais. A obtenção de metabólitos vegetais úteis diretamente de materiais vegetais frescos apresenta diversas dificuldades, como a limitação de materiais vegetais e o prolongado tempo de cultivo para obtê-los. Para superar essas limitações, abordagens in vitro envolvendo cultura de tecidos seguida de cultura de células em suspensão usando biorreatores podem fornecer um grande número de células vegetais em pouco tempo e a baixo custo.
Neste estudo, estabelecemos um método eficiente para a produção em larga escala de células de rosa-damasco. Além disso, examinamos as alterações transcricionais em células de rosa em suspensão por sequenciamento de RNA. Semelhante a estudos anteriores que usaram calos, utilizamos células em suspensão, que podem ser frequentemente aplicadas para fins industriais. Adicionalmente, transcriptomas de células em suspensão de Bletilla striata e alecrim foram recentemente estudados por sequenciamento de RNA. Neste estudo, utilizamos materiais vegetais obtidos de culturas prolongadas de células em suspensão para revelar os mecanismos moleculares subjacentes à propagação de células de rosa. Além disso, comparamos os transcriptomas de células de rosa em dois momentos diferentes para revelar as alterações transcricionais dinâmicas durante a cultura de células em suspensão.
Devido à ausência de um transcriptoma de referência para rosas-damasco, utilizamos um transcriptoma de referência para Rosa chinensis. Nossos resultados de mapeamento mostraram que mais de 94% das leituras sequenciadas de Rosa x damascena foram mapeadas no transcriptoma de Rosa chinensis. Esse resultado sugere que as duas diferentes espécies de rosa possuem um alto grau de similaridade de sequência e aplicação bem-sucedida do sistema heterólogo para análises de transcriptoma. Neste estudo, analisamos a expressão de RNAs codificadores e ncRNAs, bem como RNAs de cloroplastos e mitocôndrias.
Com um limiar de FPKM < 1, aproximadamente 28% dos RNAs codificadores não foram expressos, enquanto 580 RNAs codificadores (1,3%) foram altamente expressos em células de rosa em suspensão. Os dados sugerem que esses 580 RNAs codificadores foram os transcritos mais ativos nas células em suspensão. A análise de enriquecimento GO dos 580 RNAs codificadores revelou que os termos GO mais abundantes estavam associados à tradução e aos ribossomos. O ribossomo é um grande complexo que funciona como uma maquinaria molecular para catalisar a síntese de proteínas. A alta expressão de RNAs que codificam muitas proteínas que são componentes das subunidades ribossômicas pequena e grande sustenta a hipótese de que a tradução ocorre intensamente em células de rosa em suspensão. Além disso, a alta expressão de vários fatores de alongamento em células de rosa em suspensão indica seu papel funcional na facilitação do alongamento translacional no ribossomo durante a síntese proteica. Ademais, um grande número de RNAs codificadores com expressão muito alta em células de rosa em suspensão codifica proteínas de ligação a RNA que estão envolvidas na síntese, processamento, transporte, tradução e degradação de RNAs. Portanto, uma forte atividade de tradução no ribossomo nas células de rosa em suspensão em condições de escuro foi altamente correlacionada com o aumento da biomassa.

Descobrimos que RNAs codificadores altamente expressos em células de rosa em suspensão estão envolvidos em uma ampla gama de vias metabólicas. Destas, processos metabólicos de peptídeos e processos metabólicos de amidas celulares são os mais abundantes em células de rosa em suspensão. As amidas são usadas como espinha dorsal de muitos peptídeos e desempenham um papel importante nas unidades estruturais de um grande número de polímeros naturais e sintéticos. Elas são encontradas em uma ampla gama de pequenas moléculas bioativas. Por exemplo, amidas estão presentes em dois terços das moléculas candidatas a fármacos e são encontradas em 25% de todos os produtos farmacêuticos disponíveis no mercado. As reações de amidação são consideradas as reações mais representadas na química medicinal, representando mais de 50% dos processos relatados em 2014. Muitas aminas de ocorrência natural também são conhecidas como alcaloides, que são compostos orgânicos nitrogenados básicos, derivados principalmente de plantas. Com base nesses resultados, propomos que muitos alcaloides importantes são sintetizados em cultura de células de rosa em suspensão.

A maioria dos RNAs codificados por duas organelas, cloroplastos e mitocôndrias, não foi expressa. Um estudo anterior mostrou que o tamanho e o número de cloroplastos diminuem em células de calo em rápida propagação. Portanto, nossos resultados sugerem que os papéis funcionais dessas duas organelas podem estar diminuídos em culturas de células em suspensão. Além disso, nossas bibliotecas foram geradas a partir de mRNA usando oligo-dT, que captura especificamente caudas poli(A). Consequentemente, mRNAs originários de organelas, que carecem de mRNAs, podem exibir níveis de expressão mais baixos em comparação com mRNAs nucleares.
We found that approximately 11% of the proteins encoding highly expressed coding RNAs were associated with cell walls, based on the presence of a signal peptide. Numerous studies have shown that cell wall-associated proteins are enriched in the plant calli. During suspension cell culture in the dark, rose callus cells were dramatically propagated without any further differentiation into other tissues. Coding RNAs associated with cell wall proteins should be highly expressed to generate plant cells at the beginning of cell culture in a bioreactor. However, as the cell mass increases in a bioreactor, the required elements in the bioreactor should be shortened. Therefore, we assumed that several cell wall-associated coding RNAs were downregulated in the late stage of rose suspension cell culture.

Of the several known stressors, wounding is the primary factor that triggers callus formation by activating cell proliferation and promoting cellular reprogramming. At the initial callus formation, it has been known that stress-responsive or hormone-associated genes were highly induced. Similarly, we also found that several stress response coding RNAs including transcription factors were induced at the early stage of rose suspension cell culture. However, their expression was gradually downregulated at the late stage of rose suspension cell culture. In contrast, the coding RNAs associated with detoxification and transmembrane transport were upregulated. Reactive oxygen species (ROS) such as superoxide and hydrogen peroxide are toxic cellular metabolites that can be detoxified by various enzymes. ROS also play an important role in regulating important biological processes by acting as signaling molecules. The seven detoxification-associated RNAs encode NAD(P)H oxidase (two RNAs), peroxidase (four RNAs), and a phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase (one RNA). Plant NAD(P)H oxidases catalyze the production of superoxide, a type of ROS. Peroxidases in plants are heme-containing monomeric glycoproteins that use hydrogen peroxide or oxygen to oxidize a wide range of molecules. Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidases regulate ROS levels by detoxifying ROS. Our results suggest that the upregulation of detoxification-associated RNAs is highly correlated with strong detoxification activities of these enzymes by regulating ROS levels produced from rose suspension cell culture.
Os transcriptomas de plantas possuem muitos ncRNAs, como pequenos RNAs e ncRNAs longos (lncRNAs), que não têm capacidade de codificação de proteínas, mas são funcionais. Com o rápido desenvolvimento do sequenciamento de alto rendimento, vários ncRNAs foram identificados em diversas espécies de plantas. Os ncRNAs de plantas podem participar de numerosos processos biológicos, como desenvolvimento e respostas ao estresse, regulando a expressão gênica. Descobrimos que a maioria dos ncRNAs não era expressa em células em suspensão de rosa, mas poucos ncRNAs eram altamente expressos. No entanto, os papéis funcionais da maioria dos ncRNAs ainda não foram caracterizados. Portanto, examinamos os RNAs codificadores alvo dos ncRNAs identificados. Metade dos RNAs codificadores alvo para os 12 ncRNAs que foram altamente expressos em células em suspensão de rosa codificavam proteínas hipotéticas. No entanto, quatro RNAs codificadores regulados por ncRNAs codificam antocianidina 3-O-glicosídeo 5-O-glicosiltransferases, que estão envolvidas na biossíntese de antocianinas. Esse resultado sugere que os ncRNAs podem regular a expressão de genes envolvidos na biossíntese de antocianinas em células em suspensão de rosa.
Identificamos alguns ncRNAs que foram diferencialmente expressos entre os dois pontos temporais. No entanto, o número de RNAs codificadores alvo (179 RNAs codificadores) para ncRNAs regulados negativamente foi muito alto em comparação com o de ncRNAs regulados positivamente (24 RNAs codificadores). Curiosamente, os ncRNAs regulados negativamente identificados regulavam o mesmo conjunto de RNAs codificadores. Assim, esses ncRNAs podem ser transcritos da mesma família gênica composta por um grande número de genes. Descobrimos que regiões cromossômicas específicas eram enriquecidas com RNAs codificadores regulados por ncRNAs. Além disso, mostramos que a expressão dos ncRNAs e de seus RNAs alvo era altamente correlacionada. Infelizmente, a maioria dos RNAs codificadores regulados por ncRNAs codifica proteínas hipotéticas com funções desconhecidas. Portanto, pode ser de interesse examinar os possíveis papéis desses ncRNAs e de seus RNAs codificadores alvo no futuro próximo.
Nossos resultados mostraram que muitos RNAs codificadores foram diferencialmente expressos entre os dias seis e oito.
5. Conclusões
Neste estudo, geramos calos derivados das pétalas de rosa-damasco, que são matérias-primas úteis para cosméticos e medicamentos. A subcultura de calo de rosa em cultura de células em suspensão suplementada com açúcar no escuro promoveu significativamente o crescimento da massa de células vegetais. Analisamos transcriptomas derivados de células de rosa em suspensão colhidas em dois pontos de tempo diferentes (6 e 8 dias) por sequenciamento de RNA. Mais de 94% das leituras brutas foram mapeadas para o transcriptoma de referência da rosa. Identificamos 580 RNAs codificadores que foram altamente expressos nas células de rosa em suspensão. Esses RNAs codificadores estavam associados à tradução e ribossomos, indicando que a forte atividade de tradução nos ribossomos em células de rosa em suspensão está altamente correlacionada com o aumento da biomassa. Além disso, RNAs codificadores envolvidos em processos metabólicos de peptídeos e biossintéticos de amidas foram altamente expressos. Nossos resultados sugerem que muitas proteínas e aminas, conhecidas como alcaloides, são sintetizadas em cultura de células de rosa em suspensão. Descobrimos que aproximadamente 11% das proteínas que codificam RNAs codificadores altamente expressos estavam associadas à parede celular. Vários RNAs codificadores de resposta ao estresse, incluindo fatores de transcrição, foram induzidos no estágio inicial da cultura de células de rosa em suspensão, mas sua expressão foi gradualmente regulada negativamente no estágio tardio da cultura de células de rosa em suspensão. Em contraste, RNAs codificadores associados à desintoxicação e transporte transmembrana foram regulados positivamente no estágio tardio da cultura de células de rosa em suspensão. Descobrimos que a maioria dos ncRNAs não foram expressos em células de rosa em suspensão, mas poucos ncRNAs foram altamente expressos. No entanto, os papéis funcionais da maioria dos ncRNAs ainda não foram caracterizados. Além disso, mostramos que a expressão de ncRNAs e seus RNAs alvo estavam altamente correlacionadas. A maioria dos RNAs codificadores regulados por ncRNAs codificam proteínas hipotéticas com funções desconhecidas. Em conjunto, revelamos que RNAs envolvidos em processos de tradução e metabólicos foram altamente expressos durante a cultura de células de rosa em suspensão, resultando na propagação da massa celular da rosa.

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Materiais Suplementares
Os seguintes estão disponíveis online em , Figura S1: Rede de interação dos 12 ncRNAs com 21 RNAs codificadores. Os 21 RNAs codificadores, que são alvos dos 12 ncRNAs selecionados, foram visualizados por rede de interação usando Cytoscape ver. 3.9.1. Os ncRNAs são indicados por retângulos na cor laranja, enquanto os RNAs codificadores são indicados por ovais na cor verde clara. Figura S2: Gráfico de vulcão exibindo RNAs expressos diferencialmente. O gráfico mostra a mudança de expressão (fold change) dos RNAs no eixo x contra o valor p ajustado plotado no eixo y. Figura S3: Número de DEGs e termos GO enriquecidos. (A) O número de ncRNAs e RNAs codificadores nos DEGs identificados de acordo com RNAs regulados positivamente e negativamente. (B) O número de termos GO enriquecidos nos RNAs regulados positivamente e negativamente. Figura S4: Termos GO enriquecidos de acordo com processo biológico (A) e função molecular (B) em RNAs codificadores regulados positivamente. (A) O número de ncRNAs e RNAs codificadores nos DEGs identificados de acordo com genes regulados positivamente e negativamente. (B) O número de termos GO enriquecidos nos genes regulados positivamente e negativamente. Figura S5: Rede de interação dos seis ncRNAs regulados positivamente com seus RNAs codificadores alvo. Os 24 RNAs codificadores, que são alvos dos seis ncRNAs selecionados, foram visualizados por rede de interação usando Cytoscape ver. 3.9.1. Os ncRNAs são indicados por um retângulo na cor azul escuro, enquanto os RNAs codificadores são indicados por um oval. As mudanças de expressão (fold change) convertidas em log2 dos RNAs codificadores foram indicadas por cores verdes para RNAs regulados negativamente e cores vermelhas para RNAs regulados positivamente. Figura S6: Rede de interação de 20 ncRNAs regulados negativamente com seus RNAs codificadores alvo. Os 179 RNAs codificadores, que são alvos dos 20 ncRNAs selecionados, foram visualizados por uma rede de interação usando Cytoscape ver. 3.9.1. Os ncRNAs são indicados por retângulos na cor azul escuro, enquanto os RNAs codificadores são indicados por ovais. As mudanças de expressão (fold change) convertidas em log2 dos RNAs codificadores são indicadas por verde para RNAs regulados negativamente e vermelho para RNAs regulados positivamente. Tabela S1: Resumo dos resultados de mapeamento no transcriptoma de referência da rosa. Tabela S2: O número de reads mapeados nos quatro diferentes conjuntos de dados do transcriptoma da rosa. Tabela S3: Informações sobre seis RNAs codificadores mostrando alta expressão em células de suspensão de rosa. Tabela S4: Informações sobre os 580 RNAs codificadores que foram altamente expressos nas células de suspensão de rosa. Tabela S5: Termos GO enriquecidos nos 580 RNAs codificadores que foram altamente expressos nas células de suspensão de rosa.
Tabela S6: Localização subcelular prevista das proteínas codificadas pelos 580 RNAs codificadores.
Tabela S7: Informações sobre os 16 ncRNAs que foram altamente expressos nas células de suspensão de rosa.
Tabela S8: Informações sobre os 390 RNAs regulados positivamente.
Tabela S9: Informações sobre os 290 RNAs regulados negativamente.
Tabela S10: Termos GO enriquecidos para os 390 RNAs regulados positivamente.
Tabela S11: Termos GO enriquecidos em RNAs codificadores regulados negativamente.
Tabela S12: Informações sobre os 24 ncRNAs regulados positivamente e seus RNAs codificadores alvo.
Tabela S13: Informações sobre os 20 ncRNAs regulados negativamente e seus RNAs codificadores alvo.
Tabela S14: Informações sobre quatro RNAs selecionados para RT-PCR quantitativo.
Contribuições dos Autores
Curadoria de dados, W.K.C. e H.C.; análise formal, W.K.C., H.C., E.K., S.H.P., J.K. e Y.J.; aquisição de financiamento, J.H.L. e S.H.M.; investigação, S.-Y.K., S.H.P., J.K., J.S., K.H., J.M. e Y.J.; metodologia, W.K.C., H.C., S.-Y.K., S.H.P., J.K. e J.S.; administração do projeto, J.H.L. e S.H.M.; recursos, S.-Y.K., J.S., K.H. e J.M.; software, W.K.C. e H.C.; supervisão, J.H.L. e S.H.M.; validação, E.K.; redação—rascunho original, W.K.C.; redação—revisão e edição, W.K.C. e S.H.M. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados brutos foram depositados no banco de dados NCBI SRA com o seguinte número de acesso: PRJNA916753.

Conflitos de Interesse
Os autores Soo-Yun Kim, Euihyun Kim, Seung Hye Paek, Jiyeon Kim, Jihyeok Song, Kyoungyeon Heo, Jiae Min, Jeong Hun Lee e Sang Hyun Moh foram empregados pela empresa BIO-FD&C Co., Ltd. Os demais autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Referências
Eficácia medicinal da planta rosa: Uma mini revisão
O gênero Rosa: Um aristocrata da família das plantas com classe, cor e fragrância
Filogenia e biogeografia de rosas selvagens com atenção especial aos poliploides
Indústria do óleo de rosa e a produção de rosa oleaginosa (Rosa damascena Mill.) na Turquia
Rosa damascena e calêndula: Culturas industriais promissoras
Efeitos farmacológicos de Rosa damascena
Constituintes químicos, farmacologia experimental e clínica de Rosa damascena: Uma revisão da literatura
Rosa damascena como erva sagrada antiga com novas aplicações
Calo vegetal: Mecanismos de indução e repressão
Plaqueamento de protoplastos de mesofilo de tabaco isolados em meio de ágar
Regulação química do crescimento e formação de órgãos em tecidos vegetais cultivados in vitro
Análise de RNA-Seq do transcriptoma de Arabidopsis em calos pluripotentes
Análise global de genes e proteínas diferencialmente expressos em calo de trigo infectado por Agrobacterium tumefaciens
O perfil do transcriptoma prevê novos genes para promover a formação e transformação de calo de milho
A análise do transcriptoma revela regulação traducional em calo embriogênico derivado de micrósporo de cevada sob estresse salino
Indução de calos embriogênicos e resposta ao estresse salino revelada por RNA-Seq em espécies selvagens diploides Gossypium sturtianum e Gossypium raimondii
Indução e cultivo de novo calo vermelho de Cyclocarya paliurus e suas características morfológicas e metabólicas únicas
Análise do transcriptoma de calo de melão
O mundo em expansão dos pequenos RNAs em plantas
Descoberta e análise em todo o genoma de microRNAs e outros pequenos RNAs de calo embriogênico de arroz
Determinação da concentração celular em uma suspensão de células vegetais usando um leitor de microplacas de fluorescência
Abordagem genômica para estudar genes de desenvolvimento floral em Rosa sp
Análise proteômica do secretoma de calos de arroz
Avanços recentes em proteômica da parede celular vegetal
Análise completa do transcriptoma do sistema de cultura de calos em suspensão de Bletilla striata
Explorando o efeito do metil jasmonato na expressão de microRNAs envolvidos na biossíntese de compostos ativos em culturas de células em suspensão de alecrim por meio de RNA-Sequenciamento
Fidelidade em nível molecular: Lições da síntese proteica
Fatores de alongamento do transcripto: Moldando transcriptomas após o início da transcrição
Proteínas de ligação a RNA em plantas: A ponta de um iceberg?
Estratégias de formação de ligações amida: Avanços recentes em uma transformação atemporal
Avanços Recentes na Síntese de Amidas Mediada por Luz Visível
Análise das reações utilizadas na preparação de moléculas candidatas a fármacos
Uma abordagem baseada em conhecimento no desenho de bibliotecas de química combinatória ou medicinal para descoberta de fármacos. 1. Uma caracterização qualitativa e quantitativa de bancos de dados de fármacos conhecidos
Desenvolvimentos recentes na formação catalítica de ligações amida
Mudanças nos cloroplastos e diferenciação de células de calo em Eckloniopsis radicosa (Kjellman) Okamura (Phaeophyta, Laminariales)
Ferimento desencadeia formação de calos via mudanças hormonais e transcricionais dinâmicas
Espécies reativas de oxigênio: Metabolismo, estresse oxidativo e transdução de sinal
Espécies reativas de oxigênio na sinalização vegetal
Regulação funcional da NADPH oxidase vegetal e seu papel na sinalização
Biologia molecular e aplicação de genes de peroxidase vegetal
A regulação dos níveis de espécies reativas de oxigênio pela glutationa peroxidase é crucial para a diferenciação vegetal in vitro
RNAs não codificantes de plantas: Participantes ocultos no desenvolvimento e nas respostas ao estresse
Caracterização da 5-O-glicosiltransferase envolvida na biossíntese de antocianinas em Cyclamen purpurascens
Cultura de células em suspensão de calo de rosa gerado a partir de pétalas de rosa-damasco. (A) Botões de rosa foram esterilizados em bancada limpa. (B) Transferência de pétalas de rosa para placas. (C) Indução de calo a partir de pétalas de rosa em meio de cultura. (D) Propagação de calo de rosa em meio de cultura. (E) Transferência de subcultura de células em suspensão de rosa para o biorreator. (F) Cultura de células em suspensão de rosa em condição de escuro.
Número de RNAs codificantes de acordo com o nível de expressão (valor FPKM). A expressão de 45.548 RNAs codificantes nas células em suspensão foi calculada com base nos valores de FPKM.
Top 20 termos GO altamente enriquecidos em 580 RNAs codificantes. Os 20 principais termos GO altamente enriquecidos em 580 RNAs codificantes foram visualizados por meio de gráficos de rede de acordo com processo biológico (A), componente celular (B) e função molecular (C). Os gráficos de rede exibem a relação entre os termos GO enriquecidos. Dois termos GO (nós) estão conectados se compartilharem 20% (padrão) ou mais genes. Nós mais escuros representam conjuntos de genes mais significativamente enriquecidos. Nós maiores representam conjuntos de genes maiores. Arestas mais espessas representam mais genes sobrepostos. A rede foi gerada utilizando o site ShinyGO 0.76.3.
Previsão da localização subcelular de 580 proteínas. A localização subcelular de 580 proteínas de rosa foi prevista usando o TargetP ver. 2.0 com base na presença de pré-sequências N-terminais. Proteínas secretadas com peptídeo sinal (SP), uma proteína mitocondrial com peptídeo de trânsito mitocondrial (mTP), proteínas do cloroplasto com peptídeo de trânsito do cloroplasto (cTP) e outras indicam proteínas direcionadas a outras localizações subcelulares.

O número de ncRNAs de acordo com o nível de expressão. A expressão de 4969 ncRNAs nas células em suspensão foi calculada com base nos valores de FPKM.

Informações sobre RNAs codificadores alvo para os 20 ncRNAs cujas expressões foram reguladas negativamente. (A) O número de RNAs codificadores alvo para os 20 ncRNAs regulados negativamente. (B) Localização cromossômica dos RNAs codificadores indicada por pontos vermelhos. As regiões enriquecidas no cromossomo 2 são indicadas por linhas violeta.

Resultados da RT-PCR quantitativa em tempo real de quatro RNAs selecionados. A expressão relativa de quatro RNAs selecionados foi avaliada por RT-PCR quantitativa em tempo real e normalizada usando RhEF1. Três réplicas biológicas foram utilizadas nesta análise. A significância estatística foi determinada usando um teste t. Letras distintas (ex.: “a” vs. “b”) indicam diferenças significativas entre os grupos correspondentes.