pmid: "38933758"
title: "Estimulação cerebral profunda por ultrassom desacelera o encurtamento dos telômeros na doença de Alzheimer e em camundongos envelhecidos."
authors: "Zhang Y, Pang N, Huang X, Meng W, Meng L, Zhang B, Jiang Z, Zhang J, Yi Z, Luo Z, Wang Z, Niu L"
journal: "Fundamental research"
pubdate: "2023 May"
doi: "10.1016/j.fmre.2022.02.010"
source: "PMC Full Text"

Estimulação cerebral profunda por ultrassom desacelera o encurtamento dos telômeros na doença de Alzheimer e em camundongos envelhecidos.

Autores

Zhang Y, Pang N, Huang X, Meng W, Meng L, Zhang B, Jiang Z, Zhang J, Yi Z, Luo Z, Wang Z, Niu L

Periodico

Fundamental research (2023 May)

Conteudo

Estimulação ultrassônica profunda do cérebro desacelera o encurtamento dos telômeros em camundongos com doença de Alzheimer e envelhecimento
O comprimento dos telômeros é um biomarcador confiável para previsão de saúde e longevidade tanto em humanos quanto em animais. As técnicas comuns de neuromodulação, incluindo estimulação cerebral profunda (DBS) e optogenética, possuem excelente resolução espacial e penetração em profundidade, mas exigem a implementação de eletrodos ou fibras ópticas. Portanto, é importante desenvolver métodos para modulação não invasiva do comprimento dos telômeros. Neste estudo, relatamos um novo método para desacelerar o encurtamento dos telômeros utilizando estimulação ultrassônica profunda do cérebro (UDBS) não invasiva. Primeiramente, descobrimos que a UDBS podia ativar as proteínas associadas à telomerase em camundongos normais. Em seguida, em camundongos com doença de Alzheimer, observou-se que a UDBS desacelerava o encurtamento dos telômeros do córtex e do tecido miocárdico e melhorava efetivamente as habilidades de aprendizado espacial e memória. Da mesma forma, constatou-se que a UDBS retardava significativamente o encurtamento dos telômeros do córtex e do sangue periférico, além de melhorar as funções motoras e cognitivas em camundongos envelhecidos. Por fim, a análise do transcriptoma revelou que a UDBS regulava positivamente a via de interação ligante-receptor neuroativo. No geral, os presentes achados estabeleceram o papel crítico da UDBS no retardo do encurtamento dos telômeros e indicaram que a modulação ultrassônica do comprimento dos telômeros pode constituir uma estratégia terapêutica eficaz para o envelhecimento e doenças relacionadas ao envelhecimento.
Resumo gráfico
Introdução
Os telômeros são estruturas repetitivas de DNA nas extremidades dos cromossomos lineares que impedem a união ponta a ponta e outras anormalidades citogenéticas. Há evidências crescentes de que a homeostase do comprimento dos telômeros é essencial para a função celular e o envelhecimento do organismo. Com a idade, ocorre encurtamento dos telômeros no sangue, rins, intestinos, coração e cérebro, e estudos recentes indicaram que o encurtamento dos telômeros é um fator de risco para doenças relacionadas à idade, como neurodegeneração e câncer. Portanto, a modulação do comprimento dos telômeros pode ajudar a prevenir o envelhecimento e doenças relacionadas à idade.
A tecnologia de neuromodulação facilita o tratamento eficaz de doenças neurodegenerativas. Em particular, a estimulação cerebral profunda (ECP) e a estimulação magnética transcraniana repetitiva (EMTr) são amplamente utilizadas no tratamento da doença de Parkinson (DP) e da doença de Alzheimer (DA). No entanto, a ECP é um método invasivo que requer cirurgia, e a EMTr possui resolução espacial e profundidade de penetração limitadas. Recentemente, a estimulação cerebral profunda por ultrassom (ECPU) surgiu como um método não invasivo com alta resolução espacial e penetração profunda. A eficácia e a segurança da neuromodulação por ultrassom foram confirmadas em fatias cerebrais, roedores, macacos e humanos. Em nossos estudos anteriores, descobriu-se que a ECPU tem efeitos neuroprotetores contra o envelhecimento, a epilepsia e a DP. Em particular, Pang et al. relataram melhora no movimento e no aprendizado em camundongos idosos após ECPU do hipotálamo. Nosso grupo de pesquisa também descobriu que a ECPU pode suprimir picos epilépticos e reduzir convulsões em camundongos, macacos e pacientes epilépticos (conforme indicado por fatias cerebrais). Além disso, Zhou et al. mostraram que a ECPU tem um efeito neuroprotetor em camundongos com DP. No entanto, o mecanismo pelo qual a ECPU impacta as doenças neurodegenerativas permanece incerto. Nossa hipótese é que a ECPU pode modular o comprimento dos telômeros, melhorando assim os sintomas de doenças relacionadas ao envelhecimento. A elucidação desse mecanismo pode fornecer novas evidências para a eficácia terapêutica da ECPU em doenças neurodegenerativas.

Com base na hipótese acima, neste estudo, entregamos energia de ultrassom através do crânio para estimular o córtex e o hipocampo em camundongos com DA e envelhecimento. Consequentemente, relatamos pela primeira vez que a ECPU desacelera efetivamente o encurtamento dos telômeros em múltiplos órgãos e melhora a capacidade cognitiva em camundongos com envelhecimento e DA. Essas descobertas são solidamente apoiadas pela análise transcriptômica, que revela um mecanismo potencial para a modulação do comprimento dos telômeros; ou seja, descobriu-se que a ECPU regula positivamente a via de interação neuroativo ligante-receptor. No geral, o presente estudo demonstra o efeito protetor da ECPU a partir de uma perspectiva única e sugere que esta tecnologia não invasiva e não farmacológica tem potencial terapêutico para o envelhecimento e doenças relacionadas ao envelhecimento.

Materiais e métodos
Preparação dos animais
Vinte camundongos com proteína precursora de amiloide/presenilina 1 (APP/PS1) (todos machos, 6 meses de idade) foram adquiridos do Centro de Animais de Laboratório Médico de Guangdong. Seis camundongos normais (C57BL/6, todos machos, 8 semanas de idade) e vinte camundongos idosos (C57BL/6, todas fêmeas, 18 meses de idade) foram adquiridos do Centro de Animais da Universidade de Xiamen. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de Uso e Comitê de Ética dos Institutos de Tecnologia Avançada de Shenzhen, Academia Chinesa de Ciências.
Desenho experimental
O estudo consistiu nos três experimentos a seguir.
Experimento 1: Seis camundongos normais foram randomizados nos grupos sham (n = 3) e UDBS (n = 3). Os camundongos foram tratados por 14 dias (30 min/dia) e depois sacrificados para western blotting da telomerase.
Experimento 2: Vinte camundongos APP/PS1 foram randomizados nos grupos sham (n = 10) e UDBS (n = 10). Conforme mostrado na Fig. 3a, a UDBS foi administrada aos camundongos por 66 dias. Após a estimulação, os camundongos foram submetidos aos testes do labirinto aquático de Morris (MWM) e aos testes de condicionamento ao medo. Eles foram sacrificados para avaliação do comprimento dos telômeros no Dia 100.
Experimento 3: Vinte camundongos envelhecidos foram randomizados nos grupos sham (n = 10) e UDBS (n = 10). Os camundongos envelhecidos foram tratados por 49 dias (Fig. 4a). Fezes foram coletadas nos Dias 0, 33 e 50 para avaliar alterações da flora intestinal. Testes de campo aberto, rotarod e MWM foram realizados. Os camundongos foram então sacrificados para avaliação do comprimento dos telômeros, imunofluorescência e transcriptômica.
Sistema de estimulação ultrassônica
A UDBS (gerador de forma de onda arbitrária: 3102C, Tektronix, Texas, EUA; amplificador de potência: 325LA, Electronics & Innovation Ltd, Nova York, EUA; transdutor focalizado: NdtXducer, Northborough, EUA) foi administrada no hipocampo e córtex dos camundongos. Para o grupo sham, todos os procedimentos experimentais foram administrados, sem ativação da fonte de alimentação.
Estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de software SPSS. Os dados foram expressos como média ± valores de EPM, para um número n de espécimes analisados. Para comparar os resultados dos dois grupos, foi realizado um teste t de amostras independentes.
Resultados
Sistema UDBS
A estimulação ultrassônica profunda do cérebro (UDBS) modula o comprimento dos telômeros. (a) Esquema do alívio da UDBS no encurtamento dos telômeros em camundongos envelhecidos e com doença de Alzheimer (DA). (b) Distribuições de pressão acústica lateral e axial. (c) A sequência temporal da UDBS.
Fig 1
A Fig. 1 mostra uma visão geral do sistema UDBS e ilustrações esquemáticas da modulação do comprimento dos telômeros via UDBS. Conforme mostrado na Fig. 1a, a UDBS aliviou o encurtamento dos telômeros em camundongos envelhecidos e com DA. A Fig. 1b mostra as distribuições de pressão acústica lateral e axial. O tamanho do ponto focal foi de aproximadamente 2 × 2 × 10 mm³. A Fig. 1c exibe os parâmetros da UDBS: frequência fundamental de 500 kHz, frequência de repetição de pulso de 500 Hz, ciclo de trabalho de 5%, duração da sonicação de 1 s, intervalo interestímulo de 1 s e pressão acústica de 0,34 MPa.
A UDBS aumenta a expressão de proteínas associadas à telomerase em camundongos normais
Análises de western blotting do nível proteico de WRAP53 e TERT no córtex de camundongos normais após UDBS. (a) Cronograma experimental para camundongos de 8 semanas de idade. (b) A UDBS aumentou a expressão de WRAP53 e TERT no córtex de camundongos normais. Os dados mostrados representam a média ± valores de EPM para o n indicado. *p < 0,05, **p < 0,01, a partir do teste t de amostras independentes.
Fig 2
A homeostase do comprimento dos telômeros é essencial para a função celular e o envelhecimento do organismo. Enquanto isso, o comprimento dos telômeros é mantido pela telomerase, e o RNA codificador de WD40 antissenso a P53 (WRAP53) e a transcriptase reversa da telomerase (TERT) representam a atividade da telomerase. Aqui, investigamos se o UDBS pode modular as proteínas associadas à telomerase. Após 14 dias de UDBS, a análise de western blotting foi realizada para amostras corticais. Os resultados indicaram que o UDBS aumentou significativamente a expressão de WRAP53 e TERT (WRAP53: sham: 0.27 ± 0.06, UDBS: 0.83 ± 0.15, p < 0.05, n = 3 para cada grupo; TERT: sham: 0.49 ± 0.02, UDBS: 0.92 ± 0.08, p < 0.01, n = 3 para cada grupo; Fig. 2). Os resultados demonstraram que o UDBS poderia ativar a telomerase, sugerindo que o UDBS poderia ser usado para modular o comprimento dos telômeros.
UDBS melhora a capacidade cognitiva e desacelera o encurtamento dos telômeros em camundongos com doença de Alzheimer (DA)
UDBS desacelera o encurtamento dos telômeros e melhora as habilidades de aprendizado espacial e memória em camundongos com DA. (a) Cronograma experimental para camundongos de 6 meses de idade com proteína precursora amiloide/presenilina 1 (APP/PS1). (b) Teste do MWM. O UDBS aumentou o tempo na zona alvo. (c) No teste de condicionamento ao medo, o UDBS aumentou a porcentagem de congelamento no Dia 3. (d) Alteração no comprimento dos telômeros do córtex e miocárdio após UDBS. Os dados apresentados representam a média ± EPM para o n indicado. *p < 0.05, ****p < 0.0001, do teste t de amostras independentes.
Fig 3
A Fig. 3 mostra o efeito do UDBS no comprimento dos telômeros no modelo de camundongos com DA. O cronograma do experimento é mostrado na Fig. 3a. O UDBS foi realizado por 30 min/dia durante dois meses. Os testes do MWM e de condicionamento ao medo foram então realizados para avaliar o efeito do UDBS na função cognitiva de camundongos com DA. Conforme mostrado na Fig. 3b, o UDBS aumentou o tempo na zona alvo durante o teste da tarefa do MWM (sham: 26.02 ± 2.79%, n = 10, UDBS: 35.41 ± 3.43%, n = 9, p < 0.05). Além disso, o UDBS melhorou a latência da primeira entrada no alvo e a velocidade média. No teste de condicionamento ao medo (Fig. S1), as porcentagens de congelamento dos camundongos dos grupos UDBS e sham aumentaram com o tempo de treinamento no Dia 1. No Dia 3, no entanto, o grupo UDBS apresentou uma porcentagem de congelamento maior do que o grupo sham (sham: 26.10 ± 4.19%, UDBS: 40.47 ± 7.12%, p = 0.099, n = 10 para cada grupo; Fig. 3c).
Com base na melhora comportamental observada, investigamos ainda o efeito do UDBS no comprimento dos telômeros e descobrimos que o UDBS desacelerou significativamente o encurtamento dos telômeros nos tecidos corticais em comparação com o grupo sham (sham: 0.95 ± 0.07 razão telômero/gene de cópia única (T/S), UDBS: 2.59 ± 0.20 razão T/S, p < 0.0001, n = 6 para cada grupo). Importante, o comprimento dos telômeros para o tecido miocárdico no grupo UDBS foi visivelmente maior do que no grupo sham (sham: 0.77 ± 0.07 razão T/S, UDBS: 1.91 ± 0.05 razão T/S, p < 0.0001, n = 6 para cada grupo; Fig. 3d).
UDBS melhora a capacidade motora e cognitiva e desacelera o encurtamento dos telômeros em camundongos envelhecidos
UDBS alivia significativamente o encurtamento dos telômeros e melhora tanto as funções motoras quanto cognitivas em camundongos envelhecidos. (a) Cronograma experimental para camundongos envelhecidos de 18 meses. (b) No teste de campo aberto, o UDBS aumentou significativamente a distância total. (c) O UDBS aumentou proeminentemente a latência para queda no teste do rotarod. (d) No teste do MWM, o UDBS diminuiu significativamente a latência da primeira entrada no alvo. (e) A alteração do comprimento dos telômeros tanto do córtex quanto do sangue pelo UDBS. (f) O UDBS reduziu observavelmente o número de células senescentes sob coloração de β-galactosidase. Barra de escala: 200 μm. Os dados mostrados representam a média ± SEM para o n indicado. *p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001, a partir do teste t de amostras independentes.

Fig 4

A viabilidade do comprimento dos telômeros modulado pelo UDBS foi verificada adicionalmente em camundongos envelhecidos. Primeiro, avaliamos a função motora pós-UDBS. No teste de campo aberto, um aumento significativo na distância total foi observado para o grupo tratado com UDBS em comparação ao grupo sham (sham: 3925,12 ± 132,01 cm, n = 9, UDBS: 4961,64 ± 303,86 cm, n = 10, p < 0,01). Não houve diferença significativa na distância e no tempo na zona central entre os dois grupos (p > 0,05), conforme mostrado na Fig. 4b. Para o teste do rotarod, os camundongos do grupo UDBS permaneceram na plataforma rotatória com movimento acelerado por períodos mais longos (sham: 31,56 ± 4,41 s, n = 9, UDBS: 54,75 ± 5,95 s, n = 10, p < 0,01; Fig. 4c).

Em seguida, a função cognitiva pós-UDBS foi avaliada utilizando o teste do MWM. A Fig. 4d mostra os resultados do treinamento da tarefa do MWM, que indicaram que o UDBS melhorou a capacidade de aprendizado dos camundongos envelhecidos. Durante a tarefa de teste de sonda do MWM, a latência da primeira entrada no alvo para o grupo UDBS foi significativamente menor do que para o grupo sham (sham: 42,55 ± 7,07 s, n = 8, UDBS: 20,8 ± 5,77 s, n = 10, p < 0,05). Além disso, o tempo na zona alvo e a velocidade média foram maiores para o grupo UDBS (tempo na zona alvo: sham: 22,62 ± 2,38%, n = 8, UDBS: 23,39 ± 1,54%, n = 10; velocidade média: sham: 13,39 ± 0,60 cm/s, n = 8, UDBS: 14,82 ± 0,44 cm/s, n = 10).
Importante, o tratamento com UDBS afetou significativamente o comprimento dos telômeros neste experimento, conforme mostrado na Fig. 4e. Em detalhes, o UDBS desacelerou significativamente o encurtamento dos telômeros nos córtices dos camundongos envelhecidos (sham: 1,01 ± 0,12 razão T/S, n = 6, UDBS: 1,51 ± 0,13 razão T/S, n = 7, p < 0,05). Mais notavelmente, o encurtamento dos telômeros no sangue periférico foi visivelmente aliviado no grupo UDBS (sham: 0,64 ± 0,10 razão T/S, n = 6, UDBS: 1,13 ± 0,11 razão T/S, n = 7, p < 0,01). No entanto, nenhuma diferença estatística no comprimento dos telômeros no miocárdio foi observada entre os grupos sham e UDBS (sham: 0,76 ± 0,09 razão T/S, n = 9, UDBS: 0,80 ± 0,07 razão T/S, n = 10). Além disso, a coloração de β-galactosidase das secções corticais indicou que o UDBS reduziu significativamente a proporção de células senescentes no córtex (sham: 31,67 ± 3,48 células/mm², UDBS: 13,11 ± 0,73 células/mm², p < 0,0001, n = 9 para cada grupo), conforme mostrado na Fig. 4f.
O UDBS ativa neurônios do córtex e hipocampo em camundongos envelhecidos
O UDBS induz a expressão de c-Fos nos córtices e hipocampos de camundongos envelhecidos. Imagens representativas da proteína c-Fos no (a) córtex e (b) hipocampo após UDBS. Barra de escala: esquerda = 200 μm, direita = 50 μm. Os dados apresentados representam a média ± EPM para o n indicado. ****p < 0,0001, teste t para amostras independentes.
Fig 5
A proteína c-Fos é um marcador de ativação neuronal e foi utilizada para visualizar os efeitos do UDBS na atividade cerebral neste estudo. A estimulação por ultrassom foi novamente realizada nos camundongos envelhecidos no Dia 65. Os tecidos cerebrais foram obtidos no Dia 66 para coloração de c-Fos, com as secções cerebrais sendo coradas fluorescentemente com um anticorpo anti-c-Fos. Os resultados da análise imunofluorescente indicaram que o UDBS elevou significativamente a expressão de c-Fos no córtex (sham: 27,44 ± 2,52 células/mm², UDBS: 84,89 ± 3,18 células/mm², p < 0,0001, n = 9 para cada grupo; Fig. 5a) e no hipocampo (sham: 2,33 ± 0,29 células/mm², UDBS: 7 ± 0,71 células/mm², p < 0,0001, n = 9 para cada grupo; Fig. 5b). Esses resultados confirmaram o efeito do UDBS nos neurônios dos córtices e hipocampos de camundongos com envelhecimento normal.
O UDBS afeta a expressão de proteínas corticais em camundongos envelhecidos
A neurodegeneração está intimamente relacionada aos níveis de expressão da proteína precursora amiloide (APP), Tau, beta-amiloide (Aβ), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e densidade pós-sináptica-95 (PSD-95). Aqui, investigamos se o UDBS altera esses níveis de expressão. Após o tratamento com UDBS, a análise de western blotting foi realizada para amostras corticais adquiridas. Os resultados indicaram que os níveis de expressão de BDNF e PSD-95 do grupo UDBS foram estatisticamente maiores do que os do grupo sham. Para APP, Aβ e Tau, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos sham e UDBS. No entanto, o nível de Tau fosforilada (p-Tau) diminuiu drasticamente para o grupo UDBS (Fig. S2).
O UDBS modula a função sináptica em camundongos envelhecidos
Análise do transcriptoma do tecido cortical modulado por UDBS em camundongos envelhecidos. (a) Gráfico de vulcão mostrando genes diferencialmente expressos (DEGs) identificados no grupo UDBS em comparação com o grupo sham no córtex cerebral. Os limites de significância foram definidos como p < 0,05, |log2 FC| > 0,25. (b) Mapa de bolhas da análise de enriquecimento de vias da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) de 785 genes regulados diferencialmente identificados nos grupos UDBS e sham. (c) Análise da construção da rede PPI e módulos genéticos significativos, incluindo os módulos do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neuropeptídeo Y (NPY) e angiotensinogênio (AGT). (d) Mapa de calor dos DEGs. (e) Gráfico de barras flash dos genes upregulated. (f) Gráfico de barras flash dos genes downregulated.
Fig 6
Para compreender melhor o mecanismo molecular do aprimoramento da memória e do comportamento social modulado pelo UDBS, obtivemos perfis de transcriptoma usando sequenciamento de RNA (RNA-seq.). Realizamos a análise comparativa do transcriptoma dos córtices de camundongos envelhecidos usando a sequência de poliA-RNA. Aqui, foi empregado o Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), uma ferramenta baseada na web que recebe uma lista de genes como entrada e retorna uma lista de características ou vias da Gene Ontology (GO). Após o sequenciamento, os genes diferencialmente expressos (DEGs) entre os dois grupos foram analisados posteriormente (p < 0,05; |log2 FC| > 0,25, onde FC é a mudança de expressão). Um total de 785 DEGs foram identificados (Fig. 6a). As vias foram analisadas usando o banco de dados Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), e os resultados indicaram enriquecimento dos DEGs em 16 vias de sinalização (p < 0,05), incluindo a interação receptor-ligante neuroativo, a via de sinalização do cálcio, a via de sinalização da proteína quinase G do monofosfato de guanosina cíclico (cGMP-PKG), a via de sinalização do monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), a sinapse serotoninérgica, a sinapse gabaérgica (ácido gama-aminobutírico, GABA) e a secreção de insulina (Fig. 6b).
Um total de 23 genes estavam envolvidos nas interações receptor-ligante neuroativo, e 15 genes estavam envolvidos na transmissão sináptica. Oito genes estavam envolvidos na sinapse GABAérgica, dos quais seis (Gabre, Adcy4, Gad2, Cacna1c, Hap1, Gabrq) estavam significativamente upregulated nos camundongos UDBS. Também foi observada a downregulation de Gabra3 e Gabra1. Esses resultados demonstram que o UDBS altera a sinalização GABAérgica. Além disso, nove genes envolvidos na sinapse serotoninérgica foram significativamente modulados no grupo UDBS; as expressões de dois (Kcnj9 e Alox12b) foram diminuídas e as de sete (Ddc, Nras, Htr7, Slc18a2, Htr4, Cacna1c e Htr2c) foram aumentadas. Adicionalmente, a expressão gênica de Slc6a4, Htr2a, Htr2c, Htr4, Htr7, Htr5b e Slc18a2 foi aumentada nos camundongos UDBS. Esses resultados demonstram que o UDBS pode modular a função sináptica para melhorar a memória, a cognição e o comportamento social.
Interações proteína-proteína entre genes de valor prognóstico
A ferramenta de busca empregada foi a ferramenta de Recuperação de Genes/Proteínas Interagentes (STRING) utilizada para analisar as redes de interação proteína-proteína (IPP) entre os DEGs identificados. A rede foi composta por três módulos contendo 64 nós e 284 arestas (k-core = 6). Para conveniência de descrição, nomeamos esses módulos como BDNF, neuropeptídeo Y (NPY) e angiotensinogênio (AGT), respectivamente. No módulo BDNF (Fig. 6c), 44 arestas com 15 nós foram formadas na rede. Os nós notáveis foram Adrb1, Adcy4, Htr4, Asb4, Rnf213 e Tshr, que tiveram mais conexões com outros membros do módulo. No módulo NPY, Npy2r, Oprm1, Htr2c, Avp, Chrm5, Trhr, Gnrh1 e Rxfp3 apresentaram maiores valores de grau (Fig. 6c). Para o módulo AGT, Vcan, Thbs1, Igfbp5, Cybb e Nras ocuparam o centro do módulo, que são genes críticos para a resposta imune (Fig. 6c).
Resultados da modulação do UDBS na sinalização GABAérgica, sinapse Colinérgica, Serotoninérgica e genes de interação receptor-ligante neuroativo.
Tabela 1
Sham UDBS Regulação valor-p | FC| Atf2 6.6±1.2 9.1±1.6 up 0.013 0.457 AvPR1A 0.2±0.2 0.5±0.1 up 0.009 1.4586 Bdnf 1.3±0.3 2.4±0.5 up 0.001 0.901 C3AR1 0.8±0.1 1.1±0.2 up 0.003 0.514 Chrm5 0.3±0.2 0.6±0.3 up 0.041 1.176 Ddc 1.7±0.4 3.1±1.1 up 0.011 0.897 EDNRB 3.5±0.6 5.0±0.8 up 0.004 0.525 GRIK2 4.5±0.7 5.8±0.9 up 0.015 0.378 Htr7 1.0±0.2 2.3±0.8 up 0.002 1.252 LHCGR 0.1±0.0 0.1±0.1 up 0.031 1.122 Ngfr 1.7±1.2 4.3±1.0 up 0.002 1.319 NPY2R 1.9±0.9 3.6±0.8 up 0.007 0.940 Nras 2.1±0.1 4.6±2.6 up 0.037 1.155 Oprm1 0.1±0.0 0.2±0.0 up 0.004 0.756 Prlr 0.0±0.0 0.1±0.0 up <0.001 1.730 RXFP3 0.5±0.1 0.7±0.2 up 0.032 0.517 Trhr 0.4±0.1 0.9±0.5 up 0.032 1.238 Tshr 0.1±0.0 0.2±0.1 up 0.026 0.755 usp46 4.6±0.7 15.9±1.4 up <0.001 1.779 Abhd17a 35.6±2.6 28.8±2.7 down 0.001 0.305 Adora1 27.9±5.2 20.5±0.6 down 0.006 0.445 Adra1b 4.4±1.1 2.8±0.8 down 0.017 0.651 Adrb1 5.5±0.8 4.2±0.5 down 0.006 0.397 Alox12b 1.9±0.6 1.2±0.3 down 0.027 0.668 Chrm3 8.9±2.0 6.3±1.6 down 0.033 0.503 DRD3 3.3±0.3 2.2±0.7 down 0.007 0.563 Gabra1 44.9±7.6 34.6±3.4 down 0.013 0.376 Gabra3 43.1±5.4 33.8±4.1 down 0.007 0.351 Kcnj9 38.5±9.1 28.4±4.8 down 0.036 0.440 Lhx2 7.9±0.8 6.2±0.6 down 0.002 0.349 Mef2c 18.7±3.5 9.3±4.2 down 0.002 1.009 Nob1 6.7±0.5 5.4±0.5 down 0.001 0.312 Phyhip 187.1±16.0 155.4±4.7 down 0.001 0.268 Plag1 0.5±0.1 0.3±0.1 down 0.003 0.541 Pld3 125.6±6.2 104.4±9.9 down 0.001 0.267 tph2 0.2±0.1 0.1±0.0 down 0.021 0.796 Wnt9a 4.6±1.1 2.9±0.6 down 0.008 0.661
De acordo com os critérios de corte, selecionamos os 37 principais genes significativamente regulados positivamente e negativamente (Tabela 1 e Fig. 6d) e realizamos a análise de enriquecimento funcional. Os termos de enriquecimento funcional dos DEGs regulados positivamente estavam principalmente associados à transdução de sinal, regulação positiva da concentração de íons cálcio citosólico e/ou atividade de receptor acoplado à proteína G (Fig. 6e). Os DEGs regulados negativamente estavam principalmente envolvidos na via de sinalização do ácido gama-aminobutírico, componente integral da membrana e ligação de proteínas (Fig. 6f).
UDBS melhora a riqueza e diversidade da microbiota intestinal em camundongos envelhecidos
Estudos anteriores abordaram as redes de comunicação entre o trato gastrointestinal e o cérebro. Aqui, especulamos se o UDBS afeta a microbiota gastrointestinal. Os resultados do sequenciamento do 16S rRNA revelaram que o UDBS melhorou a riqueza e diversidade da microbiota intestinal (Fig. S3), sugerindo que o UDBS pode prolongar a vida útil dos camundongos envelhecidos. Surpreendentemente, uma mudança principal na via foi observada no grupo UDBS, enquanto nenhuma via diferencial significativa foi observada para o grupo sham com base na comparação dos dados pré e pós-tratamento (Fig. S4). No geral, os dados obtidos no presente estudo confirmam os efeitos benéficos do UDBS nos sistemas nervoso central, cardiovascular e digestivo.
Discussão
Este estudo elucida pela primeira vez que o UDBS, uma estratégia terapêutica não invasiva e não farmacológica, pode modular o comprimento dos telômeros em camundongos envelhecidos e com DA. O comprimento dos telômeros está positivamente correlacionado com a expectativa de vida e diminui com o envelhecimento e a progressão da doença. Especificamente, os resultados deste estudo demonstram que o UDBS do córtex e hipocampo é eficaz para aliviar o encurtamento dos telômeros em um modelo de camundongo com DA (Fig. 3d) e em camundongos com envelhecimento natural (Fig. 4e). Essas descobertas demonstram o potencial do UDBS como uma nova ferramenta para o tratamento do envelhecimento e doenças relacionadas à idade.
Efeitos duradouros da estimulação por ultrassom foram encontrados em modelos de camundongos com demência e em pacientes com DA. Por exemplo, Yang et al. relataram anteriormente que 49 dias (15 min/dia) de tratamento com UDBS produziram efeitos neuroprotetores contra a disfunção cognitiva induzida por alumínio. Além disso, Eguchi et al. relataram melhora na função cognitiva e aumento do fluxo sanguíneo cerebral em um modelo de demência vascular após tratamento com UDBS nos Dias 1, 3 e 5 (60 min/dia), que persistiu por pelo menos 3 meses. Mais notavelmente, Beisteiner et al. relataram escores neuropsicológicos significativamente melhorados em pacientes com DA após 2–4 semanas de tratamento com UDBS; essa melhora durou até três meses e se correlacionou com a regulação positiva da rede de memória. Além disso, Folloni et al. indicaram que 40 segundos de UDBS poderiam causar atividade cerebral em macacos por mais de 1 hora. Enquanto isso, o estudo do nosso grupo também descobriu que 15 minutos de UDBS podiam manter um efeito inibitório por 7 horas em macacos epilépticos. Esses achados são consistentes com nossos resultados, ou seja, que 45–60 dias (30 min/dia) de tratamento com UDBS melhoraram o desempenho comportamental em camundongos com DA (Fig. 3b e c) e envelhecidos (Figs. 4b–d) um mês após o tratamento com ultrassom. Assim, o encurtamento dos telômeros foi atenuado pela terapia com ultrassom, resultando em comprimento de telômero significativamente maior um mês após o tratamento com ultrassom. Enquanto isso, mais estudos são necessários para explorar a relação entre os parâmetros ultrassônicos e o efeito duradouro.

Curiosamente, descobrimos que a estimulação ultrassônica do córtex e do hipocampo desacelerou o encurtamento dos telômeros no córtex e no miocárdio de camundongos com DA (Fig. 3d). Além disso, o encurtamento dos telômeros foi consistentemente atenuado no córtex e no sangue periférico de camundongos envelhecidos (Fig. 4e). Isso sugere que a estimulação ultrassônica do cérebro pode afetar a função periférica. Esses resultados foram confirmados por nossa análise da flora do trato digestivo, pois encontramos melhora na riqueza e diversidade após o tratamento com UDBS (Fig. S3). No geral, os achados do nosso estudo sugerem que o UDBS tem efeitos sistêmicos benéficos no envelhecimento e em doenças relacionadas à idade.

Usando técnicas transcriptômicas, 785 genes candidatos diferencialmente expressos foram utilizados para identificar as vias e redes de neuromodulação do UDBS. Muitos foram enriquecidos em interações neuroativas receptor-ligante (Fig. 6b). O agrupamento adicional dos termos sinápticos de GO permitiu a identificação de uma extensa rede composta por três módulos de PPI (Fig. 6c), que estavam relacionados à transmissão sináptica e neurotransmissores. Nós altamente inter-relacionados nesses módulos, incluindo os dos módulos BDNF, NPY e AGT, foram relatados por promoverem sobrevivência e diferenciação neuronal, aprendizado e memória, e desempenho esportivo de potência.
Interessantemente, observamos a regulação negativa de Wnt9a no grupo UDBS prolongado (Fig. 6d). O nível de expressão de Wnt9a está correlacionado com a senescência celular, declínio do receptor do fator de crescimento epidérmico (eGFR) e expressão de p16INK4A. A superexpressão de Wnt9a agrava a senescência celular, evidenciada pelo aumento da expressão de p16INK4A e da atividade de sen-β-Gal. Os mecanismos pelos quais o UDBS modula o comprimento dos telômeros não foram elucidados no presente estudo e, portanto, são necessárias mais pesquisas.
Os efeitos biológicos do ultrassom são relativamente complexos e incluem cavitação, bem como efeitos térmicos e mecânicos. A cavitação geralmente pode ser produzida por ultrassom com injeção de microbolhas, o que pode causar hemorragia e danos teciduais. No entanto, é necessária uma pressão acústica superior a 40 MPa para iniciar a cavitação em tecido mole sem microbolhas. Assim, é improvável que ocorra cavitação para a pressão empregada no presente estudo. A pressão acústica e a duração do pulso são fatores importantes que influenciam o efeito térmico. Cálculos teóricos anteriores indicaram um aumento máximo de temperatura de aproximadamente 0,02 °C. Enquanto isso, numerosos estudos mostraram que o ultrassom pode ativar canais iônicos mecanossensíveis, incluindo Piezo1, MscL e TRPA1, que estão implicados nas respostas celulares. Portanto, especulamos que a força de radiação acústica desempenha um papel preponderante na neuromodulação ultrassônica.
O mecanismo do UDBS na DA e no envelhecimento não é claro, mas há numerosos estudos que comprovaram a eficácia e possíveis mecanismos do ultrassom na DA e no envelhecimento. Eguchi et al. relataram que a ativação da óxido nítrico sintase endotelial induzida pelo ultrassom desempenhou um papel importante na redução da microgliose e das placas de Aβ nos modelos de DA. Bobola et al. demonstraram que o UDBS pode ativar agudamente uma porcentagem substancial de microglias e eliminar quase 50% das placas de Aβ em camundongos 5XFAD. Enquanto isso, algumas evidências indicaram que o microbioma intestinal e o cérebro se comunicam de maneira bidirecional, podendo afetar doenças neurodegenerativas. Além disso, o encurtamento dos telômeros está associado à disfunção celular, senescência e apoptose; o comprimento dos telômeros tem sido proposto como um indicador primário do envelhecimento celular e há evidências crescentes de que a homeostase do comprimento dos telômeros é essencial para a função celular e o envelhecimento do organismo. Alguns estudos descobriram que as pessoas com maior comprimento de telômeros apresentam melhor desempenho em medidas cognitivas. Enquanto isso, o BDNF é uma neurotrofina chave e importante para o crescimento e plasticidade sináptica. Além disso, o aumento do BDNF pode aliviar os sintomas associados a distúrbios neurodegenerativos. Por exemplo, o BDNF resgata déficits de memória e melhora a cognição na DA, no envelhecimento e na DP. Adicionalmente, o PSD-95 é um elemento principal das sinapses e associado à neuroplasticidade. E o PSD-95 está envolvido no envelhecimento, na DA e em inúmeros transtornos psiquiátricos. Portanto, a alteração do comprimento dos telômeros e dos níveis de expressão de BDNF e PSD-95 induzida pelo UDBS pode ser um mecanismo unificador que explica a melhora das funções motoras e cognitivas em camundongos com DA e envelhecidos. Neste estudo, descobrimos que o UDBS retardou o encurtamento dos telômeros, o que pode ajudar a melhorar as habilidades de aprendizagem espacial e memória em camundongos com DA. Mais estudos são necessários para explorar a relação entre o comprimento dos telômeros e os distúrbios neurodegenerativos.
Nossos resultados mostraram que o UDBS pode desacelerar o encurtamento dos telômeros e melhorar os comportamentos cognitivos em camundongos. No entanto, a eficácia e a segurança do UDBS precisam ser verificadas para as aplicações clínicas. Assim, é necessária uma investigação mais aprofundada dos parâmetros ultrassônicos para entender a interação do ultrassom com os neurônios. Além disso, em comparação com o camundongo, o crânio humano é muito mais espesso. Como se sabe, a penetração, a resolução e a frequência ultrassônicas são mutuamente restritas, e ondas de ultrassom com alta frequência têm alta resolução, mas a profundidade de penetração é rasa. Para reduzir a atenuação do ultrassom ao penetrar no crânio, podem ser utilizados transdutores ultrassônicos com baixa frequência fundamental ou transdutores ultrassônicos de matriz em fase para aumentar a energia ultrassônica entregue à região alvo.
Até onde sabemos, este estudo é o primeiro a demonstrar que a estimulação ultrassônica do cérebro pode modular sistemicamente o comprimento dos telômeros em camundongos com DA e envelhecimento. É importante destacar que descobrimos que as funções motoras e cognitivas são melhoradas pela estimulação ultrassônica. Além disso, a análise do transcriptoma indicou o efeito da estimulação ultrassônica por meio de várias vias celulares (por exemplo, atividade da telomerase e interação neuroativa ligante-receptor, e sinalização de BDNF, NPY e AGT). Estudos futuros devem abranger mecanismos para elucidar as propriedades protetoras do UDBS para a homeostase dos telômeros. No geral, o presente estudo indica os efeitos do UDBS nos telômeros e o potencial deste tratamento como um mecanismo neuroprotetor contra DA e envelhecimento.
Declaração de contribuição de autoria CRediT
Yaya Zhang: Investigação, Metodologia, Análise formal, Redação – rascunho original, Redação – revisão e edição. Na Pang: Investigação, Metodologia, Análise formal, Redação – rascunho original, Redação – revisão e edição. Xiaowei Huang: Investigação, Metodologia, Análise formal, Redação – rascunho original, Redação – revisão e edição. Wen Meng: Investigação, Redação – revisão e edição. Long Meng: Supervisão, Investigação, Redação – revisão e edição. Bingchang Zhang: Investigação, Metodologia, Redação – revisão e edição. Zhengye Jiang: Investigação, Redação – revisão e edição. Jing Zhang: Investigação, Redação – revisão e edição. Zhou Yi: Investigação, Redação – revisão e edição. Zhiyu Luo: Investigação, Redação – revisão e edição. Zhanxiang Wang: Conceituação, Supervisão, Análise formal, Redação – rascunho original, Redação – revisão e edição. Lili Niu: Conceituação, Supervisão, Análise formal, Redação – rascunho original, Redação – revisão e edição.
Declaração de interesses concorrentes
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse neste trabalho.
Referências
Telômeros – estrutura, função e regulação
Telômeros e envelhecimento
Alterações sistêmicas e específicas do tipo celular no comprimento dos telômeros em subconjuntos de linfócitos
Papéis dos telômeros e da telomerase em doenças renais relacionadas à idade
O panorama das alterações moleculares em tumores neuroendócrinos pancreáticos e do intestino delgado
Encurtamento de telômeros específico de cardiomiócitos é uma assinatura distinta de insuficiência cardíaca em humanos
Telômeros em distúrbios neurológicos
Revisitando o encurtamento dos telômeros no câncer
Estimulação cerebral profunda – entrando na era da modulação de redes neurais humanas
Atalhando a depressão
Sintonizando o cérebro
Estimulação cerebral profunda na doença de Parkinson
Flashbacks de memória induzidos por estimulação cerebral profunda da região do fórnice na doença de Alzheimer
Complicações cirúrgicas e relacionadas ao hardware de longo prazo da estimulação cerebral profunda
Magnetogenética: ativação magnética remota não invasiva da atividade neuronal com um magnetorreceptor
Uma revisão da pulsação ultrassônica focalizada de baixa intensidade
Modulação ultrassônica no chip da atividade neuronal piramidal
Controle ultrassônico da atividade neural através da ativação do canal mecanossensível MscL
Estimulação cerebral profunda não invasiva por ultrassom para o tratamento de camundongos modelo da doença de Parkinson
Ultrassom transcraniano de baixa intensidade pulsado modula a plasticidade sináptica estrutural e funcional no hipocampo de ratos
Impacto offline do ultrassom focalizado transcraniano na ativação cortical em primatas
Estimulação ultrassônica transcraniana modula a descarga de neurônios individuais em macacos realizando uma tarefa de antissacada
Efeitos do ultrassom focalizado transcraniano no córtex motor primário humano usando ressonância magnética funcional de 7T: um estudo piloto
Estimulação por pulso transcraniano com ultrassom na doença de Alzheimer - uma nova terapia cerebral focal navegada
Estimulação ultrassônica transcraniana do hipotálamo em camundongos envelhecidos
A pulsação do ultrassom focalizado transcraniano suprime a epilepsia induzida por pentilenotetrazol in vivo
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Neuromodulação ultrassônica não invasiva da excitabilidade neuronal para o tratamento da epilepsia
Ultrassom vestível melhora a função motora em um modelo de camundongo MPTP da doença de Parkinson
A estimulação ultrassônica transcraniana suprime a neuroinflamação em um modelo crônico de camundongo da doença de Parkinson
A telomerase hipocampal está envolvida na modulação de comportamentos depressivos
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Eixo intestino-cérebro: como o microbioma influencia a ansiedade e a depressão
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O ativador de telomerase TA-65 alonga telômeros curtos e aumenta o período de saúde de camundongos adultos/idosos sem aumentar a incidência de câncer
Telômeros e doença humana: envelhecimento, câncer e além
A terapia de ultrassom de baixa intensidade pulsado em todo o cérebro melhora acentuadamente as disfunções cognitivas em modelos de camundongos com demência - Papéis cruciais da óxido nítrico sintase endotelial
Aumento de fatores neurotróficos em astrócitos para efeitos neuroprotetores em distúrbios cerebrais usando estimulação ultrassônica de baixa intensidade pulsada
Manipulação da atividade subcortical e cortical profunda no cérebro de primatas usando estimulação ultrassônica focalizada transcraniana
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Bioefeitos mecânicos do ultrassom focalizado de alta intensidade pulsado em um modelo neural simples
A neuroinibição reversível por ultrassom focalizado é mediada por um mecanismo térmico
Mecanismos biofísicos do ultrassom
Bioefeitos mecânicos do ultrassom
O canal iônico mecanossensível piezo1 medeia significativamente a estimulação ultrassônica in vitro de neurônios
Ativação dos canais piezo1, mas não NaV1.2, por ultrassom a 43 MHz
Neuromodulação ultrassônica via TRPA1 astrocítico
O ultrassom ativa canais K+ mecanossensíveis TRAAK através da membrana lipídica
Ultrassom focalizado transcraniano, pulsado a 40 Hz, ativa microglia de forma aguda e reduz a carga de Aβ cronicamente, conforme demonstrado in vivo
Telômeros e telomerase
Comprimento dos telômeros e função cognitiva: padrões diferenciais entre grupos sociodemográficos
Comprimento dos telômeros e função cognitiva em idosos do sexo masculino da comunidade do sul da China
Liberação condicional de BDNF por astrócitos resgata déficits de memória, densidade de espinhas dendríticas e propriedades sinápticas no modelo de camundongo 5xFAD da doença de Alzheimer
Novos insights sobre a função do BDNF cerebral no envelhecimento normal e na doença de Alzheimer
Esclarecendo o papel do BDNF na farmacoterapia da doença de Parkinson
Um arcabouço para compreender as variações da expressão de PSD-95 no envelhecimento cerebral e na doença de Alzheimer
Materiais suplementares
O material suplementar associado a este artigo pode ser encontrado, na versão online, em doi:10.1016/j.fmre.2022.02.010.