---

pmid: "38794435"
title: "Multiplicação in vitro de brotos e enraizamento de rosas-damasco 'Kashan' e 'Hervy Azerbaijan'"
authors: "Kaviani B, Deltalab B, Kulus D, Khoddamzadeh AA, Roque-Borda CA"
journal: "Plants (Basel, Switzerland)"
pubdate: "2024 May 14"
doi: "10.3390/plants13101364"
source: "PMC Full Text"

Multiplicação in vitro de brotos e enraizamento de rosas-damasco 'Kashan' e 'Hervy Azerbaijan'

Autores

Kaviani B, Deltalab B, Kulus D, Khoddamzadeh AA, Roque-Borda CA

Periodico

Plants (Basel, Switzerland) (2024 May 14)

Conteudo

Multiplicação in vitro de brotos e enraizamento dos genótipos de Rosa-damasco (Rosa damascena Mill.) ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’ para aplicações cosméticas e ornamentais

A rosa-damasco (Rosa damascena Mill.) é uma planta ornamental-medicinal da família Rosaceae, e seus compostos aromáticos e óleos essenciais são aplicados globalmente nas indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica. Devido ao seu valor econômico, esta pesquisa teve como objetivo estabelecer um protocolo para um método eficiente, rápido e de baixo custo para a multiplicação in vitro de brotos e enraizamento dos genótipos de R. damascena ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Segmentos nodais (como explantes primários) foram cultivados em meio Murashige e Skoog (MS) com combinações de vários reguladores de crescimento vegetal (PGRs), como ácido giberélico (GA3), 6-benzilaminopurina (BAP) e ácido indol-3-butírico (IBA), bem como uma substância semelhante a PGR, floroglucinol (PG), vitaminas como ácido ascórbico (AA) e carvão ativado na forma de carvão ativo (AC). Para a fase de estabelecimento, 0,1 mg·L−1 de PG, 0,2 mg·L−1 de GA3 e 1 mg·L−1 de BAP foram adicionados ao meio. Explantes secundários (segmentos nodais contendo gemas axilares produzidas a partir de explantes primários) foram obtidos após 30 dias de cultura in vitro e transferidos para meios de proliferação suplementados com diferentes concentrações de BAP (0, 0,5, 1, 1,5, 2 e 2,5 mg·L−1) e GA3 (0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8 e 1 mg·L−1) juntamente com 0,1 mg·L−1 de PG e 20 mg·L−1 de AA. Os meios de enraizamento foram suplementados com diferentes concentrações de BAP e GA3 com 0,1 mg·L−1 de IBA, PG e 20 mg·L−1 de AA e AC. Os resultados mostraram que o maior coeficiente de regeneração (4,29 e 4,28) e o maior número de folhas (23,33–24,33) foram obtidos nos explantes cultivados em meio suplementado com 2 mg·L−1 de BAP e 0,4 mg·L−1 de GA3 para os genótipos ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’, respectivamente. Da mesma forma, esta combinação de PGR proporcionou o menor tempo até a brotação (aproximadamente 6,5 dias) e emergência radicular (aproximadamente 10 dias) em ambos os genótipos. O maior número de brotos (4,78 por explante) e raízes (3,96) foi alcançado neste meio na rosa ‘Kashan’. Os comprimentos do caule e da raiz, bem como os pesos frescos e secos do caule e da raiz, também foram analisados. Na maioria das características medidas, os menores valores foram encontrados no meio controle livre de PGRs. As plântulas enraizadas foram transferidas para vasos preenchidos com perlita e turfa na proporção de 2:1 e foram aclimatizadas às condições ambientais da estufa com uma taxa média de sobrevivência de 90,12%. Esta pesquisa contribui significativamente para nossa compreensão da propagação da rosa-damasco e tem implicações práticas para as indústrias cosmética e de plantas ornamentais. Ao oferecer insights sobre a manipulação dos processos de regeneração, nosso estudo abre novas possibilidades para a produção eficaz de material vegetal de alta qualidade.

1. Introdução
   A rosa está entre as espécies ornamentais mais importantes do mundo e é comercializada como flor de corte, planta envasada, de jardim e paisagismo. As rosas também são importantes nas indústrias alimentícia, farmacêutica e medicinal, e estão disponíveis em uma ampla gama de cultivares e genótipos nos mercados internacionais. Além disso, as pétalas de rosa são uma fonte natural de fragrância e óleos essenciais, que são produtos valiosos na indústria de perfumes. O gênero Rosa abrange mais de 200 espécies, mas apenas algumas são utilizadas para a produção de óleos essenciais. Entre elas, a rosa-damasco (Rosa damascena Mill.), uma espécie híbrida derivada de Rosa gallica L. e Rosa moschata Herrm., é principalmente plantada para produção industrial de óleo. As rosas são propagadas principalmente de forma vegetativa; no entanto, a baixa capacidade de enraizamento de estacas caulinares é o principal fator limitante na propagação convencional. Além disso, plantas produzidas in vivo apresentam conteúdo e rendimento de óleo pobres e desuniformes. Consequentemente, a propagação in vitro de rosas tem desempenhado um papel crítico na rápida multiplicação de espécies e cultivares com características desejáveis e na produção de plantas saudáveis.
   A propagação in vitro é reconhecida como uma técnica importante e eficaz para a propagação em larga escala de culturas hortícolas, bem como para superar problemas causados pela produção heterogênea de sementes. O sucesso das técnicas de propagação in vitro depende de vários fatores, ou seja, o tipo e a concentração de reguladores de crescimento vegetal (PGRs), o genótipo da planta, o tipo de meio e os parâmetros do explante, que devem ser cuidadosamente otimizados. Técnicas de micropropagação têm sido utilizadas para várias espécies de rosas e seus híbridos. O uso bem-sucedido de PGRs convencionais (auxinas e citocininas) para a multiplicação de brotos e produção de raízes em membros das Rosáceas foi relatado. As citocininas (6-benzilaminopurina—BAP, ou cinetina—KIN) desempenham um papel fundamental na micropropagação, promovendo a divisão celular e a formação de brotos, estimulando assim o desenvolvimento de múltiplos brotos a partir de explantes. As auxinas, como o ácido indol-3-acético (AIA), o ácido indol-3-butírico (AIB) e o ácido naftalenoacético (ANA), por outro lado, estimulam o início e o desenvolvimento de raízes adventícias. A propagação in vitro bem-sucedida da rosa-damasco foi obtida através do uso de explantes nodais e de um meio Murashige e Skoog (MS) modificado com 0,25 mg·L−1 de AIB e/ou 0,5–4 mg·L−1 de BAP. Bosh et al. desenvolveram um sistema de imersão temporária para rosas-damasco baseado no uso de um meio MS modificado com 6 mg·L−1 de BAP. No entanto, faltam estudos sobre o uso de outros tipos de PGRs e suas interações na micropropagação desta espécie. Realizar tal pesquisa é importante, pois, de acordo com Rezanejad et al., espécies de rosas antigas (como R. damascena) são mais difíceis de propagar do que as cultivares modernas envasadas. Outra desvantagem da pesquisa relacionada à micropropagação da rosa-damasco é a falta de informações sobre o nome da cultivar estudada. Isso requer esclarecimento, especialmente para fins comerciais, pois o efeito do genótipo na eficiência da micropropagação é significativo.

O floroglucinol (PG), ou 1,3,5-tri-hidroxibenzeno, demonstra atividade semelhante à auxina e à citocinina, similar ao tiodiazuron (TDZ), e, portanto, tem considerável potencial em uma ampla gama de estudos de cultura de tecidos vegetais. Esta substância semelhante a PGR é um composto fenólico, um produto de degradação da floridzina, e é conhecida por promover a proliferação, o crescimento e o desenvolvimento in vitro de numerosas espécies de plantas. Nosso estudo anterior sobre o genótipo de rosa 'Isfahan' concentrou-se em indicar a concentração ideal de PG (0, 0,1, 0,2 e 0,3 mg⋅L−1) para melhorar a multiplicação de brotos e o enraizamento em combinação com BAP (0, 1, 2 e 3 mg⋅L−1) e AIB (0, 0,1, 0,2 e 0,3 mg⋅L−1). Com base nesses achados, aqui usamos uma concentração constante de PG e AIB (0,1 mg·L−1) em combinação com várias concentrações de giberelinas e BAP para a regeneração de brotos e raízes em um número ampliado de genótipos.
Giberelinas (GAs), derivados de ácido diterpênico pentacíclico, são hormônios vegetais naturais que são usados como RCPs para regular diversos processos biológicos e estimular tanto a divisão celular quanto o alongamento que afetam o crescimento do caule e das folhas. As GAs desempenham um papel fundamental em muitos eventos celulares, como superar a dormência em sementes e gemas, e estimular a indução floral, ou seja, são o grupo de RCPs promotores da germinação. As plantas mantêm sua homeostase celular regulando a expressão de genes de biossíntese de GAs ou genes catabólicos de GAs. A sinalização mediada por GA exibe um diálogo cruzado com outros RCPs, como as auxinas. Misra e Chakrabarty relataram que as citocininas sozinhas foram capazes de induzir gemas caulinares em Rosa clinophylla Thory, mas a produção dessas gemas foi aumentada quando as citocininas foram usadas juntamente com GA3. Portanto, é interessante usar esse RCP em sistemas de cultura de tecidos para a rosa-damasco.

O genótipo ‘Kashan’ é um dos genótipos mais importantes para a extração de óleo essencial e água de rosas a partir de rosas no Irã devido ao seu alto desempenho e aroma excelente. Esse valioso genótipo apresenta um rendimento de óleo essencial 15% maior e mantém mais compostos aromáticos no óleo essencial em comparação com outros genótipos, e há 4,6% menos compostos cerosos indesejáveis em seu óleo essencial do que em outros genótipos. Plantas obtidas a partir do cultivo in vitro de Rosa damascena (cultivares comerciais e genótipos) possuem um rendimento maior, de cerca de 10 a 15 toneladas por hectare, em comparação com plantas obtidas usando métodos tradicionais (rebentos e estacas), com rendimento de 3 a 5 toneladas por hectare. Os estoques micropropagados são de alta qualidade e livres de qualquer contaminação. Atualmente, o genótipo de rosa ‘Hervy Azerbaijan’ é propagado na província do Azerbaijão, Irã, tradicionalmente por estacas. A comparação da produção por cultura de tecidos dos genótipos ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’ é justificada pelas necessidades da produção de rosas na região do Azerbaijão Oriental, Irã. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes combinações de BAP, GA3, PG e IBA na micropropagação de R. damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’ por meio da ativação de gemas axilares.

2. Materiais e Métodos

2.1. Material Vegetal

Os experimentos foram realizados com rosas-damasco (Rosa damascena Mill.) ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’ em junho de 2021. O genótipo ‘Kashan’ foi preparado a partir de plantas-mãe de dois anos mantidas na estufa do Centro de Biotecnologia Norte e Noroeste da Província do Azerbaijão Oriental, Irã. Por outro lado, plantas-mãe de três anos do genótipo ‘Hervy Azerbaijan’ foram obtidas da estufa do Centro Técnico e Profissional de Cultura de Tecidos da província do Azerbaijão Oriental.
O genótipo 'Kashan' apresenta um desempenho superior e maior estabilidade e adaptabilidade do que o genótipo 'Hervy Azerbaijan'. 'Kashan' é uma planta perene com flores rosa-claro e um período de crescimento de pelo menos 9 meses por ano. A duração aproximada da germinação até o fim da floração deste genótipo é de 75 dias, e o comprimento médio do período de floração é de 25 dias. O tamanho das plantas de 'Hervy Azerbaijan' é menor que o de 'Kashan'. A cor das pétalas de 'Hervy Azerbaijan' é rosa-escuro e tende ao roxo. O caule de 'Hervy Azerbaijan' (com aproximadamente 80 cm de altura) é menos espinhoso que o de 'Kashan' e sua cor é vermelha no inverno.

A província do Azerbaijão Oriental está situada na região noroeste do Irã, a uma altitude de 1800 m acima do nível do mar, com coordenadas de 46°25' de longitude leste e 38°2' de latitude norte, medidas a partir do meridiano de Greenwich. Situada em uma área montanhosa, esta província possui um clima com verões amenos e invernos frios e longos.

As amostras foram coletadas na forma de ramos semi-lenhosos de 10–15 cm de comprimento e, para manter o nível de umidade e minimizar possíveis danos, os espécimes foram cuidadosamente envolvidos em um pano úmido e transportados para o laboratório dentro de um frasco isolado contendo gelo. Após a desfolha, os ramos foram cortados em explantes de nó único com cerca de 2 cm de comprimento e utilizados para cultura in vitro.

2.2. Desinfecção dos Explantes

Os explantes foram primeiro lavados com detergente líquido para louças e fungicida Captan (3 g por 500 mL de água por 20 min) preparado pela Empresa Exir-e-Keshavarzi, Yazd, Irã. Na etapa seguinte, as amostras de tecido foram submetidas a uma imersão de uma hora em água corrente da torneira. Após uma lavagem inicial, todas as amostras foram submetidas a um tratamento de um minuto com álcool etílico 70% (v/v), seguido de uma imersão de 5 min em hipoclorito de sódio (NaOCl) (marca comercial Active, Darou Pakhsh Co., Teerã, Irã) com concentração de 20% (v/v). Todos os procedimentos de desinfecção foram realizados dentro de uma cabine de fluxo laminar. Por fim, as amostras foram submetidas a três lavagens em água destilada estéril, cada uma com duração de 5 min.

2.3. Estabelecimento da Cultura In Vitro
Explantes desinfetados foram colocados dentro de frascos de vidro estéreis com volume de 150 mL preenchidos com 50 mL de meio de cultura MS basal contendo 3% (p/v) de sacarose e 0,7% (p/v) de ágar (SIGMA Aldrich, Milwaukee, WI, EUA) suplementado com 1 mg·L−1 de BAP, 0,2 mg·L−1 de GA3, 0,1 mg·L−1 de PG (SIGMA Aldrich, Milwaukee, WI, EUA), 250 mg·L−1 de Cefotaxima (Exir-e-Iran, Teerã, Irã) e 20 mg·L−1 de ácido ascórbico (Tabela 1, Figura 1A,B). O pH do meio foi ajustado para 5,6–5,8 antes da autoclavagem a 105 kPa e 121 °C por 20 min. O GA3 foi desinfetado a frio com um filtro esterilizado. Frascos contendo 500 mg de pó de cefotaxima foram utilizados para preparar a solução antibiótica. Água destilada estéril (2 mL) foi injetada no frasco com o pó usando uma seringa estéril. Após diluição, 1 mL de cefotaxima (equivalente a 250 mg·L−1) foi vertido sobre o meio de cultura esterilizado. Além disso, ácido ascórbico esterilizado por filtração foi adicionado ao meio de cultura autoclavado, para evitar a secreção de compostos fenólicos.
As culturas foram cultivadas a 24 ± 2 °C com um regime de luz/sombra de 16/8 h e intensidade luminosa de 50–60 μmol·m−2·s−1 fornecida por lâmpadas fluorescentes brancas frias. Uma subcultura foi realizada após 15 dias em recipientes e condições de cultura semelhantes. Após 30 dias, novos microbrotos adequadamente formados foram utilizados para os experimentos subsequentes.
2.4. Proliferação de Brotos e Indução de Raízes
Após o estabelecimento e crescimento inicial dos microbrotos (3–4 cm de comprimento), segmentos nodais com gemas axilares foram utilizados como explantes secundários nas fases de proliferação e enraizamento. Meio MS contendo 3% de sacarose e 0,7% de ágar foi utilizado para a proliferação de brotos. O pH do meio foi ajustado para 5,6–5,8 conforme descrito acima. Os meios de proliferação de brotos foram suplementados com diferentes concentrações de BAP (0, 0,5, 1, 1,5, 2 e 2,5 mg·L−1) e GA3 (0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8 e 1 mg·L−1). PG, antibiótico e ácido ascórbico foram utilizados nas mesmas concentrações da fase de estabelecimento (Tabela 1). As culturas foram mantidas na mesma sala de crescimento da fase de estabelecimento por 30 dias (Figura 1C,D). Meio basal com metade da concentração (½ MS) contendo 3% de sacarose e 0,7% de ágar foi preparado para o enraizamento (durando 40 dias). AIB na concentração de 0,1 mg·L−1 e carvão ativado na concentração de 20 mg·L−1 foram adicionados aos meios de enraizamento. BAP, GA3, PG, antibiótico e ácido ascórbico foram utilizados nas mesmas concentrações das fases anteriores (Tabela 1, Figura 1E).
2.5. Processo de Aclimatação
Os microbrotes enraizados (Figura 1F) foram extraídos dos frascos de cultura, e quaisquer resíduos do meio de cultura aderidos às raízes foram removidos por lavagem com água destilada esterilizada morna. Em seguida, as folhas inferiores das plantas jovens foram cuidadosamente removidas com tesoura para facilitar seu crescimento em vasos. As plântulas foram colocadas em um copo plástico preenchido com uma mistura de perlita autoclavada e turfa (na proporção de 2:1) e regadas com água estéril. Um copo plástico transparente foi colocado sobre as plântulas (Figura 1G,H). Após 15 dias, as plântulas foram transferidas para vasos plásticos (7,5 × 7,5 × 9 cm). Uma plântula por vaso foi cultivada e os vasos foram colocados em uma sala de aclimatação com umidade relativa de 70 ± 5%, regime de luz/escuridão de 11/13 h (intensidade luminosa de 100 μmol m−2 s−1) e temperatura de 25 ± 2 °C. Após 20 dias, as plântulas foram transferidas para a estufa (Figura 1I).
2.6. Delineamento Experimental e Análise de Dados
O experimento fatorial in vitro foi conduzido em delineamento de blocos completamente casualizados com 10 repetições. Cada unidade experimental compreendeu cinco frascos e três explantes foram cultivados dentro de cada frasco. Durante a etapa de proliferação de microbrotes, foram avaliados após 60 dias de cultura: tempo de indução de brotação (quebra da gema), número de folhas verdes, número de folhas amarelas, comprimento do broto, número de brotos, massa fresca do broto, massa seca do broto e coeficiente de regeneração (número de gemas laterais no caule). O número de folhas verdes e amarelas foi registrado por contagem manual. O enraizamento dos microbrotes foi realizado por 37 dias, após os quais foram medidos: tempo até a emergência das raízes, número de raízes, comprimento das raízes (comprimento médio de todas as raízes regeneradas por microbrote) e a massa fresca e seca das raízes. Para medir a massa seca dos brotos e raízes, esses órgãos foram mantidos em estufa a uma temperatura de 200 °C por 20 min, imediatamente após a medição da massa fresca. Os experimentos em estufa foram montados em delineamento de blocos completamente casualizados com três repetições e 72 vasos com uma plântula (cultivar) em cada. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias foram comparadas pelo teste de Duncan a p < 0,05 utilizando o software SAS versão 9.1. Os dados nos gráficos são apresentados como médias ± desvios padrão.
3. Resultados
Após desinfecção e estabelecimento (com eficiência superior a 85%), os explantes de ambos os genótipos foram transferidos para os meios de cultura de multiplicação. Cerca de 90% dos explantes regeneraram brotos.
Comparação das médias do efeito de diferentes concentrações de GA3 e BAP sobre o tempo até a quebra da gema (dias) dos genótipos de Rosa damascena Mill. 'Kashan' e 'Hervy Azerbaijan'. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente de acordo com o teste de Duncan.
Comparação das médias do efeito de diferentes concentrações de GA3 e BAP no comprimento do caule (cm) dos genótipos ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’ de Rosa damascena Mill. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan. Uma comparação entre ambos os genótipos revelou que o maior número de brotos (4,29–4,78 por explante) foi produzido nos meios suplementados com 2 mg·L−1 de BAP e 0,4 mg·L−1 de GA3 nos genótipos ‘Hervy Azerbaijan’ e ‘Kashan’, respectivamente (Figura 4). Esse número foi aproximadamente três vezes maior do que o obtido no meio sem PGRs. Em geral, ‘Hervy Azerbaijan’ produziu menos brotos do que ‘Kashan’.
O menor tempo até a indução/abertura de gemas (6,33 dias) foi obtido em explantes de ‘Kashan’ cultivados no meio enriquecido com 2 mg·L−1 de BAP e 0,4 mg·L−1 de GA3 (Figura 2). Em contraste, o maior tempo até a abertura de gemas (18,33 dias) foi encontrado em explantes de ‘Hervy Azerbaijan’ cultivados no meio contendo 2,5 mg·L−1 de BAP e 1 mg·L−1 de GA3 (Figura 2). Da mesma forma, os caules mais longos (7,13 cm) foram produzidos no meio MS suplementado com 2 mg·L−1 de BAP juntamente com 0,4 mg·L−1 de GA3 no genótipo ‘Kashan’. Os brotos de ‘Hervy Azerbaijan’ foram geralmente mais curtos (máximo de 6,96–6,97 cm no meio com 2 ou 2,5 mg·L−1 de BAP e 0,4 mg·L−1 de GA3), e o menor comprimento do caule (2,7–2,8 cm) foi obtido no meio controle para ambos os genótipos (Figura 3).
O número máximo de folhas verdes (24,33 por explante) foi contado no tratamento com 2 mg·L−1 de BAP e 0,4 mg·L−1 de GA3 em ‘Kashan’ (Figura 5). O número de folhas verdes também foi alto (23,66) no mesmo meio inoculado com ‘Hervy Azerbaijan’. Por outro lado, o menor número de folhas verdes (4,33–5,33 por explante) em ambos os genótipos foi contado no meio de cultura sem PGRs (Figura 5). O maior número de folhas amarelas (18,33–20,33 por explante) foi encontrado no meio contendo 2,5 mg·L−1 de BAP com 1 mg·L−1 de GA3 em ambos os genótipos estudados. O número de folhas amarelas também foi alto no meio controle com o genótipo ‘Kashan’ (Figura 6). Em geral, os explantes de ambos os genótipos de rosa cultivados nos meios suplementados com 0,4 mg·L−1 de GA3 (independentemente da concentração de BAP) tiveram mais folhas verdes e menos folhas amarelas. Resultados opostos foram relatados em plantas cultivadas no meio controle (Figura 5 e Figura 6).
O maior peso fresco (5,31 e 5,56 g) dos brotos foi relatado nos explantes cultivados nos meios suplementados com 2 mg·L−1 de BAP com 0,4 mg·L−1 de GA3 em ‘Hervy Azerbaijan’ e ‘Kashan’, respectivamente (Figura 7). Os mesmos suplementos do meio foram mais eficazes em termos de peso seco das plântulas (0,39 e 0,37 g por explante, respectivamente) (Figura 8). Os menores pesos fresco (1,54 e 1,46 g) e seco (0,10 e 0,11 g) dos brotos foram encontrados nas plântulas cultivadas no meio sem PGRs (controle).
O maior coeficiente de regeneração foi obtido no meio suplementado com 2 mg·L−1 de BAP e 0,4 mg·L−1 de GA3 no genótipo ‘Kashan’ (4,29), seguido por ‘Hervy Azerbaijan’ (4,28). Em geral, o valor deste parâmetro foi alto (acima de 4,0) nos meios suplementados com 0,4 mg·L−1 de GA3, independentemente da concentração de BAP. O menor coeficiente de regeneração (1,30 e 1,40), por outro lado, foi obtido no meio controle para ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’, respectivamente (Figura 9). Em geral, explantes cultivados nos meios sem GA3 apresentaram baixo coeficiente de regeneração (menos de 2,23).

O menor tempo até a emergência das raízes (9,33 e 10,33 dias) foi observado no meio suplementado com 2 mg·L−1 de BAP e 0,4 mg·L−1 de GA3 em ‘Hervy Azerbaijan’ e ‘Kashan’, respectivamente (Figura 10). Por outro lado, as raízes não emergiram por muito tempo (até mais de um mês) se o GA3 estivesse ausente (ou em baixa concentração) no meio de enraizamento. Raízes não foram produzidas nos meios controle.

Por outro lado, as raízes mais longas foram encontradas em MS com 2 mg·L−1 de BAP e 0,8 mg·L−1 de GA3 no ‘Kashan’ (3,96 cm por explante) e no meio com apenas 0,8 mg·L−1 de GA3 no ‘Hervy Azerbaijan’ (3,82 cm). Em geral, plantas produzidas nos meios com baixas concentrações de GA3 (0,0–0,2 mg·L−1) produziram raízes mais curtas (Figura 11).

O maior número de raízes (3,70–3,96 por explante) em ambos os genótipos estudados foi encontrado nos meios enriquecidos com 2 ou 2,5 mg·L−1 de BAP e 0,4 mg·L−1 de GA3 ou no meio contendo apenas 0,8 mg·L−1 de GA3 (Figura 12). Por outro lado, a maior massa fresca das raízes de ‘Kashan’ foi produzida em explantes cultivados em meio MS suplementado com 0,5 ou 1 mg·L−1 de BAP juntamente com 1 mg·L−1 de GA3. Quanto ao genótipo ‘Hervy Azerbaijan’, o tratamento com 1 mg·L−1 de BAP e 1 mg·L−1 de GA3 foi o mais eficaz (3,81 g de MF por explante) (Figura 13). A maior MS (0,31–0,32 g por explante) foi encontrada nos tratamentos com 1 mg·L−1 de BAP juntamente com 1 mg·L−1 de GA3 em ambos os genótipos (Figura 14).

Das 150 plantas produzidas na fase de multiplicação, 81 (54%) enraizaram com sucesso (Figura 1F). Destas oitenta e uma amostras, a adaptação de vinte e sete plantas esteve relacionada ao tratamento com 2,5 mg·L−1 de BAP sem GA3, e cinco das amostras morreram na fase de adaptação, ou seja, 81,48% sobreviveram. As próximas vinte e sete plantas foram do tratamento com 2 mg·L−1 de BAP juntamente com 0,2 mg·L−1 de GA3, e três destas plantas morreram na fase de adaptação, ou seja, 88,88% sobreviveram. Das 27 plantas de rosa restantes tratadas com 1 mg·L−1 de BAP juntamente com 0,8 mg·L−1 de GA3, todas as amostras (100%) sobreviveram. As plantas produzidas in vitro exibiram padrões de desenvolvimento semelhantes aos de suas contrapartes mãe de origem in vivo. Nenhuma diferença fenotípica foi observada.

4. Discussão
   A presente pesquisa relata um sistema bem-sucedido de propagação in vitro para os genótipos ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’ de R. damascena Mill. Estudos anteriores revelaram que os PGRs desempenham um papel vital no aumento da eficiência da propagação in vitro de muitas espécies pertencentes à família Rosaceae, o que corresponde aos nossos resultados.

Entre as citocininas utilizadas, o BAP mostrou-se o mais eficaz para a multiplicação de brotos axilares em vários genótipos de Rosa. Por exemplo, a maior taxa de multiplicação (4,2–7,5 brotos por explante) em R. canina L foi obtida usando 1–2 mg·L−1 de BAP. Um estudo sobre a propagação in vitro de R. hybrida L. demonstrou que o maior número de brotos, comprimento de brotos e número de folhas foram produzidos na presença de 2 mg·L−1 de BAP juntamente com 0,1 mg·L−1 de ANA. O presente estudo confirmou que o BAP é eficaz para a proliferação de explantes quando usado em concentrações moderadamente altas (2 mg·L−1), especialmente em combinação com GA3.

Geralmente, a concentração ideal de PGRs para a máxima multiplicação de brotos e indução de raízes não é apenas específica da espécie, mas também varia entre genótipos, cultivares e tipos de explantes, o que está relacionado ao diferente conteúdo de hormônios endógenos. Curiosamente, no presente estudo, o maior número de brotos, em ambos os genótipos estudados, foi produzido no mesmo meio de cultura, ou seja, MS contendo 2 mg·L−1 de BAP e 0,4 mg·L−1 de GA3. Este meio também foi superior em termos da maioria dos outros parâmetros vegetais que analisamos. A possibilidade de usar a mesma composição de meio para vários genótipos destaca a utilidade do protocolo de micropropagação aqui desenvolvido.
Nossos achados destacam o papel inegável da GA3 na melhoria de todas as características quantitativas e qualitativas de rosas in vitro. A GA3, particularmente no nível de 0,4 mg·L−1, aumentou todas as características positivas e diminuiu todas as características negativas em ambos os genótipos de rosa ('Kashan' e 'Hervy Azerbaijan'). Sabe-se que as giberelinas promovem a indução e o alongamento de microbrotos e induzem a rizogênese. A combinação de GA3 e TDZ no meio de cultura de Pterocarpus marsupium Roxb. melhorou a porcentagem de germinação, multiplicação e subsequente alongamento dos brotos. O uso de 1 e 5 mg·L−1 de GA3 resultou em 80,5 e 92,3% de indução de raízes em Cynara scolymus L.. No presente estudo, a GA3 estimulou a rizogênese em concentrações ainda menores. Saks e Van Staden relataram que, quando aplicada aos caules de cravos (Dianthus caryophyllus L.) cortados, a GA3 atrasou sua senescência ao reduzir o pico climatérico da produção de etileno. Da mesma forma, Beevers relatou que o ácido giberélico preveniu o amarelamento e a perda de clorofila em discos foliares de chagas (Tropaeolum majus L.). Isso poderia explicar por que, no presente estudo, um menor número de folhas amarelas e mais folhas verdes foram encontradas em ambos os genótipos de rosa-damasco no tratamento ideal com GA3. Uma comparação entre nosso trabalho e alguns outros artigos publicados, por exemplo, o de Nikbakht et al. sobre a propagação in vitro de R. damascena, mostrou que a taxa de multiplicação de brotos obtida em nosso estudo (4,78 por explante) foi maior. Em R. damascena 'Azaran' e 'Ghamsar', BAP (1–2 mg·L−1), GA3 (0,1 mg·L−1) e ANA (0,1 mg·L−1) para 'Azaran' e as mesmas concentrações de BAP e GA3, mas sem ANA para 'Ghamsar', forneceram as maiores taxas de multiplicação (cerca de 2,5) e parâmetros foliares. Ápices caulinares e gemas axilares de Rosa 'Konstancin' (R. rugosa × R. beggeriana) desenvolveram-se em brotos únicos a uma taxa semelhante à nossa (4,8 brotos por explante em meio MS com 0,5 mg·L−1 de BAP e 0,1 mg·L−1 de GA3), mas em um período de tempo maior (2–4 semanas).
O presente estudo confirmou o efeito benéfico do AIB na indução e alongamento de raízes em roseiras ('Kashan' e 'Hervy Azerbaijan'). O AIB é geralmente a auxina mais eficaz e frequentemente utilizada para enraizamento em plantas lenhosas, incluindo Rosaceae. No entanto, a formação de raízes pode ser afetada não apenas pelo tipo de auxina, mas também por sua concentração. Vários estudos mostraram que a iniciação e o desenvolvimento ótimos de raízes foram alcançados quando gemas axilares em crescimento ativo foram cultivadas em um meio suplementado com uma alta concentração de AIB. A maior porcentagem de enraizamento em três cultivares de damasco iraniano (Prunus armenica L.), 'Ordubad', 'Shams' e 'Qaysi', foi alcançada em um meio suplementado com 4 mg·L−1 de AIB. O número máximo de raízes e o comprimento radicular em Rosa hybrida foram obtidos com 2 mg·L−1 de AIB. Em pêssego (Prunus persica 'Garnem'), 1,5 mg·L−1 de AIB induziu a maior taxa de enraizamento (42,86%), o maior número de raízes (6,33 por broto) e as raízes mais longas (7,17 cm). Quanto a Physocarpus opulifolius L., o melhor enraizamento foi obtido com 1 mg·L−1 de AIB em meio MS com metade da força. No presente estudo, utilizando componentes como PG e AC, conseguimos alcançar uma alta eficiência de enraizamento da rosa-damasco em meio com uma concentração muito baixa de AIB (0,1 mg·L−1).

Nosso estudo destaca a interação entre PG e outros reguladores de crescimento vegetal na micropropagação de rosas. O PG tem demonstrado aumentar a formação de brotos e a embriogênese somática em diversas culturas hortícolas e de grãos. O floroglucinol, por ser um precursor na via de biossíntese da lignina, tem a capacidade de controlar a hiperidricidade através da lignificação. Além disso, seus homólogos atuam como sinergistas de auxina ou protetores de auxina, estimulando o enraizamento. Isso pode explicar por que a aplicação simultânea de PG, BAP e GA3 estimulou tão efetivamente o desenvolvimento de plantas completas nos genótipos de rosas estudados.
Observações morfológicas de ambos os genótipos em condições de estufa confirmaram que as plantas propagadas eram verdadeiras ao tipo, o que é altamente benéfico. Explantes cultivados em meios artificiais são expostos a reguladores de crescimento sintéticos e condições de estresse que podem estimular a ocorrência de variações genéticas, particularmente nas células do calo. Alterações genéticas nas plantas produzidas in vitro têm sido um problema grave em protocolos baseados em regeneração indireta. Portanto, preservar a estabilidade do material vegetal é um dos objetivos mais vitais na micropropagação comercial. Meristemas, bem como gemas apicais e laterais, são explantes relativamente "seguros" para a produção de plantas geneticamente estáveis. A estabilidade genética desses tipos de explantes foi confirmada em várias espécies, incluindo rosas. O risco de produzir plantas fora do tipo usando outros órgãos, como raízes, caules e folhas, é maior do que no caso dos meristemas. Portanto, no presente estudo, segmentos nodais com gemas axilares foram utilizados como explantes primários e secundários. O protocolo de micropropagação desenvolvido neste estudo mostrou-se altamente eficaz e prático, pois não foram observados calos nem diferenças morfológicas perceptíveis entre as plantas derivadas in vitro e as plantas-mãe.
5. Conclusões
A rosa-damasco é cultivada principalmente para produção industrial de óleo, pois seu óleo essencial possui notáveis propriedades farmacológicas. Certos genótipos de rosa-damasco apresentam maior potencial para produção de óleo essencial, destacando sua importância nesse aspecto. Neste estudo, foi estabelecido um protocolo rápido e eficiente para a propagação in vitro de dois genótipos de rosa-damasco, ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Uma combinação de 2 mg·L−1 de BAP com 0,4 mg·L−1 de GA3 (na presença de PG e IBA) melhorou o desempenho do crescimento in vitro de ambos os genótipos de R. damascena, aprimorando a maioria das características medidas, particularmente o número de brotos e raízes, o número de folhas verdes e o coeficiente de regeneração. Este protocolo pode ser utilizado na produção em larga escala de roseiras oleíferas.
Aviso Legal/Nota do Editor: As declarações, opiniões e dados contidos em todas as publicações são de responsabilidade exclusiva do(s) respectivo(s) autor(es) e contribuidor(es) e não da MDPI e/ou do(s) editor(es). A MDPI e/ou o(s) editor(es) se isentam de responsabilidade por qualquer dano a pessoas ou propriedades resultante de quaisquer ideias, métodos, instruções ou produtos mencionados no conteúdo.
Contribuições dos Autores
Conceitualização, B.K., A.A.K. e D.K.; metodologia, B.K.; software, B.K. e D.K.; validação, B.K. e D.K.; análise formal, B.K., D.K., A.A.K. e C.A.R.-B.; investigação, B.D. e A.A.K.; recursos, B.D. e A.A.K.; curadoria de dados, B.K.; redação—preparação do rascunho original, B.K.; redação—revisão e edição, B.K., D.K., A.A.K. e C.A.R.-B.; visualização, B.K., A.A.K., D.K. e C.A.R.-B.; supervisão, D.K. e B.K.; administração do projeto, B.K.; aquisição de financiamento. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados estão disponíveis por e-mail mediante solicitação razoável.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Referências
Propagação in vitro de Rosa ‘Konstancin’ (R. rugosa × R. beggeriana), uma planta com alto valor nutricional e pró-saúde
Respostas bioquímicas e moleculares de Rosa damascena mill. cv. Kashan ao ácido salicílico sob estresse salino
Estudo sobre o potencial citotóxico e genotóxico de hidrossóis de Rosa damascena Mill. e Rosa alba L. búlgaras—In Vivo e In Vitro
Desenvolvimentos recentes, desafios e oportunidades no melhoramento genético da rosa portadora de óleo essencial (Rosa damascena): Uma revisão
Propagação in vitro da rosa-damasco (Rosa damascena Mill.)
Aplicação e melhoria de sistemas de cultura in vitro para produção comercial de plantas ornamentais, frutíferas e industriais na Polônia
Propagação in vitro de Pyracantha angustifolia (Franch.) CK Schneid
Micropropagação de Rosa damascena Mill.: Os efeitos de agentes gelificantes nas etapas de multiplicação e aclimatização
Propagação in vitro de rosa—Uma revisão
Propagação in vitro eficiente de rosas históricas para conservação da biodiversidade
Avaliação da micropropagação da rosa-damasco de Kashan, rosa aromática de Yasooj e seu híbrido
Propagação in vitro de rosa portadora de óleo essencial (Rosa damascena Mill.)
Propagação in vitro de rosa-damasco usando o sistema de imersão temporária
Comparação da regeneração de brotos e raízes de rosa-miniatura em vaso (Rosa × hybrida L.) e rosa-damasco (R. damascena Mill.) em sistema de microcultura
Floroglucinol, BAP e NAA aumentam a proliferação de brotos axilares e outros indicadores de crescimento em cultura in vitro de rosa-damasco (Rosa damascena Mill.)
Floroglucinol em cultura de tecidos vegetais
Propagação in vitro de Rosa damascena portadora de óleo essencial usando floroglucinol: Um protocolo para multiplicação rápida e de alta qualidade de brotos e enraizamento
Micropropagação de pêssego, Prunus persica (L.) Batsch. cv. Garnem
Propagação em larga escala de Myrobolan (Prunus cerasifera) em biorreatores RITA® e avaliação da conformidade genética baseada em ISSR
Brassinosteroides, giberelina e fitocromo afetam um módulo de transcrição comum em Arabidopsis
Efeitos nocivos e protetores de terpenoides de plantas medicinais africanas
A sinalização regulatória do metabolismo da giberelina e sua interação com fitormônios em resposta a estresses abióticos em plantas
Propagação clonal de Rosa clinophylla Thory. através de cultura de gemas axilares
Investigando a indústria da água de rosas e sua importância em Qamsar Kashan
Avaliação da variação morfológica de diferentes populações de Rosa damascena Mill. de Kashan e sua correlação com o teor de óleo essencial
Um meio revisado para crescimento rápido e bioensaios com culturas de tecidos de tabaco
As questões da micropropagação de damasco (Prunus armeniaca L.)
Aplicação de meta-Topolina para melhorar a micropropagação de groselheira (Ribes grossularia)
Um sistema melhorado para a propagação in vitro de cultivares de rosa
Micropropagação de Rosa pomifera
Micropropagação de Rosa canina através da proliferação de brotos axilares
Efeitos da propagação in vitro na ontogenia de plantas micropropagadas de Rosa canina L. como um porta-enxerto promissor para rosas ornamentais
Propagação de rosa (Rosa hybrida L.) sob técnica de cultura de tecidos
Melhoria do enraizamento in vitro de alcachofra (cv. Camus de Bretagne) por GA3
Efeitos do sistema de imersão e do ácido giberélico no crescimento e aclimatação de abacaxi micropropagado
Ácido giberélico e tidiazuron promovem a micropropagação de uma árvore lenhosa ameaçada (Pterocarpus marsupium Roxb.) usando plântulas in vitro
O papel do ácido giberélico na senescência de flores de cravo
Efeito do ácido giberélico na senescência de discos foliares de capuchinha (Tropaeolum majus L.)
Micropropagação de rosa-damascena (Rosa damascena Mill.) cvs Azaran e Ghamsar
Propagação in vitro, estudos micromorfológicos e enraizamento ex vitro de árvore-bala-de-canhão (Couroupita guianensis Aubl.): Uma espécie ameaçada de uso múltiplo
Micropropagação de Pyracantha coccinea
Clonagem de romã madura (Punica granatum) cv. Jalore sem sementes via produção de brotos in vitro e enraizamento ex vitro
Micropropagação de louro-cereja Prunus laurocerasus L.
Micropropagação de duas espécies frutíferas nativas australianas, Davidsonia pruriens e Davidsonia jerseyana G. Harden e J.B. Williams
Micropropagação de sândalo-vermelho (Pterocarpus santalinus L.) usando explantes nodais maduros
2021. Micropropagação de nêspera (Mespilus germanica L.), uma árvore frutífera mediterrânea
Otimizando as condições de micropropagação para uma cultivar recalcitrante de ninebark (Physocarpus opulifolius L. maxim.)
Propagação in vitro e conservação a médio prazo de cultivar de ameixa autóctone ‘Crvena Ranka’
Estabelecimento de cultura de meristema para produção livre de vírus e geneticamente estável da planta ameaçada Hosta capitata
Efeitos do comportamento in vitro de plantas micropropagadas na estabilidade da variegação em Yucca gloriosa, Phormium tenax e Cordyline australis
Estágios de propagação in vitro (estabelecimento, proliferação de brotos, indução de raízes e aclimatização) de Rosa damascena Mill. (A) Estágio de estabelecimento, (B) explantes em crescimento no estágio de estabelecimento após 30 dias de cultivo, (C) estágio de proliferação de brotos no meio de multiplicação suplementado com 2 mg·L⁻¹ de BAP e 0,4 mg·L⁻¹ de GA₃, (D) brotos em crescimento após 60 dias, (E) plântulas no meio de enraizamento após 30 dias de cultivo, (F) plântula enraizada produzida em meio MS ½ basal enriquecido com 2 mg·L⁻¹ de BAP juntamente com 0,4 mg·L⁻¹ de GA₃, (G,H) plântulas cultivadas ex vitro em copos plásticos transparentes preenchidos com substrato de perlita e turfa esterilizados em autoclave (na proporção de 2:1) em sala de aclimatização, (I) plântulas aclimatizadas cultivadas em vasos plásticos preenchidos com solo, perlita e turfa (na proporção de 2:1:1) em estufa após 75 dias. Barra de escala: 10 mm.

Comparação de médias do efeito de diferentes concentrações de GA₃ e BAP sobre o número de brotos de genótipos de Rosa damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan.

Comparação de médias do efeito de diferentes concentrações de GA₃ e BAP sobre o número de folhas verdes (por explante) de genótipos de Rosa damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan.

Comparação de médias do efeito de diferentes concentrações de GA₃ e BAP sobre o número de folhas amarelas (por explante) de genótipos de Rosa damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan.

Comparação de médias do efeito de diferentes concentrações de GA₃ e BAP sobre o peso fresco do caule (g) de genótipos de Rosa damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan.

Comparação de médias do efeito de diferentes concentrações de GA₃ e BAP sobre o peso seco do caule (g) de genótipos de Rosa damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan.

Comparação de médias do efeito de diferentes concentrações de GA₃ e BAP sobre o coeficiente de regeneração de genótipos de Rosa damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan.

Comparação de médias do efeito de diferentes concentrações de GA₃ e BAP sobre o tempo até a emergência de raízes (dias) de genótipos de Rosa damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan.

Comparação de médias do efeito de diferentes concentrações de GA₃ e BAP sobre o comprimento da raiz (cm) de genótipos de Rosa damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan.
Comparação de médias do efeito de diferentes concentrações de GA3 e BAP no número de raízes dos genótipos de Rosa damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Médias marcadas com a mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan.
Comparação de médias do efeito de diferentes concentrações de GA3 e BAP no peso fresco das raízes (g) dos genótipos de Rosa damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Médias marcadas com a mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan.
Comparação de médias do efeito de diferentes concentrações de GA3 e BAP no peso seco das raízes (g) dos genótipos de Rosa damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’. Médias marcadas com a mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan.
Compostos adicionados ao meio basal MS (para as etapas de estabelecimento e multiplicação de brotos) e ½ MS (para enraizamento) para Rosa damascena Mill. ‘Kashan’ e ‘Hervy Azerbaijan’.
Estágios de Micropropagação Aditivos (mg·L⁻¹) Estabelecimento Multiplicação de Brotos Enraizamento BAP 1 0, 0,5, 1, 1,5, 2 e 2,5 0, 0,5, 1, 1,5, 2 e 2,5 GA3 0,2 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8 e 1 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8 e 1 IBA - - 0,1 PG 0,1 0,1 0,1 Antibiótico 250 250 250 Ácido ascórbico 20 20 20 Carvão ativo - - 20 FeNaEDTA - 100 100 Fe(OH)₃ 50 - -