pmid: "38519460"
title: "Diindóis produzidos a partir de metabólitos da microbiota comensal funcionam como ligantes endógenos de CAR/Nr1i3."
authors: "Liu J, Malekoltojari A, Asokakumar A, Chow V, Li L, Li H, Grimaldi M, Dang N, Campbell J, Barrett H, Sun J, Navarre W, Wilson D, Wang H, Mani S, Balaguer P, Anakk S, Peng H, Krause HM"
journal: "Nature communications"
pubdate: "2024 Mar 22"
doi: "10.1038/s41467-024-46559-3"
source: "PMC Full Text"
Diindóis produzidos a partir de metabólitos da microbiota comensal funcionam como ligantes endógenos de CAR/Nr1i3.
Autores
Liu J, Malekoltojari A, Asokakumar A, Chow V, Li L, Li H, Grimaldi M, Dang N, Campbell J, Barrett H, Sun J, Navarre W, Wilson D, Wang H, Mani S, Balaguer P, Anakk S, Peng H, Krause HM
Periodico
Nature communications (2024 Mar 22)
Conteudo
Diindóis produzidos a partir de metabólitos da microbiota comensal funcionam como ligantes endógenos de CAR/Nr1i3
Numerosos estudos demonstraram a correlação entre bactérias intestinais humanas e a fisiologia do hospedeiro, mediada principalmente por receptores nucleares (NRs). Apesar deste conjunto de trabalhos, a identificação e caracterização sistemática de ligantes derivados de micróbios que regulam os NRs continua sendo um desafio considerável. Neste estudo, descobrimos uma série de moléculas de diindol produzidas a partir de metabólitos de bactérias comensais que atuam como agonistas específicos para o receptor órfão constitutivo de androstano (CAR). Usando várias análises biofísicas, mostramos que suas afinidades nanomolares são comparáveis às dos agonistas sintéticos de CAR e que podem ativar tanto os ortólogos de CAR de roedores quanto humanos, o que os agonistas sintéticos estabelecidos não conseguem. Também descobrimos que os diindóis, diindolilmetano (DIM) e diindoliletano (DIE), regulam positivamente seletivamente genes-alvo genuínos de CAR em hepatócitos primários humanos e fígado de camundongo sem causar efeitos colaterais significativos. Essas descobertas fornecem novos insights sobre a complexa interação entre o microbioma intestinal e a fisiologia do hospedeiro, bem como novas ferramentas para o tratamento de doenças.
Aqui, combinando análises metabolômicas, proteômicas e biofísicas, os autores identificam e caracterizam uma série de moléculas de diindol produzidas a partir de metabólitos de bactérias comensais que atuam como agonistas específicos para o receptor órfão constitutivo de androstano (CAR), com potencial para modular a inflamação intestinal e hepática, doenças metabólicas e câncer.
Introdução
Embora muitos metabólitos derivados de micróbios tenham demonstrado contribuir significativamente para o metabolismo, a aptidão e a saúde do hospedeiro, a maioria das moléculas responsáveis e seus mecanismos subjacentes são amplamente desconhecidos. Uma abundância de estudos revelou que esses produtos microbianos podem agir tanto local quanto sistemicamente, modulando a expressão gênica do hospedeiro e os resultados fisiológicos. Um dos intermediários conhecidos nas ações de metabólitos microbianos é o receptor constitutivo de androstano (CAR, Nr1i3), um receptor nuclear órfão que desempenha papéis cruciais no metabolismo hepático e na inflamação intestinal. Estudos anteriores mostraram que a expressão e a atividade do CAR no intestino grosso dependem da presença da flora intestinal. Por outro lado, a ausência de CAR leva a uma diminuição na riqueza e composição da microbiota. Um estudo recente também descobriu que as células imunológicas que infiltram a mucosa do intestino delgado dependem do CAR para aumentar a expressão do transportador de fármacos MDR1, juntamente com outras enzimas metabolizadoras de fármacos, protegendo assim contra a toxicidade dos ácidos biliares e a inflamação intestinal. No entanto, os mecanismos pelos quais esses sinais são trocados são atualmente desconhecidos. Aqui, identificamos e caracterizamos um conjunto de dímeros de indol, referidos como diindóis, como potentes agonistas de CAR. Os diindóis são produzidos pela ponte de dois grupos indol derivados de micróbios com vários aldeídos. Prosseguimos mostrando que dois desses diindóis, diindolilmetano (DIM) e diindoliletano (DIE), regulam positivamente a expressão de genes alvo de CAR em hepatócitos primários humanos e fígado de camundongo. Ao contrário do forte agonista de CAR de camundongo (mCAR) 1,4-bis-[2-(3,5-dicloropiridiloxi)]benzeno (TCPOBOP), efeitos colaterais como proliferação e aumento do fígado não foram observados com o tratamento com DIM ou DIE. Essas diferenças na toxicidade provavelmente se devem a diferenças nas formas como os agonistas sintéticos e os diindóis se ligam e modulam a atividade do CAR.
Resultados
Ensaio de afinidade por pull-down identifica diindóis como ligantes de CAR
Para facilitar a copurificação por afinidade do receptor CAR ligado ao ligante, geramos um polipeptídeo recombinante do domínio de ligação ao ligante (LBD) de hCAR marcado com His. Como mostrado anteriormente com o receptor relacionado, receptor de pregnano X (PXR), a adição do motivo de interação LxxLL do coativador 1 do receptor de esteroide (SRC-1) ao C-terminal do LBD de hCAR tornou a proteína de fusão estável e solúvel quando expressa em bactérias recombinantes. Para validar a função da proteína de fusão purificada, testamos usando ensaios de deslocamento térmico por fluorescência (TSA) com dois agonistas conhecidos (6-(4-clorofenil)imidazo[2,1-b][1,3]tiazol-5-carbaldeído-O-(3,4-diclorobenzil)oxima (CITCO) e bisfenol A (BPA)), um antagonista (PK11195) e o agonista específico de PXR, SR12813. A estabilização apenas pelos ligantes conhecidos de CAR (Figura Suplementar 1) mostrou que a proteína de fusão é altamente seletiva e funcional.
Em seguida, a proteína de fusão foi utilizada para testar interações potenciais com metabólitos microbianos humanos usando um extrato derivado de uma mistura complexa de micróbios cultivados a partir de amostras de fezes humanas. Uma pequena quantidade do extrato do meio foi adicionada a um lisado de E. coli contendo 1 µM da proteína de fusão CAR LBD-SRC1 marcada com His. Após co-incubação, os metabólitos ligados foram extraídos da proteína purificada por afinidade e analisados por cromatografia líquida-espectrometria de massas não direcionada (LC-MS). Como o PXR é o NR mais próximo do CAR em termos de estrutura do LBD e ligantes ligados, com sobreposição significativa nos perfis de ligação de ligantes, ensaios de pull-down paralelos foram realizados usando uma proteína de fusão PXR LBD-SRC1. Isso nos permitiu identificar ligantes específicos do CAR com pouca ou nenhuma afinidade pelo PXR.
Identificação de diindóis como ligantes do hCAR.
a Gráfico de volcanos da distribuição de características de massa diferencialmente enriquecidas pelo CAR em comparação com o PXR por purificação por afinidade.
b Gráfico de volcanos da distribuição de características de massa diferencialmente enriquecidas pelo CAR a partir de amostra do microbioma intestinal em comparação com o veículo (DMSO). Os valores de p foram determinados pelo teste t de Student bicaudal não pareado. As linhas tracejadas representam os limites de significância na análise (valor de p ≤ 0,01, fold change ≥ 100).
c Cromatogramas extraídos de características de massa selecionadas enriquecidas pelo CAR que são separadas em massa por números crescentes de grupos –CH2.
d Espectros de MS/MS do ligante enriquecido pelo CAR a partir de amostra do microbioma intestinal (painel superior, laranja) em comparação com o de um padrão de referência DIM adquirido (painel inferior, preto). As estruturas dos fragmentos C17H13N2 (m/z teórico 245.1073) e C9H8N (m/z teórico 130.0651) são mostradas.
e Cromatograma UV da subfração contendo diindóis.
f Estruturas dos diindóis identificados por ensaios de pull-down do hCAR. GM microbioma intestinal, DIM diindolilmetano, DIE diindoliletano, DIP diindolilpropano, nDIB diindolil-n-butano, iDIB diindolil-iso-butano, DIPentano diindolilpentano.
Cinco características de LC-MS identificadas sob modo de ionização por electrospray positivo (ESI+) no LC-MS foram consistentemente e seletivamente enriquecidas pelo CAR-LBD marcado (razões massa/carga (m/z) = 130,0652, 144,0808, 158,0964, 172,1120 e 186,1277; Fig. 1a, c). A adição apenas do veículo DMSO ao extrato de E. coli mostrou que as moléculas interagentes não estão presentes no lisado de E. coli não adicionado (Fig. 1b). Os aumentos seriais nas massas dos hits identificados em ~14 dáltons cada sugerem adições sucessivas de grupos CH2 à menor massa de 130,0652. Identidades potenciais alternativas do metabólito com m/z 130,0652 são 3-metileno-indolina ou quinolina. Como a 3-metileno-indolina é um intermediário metabólico instável do triptofano, e um padrão adquirido de quinolina não correspondeu ao tempo de eluição do metabólito usando cromatografia de fase reversa (Fig. Suplementar 2a), eles foram descartados como candidatos prováveis. Em seguida, hipotetizamos que a característica de massa observada poderia ter sido gerada pela formação de aduto [M + H - H2O]+, como poderia ser produzido com indol-3-carbinol (I3C, C9H9NO). No entanto, o tempo de retenção de um padrão de I3C adquirido também não correspondeu ao da amostra de metabólito (Fig. Suplementar 2a). Após considerar o pequeno tamanho dessas características de massa (130–187 u) em comparação com outros ligantes de CAR (250–500 u), consideramos a possibilidade de que as massas observadas fossem íons fragmentados na fonte, gerados a partir de moléculas parentais maiores que sofreram fragmentação durante a ionização primária. Embora a baixa voltagem usada no ESI (3–4 kV) para converter moléculas neutras em íons carregados vise preservar a estrutura intacta da molécula, hipotetizamos que a fragmentação na fonte dos metabólitos poderia, no entanto, produzir um fragmento neutro não detectado e adutos [M + H]+ (diagramado na Fig. Suplementar 2b). De fato, o composto diindol DIM demonstrou produzir um fragmento neutro de indol e um íon [M + H]+ com m/z 130,0 quando analisado por MS/MS em tandem. A identidade do DIM como fonte parental foi confirmada comparando os tempos de retenção (Fig. Suplementar 2a), fragmentação na fonte (Fig. Suplementar 2c) e espectros de MS/MS (Fig. 1d) com um padrão de DIM adquirido. Como observado com o metabólito do pull-down de CAR, o padrão adquirido produziu um aduto [M + H]+ de baixa intensidade com m/z 247,1223 (Fig. Suplementar 2c), e a fragmentação por MS/MS do m/z 247,1223 produziu os mesmos íons produto 130,0652 e 245,1066 (Fig. 1d). Esse resultado sugere que as identidades mais plausíveis dos outros hits sucessivamente maiores são muito provavelmente devidas a adições sucessivas de grupos CH2 ao metileno central, designados como diindolil-etano (DIE), -propano (DIP), -butano (DIB) e -pentano (DIPentano) (Fig. Suplementar 2d).
Para facilitar a validação estrutural e as avaliações de bioatividade desses compostos anteriormente não caracterizados, realizamos um isolamento em escala ampliada dos metabólitos de amostras brutas do microbioma intestinal humano (MI) com base em nossos tempos de retenção e massas observados anteriormente. O extrato bruto de MI (1 grama) foi submetido a cromatografia de fase normal e depois de fase reversa, resultando em 7 compostos puros, denominados MI-1–7 (Fig. 1e). MI-1, -2 e -7 foram suficientemente abundantes para identificação por ressonância magnética nuclear (RMN). Utilizando RMN bidimensional (Tabela Suplementar 1), MI-1 foi confirmado como DIM, MI-2 como 3,3’-diindoliletano (DIE) e MI-7 como 3,3’-diindolil-iso-butano (iDIB) (Fig. 1f).
Também realizamos sínteses personalizadas de nDIB e do íon de massa previsto 158,0964, o 3,3’-diindolilpropano (DIP). A comparação dos tempos de retenção das moléculas purificadas por afinidade e sintetizadas sob medida confirmou as identidades desses diindóis, com exceção das isoformas alternativas de iDIB e nDIB, que não podem ser distinguidas entre si por CL-EM (Figura Suplementar 3). No entanto, essas purificações forneceram níveis suficientes de cada molécula para os ensaios confirmatórios de ligação e atividade que se seguem. A exceção foi o maior íon m/z 186,1277, que é provavelmente o diindolilpentano (DIPentano). Contudo, a extrema hidrofobicidade e os quatro isômeros potenciais do DIPentano nos desencorajaram de prosseguir com ele.
Produção não enzimática de diindóis
Produção não enzimática de diindóis.
a Via do indol-aldeído proposta subjacente à incorporação de aldeídos (R é a cadeia lateral para formaldeído, acetaldeído, propanal, n-butanal e i-butanal) em DIM, DIE, DIP, nDIB e iDIB. b Produção de diindóis dependente de pH e tempo. Os valores são dados como intensidade relativa,%.
Foi demonstrado que o DIM é produzido por duas vias in vivo – a via do I3C e uma via do indol-aldeído (Fig. 2a). A via do I3C é improvável para os outros diindóis, no entanto, pois os álcoois indoílicos não podem formar os intermediários eletrofílicos alquileno-indolenina necessários (Fig. Suplementar 2a) para atacar nucleofilicamente o segundo indol. Embora estudos anteriores ainda não tenham identificado diindóis além do DIM no intestino humano, DIE e DIB foram encontrados nas bactérias marinhas Vibrio parahaemolyticus e Pseudovibrio denitrificans, sugerindo que a produção microbiana ainda é uma possibilidade sob certas condições e talvez detectável com ensaios mais direcionados. Uma possibilidade alternativa é que os diindóis identificados sejam gerados fora das bactérias por meio de reações sequenciais de Friedel-Crafts em precursores derivados da dieta ou de micróbios (Fig. 2a). Para testar essa possibilidade, o indol foi combinado a 37 °C em múltiplos pHs com os aldeídos acetaldeído, propanal, n-butanal ou t-butanal. A análise subsequente por LC-MS confirmou que DIE, DIP e ambos os DIBs foram gerados eficientemente de maneira dependente do pH a partir do indol e dos aldeídos correspondentes (Fig. 2b). A síntese de diindol foi mais eficiente em pH 4–6, com produção decrescente em pHs mais altos (Fig. 2b). Em termos das fontes de indol e aldeídos no intestino, várias espécies bacterianas demonstraram converter triptofano em indol, e aldeídos endógenos também podem ser gerados por bactérias no trato gastrointestinal, consistente com o potencial para produção eficiente de diindol no ambiente intestinal.
Caracterização das interações CAR-diindol
Análise das interações dos diindóis com o hCAR.
a Deslocamentos térmicos induzidos por diindóis a 12,5 µM (valores são médias baseadas em triplicatas). b–e Caracterização por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) da interação CAR-SRC1 com DIM (b), DIE (c), DIP (d) ou nDIB (e). b–e Termogramas de calor representativos (painel superior) e isotermas de ligação correspondentes (painel inferior). Valores de Kd expressos como a média de dois experimentos independentes. f Respectivas assinaturas termodinâmicas de ligação ao CAR-LBD-SRC1 (n = 2 réplicas) e representam a média (±d.p.). g, h Análise diferencial de troca hidrogênio-deutério do hCAR revelando interações de ligação para CITCO e DIE. Ilustrações estruturais mapeando os dados diferenciais de HDX para o hCAR ao se ligar a (g) CITCO e (h) DIE (código PDB 1XVP) são mostradas. As estruturas são codificadas por cores de acordo com as diferenças de captação fracionária relativa somada na porcentagem de incorporação de deutério (%D). Azul escuro denota diferenças >20%, azul claro denota mudanças conformacionais mais fracas (5%< x < 20%) e vermelho denota aumento na captação de deutério. APO apo-CAR-LBD, AF2 fator de ativação-2.
Para determinar a natureza das interações físicas entre diindóis e o LBD do CAR, primeiro empregamos TSAs por fluorescência. Na ausência de ligante, observou-se uma curva de fusão sigmoidal do polipeptídeo CAR LBD-SRC1, com um ponto de inflexão da temperatura de fusão (Tm) de aproximadamente 51,5 °C (Fig. 3a). Quando incubado com 0,4–50 µM de cada diindol, a proteína apresentou deslocamentos dependentes da dose no Tm (Figura Suplementar 4). Os perfis de deslocamento térmico obtidos foram semelhantes aos produzidos com os ligantes de CAR publicados BPA e PK11195 (Figura Suplementar 1), variando de 6,2 a 8,0 °C, com o DIE apresentando o efeito mais forte (Fig. 3a). Notavelmente, como observado anteriormente, o ligante sintético de CAR CITCO não teve efeito sobre a estabilidade térmica (Figura Suplementar 1), indicando um modo de ligação diferente e não estabilizador.
Em seguida, utilizamos calorimetria isotérmica (ITC) para confirmar e caracterizar ainda mais a termodinâmica das interações dos diindóis com o CAR, e para explorar suas relações estrutura-atividade. O iDIB não foi testado devido a problemas de solubilidade neste ensaio. Titulações de soluções dos diindóis restantes, usando a proteína de fusão CAR-LBD-SRC1 com etiqueta His, resultaram em eventos de ligação exotérmicos (Fig. 3b–e, painel superior). Quando as mudanças totais de calor foram plotadas contra concentrações crescentes de proteína, inferiu-se uma estequiometria de ligação de aproximadamente 1:2 (mol/mol) proteína:ligante para todos os quatro compostos (Fig. 3b–e, painel inferior). O ajuste da curva produziu constantes de dissociação (Kds) de 3,9, 0,25, 6,0 e 0,78 µM para DIM, DIE, DIP e nDIB, respectivamente (Fig. 3b–e). A energia livre de Gibbs da reação foi favorável para cada composto, particularmente para o DIE (Fig. 3f), indicando que a ligação do ligante é espontânea. A ligação do ligante diindol também foi caracterizada por uma entalpia de ligação negativa benéfica (ΔH). No entanto, os valores favoráveis de entalpia para DIM, DIE e DIP também foram acompanhados por uma perda significativa de entropia (ΔS), indicativa de uma perda de liberdade conformacional associada à ligação do ligante. As respostas termodinâmicas para nDIB indicam contribuições favoráveis tanto de entalpia quanto de entropia, que juntas fornecem uma energia de Gibbs (ΔG) comparável à do DIE (Fig. 3f), consistente com suas afinidades igualmente altas (Kds = 0,78 e 0,25 µM, respectivamente; Fig. 3c, e).
Para obter mais informações sobre os contatos de ligação espacial do diindol e os efeitos na estrutura do LBD de CAR, também empregamos a análise de troca hidrogênio-deutério acoplada à EM (HDX-MS). A HDX-MS foi utilizada anteriormente para determinar a dinâmica conformacional das regiões do LBD de mCAR induzidas pela ligação do ligante sintético de mCAR TCPOBOP. Aqui, usamos o ligante diindol de maior afinidade, DIE, para comparar a taxa e a localização da troca de deutério no LBD de hCAR em relação aos efeitos do CITCO, o ligante sintético de hCAR de alta afinidade. Todos os experimentos de HDX-MS foram conduzidos por 1, 10 e 30 min e para três estados: hCAR na ausência de qualquer ligante (hCAR apo), na presença de 100 µM de CITCO e na presença de 100 µM de DIE (Tabela Suplementar 2). A cobertura média de sequência para todos os experimentos foi de 94,1% com uma redundância média de peptídeos de 5,49. Para ambos CITCO e DIE, os aminoácidos 51–65 (H3) apresentaram a diferença mais substancial na captação de deutério (>20%) em comparação com hCAR apo. Ambos os ligantes também induziram uma diminuição relativamente pequena (10%–20%) na captação de deutério para os aminoácidos 28–39 (H2) e 115–133 (H6), indicando uma mudança relativamente sutil na estrutura ou dinâmica após a ligação do ligante (Fig. 3g, h).
Esses resultados mostram que o DIE se liga ao hCAR com muitos dos mesmos sítios de interação estruturalmente determinados que o CITCO (na interface das hélices 2, 3 e 6). No entanto, duas regiões do LBD de CAR responderam de forma diferente aos dois ligantes. Para os aminoácidos 217–234 (H11), a complexação com CITCO resultou em uma captação de deutério mais pronunciada (>20%, Fig. 3g) em comparação com a complexação com DIE (<10%, Fig. 3h). Em contraste, para os resíduos adjacentes 235–243 (H12/AF2), a ligação do CITCO diminuiu a captação de deutério, enquanto o DIE aumentou a captação. Isso indica que, apesar da posição geral da hélice 12 em uma conformação constitutivamente ativa, o CITCO ainda é capaz de estabilizar ainda mais essa conformação. Essa estabilização do sítio de ancoragem do cofator é consistente com os efeitos no recrutamento de cofatores. Um ensaio de recrutamento de cofator PGC1α (proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) baseado em transferência de energia de ressonância por fluorescência resolvida no tempo (TF-FRET) mostra que o CITCO é capaz de aumentar o recrutamento de PGC1α além dos níveis 'constitutivos', enquanto o DIE não (Fig. Suplementar 5).
Os diindóis ativam seletivamente a atividade transcricional do hCAR
Os diindóis induzem a translocação nuclear e a atividade transcricional do hCAR.
a Hepatócitos primários humanos (HPHs) do doador de fígado #203 foram infectados com 2 µL de hCAR marcado com proteína fluorescente amarela melhorada adenoviral (Ad/EYFP-hCAR) seguido pelo tratamento com 0,1% DMSO, 1 mM PB, 10 µM DIM ou DIE por 8 h. b Células HEK293 transfectadas com GAL4-hCAR-LBD foram expostas a diferentes concentrações de CITCO, DIM, DIE, DIP, nDIB ou iDIB. A atividade basal do repórter é reduzida com o tratamento com 1 µM PK11195. Os ensaios foram realizados em triplicata (n = 3 experimentos independentes), e os dados são expressos como médias (±dp). c Células HepG2 foram transfectadas com um repórter CYP2B6-2.2 kb e vetores de expressão hCAR1+A. As células transfectadas foram subsequentemente tratadas com controle veículo (0,1% DMSO), CITCO, DIM ou DIE nas concentrações indicadas por 24 h. Os resultados representam 2 experimentos independentes (teste ANOVA unidirecional em DIM e DIE; e teste t de Student bicaudal não pareado em CITCO, n = 3/cada, dados expressos como médias ± (dp). *p < 0,05, ***p < 0,001 em comparação ao veículo). d Análise de RT-qPCR da expressão de mRNA de cyp2b6, cyp3a4 e sult2a1 em HPH (de dois doadores HL#203 e HL#204) tratados por 48 h com veículo (0,1% DMSO) ou concentrações indicadas de ligantes. Os resultados foram obtidos a partir de experimentos realizados em triplicata. Os dados são expressos como médias ± (dp); teste ANOVA unidirecional, ***p < 0,001 em comparação ao veículo. PB fenobarbital.
Conforme observado acima, a estrutura fixa não canônica das hélices 10–12 do LBD do hCAR o torna constitutivamente ativo quando no núcleo. No entanto, o CAR não ligado é normalmente mantido inativo pela retenção no citoplasma, com a ligação do ligante promovendo o transporte nuclear. Para avaliar a capacidade dos diindóis de promover a translocação nuclear do hCAR, realizamos um ensaio de translocação intracelular usando hepatócitos primários humanos (HPHs). Usando HPHs obtidos de dois indivíduos, DIM e DIE mostraram promover eficientemente a realocação nuclear do hCAR (Fig. 4a).
Embora a atividade do CAR seja considerada constitutiva uma vez no núcleo, utilizamos algumas outras abordagens transcricionais para testar efeitos sutis dos diindóis. A primeira faz uso de um ensaio baseado em deslocamento de antagonista. Um construto GAL4-hCAR LBD foi transfectado em células HEK293 juntamente com o agonista inverso do hCAR, PK11195 (IC50 = 1,3 µM). A inclusão do antagonista resultou em uma diminuição de quase 6 vezes na expressão do repórter da luciferase (Fig. Suplementar 5a). O co-tratamento com PK11195 e 3 µM de CITCO resulta em uma recuperação de aproximadamente 50% do sinal do repórter (Fig. Suplementar 6a). O co-tratamento com PK11195 e DIM, DIE ou nDIB também resultou em desrepressão, com EC50s na faixa micromolar a submicromolar (Fig. 4b). As EC50s do DIP e iDIB não puderam ser determinadas neste ensaio devido à luminescência inespecífica elevada (Fig. Suplementar 6b). Notavelmente, todos os diindóis testados exibiram maior eficácia do que o CITCO, com um valor de Emax aproximadamente 1,5 vezes maior que o CITCO (Fig. 4b). Dado que o CITCO tem uma capacidade única de estimular ainda mais a ligação do coativador, essa vantagem de aproximadamente 1,5 vezes na atividade dos diindóis sugere uma maior capacidade de deslocar o agonista inverso.
Nossa segunda abordagem transcricional utilizou uma variante do hCAR que possui uma inserção de alanina entre as hélices 7 e 8 do LBD (hCAR1+A), que interrompe sua atividade constitutiva e a torna responsiva a ligantes. Quando transfectada juntamente com um repórter do CYP2B6, tanto o DIM quanto o DIE foram capazes de aumentar significativamente a atividade do hCAR1+A (Fig. 4c), sugerindo que ambos podem induzir mudanças conformacionais promotoras de atividade a partir do interior do bolsão do LBD.
Derivados de indol, incluindo o diindol DIM, foram previamente relatados como também atuando como ligantes do PXR e do receptor de hidrocarboneto arílico (AhR). Para testar se os diindóis aqui identificados também se ligam ao PXR ou AhR, testamos seus potenciais efeitos em repórteres do PXR e AhR em células cultivadas. Embora alguns dos diindóis tenham sido capazes de ativar o PXR (Fig. Suplementar 6c, d), as concentrações necessárias (5–15 µM) excedem em muito a faixa fisiológica mais baixa que ativa o CAR. Nenhuma resposta do AhR foi observada na concentração relativamente alta testada de 10 µM (Fig. Suplementar 6e).
Em seguida, investigamos a capacidade do DIM e do DIE de ativar a transcrição de um gene alvo direto conhecido do hCAR, o cyp2b6, em PHHs. Consistente com nossos ensaios de repórter gênico anteriores, o DIM e o DIE regularam positivamente seletivamente a expressão do mRNA do cyp2b6 em ambos os doadores, sem ter efeitos sobre o gene não alvo sult2a1 (Fig. 4d). Efeitos também foram observados no gene alvo conjunto CAR/PXR, cyp3a4, embora esses efeitos tenham tendido a ser mais variáveis (Fig. 4d). Em conjunto, nossos ensaios baseados em células mostram que os diindóis, particularmente o DIE, atuam como agonistas fortes do hCAR com quase a mesma eficácia do potente agonista sintético CITCO.
Diindóis ativam a atividade transcricional do mCAR in vivo
Diindóis ativam genes alvo do mCAR.
Camundongos machos WT e Nr1i3−/− foram tratados com Veículo, DIM, DIE, agonista inverso de CAR, androstenol conforme indicado. Gráficos mostram análises de qPCR dos genes a
cyp2b10, b
cyp3a11 e c
sult2a1. (n = 6 para camundongos WT, n = 4 para óleo de milho, n = 5 para DIM e n = 3 para DIE em camundongos Nr1i3−/−). Os dados mostrados são médias ± (EPM) (comparações pareadas estatisticamente significativas foram calculadas usando testes ANOVA de uma via comuns; valores de p determinados comparando com óleo de milho ou And). d Imagens representativas de histologia hepática dos grupos de tratamento. Áreas de inflamação focal ou colangite leve estão marcadas com setas pretas. And androstenol.
Conforme observado anteriormente, uma das funções do CAR é a desintoxicação de xenobióticos, que é mediada em parte pela ativação dos genes do citocromo P450 (cyp), glutationa S-transferase e sulfotransferase (sult). Observamos como esses genes são afetados nos fígados de camundongos após um regime de 3 dias de injeções intraperitoneais de DIM ou DIE. Descobrimos que o gene alvo padrão ouro do mCAR, cyp2b10 (cyp2b6 humano), é robustamente induzido em camundongos do tipo selvagem (WT), mas não em camundongos deficientes em CAR, tanto por DIM quanto por DIE (Fig. 5a e Fig. Suplementar 7a). Como controle, também pré-tratamos camundongos com o agonista inverso de CAR androstenol (And) para reduzir seletivamente a expressão do gene alvo do CAR. Como esperado, o pré-tratamento com And reduziu bastante a expressão do gene alvo e as respostas tanto a DIM quanto a DIE (Fig. 5a e Fig. Suplementar 7a).
Outros genes alvo do mCAR previamente relatados responderam de forma menos específica. Por exemplo, cyp3a11 (ortólogo ao cyp3a4 humano), que também é um gene alvo conhecido do mPXR, mostrou um aumento em vez de uma diminuição em resposta ao pré-tratamento com And (Fig. 5b), provavelmente porque And também é um agonista do mPXR. A adição subsequente de DIM ou DIE não afetou essa indução dependente de And, nem a sua adição na ausência de And (Fig. 5b), sugerindo que o PXR pode ser o principal regulador desse gene nessas condições. A expressão de sult2a1, um gene alvo previamente relatado do CAR, PXR, AhR e VDR, também não apresentou respostas significativas a DIM, DIE ou And em camundongos WT ou Nr1i3−/− (Fig. 5c, Fig. Suplementar 6b, c). Esses resultados indicam que DIM e DIE podem ambos promover seletivamente a ativação de genes alvo do CAR in vivo, embora os efeitos sejam provavelmente complicados por efeitos indiretos, efeitos compensatórios e variações específicas do sexo.
Os tratamentos de camundongos com o agonista sintético do mCAR, TCPOBOP, tendem a ativar fortemente os genes-alvo do mCAR (Fig. Suplementar 7d–f), resultando em proliferação robusta de células hepáticas, crescimento (Fig. Suplementar 8a), toxicidade e carcinogênese ocasional. Para testar se nossos compostos diindol causam resultados semelhantes, primeiro examinamos os pesos hepáticos pós-tratamento. Diferentemente dos aumentos de crescimento observados após o tratamento com TCPOBOP, nenhuma alteração significativa foi observada após o tratamento com DIM ou DIE (Fig. Suplementar 8b, c). Em seguida, realizamos análises histológicas dos tecidos hepáticos. A coloração com hematoxilina e eosina (H&E) não revelou aumento no tamanho dos hepatócitos, inchaço citoplasmático, danos óbvios ou inflamação após o tratamento com DIM ou DIE (Fig. 5d), sugerindo que esses ligantes são bem tolerados no fígado. Observamos inflamação focal ocasional e colangite leve com o tratamento com And, mas isso foi reduzido pelo co-tratamento com DIM ou DIE (Fig. 5d).
Discussão
Nossa identificação de uma série de compostos diindol como ligantes de alta afinidade do CAR contribuirá para a compreensão dos papéis relativamente pouco estudados desempenhados pelo CAR nas interações hospedeiro-microrganismos intestinais, bem como nas causas e soluções para respostas metabólicas, fisiológicas e inflamatórias associadas. Neste estudo, focamos principalmente nos dois diindóis mais simples e solúveis, DIM e DIE. Embora o DIM já tenha sido encontrado com papéis preventivos no câncer, até agora suas ações eram consideradas mediadas pelo PXR e pelo AhR. No entanto, mostramos aqui que o DIM é um ligante de alta afinidade do CAR que dificilmente se liga a esses receptores alternativos em concentrações fisiológicas. O DIE e os outros diindóis identificados também provavelmente têm aplicações em doenças semelhantes, dependentes do CAR.
Em termos de suas fontes, apenas o DIM demonstrou ser produzido pelo microbioma. Nossos resultados sugerem que os outros são muito provavelmente ou frequentemente produzidos a partir da interação espontânea de indóis e aldeídos produzidos por microrganismos, que são abundantes no intestino superior adequadamente ácido. Notavelmente, é aqui que o CAR foi recentemente demonstrado ser necessário para a prevenção da inflamação induzida por ácidos biliares. A Fig. Suplementar 9 mostra que, por conta própria, os lactobacilos, que contribuem para o baixo pH dessa região, produzem acetaldeído e, quando suplementados com indol, produzem altos níveis de DIE. O indol já foi demonstrado ser produzido por várias cepas bacterianas comensais.
Além do acetaldeído produzido por microrganismos, que é necessário para a produção de DIE, o acetaldeído também pode ser produzido no fígado a partir do álcool pela enzima aldeído desidrogenase-2. Assim, o DIE também tem potencial para ser produzido no fígado se o indol produzido por microrganismos intestinais for transportado até lá. Embora a presença de DIE no fígado possa ter efeitos benéficos, a produção crônica como consequência da ingestão prolongada de álcool pode ser prejudicial, dado que a ativação do mCAR pelo consumo prolongado de fenobarbital está associada a carcinomas hepatocelulares.
Nossos resultados mostram que os efeitos agonísticos dos diindóis sobre o CAR são diferentes daqueles mediados pelo ligante sintético humano do CAR, CITCO, e pelo ligante sintético murino do CAR, TCPOBOP. O CAR é um RN incomum, pois sua capacidade de recrutar coativadores é essencialmente constitutiva devido à posição fixa da H12. Em vez do método clássico de ativação de ligantes de RN, que envolve mudanças na estrutura do bolsão do LBD e no reposicionamento da H12 para formar um bolsão de ligação a coativadores, os ligantes do CAR atuam desfazendo complexos diméricos acompanhados por chaperonas no citoplasma, permitindo a translocação de monômeros do CAR para o núcleo. O CITCO e o TCPOBOP não foram selecionados com base neste último, mas sim em suas capacidades de aumentar ainda mais o recrutamento de cofatores. Nossos dados, incluindo análises de HDX-MS, sugerem que os diindóis ocupam o bolsão do LBD do hCAR, enquanto a ligação do CITCO pode ocupar principalmente um sítio mais periférico próximo ou que afeta o bolsão AF-2. Isso provavelmente ajuda a explicar por que o CITCO não tem efeitos sobre a estabilidade térmica do hCAR tanto em ensaios baseados em TSA (Figura Suplementar 1c, e) quanto em ITC. Esses resultados são consistentes com as capacidades dos diindóis de se ligar e ativar tanto o hCAR quanto o mCAR, enquanto o CITCO se liga apenas ao hCAR e o TCPOBOP se liga apenas ao mCAR.
Tanto em células hepáticas primárias humanas quanto em fígados de camundongos, o DIM e o DIE atuaram como potentes ativadores dos genes-alvo ortólogos bem estabelecidos do CAR em camundongos e humanos, cyp2b6 e cyp2b10. Os efeitos do DIM e do DIE sobre outros genes-alvo do CAR previamente relatados em fígados de camundongos tratados por três dias foram menos claros. Suspeitamos que alguns destes ou não são genes-alvo diretos, ou são afetados por efeitos compensatórios ao longo do tratamento. Vale a pena notar que o DIM e o DIE são rapidamente degradados pela indução de genes-alvo do CAR, pois seus níveis se acumularam significativamente em camundongos Nr1i3−/− (Figura Suplementar 10). Esses resultados também podem explicar por que os tratamentos com diindóis não resultaram em hiperplasia hepática, como é tipicamente causado pelo TCPOBOP. Com maior estabilidade e ativação de genes-alvo potencialmente mais ampla e mais alta, as ações do TCPOBOP podem ser mais prolongadas e diversas.
Conforme observado anteriormente, o CAR desempenha papéis em vários processos e doenças, incluindo diabetes, doença hepática gordurosa e vários distúrbios inflamatórios. Ligantes naturais de alta afinidade, como DIM e DIE, podem ser adequados para tratar esses distúrbios. Eles também podem servir como modelos para o desenvolvimento de compostos semelhantes com propriedades farmacocinéticas otimizadas e resultados direcionados.
Métodos
Reagentes
DIM (15927), SR12813 (18115), I3C (11325) e androstenol (33457) foram adquiridos da Cayman Chemical. CITCO (C6240), TCPOBOP (T1443), PK11195 (C0424), BPA (239658), quinolina (94517), indol (I3408), formaldeído (252549), acetaldeído (402788), propionaldeído (538124), n-butiraldeído (418102) e i-butiraldeído (240788) foram adquiridos da Sigma. DIE (2021-0486967), DIP (2021-0488974), nDIB (2021-0485695) e iDIB (2021-0488971) foram adquiridos da Enamine.
Experimentos com animais
Camundongos C57BL/6 J com 12–15 semanas de idade foram obtidos do Jackson Laboratories e alojados em ciclo padrão de 12 h claro/escuro. Camundongos Nr1i3−/− com fundo C57BL/6 J foram obtidos do laboratório de David Moore (PMID: 11057673) no Baylor College of Medicine e usados com 13–26 semanas de idade. Camundongos machos e fêmeas selvagens e camundongos machos Nr1i3−/− foram utilizados neste estudo, devido às atividades do CAR específicas ao sexo. Os camundongos foram alojados em grupos de 2–5 camundongos por gaiola em ciclo padrão de 12 h claro/escuro e alimentados com ração para roedores (Inotiv, Teklad rodent diet 2918). A temperatura foi mantida a 21 °C, com variação de 21–24 °C, e a umidade entre 16–51%. As diretrizes do National Institute of Health para o cuidado e uso de animais de laboratório foram seguidas, com todos os experimentos realizados conforme orientação do Institutional Animal Care and Use Committee da University of Illinois, Urbana-Champaign (UIUC, protocolo IACUC: 22183). Os camundongos foram aclimatizados ao biotério da UIUC por 2 semanas antes dos experimentos. DIM e DIE foram dissolvidos em 5% de DMSO em óleo de milho e injetados intraperitonealmente a 25 mg/kg uma vez ao dia durante três dias. Após 4 h da terceira injeção, os camundongos foram sacrificados para coleta de soro, fígados e intestinos. TCPOBOP foi dissolvido em óleo de milho e injetado intraperitonealmente a 3 mg/kg uma vez, e os fígados foram coletados após 3 dias para estudos posteriores. Quando utilizado para bloquear a atividade do CAR, androstenol a 100 mg/kg foi injetado intraperitonealmente 15 min antes do primeiro tratamento com DIM ou DIE. O RNA dos fígados dos camundongos foi isolado usando reagente TRIzol (Invitrogen) conforme instruções do fabricante. 3–5 µg de RNA foram usados para sintetizar cDNA com primers aleatórios (NEBioLabs) e kits Maxima Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific). O cDNA foi posteriormente diluído, e 50 ng foram usados para qRT-PCR baseada em SYBR green (Thermo Fisher Scientific). A expressão gênica relativa foi calculada pelo método delta Ct e normalizada aos níveis de 36b4 como controles de carregamento. Os primers de qPCR para análise de expressão gênica estão listados na Tabela Suplementar 3.
Construção de plasmídeos de expressão
Os peptídeos do LBD do CAR humano e do SRC1 foram clonados em um vetor pET28-MHL (acesso GenBank EF456735), que foi primeiramente linearizado por digestão com BseRI (NEB, R0581S). O LBD do CAR humano (Lys108 – Ser352) foi amplificado por PCR a partir de cDNA com uma extensão N-terminal de 15 pb complementar ao esqueleto linearizado e uma extensão C-terminal de 15 pb complementar ao fragmento de SRC1. O peptídeo SRC1 (Ser682 – Ser700) com um linker upstream de 10 resíduos (N-SGGSGGSSHS-C) foi amplificado por PCR a partir de um plasmídeo pLIC-PXR_link_SRC1 gentilmente fornecido pelo Laboratório Redinbo (UNC Chapel Hill). O fragmento de SRC1 foi amplificado com uma extensão N-terminal de 15 pb complementar ao LBD do hCAR e uma extensão C-terminal de 15 pb complementar ao vetor linearizado. Os fragmentos de DNA foram combinados e inseridos em um vetor pET28-MHL por In-Fusion HD Cloning (Takara Bio, CA, EUA). A construção final contém um LBD do hCAR marcado com HIS6 fundido ao peptídeo SRC1 por um linker flexível de 10 resíduos.
Um plasmídeo de expressão pET28-MHL hPXR LBD-SRC1 foi feito amplificando o cassete hPXR LBD-SRC1 do vetor pLIC com extensões de 15 pb complementares a cada extremidade do esqueleto pET28-MHL digerido com BseRI. O DNA amplificado foi inserido no vetor pET28-MHL por In-Fusion HD Cloning.
Pull-downs
Os vetores hCAR LBD-SRC1 e hPXR LBD-SRC1 foram transformados em células BL21(DE3) (NEB, C2527) e culturas crescidas em meio LB a 37 °C até atingir uma DO600 de 1,0. A temperatura foi então reduzida para 17 °C, e as culturas foram induzidas com 0,1 mM de isopropil 1-tio-β-D-glucopiranosídeo (IPTG, BioShop IPT001) por 16 h. Os pellets bacterianos coletados foram ressuspensos em tampão contendo 20 mM de Tris/HCl (pH 8,2), 300 mM de NaCl, 5 mM de imidazol (BioShop, IMD508) e 0,5 mM de DTT (BioShop, DTT001). Após sonicação (5 min a 40% de amplitude usando ciclos de 10 s ligado/10 s desligado) e centrifugação a 18.000 × g a 4 °C por 20 min, os sobrenadantes foram incubados com amostras de microbioma intestinal (1:100, v-v) e 7 μL de esferas de agarose magnética de níquel HIS-select (H9914, Sigma-Aldrich) por 30 min a 4 °C, em seguida por 15 min à temperatura ambiente. Os fluxos passantes foram removidos usando um suporte magnético. Após lavar três vezes com 100 μL de tampão contendo 20 mM de Tris/HCl (pH 8,2), 300 mM de NaCl e 30 mM de imidazol, os complexos LBD-ligante marcados com His foram eluídos com 100 μL de tampão contendo 20 mM de Tris/HCl (pH 8,2), 300 mM de NaCl e 300 mM de imidazol usando um suporte magnético.
Análise por LC-MS
Preparação de amostras para LC-MS e análise de dados foram realizadas conforme descrito em uma publicação anterior, com pequenas modificações. Amostras de eluição (n = 3) foram carregadas em uma placa de dessalinização por centrifugação Zeba (Thermo Fisher Scientific, 7 K MWCO (89807)), em seguida centrifugadas a 1500 g a 4 °C por 2 min. As amostras dessalinizadas foram então evaporadas por SpeedVac e ressuspendidas em metanol grau HPLC (Fisher Chemical A4564). As amostras foram então carregadas em uma coluna de fase reversa (AccucoreTM Vanquish C18+, 1,5 µm 50 × 2,1 mm, Thermo Fisher) usando um sistema UPLC em metanol, e eluídas com um gradiente começando com 90% de fase móvel A (H2O (Fisher Chemical 022934-M6) contendo 0,1% de ácido fórmico (Fisher Chemical A11750)) e 10% de fase móvel B (metanol contendo 0,1% de ácido fórmico) no tempo zero, com uma taxa de fluxo de 0,15 mL/min, em seguida aumentando para 50% de fase móvel B em 2 min, 100% de fase móvel B em 5 min, depois mantida isocrática por 3 min antes de retornar a 90% de fase móvel A nos próximos 0,5 min, e finalmente mantida isocrática por 1,5 min. As temperaturas da coluna e dos compartimentos de amostra foram mantidas a 40 °C e 10 °C, respectivamente. Os dados foram adquiridos em modo de MS completo e monitoramento de reação paralela (PRM). A voltagem do spray (+) foi de 3,5 kV e a temperatura do capilar (+ ou +−) foi de 300 °C. Os parâmetros para a varredura de MS completo foram registrados na resolução R = 70.000 com um máximo de 3 × 10⁶ íons coletados em 200 ms, seguido pela varredura de MS/MS PRM registrada na resolução R = 17.500 (em m/z 247,1229) com um máximo de 3 × 10⁶ íons coletados em 200 ms. A análise de dados de metabolômica não direcionada foi realizada usando um programa R interno. Especificamente, arquivos brutos de MS foram convertidos para formato aberto (.mzXML). Características químicas foram detectadas com o pacote XCMS com precisão de massa de 2,5 ppm. As características foram correspondidas entre diferentes amostras com uma janela de tolerância de tempo de retenção de 0,5 min. Características metabólicas putativas foram selecionadas calculando a mudança de dobra das características dos tratamentos em relação aos controles. Apenas características com abundância 100 vezes maior (p < 0,01) usando CAR LBD versus controles foram consideradas verdadeiras características metabólicas.
Produção de proteína recombinante hCAR
Proteínas recombinantes foram expressas conforme descrito acima na seção de pulldown. As proteínas foram purificadas usando resina HisPur Ni-NTA (Thermo Fisher Scientific, 88222), seguidas por FPLC de exclusão por tamanho (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare, Life Sciences) equilibrada com 150 mM de NaCl, 50 mM de HEPES (pH 8,2) e 0,5 mM de DTT a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.
1 grama de extrato bruto de GM foi aplicado a uma coluna empacotada com 10 g de sílica e lavada com clorofórmio (CHCl3, Fisher Chemical, BPC298500). A amostra foi eluída serialmente em cinco frações usando 1 mL de fase móvel composta de CHCl3 e um gradiente crescente de MeOH. Cada fração foi analisada por LC/MS para identificar frações enriquecidas com as características de massa de interesse. Uma solução de CHCl3:MeOH 100:1 produziu a fração com maior enriquecimento. Esta fração foi ainda purificada em oito frações por cromatografia C8 de fase reversa (Luna 5 µm C8(2) 100 Å, 250 × 10 mm, Phenomenex) usando uma eluição gradiente de 20% H2O e 80% MeOH, aumentando para 100% MeOH ao longo de 20 min. Cada fração foi analisada por LC/MS para confirmar a presença e o rendimento relativo dos compostos alvo. As temperaturas da coluna e dos compartimentos das amostras foram mantidas a 20 °C e 4 °C, respectivamente. Os dados foram adquiridos em um comprimento de onda de 280 nm usando um detector DAD.
Análise de RMN das frações de GM isoladas
Espectros de RMN de 1H e 13C foram registrados em um Espectrômetro de RMN Agilent DD2 de 700 MHz (Agilent, Santa Clara CA, EUA). Os deslocamentos químicos são dados em valores de δ (ppm) relativos aos obtidos a partir do sinal do solvente [MeOH-d4 (δH 4.78; δC 49.2)]. Sequências de pulso padrão programadas no instrumento foram usadas para cada medição.
Síntese de novo de diindol
Uma solução de 1 mL de indol (0,25 mM) foi combinada com formaldeído, acetaldeído, propionaldeído ou n-/i-butiraldeído (0,2 mM) em água. As misturas foram agitadas em tubos selados a 37 ± 2°C em pH 4,4, 5,4, 6,4, 7,4 ou 8,4 por 1 e 6 h. Cada mistura de reação foi submetida à análise por LC-MS para determinar a abundância de produtos di-indol formados.
Produção de diindol por Lactobacillus
Todo o cultivo bacteriano ocorreu em câmara anaeróbica a 37 °C. O estoque bacteriano congelado de cada cepa foi estriado em placas de ágar MRS e incubado por 2 dias. As cepas foram reestiradas em placas frescas e incubadas por mais 2 dias. 10 mL de caldo MRS foram inoculados com uma única colônia de cada cepa e incubados durante a noite. 1 µL de cada cultura overnight foi adicionado a poços de uma placa de cultura de tecidos de fundo redondo de 96 poços em triplicata, contendo 99 µL de MRS ou MRS suplementado com 500 µM de indol. As placas foram cobertas, seladas e incubadas por 48 h. As bactérias foram ressuspendidas no meio por pipetagem suave para cima e para baixo em cada poço. Leituras de OD600 foram feitas usando um Leitor de Microplacas Infinite Pro 200 (Tecan, Männedorf, Suíça). Os lipídios foram extraídos da cultura usando uma mistura de CHCl3:MeOH:H2O (4:5:1) e centrifugados para separar as camadas orgânica e não orgânica. A camada inferior de clorofórmio contendo os compostos diindol foi cuidadosamente transferida para uma placa nova, evaporada a vácuo e depois ressuspendida em 100 µL de metanol. As placas foram armazenadas a −20 °C até a análise por LC-MS.
Ensaios de coativador hCAR por TR-FRET LanthaScreenTM
Ensaios de coativador LanthaScreenTM TR-FRET hCAR foram realizados de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, A15141). Os compostos teste foram incubados por 2 h à temperatura ambiente com GST-hCAR-LBD (5 nM), anticorpo anti-GST marcado com térbio (5 nM) e peptídeo coativador Fluoresceína-PGC1α (125 nM). As incubações foram realizadas em quatro réplicas técnicas. As emissões TR-FRET foram medidas usando um leitor de microplacas de fluorescência Tecan Infinite F200. Os resultados foram expressos como a razão da intensidade de fluorescência a 520 nm (emissão de fluoresceína excitada por emissões de térbio) e 495 nm (emissões de térbio).
TSAs de fluorescência
A proteína purificada hCAR LBD-SRC1 foi ensaiada em 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 e 1,8 mM KH2PO4, 0,5% DMSO, pH 7,4, a uma concentração final de 2,2 µM. SYPRO Orange foi usado a uma concentração final de 10× (Invitrogen, S6650). Cada amostra foi dividida em três réplicas de 25 µL. As soluções das amostras foram dispensadas em placas de reação óptica de 96 poços (Thermo Fisher Scientific, 4306737) e seladas com folhas de placa de PCR óptica (Thermo Fisher Scientific, AB-1170). Os experimentos de TSA foram realizados usando um sistema QuantStudio 12 K Flex Real Time PCR (Applied Biosystems). A temperatura foi aumentada de 25 °C para 95 °C a uma taxa de 0,3 °C/min, e a fluorescência do SYPRO orange foi monitorada. Os dados brutos de fluorescência e as temperaturas de fusão foram determinados usando ajuste de curva de regressão não linear com GraphPad Prism 9.
Calorimetria de titulação isotérmica
A proteína purificada hCAR-SRC1 (200–250 µM) foi dissolvida em 120 μL de PBS e suplementada com 0,5% DMSO. Todos os experimentos foram realizados em um instrumento MicroCal Auto-iTC200 (Malvern Panalytical, Malvern, Reino Unido) a 25 °C. Os ligantes foram usados a uma concentração de 50 μM. A proteína foi titulada nas células em uma série de 19 injeções (injeção 1 = 0,4 µL, injeção 2–19 = 2 µL) com intervalo de 180 s. Experimentos de controle realizados pela injeção da proteína na solução de ligante produziram calores de diluição insignificantes, e as respostas de calor foram subtraídas. Os efeitos de calor integrados foram analisados usando o software Microcal Origin 7 (Malvern Instruments).
HDX-MS bottom-up
A proteína CAR humana foi preparada a 10 µM em acetato de amônio 100 mM pH 7,25 e diluída em tampão de equilíbrio (tampão fosfato 10 mM, pH 7,5) ou tampão de reação deuterado (tampão fosfato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 em D2O). Após tempos de marcação de 1, 10 ou 30 min a 25 °C, as amostras foram misturadas com volumes iguais de tampão de parada (tampão fosfato 100 mM, pH 2,5) a 0 °C. Para amostras de complexo proteína-ligante, hCAR foi misturada 1:10 com CITCO ou composto DIE a uma concentração final de 100 µM com 2% de DMSO. O HDX-MS foi realizado usando um sistema comercial HDX da Waters (M-class ACQUITY UPLC e Water Cyclic IMS Mass Spectrometer). A leucina encefalina foi usada para correção de massa, e todos os pontos de tempo foram realizados em triplicata. As amostras foram digeridas usando uma coluna de pepsina Enzymate BEH (2,1 × 30 mm, Waters) a 15 °C. Os peptídeos foram dessalinizados em uma pré-coluna ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard (2,1 × 5 mm, Waters) e separados usando uma coluna ACQUITY UPLC BEH C18 (100 × 1 mm, Waters). O servidor ProteinLynx Global (PLGS) e o software DynamX foram usados para identificação de peptídeos e análise de captação de deutério, respectivamente. O PyMOL 2.5 foi usado para visualização estrutural.
Plasmídeos repórteres de genes de mamíferos
Os plasmídeos GAL4-hCAR, UAS-Luc, pcDNA-GAL4, pGL4-Renilla-Luc e pGEM foram gentilmente fornecidos pelo Dr. David Mangelsdorf. O plasmídeo GAL4-hCAR codifica um DBD quimérico da GAL4 de levedura expresso constitutivamente fundido a um LBD da hCAR. O plasmídeo UAS-Luc codifica um repórter de luciferase de vagalume sob o controle de um elemento de resposta GAL4. O plasmídeo pcDNA codifica um DBD da GAL4 expresso constitutivamente e foi usado como vetor controle para determinar a luminescência inespecífica em todos os ensaios repórteres celulares HEK293T. O plasmídeo pGL4-Renilla-Luc codifica um repórter de luciferase Renilla expresso constitutivamente e foi usado como controle de transfecção nos ensaios repórteres celulares HEK293T. O plasmídeo pGEM não contém cassetes de expressão de mamíferos e foi usado como plasmídeo de preenchimento para transfecções.
Ensaios repórteres de genes por transfecção dupla em HEK293T
Células HEK293T (ATCC, CRL-3216) foram semeadas a uma densidade de 40.000 células por poço em microplacas brancas de fundo chato de 96 poços (Greiner CellStar, 655073) em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (2,5 g/L de glicose) suplementado com 10% de soro fetal bovino tratado com carvão e 100 unidades/mL de penicilina, e incubadas por 24 h a 37 °C. A transfecção foi realizada utilizando 0,3 µL/poço de Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, 11668019). As células foram transfectadas com 10 ng/poço de pcDNA ou GAL4-hCAR, 50 ng/poço de UAS-Luc, 5 ng/poço de pGL4-Renilla-Luc e 85 ng/poço de pGEM, totalizando 150 ng/poço de DNA. Após uma breve incubação (5 h), o meio foi suavemente aspirado de cada poço e os compostos teste foram adicionados em meio suplementado com 1 µM de PK11195. As células foram incubadas por 16 horas para permitir o acúmulo de luciferase e, em seguida, processadas usando o Sistema Dual-Glo Luciferase Assay (Promega, E2940) de acordo com as instruções do fabricante. As incubações foram realizadas em quatro réplicas técnicas.
Os ensaios de transfecção de PXR foram realizados em células HEK293T conforme publicado anteriormente, com as seguintes modificações. 30.000 células por poço em placa de 96 poços foram transfectadas usando 200 ng/poço do plasmídeo Gal4-hPXR-LBD, 100 ng/poço do plasmídeo de expressão de β-Gal e 700 ng/poço do repórter TK-(MH100)4-LUC. Após 24 h de transfecção usando Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, 11668019), as células foram expostas aos compostos teste por 24 h. O Sistema Neolite Reporter Gene Assay (PerkinElmer, 6016716) foi utilizado para determinar as atividades de luciferase usando um leitor de placas (Perkin Elmer, X5 2030 Multilabel Reader). Os dados foram expressos como média ± DP de RLU (unidades relativas de luz do ensaio de luciferase) normalizados para a atividade de β-Gal no mesmo poço.
Ensaios estáveis de gene repórter HG5LN
As linhagens celulares HG5LN, HG5LN hCAR e HG5LN hPXR foram estabelecidas conforme descrito anteriormente. Brevemente, a linhagem celular HG5LN foi estabelecida pela integração de um gene repórter de luciferase responsivo a GAL4 (GAL4RE5-bGlob-Luc-SV-Neo) em células HeLa. As células HG5LN foram então transfectadas de forma estável usando um plasmídeo pSG5-GAL4 (DBD)-hCAR/hPXR (LBD)-puromicina, e clones estáveis foram selecionados na presença de 0,5 μg/mL de puromicina. As linhagens celulares foram semeadas a uma densidade de 40.000 células por poço em placas brancas opacas de 96 poços e tratadas com compostos teste após 24 h. Após incubação com os compostos teste, as células foram incubadas por 16 h, o meio de cultura foi substituído por meio teste contendo solução de 0,3 μM de luciferina e a fluorescência foi quantificada.
Transfecção transiente em células HepG2
Células HepG2 (ATCC, HB-8065) semeadas em placas de 24 poços foram transfectadas com o construto repórter CYP2B6-2.2 kb contendo tanto um módulo intensificador responsivo a PB quanto o XREM distal na presença do vetor de expressão hCAR1+A e do vetor de luciferase renilla pRL-TK (Promega) usando o Reagente de Transfecção de DNA X-tremeGENE 9 (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) antes do tratamento com DMSO 0,1%, CITCO (1 µM), DIM ou DIE (1, 5 e 10 µM) por mais 24 h. As atividades das luciferases firefly e renilla foram detectadas usando o Kit Dual-Luciferase (Promega).
Ensaios estáveis do gene repórter H4IIE
Os bioensaios H4IIE-luc foram realizados de acordo com métodos previamente descritos. Resumidamente, células tripsinizadas (20.000 células por poço) foram semeadas nos 60 poços internos de placas de 96 poços. Após 24 h de incubação, os poços teste e controle foram dosados com compostos teste por 72 h e a luminescência da luciferase foi quantificada. As respostas do bioensaio H4IIE-luc (expressas como unidades de luminescência relativa média) foram convertidas em alterações de dobra (fold change) do grupo dosado com veículo.
Ensaio de hepatócitos humanos primários (PHH)
A cultura de PHH, extração de RNA e análises de expressão gênica foram realizadas conforme descrito anteriormente. As sequências de primers para cyp2b6, cyp3a4, sult2a1 e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapdh) são mostradas na Tabela Suplementar 3. Os valores de expressão foram quantificados usando o método 2ΔΔCt, normalizando para gapdh como gene de referência e determinando a alteração de dobra (fold change) em comparação com os valores controle (n = 3).
24 h após a semeadura a 0,25 × 106 células/poço em placa biocoat de 24 poços, os PHHs foram infectados com 2 µL de hCAR marcado com proteína fluorescente amarela aprimorada adenoviral (Ad/EYFP-hCAR), seguido de tratamento com DMSO 0,1%, fenobarbital (PB) (1 mM), DIM (10 µM) ou DIE (10 µM) por 8 h. As células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato e fixadas por 30 min com formaldeído a 4% à temperatura ambiente e então coradas com 4,6-diamidino-2-fenilindol dicloridrato por 30 min após lavagem três vezes com solução salina tamponada com fosfato. A localização subcelular do hCAR e dos núcleos foi visualizada usando um microscópio de fluorescência invertido Nikon Eclipse Ti-E (Nikon, Edgewood, NY) nos canais de fluorescência YFP/FITC e DAPI. Os compostos foram adicionados à placa em triplicata e os resultados analisados conforme detalhado abaixo com fatores z calculados conforme descrito anteriormente.
Histologia
Os tecidos hepáticos foram fixados em formalina tamponada neutra a 10% por 24 h, processados e incluídos em parafina. Cortes de tecido hepático foram feitos com espessura de 5 µm e desparafinizados em xileno e etanol. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (H&E) de acordo com o protocolo do fabricante.
Estatística e reprodutibilidade
Testes de ANOVA de uma via com testes de comparações múltiplas (para >3 grupos) e testes t não pareados bicaudais (para 2 grupos) foram realizados conforme especificado nas legendas das figuras, utilizando o Prism 9 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Todos os dados foram apresentados como médias ± EPM ou médias ± DP conforme especificado nas legendas das figuras. Os dados foram considerados significativos se p < 0,05. Pelo menos três experimentos independentes foram realizados nos ensaios de pulldown, TSA, repórter de luciferase e produção de diindol por Lactobacillus. Dois experimentos independentes foram realizados nos ensaios de ITC, HDX-MS, TR-FRET e localização subcelular. Os ensaios de localização subcelular do CAR em hepatócitos primários humanos foram alocados aleatoriamente em grupos experimentais. As imagens foram coletadas sem viés e as análises realizadas por análises cegas. Todas as tentativas de replicação foram bem-sucedidas. Para os experimentos com camundongos, o tamanho amostral foi determinado com base em estudos anteriores. Todas as réplicas biológicas que comprovam a reprodutibilidade estão descritas em cada legenda de figura. Nenhum dado foi excluído nas outras análises.
Resumo do relatório
Mais informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Resumo do Relatório do Nature Portfolio vinculado a este artigo.
Informações complementares
Nota do editor: A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Estes autores contribuíram igualmente: Jiabao Liu, Ainaz Malekoltojari.
Estes autores supervisionaram conjuntamente este trabalho: Hui Peng, Henry M. Krause.
Informações complementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1038/s41467-024-46559-3.
Contribuições dos autores
J.L., S.M., P.B., D.W., W.N., H.W., H.P., S.A. e H.K. planejaram os experimentos. J.L. e A.M. realizaram os experimentos de expressão proteica, caracterização, pulldown e identificação de ligantes mostrados na Fig. 1 e Figs. Complementares 1–3, e realizaram os experimentos nas Figs. 4a–f e Fig. Complementar 3. J.L. também realizou isolamentos, purificações e caracterizações descritos na Fig. 1, Fig. Complementar 2 e Tabela 1, e realizou os experimentos mostrados na Fig. 2 e Fig. Complementar 5. A.M. também realizou experimentos descritos na Fig. 5b e Fig. Complementar 6a. V.C. realizou os experimentos de HDX nas Figs. 3g, h. L.L. realizou os experimentos nas Figs. 4a, c, d. M.G. realizou os experimentos na Fig. Complementar 6b, c. H.L. realizou os experimentos na Fig. Complementar 6d. H.B. e J.S. realizaram os experimentos na Fig. Complementar 6e. A.A. e N.D. realizaram os experimentos nas Figs. 5 e Figs. Complementares 7, 8 e 10. J.C. realizou os experimentos na Fig. Complementar 9. J.L. e A.M. escreveram o manuscrito inicial. H.M.K. revisou e editou o manuscrito.
Revisão por pares
Informações sobre a revisão por pares
A Nature Communications agradece a Francesca Ronchi, Oscar Yanes e ao outro revisor anônimo por sua contribuição à revisão por pares deste trabalho. Um arquivo de revisão por pares está disponível.
Disponibilidade de dados
Os dados metabolômicos gerados neste estudo foram depositados no MassIVE sob o código de acesso ID: MSV000091840 (10.25345/C5NV99M7M). A estrutura proteica utilizada neste estudo foi depositada no PDB sob o código 1XVP
Disponibilidade de código
O código utilizado na análise de pulldown está disponível em https://github.com/huiUofT/humanCAR.
Interesses concorrentes
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Referências
Interações metabólicas entre hospedeiro e microbiota intestinal
Microbiota intestinal na saúde e doença metabólica humana
O microbioma intestinal humano: da associação à modulação
Ativação dos xenorreceptores CAR e PXR e consequências no metabolismo lipídico, homeostase da glicose e resposta inflamatória
A ativação do receptor nuclear CAR melhora o diabetes e a doença hepática gordurosa
PXR e CAR no metabolismo energético
O receptor constitutivo de androstano regula a resposta da mucosa intestinal a lesões
Flora intestinal, receptores Toll-like e receptores nucleares: uma comunicação tripartite que ajusta a imunidade inata no intestino grosso
A deleção do receptor constitutivo de androstano levou a alterações intestinais e aumento de imidacloprido no fígado murino
Compreendendo as funções fisiológicas dos receptores nucleares sensores de xenobióticos do hospedeiro PXR e CAR no microbioma intestinal usando camundongos geneticamente modificados
CAR direciona a adaptação das células T aos ácidos biliares no intestino delgado
A hepatomegalia induzida por TCPOBOP e a proliferação de hepatócitos são atenuadas pela interrupção combinada da sinalização de MET e EGFR
Construção e caracterização de uma proteína tetrada PXR/SRC-1 totalmente ativa com estabilidade aumentada
Identificação de um novo agonista do receptor constitutivo de androstano humano (CAR) e seu uso na identificação de genes alvo do CAR
Perfil do bisfenol A e oito de seus análogos na atividade transcricional via receptores nucleares humanos
O ligante do receptor periférico de benzodiazepina 1-(2-clorofenil-metilpropil)−3-isoquinolina-carboxamida é um novo antagonista do receptor constitutivo de androstano humano
Mapeamento personalizado do metabolismo de drogas pelo microbioma intestinal humano
Moduladores de moléculas pequenas do receptor constitutivo de androstano
Quantificação por LC-MS/MS de sulforafano e metabólitos de indol-3-carbinol em plasma e urina humanos após ingestão dietética de brócolis fortificado com selênio
Conversão pós-ingestão de indóis dietéticos em agentes anticancerígenos
Vibrindol A, um metabólito da bactéria marinha Vibrio parahaemolyticus, isolado do muco tóxico do peixe-cofre Ostracion cubicus
Indóis naturais da bactéria Pseudovibrio denitrificans P81 isolada de uma esponja marinha, espécie Aaptos
Modulação de um soluto urêmico circulante via manipulação genética racional da microbiota intestinal
Zhou, Y. & Chen, C. Distribuição de aldeídos alifáticos de cadeia curta no trato gastrointestinal de suínos (P06-033-19). Curr. Dev. Nutr.3, nzz031 (2019).
Formação in vitro de acetaldeído por bactérias colônicas humanas
CINPA1 se liga diretamente ao receptor constitutivo de androstano e inibe sua atividade
Medição direta da energia de ligação proteica por calorimetria de titulação isotérmica
A dinâmica da hélice 11 é crítica para a atividade do receptor constitutivo de androstano
Translocação nuclear do receptor CAR responsiva ao fenobarbital na indução do gene CYP2B
Um único aminoácido controla a troca funcional do receptor constitutivo de androstano humano (CAR) 1 para a variante de splicing sensível a xenobióticos CAR3
Diindolilmetano, um composto natural, induz a expressão dos genes CYP3A4 e MDR1 ao ativar o PXR humano
Um modulador seletivo do receptor de hidrocarboneto arílico, 3,3’-diindolilmetano, inibe o crescimento de células de câncer gástrico
Regulação da expressão do gene sulfotransferase por hormônios glicocorticoides e xenobióticos em cultura primária de hepatócitos de rato
O receptor nuclear órfão humano PXR é ativado por compostos que regulam a expressão do gene CYP3A4 e causam interações medicamentosas
O receptor nuclear CAR medeia a indução específica de xenobióticos no metabolismo de fármacos
Metabólitos de androstano se ligam e desativam o receptor nuclear CAR-beta
Indução mediada por PXR do CYP3A4 humano e Cyp3a11 de camundongo pelo glicocorticoide budesonida
Os receptores nucleares órfaos receptor constitutivo de androstano e receptor de pregnano X compartilham ligantes xenobióticos e esteroides
Regulação do receptor constitutivo de androstano e seus genes alvo por jejum, cAMP, fator nuclear alfa de hepatócito e o coativador receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo coativador-1alfa
Regulação do receptor de vitamina D da sulfotransferase de esteroides/ácidos biliares SULT2A1
A ativação de CAR e beta-catenina induz crescimento hepático descontrolado e tumorigênese
O estresse xenobiótico induz hepatomegalia e tumores hepáticos através do receptor nuclear constitutivo de androstano
Propriedades quimiopreventivas do 3,3’-diindolilmetano no câncer de mama: evidências de estudos experimentais e humanos
Acetaldeído, micróbios e câncer do trato digestivo
Indóis: metabólitos produzidos por bactérias intestinais capazes de controlar a manifestação de doenças hepáticas
Direcionar a aldeído desidrogenase-2 hepática previne o consumo pesado, mas não moderado, de álcool
O CYP2B10 hepático é altamente induzido pelo etanol em binge e contribui para a lesão hepática aguda-sobre-crônica induzida pelo álcool
O receptor nuclear órfão constitutivo ativo/de androstano é essencial para a promoção de tumores hepáticos pelo fenobarbital em camundongos
O fenobarbital ativa indiretamente o receptor constitutivo ativo de androstano (CAR) pela inibição da sinalização do receptor do fator de crescimento epidermal
Tzameli, I., Pissios, P., Schuetz, E. G. & Moore, D. D. O composto xenobiótico 1,4-bis[2-(3,5-dicloropiridiloxi)]benzeno é um ligante agonista para o receptor nuclear CAR. Mol. Cell. Biol.20, 2951–2958 (2000).
Ativação sinérgica do receptor X de pregnano humano por coquetéis binários de compostos farmacêuticos e ambientais
Avaliando a seletividade de ligantes farmacêuticos de FXR, LXRs, CAR e RORgama com linhagens celulares repórteres
Um novo módulo intensificador distal regulado pelo receptor X de pregnano/receptor androstano constitutivo é essencial para a indução máxima da expressão do gene CYP2B6
Compostos ativos para AhR recém-identificados nos sedimentos de uma área industrial usando análise dirigida por efeito
Análise de alto conteúdo da translocação do receptor androstano constitutivo (CAR) identifica o citrato de mosaprida como um agonista de CAR que reprime a gliconeogênese
O receptor androstano constitutivo regula diferencialmente a homeostase dos ácidos biliares em modelos murinos de colestase intra-hepática
A ativação de CAR e β-catenina induz crescimento hepático descontrolado e tumorigênese
Peng, H. Diindóis produzidos a partir de metabólitos da microbiota comensal funcionam como ligantes endógenos de CAR/Nr1i3. 10.5281/zenodo.10684290 (2024).