pmid: "37079315"
title: "AURKB Melhora a Remodelação Cromossômica de Genes Teloméricos e Acelera a Tumorigênese do Melanoma Uveal."
authors: "Wang H, Pan H, Huang X"
journal: "Investigative ophthalmology & visual science"
pubdate: "2023 Apr 03"
doi: "10.1167/iovs.64.4.23"
source: "PMC Full Text"

AURKB Melhora a Remodelação Cromossômica de Genes Teloméricos e Acelera a Tumorigênese do Melanoma Uveal.

Autores

Wang H, Pan H, Huang X

Periodico

Investigative ophthalmology & visual science (2023 Apr 03)

Conteudo

AURKB Melhora a Remodelação Cromossômica de Genes Teloméricos e Acelera a Tumorigênese do Melanoma Uveal

Objetivo
O melanoma uveal (MU) é a malignidade intraocular mais comum em adultos, desenvolvendo metástases hepáticas e ameaçando a vida do paciente. As terapias atuais não conseguiram melhorar significativamente a sobrevida dos pacientes com MU. Assim, a descoberta de medicamentos potentes é iminente.

Métodos
A análise bioinformática integrada do The Cancer Genome Atlas e a imuno-histoquímica de tecidos de pacientes revelaram o papel oncogênico da aurora quinase B (AURKB) no MU. Ensaios de sensibilidade a medicamentos e um modelo animal intraocular ortotópico foram utilizados para testar a eficácia dos inibidores de AURKB. Sequenciamento de RNA e imunotransferência foram realizados para identificar o efetor downstream. Um ensaio de imunoprecipitação da cromatina foi conduzido para elucidar a regulação transcricional da AURKB no gene alvo.

Resultados
A AURKB foi encontrada superexpressa em pacientes com MU, resultando em um prognóstico ruim. Felizmente, o inibidor específico de AURKB, hesperadina, alcançou eficiência farmacológica proeminente no MU in vitro e in vivo. Mecanicamente, a hesperadina comprometeu a fosforilação da histona H3 na serina 10 (H3S10ph) no promotor da transcriptase reversa da telomerase, acompanhada pela metilação da histona H3 na lisina 9. Esse estado metilado da região promotora forçou a condensação da cromatina e, consequentemente, interrompeu a transcrição da transcriptase reversa da telomerase.

Conclusões
Coletivamente, nossos dados demonstraram que os inibidores de AURKB desaceleraram a tumorigênese do MU ao silenciar epigeneticamente a expressão da transcriptase reversa da telomerase oncogênica, indicando a AURKB como um potencial alvo terapêutico no MU.

O melanoma uveal (MU) é a malignidade intraocular primária mais comum em adultos, prejudicando gravemente a função visual e até mesmo a vida do paciente. Aproximadamente metade dos pacientes com MU desenvolve metástases à distância e morre dentro de 1 ano. Assim, a detecção precoce e o tratamento de pequenas lesões são cruciais para o controle local e a preservação visual, a prevenção de metástases e a melhora da sobrevida.

A família das aurora quinases contém três membros: aurora quinase A/B/C, que possuem um domínio catalítico conservado, mas desempenham funções distintas. Como uma serina/treonina quinase, a aurora quinase B (AURKB) é bem conhecida por seu papel fisiológico na progressão mitótica, incluindo a montagem do fuso, o alinhamento cromossômico e a citocinese, por meio da fosforilação espaço-temporal altamente organizada de proteínas de interação na região do centrômero. Além disso, a perda de AURKB leva à mitose anormal e à má segregação cromossômica, resultando em instabilidade genética. Além do papel crucial na mitose, a AURKB pode ser ativada pela via ATR-CHK1 em resposta a erros de replicação do DNA. Adicionalmente, a AURKB ativada no corpo médio desencadeia o ponto de verificação de abscisão, evitando a formação de micronúcleos.
Recentemente, a amplificação ou superexpressão de AURKB tem sido relatada com frequência em várias neoplasias malignas, sugerindo um estágio tumoral mais elevado e um prognóstico desfavorável. Além disso, a AURKB, em cooperação com o TP53 mutante, impulsionou a transformação maligna de células de embrião de hamster chinês in vivo. Ademais, certos tumores quimiorresistentes apresentaram expressão elevada de AURKB ou parada do crescimento em resposta a inibidores de AURKB. Como a expressão aberrante de AURKB foi observada com frequência em neoplasias malignas, uma variedade de inibidores de pequenas moléculas direcionados à AURKB foi desenvolvida e está em diferentes fases de ensaios clínicos. A hesperadina, usada principalmente como um inibidor indolinônico competitivo de adenosina trifosfato da AURKB, interferiu na conformação ativa do loop T marcada pela fosforilação na Thr232. Além da AURKB, a hesperadina inibiu outras atividades quinase, incluindo CaMKII-δ, MST4, MEKK2, AMPK, Lck, MKK1, MAPKAP-K1, CHK1 e PHK. Adicionalmente, a hesperadina suprimiu o câncer pancreático por meio de um novo eixo ATF4/GADD45A mediado pelo excesso de estresse mitocondrial–retículo endoplasmático. Vários estudos demonstraram o papel da AURKB na ativação da via PI3K/AKT/fator nuclear-κB para promover a sobrevivência e inibir a apoptose. No entanto, o papel da AURKB no melanoma uveal (MU) e o mecanismo subjacente permanecem elusivos.

No presente estudo, uma análise integrada do The Cancer Genome Atlas (TCGA) sugeriu o papel da AURKB na aceleração da oncogênese e metástase do MU, corroborada ainda mais por uma série de experimentos in vitro e in vivo. O sequenciamento de RNA de células de MU tratadas com inibidor de AURKB indicou que a AURKB pode manipular a organização dos telômeros. Além disso, um ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) demonstrou que a AURKB alcançava essa regulação sofisticada modulando o status epigenético da histona, criando uma estrutura de cromatina aberta para facilitar a transcrição da telomerase transcriptase reversa (TERT). Portanto, nossos achados caracterizam uma rede de ativação transcricional profunda que liga a tumorigênese e a homeostase dos telômeros por meio da remodelação da cromatina mediada pela AURKB e estabelecem a base teórica para a potencial aplicação clínica de inibidores de AURKB no MU.

Métodos
Reagentes
Danusertibe, hesperadina, TAK-901 e inibidor de Aurora A I foram adquiridos da MedChemExpress Company (Monmouth Junction, NJ, EUA). Os anticorpos primários incluíram anticorpo de coelho anti-fosfo-AURKBT232 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA; 2914T), anticorpo de camundongo anti-AURKB (Abcam [Cambridge, Reino Unido], 3609), anticorpo de coelho anti-H3 (Abcam, ab1791), anticorpo de coelho anti-H3S10ph (Abcam, ab5176), TERT (Abcam, ab230527), histona H3 na lisina 9 (H3K9me)2/3 (CST, 13969) e GAPDH (Bioworld Technology, Bloomington, MN, EUA; MB001). Os anticorpos secundários incluíram IgG de coelho conjugada com HRP (Cell Signaling Technology, 7074) e IgG de camundongo conjugada com HRP (Cell Signaling Technology, 7076).
As linhagens celulares foram cultivadas em meio Roswell Park Memorial Institute 1640 contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos (penicilina, 100 U/mL; estreptomicina, 100 µg/mL). Essas células foram mantidas em ambiente umidificado a 37°C com 5% de CO2 e 100% de umidade. O meio de cultura foi trocado a cada 3 dias.
Dados de Sensibilidade a Fármacos – Concentração Inibitória Mediana
A sensibilidade aos fármacos foi testada em células UM usando o ensaio CCK8. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5000 células/poço e, em seguida, tratadas com diferentes concentrações dos fármacos em triplicata. Após 72 horas de incubação, a viabilidade celular foi quantificada usando o ensaio CCK8, e a concentração inibitória mediana foi estimada usando o GraphPad Software 8.0.1.
Citometria de Fluxo
As células foram coletadas e fixadas em etanol 70%, tratadas com 300 µg/mL de RNase A, e seus núcleos foram corados com 10 µg/mL de PI. Um citômetro de fluxo FACS detectou os núcleos corados. Os dados foram analisados pelo software ModFit. O ensaio de apoptose foi realizado usando um Kit de Detecção de Apoptose FITC Annexin V (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, EUA). As células foram lavadas duas vezes com PBS frio e, em seguida, ressuspensas em tampão de ligação 1× a uma concentração de 1 × 106 células/mL, e 5 µL de conjugado Annexin V-FITC e 10 µL de solução de PI foram adicionados a cada 100 µL de suspensão celular. As células foram suavemente agitadas em vórtex e incubadas por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, 400 µL de tampão de ligação 1× foram adicionados a cada tubo. A citometria de fluxo foi usada para analisar as células dentro de 1 hora, e a taxa de apoptose concreta foi calculada usando o software FlowJo.
Sequenciamento de RNA e Análise Bioinformática
Um total de 92,1 células foram tratadas com DMSO ou 0,1 µM de hesperidina por 24 horas. O RNA total foi extraído e o perfil de expressão de mRNA foi analisado usando sequenciamento de RNA. Uma análise de enriquecimento de conjuntos de genes foi realizada usando a ferramenta online WebGestalt (http://www.webgestalt.org/).
Análise do Banco de Dados
O banco de dados GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) fornece informações de sobrevida do UM e índices de correlação. Análises de sobrevida de Kaplan–Meier de AURKB e TERT foram realizadas, e o valor de corte foi definido de acordo com o valor mediano da expressão normalizada. No TCGA, pacientes com UM são divididos em dois grupos de acordo com o Z-score de AURKB. O status vital, evento metastático, cluster SCNA, mutação BAP1 e transcriptoma desses dois grupos foram então comparados.
Imuno-histoquímica (IHC)
A coloração imuno-histoquímica foi realizada nas amostras de UM incluídas em parafina. As secções foram desparafinizadas, reidratadas e submetidas à recuperação antigênica. Após o bloqueio da atividade da peroxidase endógena, as secções foram incubadas com anticorpos primários contra AURKB (1:200) e TERT (1:100) durante a noite a 4°C. Em seguida, as secções foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP, seguidas de coloração com DAB e contracoloração com hematoxilina. As secções coradas foram observadas ao microscópio.
Resumidamente, as seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina foram desparafinizadas e reidratadas, seguidas de recuperação antigênica induzida por calor em pH 9,5. Em seguida, os anticorpos primários AURKB e H3S10ph foram adicionados. Algumas seções foram incubadas com BSA a 5% como controles negativos. Tecidos de câncer colorretal humano embebidos em parafina foram usados como controles positivos devido à alta expressão de AURKB (www.proteinatlas.org). Em seguida, as seções de tecido foram incubadas por 8 horas à temperatura ambiente. Na sequência, as seções de tecido foram incubadas com IgG anti-camundongo de cabra Alexa Fluor 488 (Abcam, ab150113) e IgG anti-coelho de cabra Alexa Fluor 647 (Abcam, ab150079) por 90 minutos em tampão de bloqueio. Depois, as seções de tecido foram coradas com Hoechst por 30 minutos em tampão de lavagem. Então, as seções de tecido foram imersas em etanol até que a coloração desejada fosse alcançada. Finalmente, as seções de tecido foram montadas com lamínulas usando meio de montagem aquoso apropriado. A quantificação relativa da coloração imunofluorescente do tecido foi realizada pelo Software Image J. Consentimentos informados por escrito foram fornecidos por todos os participantes envolvidos neste estudo.

Imunotransferência (Western Blot)

As proteínas foram extraídas via tampão de lise proteica. Os sobrenadantes foram coletados após centrifugação dos lisados a 12.000×g por 5 minutos a 4°C. A concentração de proteínas foi avaliada usando o Kit de Ensaio de Proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Lisados celulares contendo 30 µg de proteína foram separados em um gel de eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio a 4-20% (Solarbio, Pequim, China) e então transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno (Millipore, Burlington, MA, EUA) usando um Trans-Blot Turbo. As membranas foram então bloqueadas em uma solução de salina tamponada com Tris contendo Tween-20 a 0,05% e leite desnatado a 5% por 60 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram incubados durante a noite a 4°C. Anticorpos secundários conjugados com HRP foram incubados com as membranas por 2 horas à temperatura ambiente. As membranas foram finalmente reveladas usando um substrato de quimioluminescência intensificada.

ChIP

O ensaio de ChIP foi realizado usando o Kit EZ-Magna ChIP A/G (Millipore) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram fixadas e centrifugadas, e os pellets foram ressuspendidos em tampão de lise ChIP. Após sonicação, o complexo de DNA fragmentado dos lisados nucleares foi coletado, e anticorpos como H3S10ph, H3K9me2/3, RNA polimerase II e IgG foram adicionados. A mistura foi incubada durante a noite, e esferas magnéticas foram adicionadas para precipitar os complexos DNA–proteína–anticorpo. Após a eluição, as amostras estavam prontas para a análise por PCR em tempo real. As sequências dos iniciadores (primers) de ChIP são apresentadas aqui: direto (forward), 5ʹ-TCCCCTTCACGTCCGGCA-3ʹ; reverso (reverse), 5ʹ-AGCGGAGAGAGGTCGAATCG-3ʹ.

O Comprimento Relativo dos Telômeros por RT-PCR Quantitativo
A PCR quantitativa foi realizada em triplicata, e as reações incluíram 4 µL de DNA genômico (80 ng), 0,1 µL de primer de telômero (10 µM) (direto: 5ʹ-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3ʹ; reverso: 5ʹ-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3ʹ), 0,1 µL de primer direto YH-1 (10 µM) (5ʹ-CGCACAGAGTAGTAAGGAAAGTGAAGTAGGCCGGGC-3ʹ), 1 µL de primer reverso YH-1 (10 µM) (5ʹ-GTGCTGGGATTACAGGCGTGAG-3ʹ), 1 µL de uniprimer2 (5ʹ-VIC-ATGGACAGTGAGATCTGTCCAT-BHQ1CGCACAGAGTAGTAAG-3ʹ) e 10 µL de NovoStart SYBR quantitative PCR SuperMix, em um volume final de reação de 20 µL. As amplificações dos telômeros foram detectadas usando corante SYBR green. Todas as PCRs foram realizadas em um Sistema 7500 Real-Time PCR. Mais informações foram encontradas no trabalho de Xiao.
Modelo Animal Intraocular Ortotópico
Um total de células 92.1 (2,5 × 10⁵ em 2,5 µL por injeção) foi inoculado no espaço sub-retiniano dos olhos direitos de camundongos fêmeas nuas de 8 semanas de idade no dia 0. Para preparar um trajeto de agulha, uma agulha 30G foi introduzida atrás do limbo para acessar a coroide, e a suspensão celular foi inoculada usando uma seringa microliter Hamilton através do trajeto da agulha. Nos dias 7, 14, 21 e 28, o grupo experimental recebeu 2,5 µL de hesperadina (10 mM) por injeção intravítrea, e o grupo controle recebeu um volume igual de solução salina. No dia 35, os camundongos foram eutanasiados de forma humanitária para enucleação ocular. O Comitê de Cuidado e Uso Animal da Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai aprovou o estudo.
Pequeno RNA Interferente (siRNA) e Transfecção
Duplexos de siRNA para silenciamento de AURKB foram sintetizados pela GenePharma (Suzhou, China). As células foram transfectadas com os siRNAs usando o reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Waltham, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências de si-AURKB-1 e -2 são UUGAUGACUUUGAGAUUGG e GGAGGAGGAUCUACUUGAUU.
Empacotamento de Lentivírus
As células 293 T foram mantidas em meio de cultura DMEM completo a uma concentração de 6.000.000 de células por placa e transfectadas usando o reagente Lipofectamine 2000 com 3 mg de pLVX-TERT, 3 mg de pMD2.D e 6 mg de PsPax. O meio foi substituído por 5 mL de meio fresco após 6 horas de incubação com as células 293T. Os sobrenadantes foram coletados 48 horas e 72 horas após a transfecção e, em seguida, misturados e filtrados através de um filtro de acetato de celulose de 0,45 µm (Sartorius, Göttingen, Alemanha). Os sobrenadantes virais foram ainda concentrados com Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 (Millipore) a 4°C e centrifugados a 5000 rpm por 30 minutos. As colônias foram selecionadas para cultura subsequente após incubação com 1 µg/mL de puromicina por 2 semanas.
Análises Estatísticas
A análise estatística foi conduzida usando o Software GraphPad 8.0.1. Os dados foram apresentados como média ± EPM ou DP. Além disso, a diferença significativa entre o grupo tratado e o controle foi testada pelo teste t de Student. Um valor de P menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
AURKB Indicou Sobrevida Ruim de Pacientes com UM
Para explorar o possível papel da AURKB no MU, primeiro classificamos as amostras de MU do TCGA em dois grupos de acordo com o nível de expressão do mRNA de AURKB e descobrimos que o grupo com alta AURKB apresentava maior taxa de morte e metástase (Fig. 1A). Para confirmar ainda mais o papel da AURKB no prognóstico do MU, consultamos o banco de dados GEPIA. A expressão de AURKB foi correlacionada negativamente com a sobrevida global e a sobrevida livre de doença dos pacientes com MU (Figs. 1B, 1C). As alterações no número de cópias somáticas (SCNA) foram recorrentes no MU, incluindo perdas em 1p, 6q, 8p e 16q; ganhos em 6p e 8q; e M3. O agrupamento não supervisionado de SCNA definiu quatro subtipos, com os agrupamentos 3 e 4 de SCNA apresentando mais eventos aneuploides associados à metástase. A análise integrada do TCGA indicou que os agrupamentos 3 e 4 de SCNA eram mais frequentes no grupo de alta AURKB (Fig. 1A). Além disso, a mutação inativadora do BAP1 também foi considerada um marcador importante de metástase do MU, sendo mais frequente em espécimes com maior expressão de AURKB (Fig. 1A). Por fim, realizamos a análise de vias da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto no TCGA e revelamos que os genes que compõem a assinatura do programa de telômeros, amplamente aceita por seu papel na iniciação e metástase do câncer, estavam altamente enriquecidos nas amostras de MU com maior nível de AURKB (Fig. 1A). Em conjunto, esses dados indicam que a AURKB pode desempenhar um papel fundamental na modulação da tumorigênese e metástase do MU.
AURKB indicou baixa sobrevida dos pacientes com MU. (A) A análise integrada do TCGA demonstrou que o agrupamento hierárquico alto de SCNA e a mutação do BAP1 foram mais frequentes em pacientes com maior expressão de AURKB, que eram suscetíveis a metástase e morte. A análise de vias da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) sugeriu que a assinatura do programa de telômeros estava enriquecida no subgrupo de alta AURKB. (B, C) A análise de sobrevida de Kaplan–Meier de acordo com o GEPIA sugeriu que a expressão de AURKB estava correlacionada negativamente com a sobrevida global (B) e a sobrevida livre de doença (C) dos pacientes com MU.
Células de MU foram sensíveis à inibição de AURKB
Realizamos o ensaio de sensibilidade a drogas de inibidores de AURKB em quatro linhagens celulares de UM (92.1, MEL290, OMM2.3 e XMP46) e uma linhagem celular de melanoma cutâneo (A375). O TAK-901, um inibidor de alvo duplo direcionado à AURKA e AURKB, apresentou a maior atividade antitumoral (Fig. 2B). O inibidor específico de AURKB, hesperadina, também mostrou uma baixa concentração inibitória média na maioria das linhagens celulares de UM, variando de 5 nM a 7 µM (Fig. 2A). O danusertibe, um potente inibidor pan-aurora quinase com a maior atividade contra AURKA, foi menos eficiente na inibição de células de UM do que TAK-901 e hesperadina (Fig. 2C). O inibidor específico de AURKA, inibidor de Aurora A I, apresentou a menor atividade tumoricida (Fig. 2D). Esses resultados demonstram que as células de UM são sensíveis a inibidores direcionados especificamente à AURKB, e não à AURKA/C. Para explicar melhor a resposta terapêutica variada em diferentes células, o nível basal da proteína AURKB foi detectado (Fig. Suplementar S1A). Como esperado, a sensibilidade das células de melanoma à hesperadina foi positivamente correlacionada com a expressão de AURKB. Além disso, detectamos a forma ativa de AURKB em células de UM expostas a quatro inibidores na mesma série de concentrações (Fig. Suplementar 1B). Hesperadina, TAK-901 e danusertibe diminuíram o nível proteico de fosfo-AURKBT232 em graus variados, basicamente em consonância com a sensibilidade ao fármaco. No entanto, nenhuma alteração significativa de fosfo-AURKBT232 foi detectada em células tratadas com inibidor de Aurora A I, embora as células de UM fossem moderadamente sensíveis a esse inibidor. Para evitar efeitos fora do alvo, siRNAs foram usados para nocautear especificamente AURKB (Fig. Suplementar S1C). Um ensaio CCK8 mostrou que o nocaute de AURKB inibiu severamente a proliferação de células de UM (Fig. Suplementar S1D), o que comprovou o papel oncogênico da AURKB em UM. Coletivamente, tanto as abordagens genéticas quanto as farmacológicas demonstraram o papel central da AURKB na carcinogênese de UM.
As células de UM foram sensíveis aos inibidores de AURKB. Quatro inibidores de aurora quinase, incluindo o inibidor específico de AURKB hesperadina (A), o inibidor de alvo duplo direcionado à AURKA/B TAK-901 (B), o inibidor pan-aurora quinase danusertibe (C) e o inibidor específico de AURKA inibidor de Aurora A I (D) foram examinados quanto à sua eficácia antitumoral em quatro linhagens celulares de UM (92.1, MEL290, OMM2.3 e XMP46) e uma linhagem celular de melanoma cutâneo A375. Os valores de concentração inibitória média (IC50) foram calculados usando o GraphPad Software 8.0.1.
Hesperadin Induziu Parada do Ciclo Celular e Apoptose em Células de UM
Para explorar mais o papel da AURKB no UM, escolhemos o inibidor específico de AURKB, hesperadina, para estudar o impacto no ciclo celular e na apoptose. Após o tratamento com hesperadina nas células 92.1, MEL290 e OMM2.3, as porcentagens de células na fase G2/M aumentaram significativamente. Correspondentemente, a porcentagem de células na fase G1 diminuiu (Figs. 3A, 3C). A coloração com Anexina V-FITC/PI mostrou que a hesperadina poderia induzir apoptose nas células 92.1, MEL290 e OMM2.3, com taxas de apoptose de aproximadamente 28,7, 24,9 e 11,29 (Figs. 3B, 3D). Esses resultados demonstram que a hesperadina pode inibir a propagação de células UM ao induzir parada do ciclo celular e apoptose.

Parada do ciclo celular e apoptose induzidos por hesperadina em células UM. (A) As células 92.1, MEL290 e OMM2.3 foram tratadas com 0 e 0,3 µM de hesperadina. Após 24 horas, as células foram coletadas e coradas com PI. Em seguida, a distribuição do ciclo celular foi medida por citometria de fluxo. (B) As células também foram coradas com Anexina V-FITC/PI e medidas por citometria de fluxo. As células vivas estavam localizadas no quadrante inferior esquerdo. (C) Quantificação das células na fase G2/M. (D) Quantificação de células apoptóticas iniciais e tardias localizadas nos quadrantes inferior e superior direito. A análise estatística foi realizada usando o GraphPad Software 8.0.1. Os dados foram apresentados como média ± DP. Além disso, a diferença significativa entre o tratado e o controle foi testada pelo teste t de Student. *P < 0,05; **P < 0,01.

Hesperadina Regulou Assinaturas Transcriptômicas Relacionadas à Replicação de DNA e Mitose

Para avaliar as mudanças transcriptômicas das células UM em resposta à hesperadina, tratamos 92.1 com 0,1 µM de hesperadina ou DMSO por 24 horas e, em seguida, realizamos sequenciamento de RNA em ambos os grupos em triplicata. O mapa de calor de todos os genes diferencialmente expressos (DEGs) com valor de P menor que 0,05 e |log2FC| maior que 1 foi mostrado na Figura 4A. Um total de 1967 DEGs regulados negativamente e 742 regulados positivamente foram identificados (Fig. 4B). Análises de enriquecimento funcional de vias de ontologia genética foram realizadas para interpretar o processo biológico, os componentes celulares e a função molecular dos transcritos, bem como a abundância relativa de transcritos. Os genes regulados negativamente devido à exposição à hesperadina foram enriquecidos para organização do cinetócoro, coesão das cromátides irmãs, regulação da replicação do DNA e transição do ciclo celular em termos de processo biológico, consistente com o papel da AURKB na regulação da mitose (Fig. 4C). Os transcritos regulados positivamente foram associados principalmente à montagem do nucleossomo e ao metabolismo do colesterol (Fig. 4D).
RNA-sequencing revelou que a hesperadina alterou o transcriptoma das células de UM. (A) Mapa de calor dos dados de RNA-sequencing realizados em células 92.1 tratadas com DMSO ou 0,1 µM de hesperadina por 24 horas. (B) Gráfico de vulcão dos dados de RNA-sequencing apresentou 1967 DEGs regulados negativamente e 742 DEGs regulados positivamente com valor de P menor que 0,05 e |log2FC| > 1. (C, D) Análises de enriquecimento funcional de vias de ontologia gênica (GO) foram realizadas para interpretar o processo biológico, componentes celulares e função molecular dos transcritos e abundância relativa de transcritos para DEGs regulados negativamente (C) e regulados positivamente (D). (E) Análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) dos DEGs quanto ao efeito da hesperadina na replicação do DNA. (F) GEPIA revelou que TOP2A e MCM6 estavam positivamente correlacionados com AURKB. (G) Análise GSEA dos DEGs quanto ao efeito da hesperadina na transição do ciclo celular. (H) GEPIA revelou que PLK4 e CENPE estavam positivamente correlacionados com AURKB.
A seguir, realizamos ainda a análise de enriquecimento de conjuntos gênicos dos DEGs. A análise de ontologia gênica no processo biológico revelou que os conjuntos gênicos de replicação do DNA e progressão do ciclo celular foram regulados negativamente devido ao tratamento com hesperadina (Figs. 4E, 4G). Dois genes bem conhecidos de regulação da replicação do DNA, TOP2A e MCM6, foram inibidos transcricionalmente, ambos apresentando alta intensidade de correlação com AURKB em termos de abundância de transcritos no banco de dados GEPIA (Fig. 4F). Passando para genes relacionados à transição do ciclo celular, PLK4 e CENPE, também estavam correlacionados com AURKB (Fig. 4H). Esses achados sugerem que a hesperadina suprime o crescimento do UM ao interferir na replicação do DNA e na mitose.
AURKB Regulou Positivamente a Transcrição de TERT ao Modular a Fosforilação e Metilação da Histona H3
Para investigar melhor o papel da AURKB no UM, realizamos uma análise de IHC dos tecidos de nossos pacientes. Os resultados mostraram que a expressão de AURKB foi maior em espécimes de câncer do que em olhos normais (Figs. 5A, 5B). A assinatura gênica de telômeros pode ser o efetor a jusante da AURKB, conforme mencionado anteriormente. A expressão de TERT foi consistentemente regulada negativamente pelo inibidor de AURKB, como evidenciado pelo nosso RNA-sequencing (Fig. 4B).
AURKB regulou a transcrição de TERT modulando a fosforilação e metilação da histona H3. (A) Coloração por IHC e (B) quantificação de H3S10ph e AURKB foram realizadas em tecidos coroidais de UM e paracancerosos. (C) A análise do GEPIA revelou uma correlação positiva entre a expressão de AURKB e TERT. (D) A análise de sobrevida de Kaplan–Meier baseada no GEPIA sugeriu que TERT estava negativamente correlacionada com a taxa de sobrevida global para pacientes com UM. (E) Análise de imunotransferência de H3S10ph e TERT em células 92.1 e OMM2.3 tratadas com concentrações crescentes de hesperadina. (F, G) Ensaios de ChIP foram conduzidos em células de UM tratadas com DMSO e hesperadina para detectar a alteração de H3S10ph e H3K9me2/3. (H) O comprimento relativo dos telômeros foi detectado usando RT-qPCR baseado em sonda fluorescente duplamente marcada. A diferença significativa entre o tratado e o controle foi testada pelo teste t de Student usando o GraphPad Software 8.0.1.
Para verificar que TERT era o efetor downstream de AURKB, tratamos 92.1 e OMM2.3 com hesperadina; a proteína TERT diminuiu drasticamente (Fig. 5E). Além disso, a expressão de TERT foi verificada como correlacionada com a de AURKB no TCGA (Fig. 5C). Ademais, a superexpressão de TERT foi significativamente correlacionada com baixa sobrevida livre de doença em pacientes com UM (Fig. 5D). Para verificar ainda mais o papel de TERT em um papel oncogênico dominado por AURKB no UM, testamos a sensibilidade ao fármaco em células 92.1 e OMM2.3 com superexpressão de TERT (Fig. Suplementar S2). Como esperado, TERT induziu quimiorresistência das células de UM à hesperadina. É bem conhecido que TERT é crítico na preservação da integridade telomérica. Consistentemente, a hesperadina encurtou efetivamente o comprimento dos telômeros de maneira dependente da concentração (Fig. 5F). Esses resultados demonstraram que a AURKB oncogênica funcionava na manutenção da integridade dos telômeros através da regulação positiva da expressão de TERT.
Os estados epigenéticos da histona H3 e a acessibilidade da cromatina estão envolvidos nas decisões do destino celular por meio da regulação da transcrição. A AURKB é uma quinase serina/treonina que induz a H3S10ph. Para explorar se a AURKB regulava seus genes-alvo de maneira dependente de modificação de histonas, primeiro detectamos os níveis de H3S10ph em nossos pacientes com UM por meio de análise de IHC. Como esperado, os níveis de H3S10ph estavam aumentados em espécimes de tumor em comparação com controles normais (Figs. 5A, 5B). A AURKB e a H3S10ph colocalizaram-se em certa medida, implicando uma possível interação espacial (Fig. 5A, ponto alaranjado no painel de fusão). Além disso, a análise de immunoblotting mostrou que a H3S10ph diminuiu significativamente, acompanhada por uma diminuição concomitante de TERT, após o tratamento com hesperadina (Fig. 5E). A H3S10ph foi relatada como suportando uma estrutura de cromatina aberta para aumentar a transcrição, expulsando o complexo metilase que catalisa H3K9me2/3. Para testar a hipótese de que a AURKB regulava transcriptionalmente o TERT alterando o status de fosforilação e metilação das histonas, detectamos a H3S10ph e a H3K9me2/3 do promotor de TERT usando um ensaio de ChIP. O tratamento com hesperadina inibiu significativamente a fosforilação de H3S10, acompanhado por di- e trimetilação acumulativa de H3K9 (Figs. 5G, 5H). Esses resultados demonstram que a AURKB mantém um quadro de cromatina aberta para aumentar a transcrição de TERT via fosforilação de H3S10 e desmetilação de H3K9 na região do promotor de TERT.
A Hesperadina Inibiu o Crescimento de Xenotransplante Ortotópico
Para avaliar a eficiência farmacológica da hesperadina in vivo, estabelecemos um modelo de xenotransplante ortotópico de UM. Nenhuma diferença significativa de peso foi observada entre o grupo controle e o experimental (dados não mostrados), indicando a segurança da hesperadina. Surpreendentemente, todos os cinco camundongos do grupo controle desenvolveram tumores ortotópicos. No entanto, a taxa de sobrevivência tumoral do grupo experimental foi de apenas 20% (1/5) (Figs. 6A, 6B). Os resultados da coloração HE revelaram que quatro dos cinco xenotransplantes no grupo controle romperam a esclera para formar tumores extraoculares, enquanto o único xenotransplante no grupo hesperadina foi estritamente restrito ao globo ocular (Fig. 6A). Este ensaio pré-clínico demonstrou a excelente eficiência antitumoral da hesperadina em UM. Para verificar ainda mais a via efetora da hesperadina em UM, realizamos coloração IHC de H3S10ph, TERT e Ki67 (Fig. 6C). O índice Ki67 diminuiu drasticamente com o tratamento com hesperadina, confirmando o papel antiproliferativo da hesperadina. Como esperado, a hesperadina in vivo impediu significativamente a deposição de H3S10ph e, consequentemente, impediu a transcrição de TERT. Os experimentos animais confirmaram que a hesperadina poderia inibir significativamente a ocorrência e o desenvolvimento de UM.
A hesperadina inibiu o crescimento de xenoenxertos ortotópicos. (A) Os globos oculares dos grupos DMSO e hesperadina foram enucleados para coloração HE. Asterisco, retina; ponta de seta, esclera. (B) Quantificação das áreas tumorais na secção tumoral máxima para ambos os grupos. (C) A coloração IHC de H3S10ph, TERT e Ki67 foi realizada em lâminas tumorais de ambos os grupos. Os painéis esquerdo e médio mostraram os resultados da coloração dos grupos tratados com DMSO e hesperadina. O painel direito apresentou as imagens de coloração da secção do globo ocular sem tumores do grupo tratado com hesperadina. A diferença significativa entre o grupo tratado e o controle foi testada pelo teste de Mann–Whitney usando o GraphPad Software 8.0.1. *P < 0,05; **P < 0,01.

Discussão
A amplificação ou superexpressão de AURKB foi relatada em leucemia e na maioria dos tumores sólidos. Além disso, a expressão de AURKB potencializou a resistência a medicamentos em glioblastoma e câncer de pulmão. Mais interessante ainda, AURKB desempenhou um papel motor na facilitação da transformação de epitélios murinos em tumor mamário, induzindo poliploidia e consequente instabilidade genômica. No entanto, o papel de AURKB no UM permanece elusivo. Uma análise de sobrevida de Kaplan–Meier baseada no TCGA mostrou que a maior expressão de AURKB estava associada a uma menor probabilidade de sobrevida global e livre de doença, indicando um prognóstico ruim para pacientes com UM. A coloração IHC adicional de amostras de nossos próprios pacientes demonstrou que AURKB estava superexpressa de forma aberrante em pacientes com UM. Esses achados indicaram que AURKB poderia ser um alvo terapêutico para o UM.

A depleção de AURKB mostrou-se benéfica na diminuição da progressão tumoral e na ressensibilização de células cancerígenas à quimioterapia e terapia-alvo. Assim, vários inibidores de pequenas moléculas direcionados a AURKB foram desenvolvidos. Inibidores altamente seletivos para AURKB, incluindo hesperadina e barasertibe, inibiram significativamente a proliferação de células cancerígenas humanas de mama, próstata, pulmão, cólon e sangue in vitro e in vivo. Além de estudos pré-clínicos, esses inibidores também alcançaram benefícios terapêuticos em certos tumores sólidos e leucemia em diferentes fases de ensaios clínicos. O ensaio de sensibilidade a medicamentos demonstrou que as linhagens celulares de UM eram proeminentemente sensíveis ao inibidor específico de AURKB, hesperadina, bem como aos inibidores pan-Aurora quinase, danusertibe e TAK-901. No entanto, o inibidor de Aurora A I, altamente seletivo para AURKA, exibiu atividade antitumoral muito mais fraca do que os inibidores direcionados a AURKB, sugerindo que AURKB, e não AURKA, levou à tumorigênese do UM. O ensaio de knockdown genético verificou ainda o papel oncogênico de AURKB no desenvolvimento do UM. Consistente com os resultados in vitro, a hesperadina impediu significativamente a propagação de células cancerígenas nos globos oculares. Curiosamente, a hesperadina desempenhou um papel inesperado na restrição da invasão do UM, sugerindo seu papel potencial na prevenção de metástases. Experimentos adicionais relacionados à metástase in vitro e in vivo são necessários para testar essa possibilidade.
Como um dos condutores mitóticos clássicos, a AURKB garante a distribuição fiel dos cromossomos nas células-filhas. A anormalidade da AURKB levou à divisão celular aberrante e à aneuploidia/poliploidia, resultando subsequentemente em transformação tumorigênica. Wang et al. descreveram uma interação antagônica entre AURKB e BRCA1/2, na qual eles encorajaram a progressão tumoral através da regulação do ciclo celular, tetraploidia cromossômica e citocinese de maneira dependente de p53. Em consonância com estudos anteriores, o tratamento com hesperadina desencadeou uma parada acentuada no ciclo celular em G2/M e apoptose em células de UM. Outro papel evolutivamente conservado da AURKB foi remover a torção nas forquilhas de replicação e reiniciar a duplicação do DNA durante a interfase, o que foi desencadeado pela via ATM/ATR-CHK1/2 em resposta a danos no DNA. Nossa análise de sequenciamento de RNA mostrou que a hesperadina prejudicou significativamente a autoduplicação do genoma e interrompeu a progressão do ciclo celular das células de UM. Além disso, TOP2A e MCM6, conhecidas por seus papéis na liberação de torção e ativação da forquilha de replicação, foram inibidas transcricionalmente pelo tratamento com hesperadina. A hesperadina também diminuiu notavelmente a expressão de PLK4 e CENPE, garantindo a transição normal do ciclo celular ao regular a duplicação de centríolos e a segregação cromossômica. Notavelmente, a expressão desses genes essenciais estava bem correlacionada com a da AURKB em pacientes com UM. Essas descobertas confirmaram que a inibição da AURKB inibiu a tumorigênese do UM ao interferir na duplicação da cromatina e nos processos do ciclo celular.

Intrigantemente, a análise de via funcional do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes do TCGA revelou que conjuntos de genes de telômeros, amplamente aceitos por seus papéis na iniciação do câncer e regulação de metástases, muito provavelmente participaram da oncogênese e da progressão do UM sob o controle da AURKB. A AURKB foi encontrada localizada nas extremidades dos cromossomos e desempenhou um papel de faca de dois gumes na integridade estrutural dos telômeros ao interagir com proteínas protetoras ou destrutivas. É bem sabido que a TERT catalisa a adição de sequências repetitivas TTAGGG às extremidades dos cromossomos para manter a estabilidade genômica. Mutações no promotor de TERT, que causam aumento da expressão de TERT, são detectáveis em 32% a 43% dos melanomas conjuntivais primários e 30% dos melanomas cutâneos primários, correlacionando-se com doenças metastáticas e menor sobrevida. No entanto, mutações no promotor de TERT ocorrem com frequência extremamente baixa no UM. Literatura limitada relatou que TERT era altamente expresso no UM e contribuía para a stemness do UM. Além disso, TERT poderia regular o microambiente tumoral ao facilitar a angiogênese tumoral, moldar o ambiente inflamatório e imunossupressor, bem como ativar os fibroblastos associados ao câncer. Em nosso estudo, o tratamento com hesperadina reduziu o nível da proteína TERT e encurtou o comprimento dos telômeros das células de UM, provando eventos teloméricos como efetores da AURKB.
Os mecanismos subjacentes à regulação da função molecular pela AURKB eram sofisticados, envolvendo pelo menos a estabilidade proteica e a remodelação da cromatina. Foi relatado que a AURKB modula a acessibilidade da cromatina ao fosforilar diretamente a histona H3 na serina 10 de maneira dependente do ciclo celular. A histona fosforilada ainda expulsou a agregação do complexo metilase e impediu a consequente deposição transrepressiva de H3K9me2/3. A análise IHC dos tecidos de nossos pacientes com UM mostrou colocalização de AURKB e H3S10ph, indicando a possível interação. Outro ensaio de ChIP demonstrou que a hesperadina restringiu substancialmente a deposição de H3S10ph no promotor do TERT, dando oportunidade às histonas metilases transrepressivas. O status de H3K9me2/3 na região promotora do TERT após o tratamento com hesperadina condensou a cromatina e consequentemente fechou a porta para o complexo de transcrição específico do TERT (Fig. 7). No entanto, mais pesquisas são necessárias para identificar as correspondentes histonas H3 quinases e metilases no UM, o que pode dar pistas para novos alvos terapêuticos. Coletivamente, todos esses achados sugerem que a superexpressão de AURKB desempenhou um papel essencial na tumorigênese do UM. Inibidores de pequenas moléculas direcionados à AURKB podem ser implicados como potenciais candidatos antitumorais clínicos.

Um diagrama esquemático deste estudo mostrando o mecanismo subjacente ao efeito supressor da hesperadina no UM. A AURKB expulsa a histona metiltransferase (MET) e então fosforila a histona H3 na serina 10 no promotor do TERT. O promotor fosforilado recruta o complexo da RNA polimerase para promover a transcrição do TERT. A hesperadina inibiu a atividade enzimática da AURKB, dando oportunidade à histona metiltransferase para metilar a histona H3 na lisina 9. O corpo gênico metilado fechou a acessibilidade ao complexo da RNA polimerase e inibiu a transcrição do TERT, levando à apoptose do UM.

Material Suplementar

Referências

Melanoma uveal
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