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pmid: "38796426"
title: "A co-entrega mediada por nanopartículas de sílica porosa revestidas por exossomos de 3,3'-diindolilmetano e doxorrubicina atenua a EMT impulsionada por células-tronco cancerígenas no câncer de mama triplo-negativo."
authors: "Sarkar R, Biswas S, Ghosh R, Samanta P, Pakhira S, Mondal M, Dutta Gupta Y, Bhandary S, Saha P, Bhowmik A, Hajra S"
journal: "Journal of nanobiotechnology"
pubdate: "2024 May 25"
doi: "10.1186/s12951-024-02518-0"
source: "PMC Full Text"

A co-entrega mediada por nanopartículas de sílica porosa revestidas por exossomos de 3,3'-diindolilmetano e doxorrubicina atenua a EMT impulsionada por células-tronco cancerígenas no câncer de mama triplo-negativo.

Autores

Sarkar R, Biswas S, Ghosh R, Samanta P, Pakhira S, Mondal M, Dutta Gupta Y, Bhandary S, Saha P, Bhowmik A, Hajra S

Periodico

Journal of nanobiotechnology (2024 May 25)

Conteudo

Exosome-sheathed porous silica nanoparticle-mediated co-delivery of 3,3′-diindolylmethane and doxorubicin attenuates cancer stem cell-driven EMT in triple negative breast cancer

Contexto
O manejo terapêutico do câncer de mama triplo negativo (CMTN) localmente avançado e metastático é frequentemente limitado devido à resistência à quimioterapia convencional. A metástase é responsável por mais de 90% da mortalidade associada ao câncer de mama; portanto, a necessidade clínica de prevenir ou direcionar a metástase é imensa. A transição epitélio-mesenquimal (EMT) das células-tronco cancerígenas (CTCs) é um determinante crucial na metástase. A doxorrubicina (DOX) é o medicamento quimioterápico frequentemente usado contra o CMTN que pode aumentar o risco de metástase em pacientes. Após o tratamento do câncer, as CTCs com a característica de EMT persistem, o que contribui para a malignidade avançada e a recorrência do câncer. Os últimos desenvolvimentos em nanotecnologia para aplicações medicinais levantaram a possibilidade de usar nanomedicamentos para atingir essas CTCs. Assim, apresentamos uma nova abordagem de tratamento combinatório de DOX com o indol dietético 3,3′-diindolilmetano (DIM), que é um campo intrigante de pesquisa que pode direcionar a indução de EMT mediada por CTCs no CMTN. Para a entrega eficiente de ambos os compostos ao nicho tumoral, um método avançado de liberação de fármacos baseado em exossomos revestidos com nanopartículas de sílica mesoporosas pode fornecer uma estratégia atraente.

Resultados
A DOX, de acordo com nossas descobertas, foi capaz de induzir EMT em CTCs, tornando as células de câncer de mama mais agressivas e metastáticas. Em CTCs produzidas a partir de esferas de MDAMB-231 e 4T1, a superexpressão de N-caderina, Snail, Slug e Vimentina, bem como a regulação negativa de E-caderina pelo tratamento com DOX, não apenas demonstrou indução de EMT, mas também ressaltou a necessidade premente de uma nova combinação quimioterápica para neutralizar esse efeito prejudicial da DOX. Para atingir esse objetivo, o DIM foi combinado com DOX e entregue às CTCs concomitantemente, carregando-os em nanopartículas de sílica mesoporosas encapsuladas em exossomos (e-DDMSNP). Esses exossomos melhoraram a especificidade, a estabilidade e a capacidade de homing do DIM e da DOX no nicho de CTCs in vitro e in vivo. Além disso, após tratar a população de células CMTN enriquecidas com CTCs com e-DDMSNP, foi observada uma diminuição notável na indução de EMT mediada por DOX.

Conclusão
Nossa pesquisa busca propor uma nova noção para tratar o CMTN, introduzindo esta preparação nano-exossômica única contra a EMT induzida por CTCs.

Resumo Gráfico

Informações Suplementares
A versão online contém material suplementar disponível em 10.1186/s12951-024-02518-0.

Introdução
O CMTN é um subtipo heterogêneo de câncer de mama que ocorre principalmente em mulheres jovens na pré-menopausa, com menos de 40 anos de idade. Apresenta um prognóstico ruim e compreende aproximadamente 15 a 20% de todos os carcinomas de mama. Pacientes com CMTN têm menor tempo de sobrevida em comparação com outros subtipos de câncer de mama. Embora no CMTN a taxa de mortalidade seja de 40%, aproximadamente 46% das pacientes sofrem uma recidiva ou metástase à distância nos primeiros 3 a 5 anos após o diagnóstico. Existem diversos tratamentos disponíveis para o câncer de mama; a remoção cirúrgica do tumor original é frequentemente necessária para o manejo da doença avançada. Infelizmente, pesquisas tanto de ambiente experimental quanto clínico indicaram que a cirurgia oncológica pode aumentar a chance de metástase e recorrência. As células cancerígenas se propagam do tumor primário para órgãos distantes por meio de um processo complexo chamado metástase, que é dividido em várias fases, como a separação das células tumorais do tumor primário, migração, invasão, intravasão, sobrevivência na vasculatura, extravasão e colonização de sítios secundários. Uma geração disruptiva de alterações genéticas e epigenéticas nas células tumorais (fatores intrínsecos) e um microambiente caótico (sinais extrínsecos) transformam as células cancerígenas em metastáticas durante essa cascata metastática. A questão principal na pesquisa do câncer de mama é determinar os sinais extrínsecos e intrínsecos que causam a metástase do câncer de mama.

As células-tronco cancerígenas (CTCs) são um subconjunto da massa tumoral que possuem a capacidade de autorrenovação, diferenciação em outros tipos celulares e são responsáveis pelo início, progressão e metástase do câncer. Hipotetiza-se que as CTCs permanecem dormentes durante a quimioterapia, permitindo que continuem a gerar câncer após o término do tratamento. A dormência é uma condição na qual as células tumorais estão ocultas e imperceptíveis ao longo do desenvolvimento do tumor ou após a terapia, e essa condição pode ser observada no CMTN. A transição epitélio-mesenquimal (TEM) é uma fase importante na metástase, pois implica uma mudança nos padrões de expressão gênica que leva a células com maior mobilidade. Após seu descolamento dos sítios primários, as CTCs que sofreram indução da TEM devem passar pelos sistemas linfático e circulatório para se disseminar. Portanto, há evidências crescentes de uma correlação entre essas TEM e as CTCs. Além disso, a biologia da metástase do câncer pode ser melhor compreendida por meio de estudos moleculares e funcionais aprofundados da indução da TEM nas CTCs. Assim, a descoberta de modalidades terapêuticas alternativas para direcionar as CTCs oferece uma estratégia promissora para combater e eliminar a metástase do câncer. A principal forma de tratamento para pacientes com CMTN é a quimioterapia sistêmica citotóxica convencional. Elas são primariamente suscetíveis à quimioterapia convencional, mas a suscetibilidade inicial a esse tratamento não se correlaciona com a sobrevida global em pacientes com CMTN que obtiveram remissão completa.
Entre os fármacos quimioterápicos sistêmicos, a doxorrubicina (DOX), um antibiótico antraciclina, é comumente usada como tratamento de primeira linha em pacientes com TNBC. Ela causa inibição da topoisomerase II, produção de radicais livres e intercalação de DNA e proteínas. No entanto, o uso clínico da DOX é limitado devido ao desenvolvimento de toxicidade miocárdica em pacientes, bem como efeitos citotóxicos em células normais, levando a efeitos colaterais indesejados que podem impactar substancialmente a saúde e a qualidade de vida do paciente. A DOX é tão importante na quimioterapia do câncer; é crucial reduzir sua toxicidade para as células normais. A administração concomitante de antioxidantes ou outros sequestradores de radicais livres pode ajudar a atingir esse objetivo. De acordo com pesquisas epidemiológicas, o consumo de vegetais crucíferos pode ajudar a prevenir várias doenças crônicas, especialmente o câncer. Um dos principais constituintes de vegetais crucíferos como repolho, couve-flor, rabanete, mostarda, nabo, brócolis é o 3,3′-diindolilmetano (DIM), que tem a capacidade de conter o efeito da DOX. Chu et al. relataram que o DIM é capaz de atingir as CSCs em vários cânceres humanos. De acordo com Thekkekkara et al., o DIM é um composto não tóxico e tem potencial radioprotetor devido à sua propensão a sequestrar radicais livres e interromper muitas cascatas de sinalização que resultam em danos celulares causados pela radiação ionizante. Também é fascinante que certos compostos que demonstraram ter um efeito calmante na hepatotoxicidade induzida por DOX, como extratos de plantas medicinais, produtos naturais e produtos químicos. Nesse aspecto, o DIM poderia ser uma combinação eficaz com a DOX que pode aumentar a eficácia anti-TNBC desta. Além disso, é intrigante descobrir se essa terapia combinatória poderia ser uma medida eficaz para tratar a EMT mediada por CSC no TNBC.

A baixa solubilidade do fármaco, meia-vida e resistência ao fármaco devido à ligação insuficiente do fármaco com os ligantes específicos dos tumores são as principais causas das limitações na potência dos medicamentos anticancerígenos. Testes de nanoformulações como hidrogéis, adesivos de microagulhas, polímeros biodegradáveis, microesferas e nanopartículas foram conduzidos na tentativa de encontrar uma solução adequada para todos esses problemas clínicos. Embora a eficácia das nanoformulações tenha sido demonstrada em estudos pré-clínicos, seu uso em ensaios clínicos tem sido dificultado pela toxicidade e efeitos fora do alvo.
Todos os desafios mencionados anteriormente validam o desenvolvimento de novos e aprimorados nanocarreadores com características adequadas, incluindo baixa toxicidade, meia-vida prolongada e biocompatibilidade. Para direcionar ligantes específicos, a criação de nanocarreadores modificados pode ser uma solução. Para atender a essas necessidades, pesquisadores inventaram vesículas extracelulares, os exossomos, como sistema de entrega para diversos quimioterápicos. Exossomos são vesículas lipídicas derivadas de membrana com um diâmetro de aproximadamente 40–200 nm, secretadas por vários tipos celulares e existentes tanto in vitro quanto in vivo. Além das propriedades como contribuição para a homeostase e desenvolvimento de doenças incluindo câncer e distúrbios neurodegenerativos, essas vesículas estão sendo exploradas para melhor entrega de cargas terapêuticas a células ou tecidos específicos, aproveitando sua capacidade endógena de direcionamento tecidual. Exossomos são agentes de entrega eficazes com tamanho pequeno e maior biocompatibilidade em comparação com outras nanoformulações.
Considerando as considerações acima, sintetizamos nanopartículas de sílica mesoporosa carregadas com DIM e DOX encapsuladas em exossomos (e-DDMSNP) para direcionamento a células cancerígenas e CSCs. Deve-se notar que, após a administração de DOX, a expressão de diferentes marcadores de EMT, como N-caderina, Snail, Slug e Vimentina, foi regulada positivamente, enquanto a expressão do nível de E-caderina diminui nas populações de CSCs. Para confirmar isso, é monitorado o estudo in vitro de indução de EMT, metástase em camundongos portadores de tumores após tratamento com DOX. Como o marcador de câncer de mama BRCA1 é superexpresso no pulmão de camundongos que recebem tratamento com DOX, observou-se que o DOX aumenta o risco de metástase. Por outro lado, após o tratamento com o e-DDMSNP, a taxa de formação de esferas mediada por CSC foi notavelmente prejudicada, indicando a inibição da staminalidade. Mais significativamente, no modelo in vivo tratado com e-DDMSNP, os camundongos apresentaram supressão do início e progressão tumoral, do tempo de sobrevida mediano e da metástase. Portanto, esta estratégia de direcionamento a CSCs mediada por e-DDMSNP pode abrir um novo caminho para prevenir a metástase tumoral.
Materiais e métodos
Síntese de nanopartícula de sílica mesoporosa à base de PEG-PLGA carregada com DIM e DOX
As nanopartículas de sílica mesoporosa (MSNPs) foram sintetizadas modificando o procedimento relatado por Stӧber et al.. Em uma solução de brometo de cetil trimetil amônio (CTAB) e acetato de amônio a 10%, foi adicionado hidróxido de sódio 1 N gota a gota para ajustar o pH para aproximadamente 11. Esta solução foi então agitada magneticamente por 1 h a 75 °C. Depois disso, tetraetil ortossilicato (TEOS) foi adicionado à solução imediatamente seguido pela adição gota a gota de 3-aminopropil trietoxissilano (APTES) e agitado por mais 2 h à temperatura ambiente. Em seguida, a solução foi submetida à centrifugação e o pellet resultante foi redisperso em metanol. Para remover o excesso de moléculas de surfactante, foi realizada lavagem com metanol por centrifugações repetidas. O sobrenadante foi então descartado e as MSNPs foram secas ao ar.
Após isso, 20 mg de MSNPs foram dispersas em 4 ml de água duplamente destilada (dH2O) em um balão de fundo redondo usando um agitador magnético. A solução de DIM a 1 mM foi adicionada gota a gota e a solução foi agitada por 2–3 h. A solução foi então coletada em microtubos e centrifugada, e o pellet de DIM encapsulado em MSNP (NDIM) foi coletado e seco ao ar. No caso do DOX encapsulado em MSNP (NDOX), usando um agitador magnético, 20 mg de MSNPs foram dissolvidas em 4 ml de dH2O em um balão de fundo redondo. A solução de DOX a 1 mM foi adicionada gota a gota na solução e agitada por 2–3 h. Em seguida, foi novamente centrifugada e o sobrenadante foi descartado. O pellet de NDOX foi seco ao ar.
Além disso, 25 mg de MSNPs foram dispersos separadamente em 10 ml de etanol e solução de DOX (1 mM) foi adicionada gota a gota e agitada por 2 h no escuro. A superfície das MSNPs carregadas com DOX foi funcionalizada com grupos amino adicionando 20 µl de solução de 3-aminopropil trietoxissilano (APTES) previamente preparada em etanol. A mistura resultante foi deixada em agitação por mais 6 h. As MSNPs funcionalizadas com amino e carregadas com DOX (DOX-fMSNPs) foram isoladas por centrifugação. O pellet foi deixado para secar ao ar. As DOX-fMSNPs foram redispersas em 4 ml de dH2O em um balão de fundo redondo. Em seguida, solução de DIM 1 mM foi adicionada gota a gota a esta solução e, simultaneamente, 100 µl de solução de PEG-PLGA a 1 mg/ml foram adicionados à mistura e continuou a ser agitada por mais 2 h. Após isso, a solução foi centrifugada e o pellet foi deixado para secar ao ar naturalmente para gerar o produto final, MSNPs encapsuladas com PEG-PLGA e carregadas com DIM e DOX (DDMSNPs).

Caracterização das MSNPs vazias e DDMSNPs

Para este fim, as amostras foram preparadas pressionando-as em pastilhas de KBr na proporção de 2:8. Em seguida, foram escaneadas entre 4000 e 400 cm−1 com resolução de 4 cm−1. As características morfológicas das MSNPs e DDMSNPs foram observadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) modelo FEI Quanta 250 (EUA). Antes de registrar as imagens, as amostras foram revestidas com ouro por pulverização catódica e, em seguida, observadas por MEV. A concentração de DIM e DOX foi determinada usando espectrofotômetro UV-Vis (Shimadzu UV 1800, Japão). Para determinar a morfologia das MSNPs e DDMSNPs, foi utilizado o microscópio eletrônico de transmissão (MET) JEOL JEM-2100 (JEOL, Inc., Peabody, MA, EUA) com tensão de aceleração de 300 kV. Uma gota da suspensão de nanopartículas foi dispersa em água DI, liofilizada e montada em um filme fino de carbono amorfo depositado em uma grade de cobre (300 malhas). Após isso, as grades foram secas em condições limpas e examinadas diretamente com o MET. O Nano Zetasizer (Malvern Instruments, Malvern, Reino Unido) foi aplicado para realizar espalhamento de luz dinâmico (DLS) para identificar o tamanho das MSNPs. Os grupos estruturais mais importantes responsáveis pela funcionalidade foram identificados analisando o espectro infravermelho obtido no modo de transmissão com um espectrômetro de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) (FTIR-8400S, Shimadzu).

Análise da porcentagem de carga de fármaco

DDMSNPs foram dispersas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e a porcentagem de carga de fármaco foi medida usando um espectrofotômetro UV-Vis (Shimadzu UV 1800, Japão) a 235 nm e 496 nm usando a fórmula:onde a concentração total de fármaco (livre + encapsulado) no sistema, , e a no filtrado, .

Estudo de liberação de fármaco
O estudo de liberação do fármaco do DDMSNP foi realizado suspendendo os MSNPs carregados com DIM-DOX em 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) de pH 7,4, em triplicata, e agitados a 37 °C em condição escura. Em intervalos de tempo determinados, o sobrenadante foi removido e a absorbância registrada em 235 nm e 496 nm para as soluções de DIM e DOX, respectivamente. A porcentagem de liberação dos fármacos foi calculada utilizando a seguinte equação: onde [Fármaco]t é a concentração total do fármaco e a concentração do fármaco medida a cada hora.

Estudo in vitro

Cultura de células e reagentes

As linhagens celulares de câncer de mama humano MDAMB-231, linhagem celular epitelial mamária de camundongo 4T1 e linhagem celular de melanoma murino B16 foram cultivadas em RPMI-1640 ou DMEM (Invitrogen) suplementados com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (Gibco, EUA) e 1% de penicilina/estreptomicina em 5% de CO2 a 37 °C.

A linhagem celular epitelial mamária MCF-10A foi cultivada em meio Eagle modificado por Dulbecco/Mistura de Nutrientes F-12 Ham suplementado com 100 ng/ml de toxina colérica (Sigma, St. Louis, MO, EUA), 10 ng/ml de fator de crescimento epidérmico (EGF) (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA), 10 µg/ml de insulina, 500 ng/ml de hidrocortisona e 5% de soro de cavalo inativado pelo calor (todos da Sigma).

Análise por citometria de fluxo

As células MDAMB-231 e 4T1 foram tripsinizadas e coletadas em microtubos após tratamento com DOX e DDMSNP. O meio foi então removido por centrifugação e 500 µl de PBS foram adicionados. O sobrenadante foi então removido, e paraformaldeído a 4% foi adicionado e incubado por 10 min no gelo. As células foram então lavadas novamente com PBS, e anticorpos primários para N-caderina (marcada com Alexa Fluor™ 594) e E-caderina (marcada com PerCP-Cyanine5.5) foram adicionados por 2 h, e a citometria de fluxo foi realizada com um FACS LSRFortessa X-20.

Geração de mamoesferas a partir de linhagens celulares de câncer de mama

MDAMB-231 e 4T1, cultivadas como monocamada, foram tripsinizadas e semeadas em uma densidade de 1 × 10⁵ células/ml em meio livre de soro com suplementos de crescimento em placas de 6 poços revestidas com poli-HEMA. Colônias esféricas enriquecidas em células-tronco cancerígenas são conhecidas como tumoroesferas ou mamoesferas, que foram geradas em até 7 dias. Essas esferas foram então submetidas ao tratamento com DOX e DDMSNP por 4 h e utilizadas para diferentes experimentos, como citometria de fluxo, western blotting, etc.

Análise da expressão de marcadores de CSC e EMT por citometria de fluxo

Após os tratamentos com DOX e DDMSNP, as células formadoras de esferas foram coletadas e centrifugadas para eliminar o excesso de meio. Paraformaldeído a 4% foi adicionado após a lavagem com PBS e colocado no gelo por 10 min. Após uma lavagem com PBS, o sobrenadante foi descartado e as células foram marcadas com anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromos (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA) contra CD44 (FITC) e CD24 (PE). A expressão de diferentes marcadores de EMT, como N-caderina (marcada com AlexaFluor™ 594) e E-caderina (marcada com PerCP-Cyanine5.5), na população de CSCs CD44+/CD24−/baixa foi examinada usando o FACS LSRFortessa X-20 e analisada pelo software BD FACSDiva™.
Separação de células
1 × 10⁷ células de esferas 4T1, bem como de cultura de monocamada e esferas MDAMB-231, foram incubadas com anticorpo primário contra CD24 de acordo com o procedimento do fabricante mencionado no CD24 Microbead Kit (Miltenyi Biotec). Em seguida, microesferas de IgG anti-camundongo de cabra (Miltenyi Biotec) foram adicionadas às células marcadas e colunas MiniMACS (Miltenyi Biotec) foram utilizadas para separar magneticamente as células. Microesferas de CD44 (Miltenyi Biotec) foram adicionadas para adquirir células CD24− a 4 °C por 15 min. As células foram novamente lavadas e separadas magneticamente. A população de CSCs CD44+/CD24−/baixa foi coletada para experimentos posteriores.
Análise do gráfico de Kaplan–Meier
O Kaplan–Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis/) foi utilizado para estudar as informações de sobrevida associadas à N-caderina e E-caderina em pacientes com TNBC.
Análise de dados do TNMplot
O TNMplot (https://tnmplot.com/analysis/) foi utilizado para analisar a expressão gênica em vários tecidos normais, tumorais e metastáticos. Em nosso presente estudo, as expressões de N-caderina e E-caderina foram comparadas entre tecidos normais, tumorais e metastáticos da mama usando esta ferramenta.
Análise do gráfico ROC
O ROC Plotter (https://www.rocplot.org/) é uma ferramenta online fácil de usar que foi utilizada para avaliar a expressão dos genes de interesse (N-caderina e E-caderina) diante do tratamento com DOX recebido pelos pacientes com TNBC.
Predição baseada no modelo de radar de biodisponibilidade
Usando SMILES canônicos do DIM e DOX nativos, a biodisponibilidade desses fármacos foi prevista a partir de seis propriedades físico-químicas, como lipofilicidade, tamanho, polaridade, insolubilidade, insaturação e flexibilidade do modelo de radar.
Otimização de compostos por predição baseada no modelo BOILED-Egg
O modelo BOILED-Egg obtido do servidor online SwissADME, um gráfico entre wLogP vs área de superfície polar topológica (TPSA), foi utilizado para determinar a penetração dos fármacos nativos, ou seja, DIM e DOX, através da junção apertada (BBB).
Predição de ADME baseada em bioinformática
Várias propriedades ADME, como físico-químicas (peso molecular, TPSA), lipofilicidade (iLogP, wLogP), farmacocinética (gastrointestinal (GI), pele (LogKp), permeabilidade BBB e substrato de P-gp, semelhança com fármacos (Lipinski, pontuação de biodisponibilidade) do DIM e DOX nativos foram previstas usando o servidor online baseado em SwissADME (http://www.swissadme.ch/).
Análise de combinação de fármacos
DIM e DOX foram adicionados separadamente e juntos em uma proporção constante, calculada a partir de uma curva dose-efeito. O efeito de inibição foi classificado em uma escala de 0 a 1, com 0 representando nenhum impacto e 1 representando 100% de efeito. O índice de combinação (CI), a fração afetada (Fa) e o índice de redução de dose (DRI) foram calculados usando o software CompuSyn (versão 1.0; T. C. Chou e N. Martin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nova York), e um isobolograma foi criado para quantificar o efeito das interações medicamentosas. O mesmo procedimento foi seguido no caso de DIM encapsulado em DDMSNP (DDMSNP1) e DOX encapsulado em DDMSNP (DDMSNP2).
Ensaio de viabilidade celular
O ensaio de viabilidade celular foi realizado utilizando MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] (Sigma-Aldrich, EUA). As células MDAMB-231, 4T1 e MCF-10A foram cultivadas em placa de 96 poços e tratadas com DIM nativo, DOX nativo, DIM-DOX em combinação, NDIM, NDOX e DDMSNP por 24 h. As células tratadas foram então incubadas em meio fresco contendo MTT (0,5 mg/ml) a 37 °C por 3 h. Em seguida, DMSO foi utilizado para solubilizar os cristais de formazan e a absorbância foi medida a 570 nm usando um leitor de microplacas automatizado (Infinite® 200 PRO, TECAN, Suíça).

Imunotransferência

Após 4 h de tratamento com DOX e DDMSNP, as células MDAMB-231 e 4T1 foram colhidas em tampão de lise e os lisados celulares totais foram preparados usando protocolo padrão. Cada amostra continha uma quantidade idêntica de lisado proteico (100 µg) para análise por western blot. SDS-PAGE foi usado para separar as proteínas, que foram então transferidas para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite seco desnatado. Após três lavagens, as membranas foram incubadas por 2 h à temperatura ambiente com anticorpos primários em TBS. Após três lavagens adicionais, as membranas foram incubadas por 2 h à temperatura ambiente com anticorpos secundários conjugados com HRP. As proteínas de interesse foram visualizadas sob quimioluminescência (Invitrogen™ iBright™). A indução de EMT em células TNBC foi confirmada usando anticorpos contra N-caderina, E-caderina, Snail, Slug, Vimentina, β-Actina, α-tubulina etc. (Cell Signaling Technology, Abcam e Santa Cruz Biotechnology).

Ensaio de apoptose por Anexina V/PI por citometria de fluxo

Após 48 h de tratamento, as células MDAMB-231 e 4T1 foram tripsinizadas e lavadas com PBS (pH 7,4). Em seguida, as células foram ressuspensas em 500 µl de tampão de ligação e lavadas novamente com PBS. Depois disso, 5 µl de FITC-Anexina V e iodeto de propídio (PI) foram adicionados e incubados por 15 min no escuro. Após a incubação, 400 µl de tampão de ligação de Anexina foram adicionados e passados por malha de nylon, mantidos em gelo e analisados por citometria de fluxo. Os dados foram adquiridos no FACS LSRFortessaX-20 e analisados pelo software BD FACSDiva™.

PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR)

De acordo com as instruções do fabricante, o RNA total foi extraído de células MDAMB-231 e 4T1 tratadas com DOX e DDMSNP usando o reagente TRIzol (Invitrogen, NY, EUA). Para cada amostra, 2 µg de RNA foram convertidos em cDNA usando o kit de isolamento de cDNA (Bio-Rad, EUA). As amostras foram então usadas para análise de qRT-PCR usando Power SYBR Green Master Mix no Sistema Roche LightCycler® 96 (Suíça). Os dados foram analisados pelo módulo light cycler 96 1.1.

H-N-caderina F-CCTCCAGAGTTTACTGCCATGAC R-GTAGGATCTCCGCCACTGATTC H-E-caderina: F-CCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAG R-TGGCAGTGTCTCTCCAAATCCG H-GAPDH: F-GAAAGCCTGCCGGTGACTAA R-TTCCCGTTCTCAGCCTTGAC M-N-caderina: F-CAGCCGGAGAACAGTCTCCAA R-GCGAGCTGGTAACAAATAGCG M-E-caderina: F-AACCCAAGCACGTATCAGGG R-ACTGCTGGTCAGGATCGTTG M-GAPDH: F-GAAGGTCGGTGTGAACGGATTT R-ATGAGGTCCACCACCCTGTT

A lista de primers (humano e camundongo) usados para análise de qRT-PCR:

Indução de EMT
A EMT foi induzida em células MDAMB-231 e 4T1 em meio de cultura padrão (6 ml/placa de 10 cm) contendo StemXVivo® EMT Inducing Media Supplement (1X) (R&D Systems) seguindo as instruções do fabricante. As células foram então incubadas a 37 °C com 5% CO2 por 3 dias, seguido pela substituição do meio de cultura fresco com o mesmo suplemento. Após 5 dias, as células foram coletadas e submetidas a diferentes experimentos.
Transfecção
O constructo de E-caderina e o siRNA contra E-caderina foram transfectados usando lipofectamina™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram usadas para experimentos posteriores 24 h após a transfecção.
Encapsulação de DDMSNP em exossomo e confirmação da carga por MET
Inicialmente, a linhagem celular B16 foi tratada com DDMSNP e cultivada em DMEM com 10% FBS em 5% CO2 a 37 °C. Essas células então secretaram exossomos carregados com DDMSNP. Após 24 h de tratamento, as células foram lavadas e resembradas em um novo frasco com meio fresco. O meio condicionado das células foi coletado após 48 h de cultura e os exossomos foram isolados usando o kit Total Exosome Isolation (Invitrogen, cat. No. 4478359) de acordo com as instruções do fabricante e armazenados a −80 °C para uso posterior.
O tamanho e a morfologia dos exossomos vazios e dos exossomos encapsulados com DDMSNP (e-DDMSNP) foram examinados usando um microscópio eletrônico de transmissão JEOL JEM-2100 (JEOL, Inc., Peabody, MA, EUA) a uma tensão de aceleração de 300 kV.
Microscopia confocal
As células MDAMB-231 foram cultivadas em lamínulas em uma placa de Petri por 16–20 h e tratadas com e-DDMSNPs por 4 h. Após isso, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% em PBS por 10 min antes de serem enxaguadas três vezes com PBS. A permeabilização em Triton X-100 a 0,5% por 5 min foi seguida por bloqueio com BSA a 2% em PBS por 30 min. Após isso, as lâminas foram incubadas em câmara úmida durante a noite a 4 °C com o marcador de exossomo CD63 (Thermo Fisher Scientific) em PBS e lavadas três vezes com Triton X-100 a 0,3% em PBS. As células foram então tratadas com anticorpos secundários conjugados com FITC (1:250) em PBS contendo Triton X-100 a 0,3% e soro normal de cabra a 10% por 2–3 h a 37 °C antes de serem enxaguadas três vezes com PBS contendo Triton X-100 a 0,3%. Finalmente, as amostras foram montadas em lâminas de vidro limpas com meio de montagem vecta shield e armazenadas a 4 °C até serem examinadas em um microscópio confocal de varredura a laser (Leica).
Após o tratamento com e-DDMSNPs por 4 h, as esferas foram transferidas de uma placa de 6 poços para o poço de uma placa de 12 poços e lavadas com PBS e colocadas na incubadora por 1 h para sedimentar. Após isso, foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 20 min e depois lavadas com Triton-X a 0,25%. Após o bloqueio com BSA a 3%, as esferas foram lavadas com PBS. O anticorpo primário contra CD63 foi então adicionado e mantido a 4 °C durante a noite. Após a lavagem, o anticorpo secundário conjugado com FITC foi adicionado e, em seguida, o núcleo foi corado com DAPI e visualizado em microscópio confocal.
Modelo de câncer de mama ortotópico expressando RFP
Estabelecimento de linhagem celular estável expressando RFP
18 h antes da transfecção, células altamente invasivas de esferas derivadas de 4T1 foram semeadas em placas de 6 poços (3 × 10⁵ células/poço). O vetor expressando RFP (addgene) foi transfectado nas células das esferas derivadas de 4T1 na proporção de 1:10 usando lipofectamina™ 2000 (Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo repórter foi utilizado para selecionar células resistentes a G418. Após 48 h de incubação, as células foram cultivadas por quatro semanas em meio suplementado com G418 a 400 μg/ml. Os clones celulares resultantes com expressão estável de RFP foram selecionados e cultivados para crescer esferas enriquecidas com CSC para investigação adicional. Essas esferas foram então submetidas à separação celular baseada em coluna MACS para isolar CSCs expressando RFP CD44+/CD24-.
Animais experimentais
Da colônia de animais do Instituto Nacional de Câncer Chittaranjan (Calcutá, Índia), camundongos fêmeas adultas BALB/c (6–7 semanas de idade, 25 g de peso corporal) foram coletadas e utilizadas para este estudo. Elas foram mantidas sob condições ambientais típicas (temperatura: 23 ± 2 °C, umidade relativa: 80%, 55 ± 10% e condições de luz e escuridão de 12 h/12 h) e alimentadas com dieta padrão em pellets (pellet para camundongos EPIC da Kalyani Feed Milling Plant, Kalyani, Bengala Ocidental, Índia) ad libitum. Todos os procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes para o Controle e Supervisão de Experimentação Animal (CPCSEA) e aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (Reg. nº 1774/GO/RBi/S/14/CPCSEA, Índia). Após a conclusão do experimento, todos os resíduos foram descartados de maneira segura e higiênica.
Desenho experimental
CSCs derivadas de 4T1 expressando RFP: CSCs derivadas de 4T1 expressando RFP foram implantadas no coxim mamário de cada camundongo deste grupo e mantidas sem tratamento por 10 dias. Em seguida, cada animal recebeu injeção de soro fisiológico regular no nicho tumoral por 10 dias.
CSCs derivadas de 4T1 expressando RFP + exossomos: Cada animal neste grupo recebeu injeção de CSCs derivadas de 4T1 estáveis no coxim mamário e foi mantido sem tratamento por 10 dias. O tratamento foi então mantido por 10 dias com exossomos vazios (5 mg/kg de peso corporal) injetados no nicho tumoral.
CSCs derivadas de 4T1 expressando RFP + MSNPs: Após a inoculação de CSCs derivadas de 4T1 estáveis no coxim mamário, cada animal deste grupo foi mantido sem tratamento por 10 dias. O tratamento foi então realizado por 10 dias com MSNPs vazias (5 mg/kg de peso corporal) injetadas no nicho tumoral.
CSCs derivadas de 4T1 expressando RFP + DOX: Cada animal neste grupo recebeu CSCs derivadas de 4T1 estáveis implantadas no coxim mamário e foi mantido em condição não tratada por 10 dias. O tratamento foi continuado por mais 10 dias com DOX (5 mg/kg de peso corporal) injetada no nicho tumoral.
RFP expressing 4T1 derived CSCs + e-DDMSNP: Todos os animais deste grupo tiveram CSCs derivadas de 4T1 estáveis inoculadas na almofada adiposa mamária e foram mantidos em condição não tratada por 10 dias. Após isso, esses animais foram tratados com e-DDMSNP (5 mg/kg de peso corporal) injetado no nicho tumoral por 10 dias.

Camundongos BALB/c foram usados para determinar o efeito do e-DDMSNP na correlação de fatores EMT regulados positivamente e negativamente com a localização distante de células neoplásicas por CSCs expressando proteína de fusão RFP selecionadas de linhagem celular estável na metástase de câncer de mama em um modelo ortotópico de camundongo 4T1. O tumor sólido foi induzido pela injeção de CSCs derivadas de 4T1 expressando RFP (5 × 10⁵) em 100 μl de solução livre de soro na glândula mamária (abaixo do mamilo). Em seguida, os tumores foram deixados crescer por um período de 10 dias e os camundongos foram distribuídos em cinco grupos (n = 12). Seis animais de cada grupo foram mantidos para verificar a sobrevivência, enquanto seis animais de cada grupo foram retirados para estudos adicionais. Os camundongos experimentais foram distribuídos nos seguintes grupos-

Os camundongos foram sacrificados no 21º dia após a implantação estável de CSCs derivadas de 4T1, exceto os camundongos reservados para o estudo de sobrevivência. Além disso, os pulmões foram lavados em PBS e colocados em uma solução de formalina a 4% por 48 h antes de serem desidratados, embebidos e criosseccionados para coloração H & E e imunofluorescência. Em média, n = 6 número de nódulos por grupo foram considerados para os resultados. Os órgãos dos camundongos portadores de tumor gerados por CSCs derivadas de 4T1 expressando RFP também foram submetidos à imagem de órgãos.

Resposta do crescimento tumoral e estudo de sobrevivência

A eficácia antitumoral de DOX e e-DDMSNP foi avaliada medindo a inibição do volume tumoral e a contagem de células tumorais viáveis pelo método de exclusão do azul de tripano. A resposta do crescimento tumoral foi avaliada com base no tempo de sobrevida mediano (MST) e no aumento percentual da expectativa de vida (% ILS). O tempo médio de sobrevida (MST) foi calculado de acordo com a equação: MST = (dia da primeira morte + dia da última morte)/2. O percentual de aumento da expectativa de vida (ILS) foi calculado usando a equação: ILS% = (T–C)/C × 100, onde T representa o MST dos animais tratados e C representa o MST do grupo controle tumoral. T/C% (tratado vs. controle tumoral) foi calculado como MST dos animais tratados/MST do grupo controle tumoral. TIR% (taxa de inibição do crescimento tumoral) = (A–B)/A × 100, onde A representa o volume tumoral médio do grupo controle tumoral e B representa o volume tumoral médio do grupo tratado.

Espectrometria de massa

A existência de e-DDMSNP no tecido tumoral sólido foi confirmada por espectrometria de massa. Resumidamente, o tecido tumoral foi congelado em nitrogênio líquido e depois triturado usando almofariz e pistilo resfriados. 200 μl de éter dietílico foram adicionados ao tecido triturado e sonicados por 5 min em um sonicador de banho. Após agitação em vórtex, a amostra foi centrifugada a 10.000 rpm por 10 min e o sobrenadante foi coletado para análise por espectrometria de massa. Além disso, DIM nativo e DOX nativa também foram usados como referência para espectrometria de massa.
Imagem de órgãos
A imagem de órgãos foi utilizada para monitorar a proliferação celular e a metástase em camundongos injetados com CSCs derivadas de 4T1 expressando RFP de diferentes grupos de tratamento. O tecido tumoral e o pulmão foram coletados para imagem de órgãos e os dados foram adquiridos pelo sistema IVIS® Lumina LT In Vivo Imaging System, PerkinElmer.

Ensaio de histologia e imunofluorescência (IF)
Tecido tumoral, pulmão, coração, rim, fígado e baço foram coletados de todos os grupos de camundongos. Após 24 h de fixação em formalina a 10%, as amostras de tecido foram desidratadas em concentrações crescentes de etanol, clarificadas em xileno e embebidas em blocos de parafina, sendo então processadas para histologia convencional embebida em parafina com coloração por hematoxilina e eosina (H & E). As secções foram observadas em microscópio óptico (DM 1000, Leica, Alemanha) e fotomicrografias foram obtidas com o software LAS EZ.

Para IF, secções de tecido do grupo controle e de camundongos tratados com DOX ou e-DDMSNP foram submetidas à recuperação antigênica utilizando tampão citrato. Isto foi seguido por bloqueio com BSA a 3% e incubação overnight a 4 °C com anticorpos primários contra BRCA1, N-caderina e E-caderina. Após isso, as secções de tecido foram incubadas por 2 h à temperatura ambiente com anticorpos secundários conjugados com fluorocromo, como AlexaFluor™ 594 e AlexaFluor™ 488. Finalmente, os núcleos celulares foram corados com DAPI e as secções foram examinadas em microscópio de fluorescência (Olympus BX53, Japão).

Resultado
Síntese e caracterização de nanopartículas de sílica mesoporosa carregadas com DIM e DOX (MSNPs)
Síntese e caracterização de MSNP e DDMSNP. A Protocolo de síntese de Stӧber modificado para a preparação de MSNP e DDMSNP. B Imagem de MEV mostra conformações esféricas e tamanho de ~ 100 nm dos MSNPs sintetizados. C Imagem de MET representa a análise morfológica do MSNP vazio, bem como o carregamento de DIM e DOX dentro do MSNP. D Análise de DLS mostra um tamanho médio do DDMSNP de 80–150 nm. E Análise de FTIR mostra espectros comparativos de DIM, DOX, MSNP, NDIM, NDOX e DDMSNP para confirmar a encapsulação bem-sucedida de DIM e DOX nas nanopartículas. F Estudo de liberação de fármaco do DDMSNP mostra uma liberação prolongada de DIM e DOX da nanopartícula em pH fisiológico 7,4.
MSNPs carregados com DIM e DOX à base de PEG-PLGA foram sintetizados e caracterizados por diferentes técnicas (Fig. 1). Imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostraram que os MSNPs eram de formato esférico e homogeneamente dispersos (Fig. 1B). A internalização de DIM e DOX nos MSNPs foi confirmada por microscopia eletrônica de transmissão (MET) (Fig. 1C). A investigação morfológica de MSNPs vazios e MSNPs carregados com fármacos também foi realizada por MET (Fig. 1C). O espalhamento de luz dinâmico (DLS) foi executado para determinar o tamanho dos MSNPs carregados com DIM e DOX (DDMSNPs). Os resultados mostraram que a distribuição de tamanho dos DDMSNPs variava de 80 a 150 nm (Fig. 1D). A espectroscopia no infravermelho forneceu uma infinidade de conhecimentos sobre os grupos funcionais da nanopartícula, em particular, forneceu informações sobre o arranjo e empacotamento das cadeias de superfície. Para melhorar a cobertura do material de revestimento nas superfícies das partículas do núcleo, moléculas bifuncionais foram frequentemente usadas para modificar suas superfícies. Compostos orgânicos com funções duplas, como APTES, foram usados para modificar a superfície das partículas do núcleo. Em uma extremidade desta molécula havia um grupo etóxi; enquanto na outra havia um grupo amino. Através do grupo hidroxila, o APTES criou uma ligação covalente com nanopartículas de sílica, o que fez com que sua superfície se tornasse terminal NH. O DIM mostrou banda característica na região de 3394 cm⁻¹ e foi deslocada para 3420 cm⁻¹ no DIM-MSNP (NDIM), o que foi atribuído ao estiramento NH (Fig. 1E). Além disso, o estiramento C–H no DIM foi deslocado de 2921 cm⁻¹ para 2925 cm⁻¹ no NDIM. O grupo indol foi identificado como a causa da banda distintiva na região, que era 1641 cm⁻¹ no DIM e deslocada para 1648 cm⁻¹ no NDIM. A ligação aromática (C=C) foi observada a partir dos estudos de FTIR medindo o deslocamento na posição do pico de 1540 cm⁻¹ para 1543 cm⁻¹. Portanto, esses deslocamentos na posição do pico foram devidos à interação entre o DIM e o MSNP. O espectro de FTIR do DOX livre revelou picos únicos nos números de onda: 668 cm⁻¹ correspondente a ligações C–H de alquino, entre 1022 cm⁻¹ e 1096 cm⁻¹ correspondente a ligações C–H aromáticas, 1406 cm⁻¹ correspondente a ácidos carboxílicos, 1636 cm⁻¹ correspondente a estiramento C=C de alquenila, 2086 cm⁻¹ correspondente a grupo amino, 2352 cm⁻¹ correspondente a aminas carregadas C=NH⁺, 3453 cm⁻¹ correspondente a estiramento O–H (Fig. 1E). O deslocamento de pico dessas ligações foi observado na Fig. 1E para o MSNP carregado com DOX (NDOX).
O pico de FTIR em torno de 466 cm⁻¹ mostrou o modo de flexão Si–O–Si, e aquele na faixa de 750–850 cm⁻1 correspondeu a NH₂ para o MSNP funcionalizado com amino. Aminas primárias, secundárias e terciárias apresentaram picos em diferentes números de onda. As aminas primárias apresentaram dois picos, um com um pico mais amplo em 3440 cm⁻¹ e um pico menor em torno de 1631 cm⁻¹ associado ao estiramento assimétrico de NH₂. Os picos de NH e NH₂ indicaram a funcionalização da superfície de sílica com grupos amina (Fig. 1E). No caso dos MSNPs carregados com DIM, foi observado o pico forte e largo em 3414 cm⁻¹ correspondente à sobreposição de grupos hidroxila e amina (do grupo indolil do DIM livre) (Fig. 1E). Os resultados também mostraram picos característicos atribuídos ao estiramento simétrico (492 e 803 cm⁻¹) e assimétrico (1098 cm⁻¹) de Si–O–Si, e vibrações de estiramento de Si–OH (941 cm⁻¹) para MSNPs não funcionalizados (Fig. 1E). O espectro mostrado na Fig. 1E correspondeu aos MSNPs encapsulados com PEG-PLGA e carregados com DIM e DOX, ou DDMSNPs. A banda larga e suave em torno de 3500 cm⁻¹ estava relacionada à capacidade do oxigênio de formar ligações de hidrogênio. Um pequeno dubleto em torno de 3000 cm⁻¹ foi associado aos grupos CH, CH₂ e CH₃. O pico típico em 1752 cm⁻¹ foi devido ao estiramento C=O. Embora a largura de banda característica em 1182 cm⁻¹ pudesse ser atribuída ao grupo éter. As bandas características em 1130 cm⁻¹ e 1452 cm⁻¹ foram devidas ao grupo C–O–C e à ligação CH do grupo metila, respectivamente. Como os espectros mostraram, os grupos característicos do PLGA foram mais fortes que os do PEG, porque o primeiro constitui mais de 90% do copolímero em bloco. Portanto, a presença de PEG foi pouco detectável pelo pequeno sinal dos harmônicos C–C–O localizados em torno de 950 e 840 cm⁻¹. Após suspender nanopartículas de sílica mesoporosa carregadas com DIM e DOX (DDMSNPs) em PBS (pH 7,4) e medir a absorbância de DIM e DOX na forma livre e encapsulada no filtrado, calculamos que a quantidade estimada de fármacos encapsulados nos DDMSNPs foi de aproximadamente 84% de DIM e aproximadamente 81% de DOX. O ensaio de liberação de fármacos dos DDMSNPs foi realizado em PBS (pH 7,4). Os resultados foram apresentados como porcentagem de liberação cumulativa ao longo de 10 h. Uma liberação mais rápida de DIM e DOX foi observada em pH 7,4 em meio PBS. Mostramos que 50% do fármaco foi liberado após 3 h, enquanto 90% do fármaco foi liberado em 8 h em meio PBS (Fig. 1F). Esse comportamento de liberação indicou que os fármacos seriam liberados em pH biológico.
Liberações controladas de DIM e DOX foram observadas a partir das nanoplataformas de sílica mesoporosa.
Doxorubicina induz progressão da EMT mediada por CSC
Efeito da DOX em células TNBC e CSCs derivadas das linhagens celulares MDAMB-231 e 4T1. A Superexpressão de Snail, Slug e Vimentina pelo tratamento com DOX. (i) A figura mostra a expressão de Snail, Slug e Vimentina em grupos controle e tratados com 20 µM de DOX de células MDAMB-231 e 4T1 por análise de western blot. (ii) A ilustração gráfica denota média ± DP, n = 3. * indica P ≤ 0.0002. B (i) A figura representa os tamanhos das CESs derivadas das linhagens celulares MDAMB-231 e 4T1 após o tratamento com DOX em comparação ao controle. (ii) A representação gráfica do diâmetro e número de CESs dos grupos controle e tratados com DOX não mostra diferenças significativas. C (i, ii) A análise de FACS avalia as expressões de N-caderina e E-caderina na população de CSCs CD44+/CD24-/low em ambas as esferas derivadas de linhagens celulares dos grupos controle e tratados com DOX por 4 h. D O gráfico de barras representa diferença significativa entre a expressão de N-caderina dos grupos controle e tratados com DOX, * indica (P < 0.0001) e diferença não significativa entre a expressão de E-caderina dos mesmos grupos nas CESs derivadas de MDAMB-231 (painel esquerdo). O painel direito denota diferenças significativas entre as expressões de N-caderina e E-caderina das CESs derivadas de 4T1, * indica (P < 0.0001). E Os dados de western blot representam as expressões de N-caderina, E-caderina, Snail, Slug e Vimentina em CESs tratadas com DOX derivadas de células MDAMB-231 e 4T1. A representação gráfica mostra as diferenças significativas entre as expressões dessas proteínas nos grupos controle e tratados com DOX, * indica (P < 0.01). F O estudo de imunofluorescência avalia a expressão de BRCA1 (vermelho) no coxim adiposo mamário e pulmão metastático em grupos tratados e não tratados com DOX de camundongos BALB/c portadores de tumor derivado de células 4T1 (n = 6 em cada grupo) (painel esquerdo) e camundongos BALB/c portadores de tumor derivado de CSCs 4T1 (n = 6 em cada grupo) (painel direito).
DOX foi tratado em células MDAMB-231 e 4T1 de forma dose-dependente, resultando em alteração na expressão de marcadores de EMT, como a N-caderina. Na dosagem de 20 µM, uma alteração significativa (P < 0,005) na expressão desse marcador foi observada em ambas as linhagens celulares, o que se manteve consistente em dosagens mais altas (Fig. S1Ai, ii). Assim, experimentos adicionais foram conduzidos com a mesma dosagem de DOX. Embora a expressão de E-caderina tenha diminuído após o tratamento com DOX nas células 4T1, nenhuma expressão proteica detectável foi observada no caso das células MDAMB-231. Isso foi bastante semelhante a relatos anteriores que afirmam que as células MDAMB-231 têm expressão muito baixa de E-caderina devido à metilação do promotor, aparentemente muito fraca para ser detectada por western blot, mas pode ser detectada como uma pequena subpopulação em citometria de fluxo. Como a expressão de Snail, Slug e Vimentina aumentou após o tratamento com DOX, confirmou-se que DOX promove EMT em células MDAMB-231 e 4T1 (Fig. 2Ai, ii). Além disso, o número e o diâmetro das esferas enriquecidas com CSC (CESs) não mudaram após o tratamento com DOX em comparação com as esferas de controle (Fig. 2Bi, ii). A análise por citometria de fluxo revelou que, após o tratamento com DOX, a porcentagem de células expressando N-caderina aumentou significativamente (P < 0,005) para 65,7% e 12,6% em comparação com o controle (55,4% e 5,5%) em MDAMB-231 e 4T1, respectivamente (Fig. S1Bi–iii). Por outro lado, uma subpopulação de células MDAMB-231 apresentou expressão fraca de E-caderina, que não foi significativamente alterada quando tratada com DOX (Fig. S1Bi–iii). Além disso, não foi observada alteração significativa no tratamento com DOX na porcentagem de células positivas para E-caderina no caso de 4T1 (Fig. S1Bii, iii). Surpreendentemente, um aumento notável na expressão de E-caderina foi observado nas CESs derivadas de MDAMB-231 em comparação com as células MDAMB-231 (Fig. S1C.i-ii). Em relação às CESs, DOX causou um aumento na população de células expressando N-caderina e uma diminuição na população de células expressando E-caderina, indicando o início de EMT como resultado desse tratamento (Fig. 2Ci, ii, D). No entanto, a diminuição na população positiva para E-caderina após o tratamento com DOX não foi tão significativa no caso das CESs derivadas de MDAMB-231. Nos resultados de imunoblotting, alterações semelhantes na expressão dos níveis de N-caderina e E-caderina foram observadas nas CSCs classificadas provenientes das CESs derivadas de ambas as células tratadas com DOX (Fig. 2E).
No entanto, o aumento na expressão de outros marcadores de EMT, como Snail, Slug e Vimentina, também foi documentado por análise de immunoblotting, o que sugere indução de EMT em CSCs pela DOX (Fig. 2E). Além disso, as curvas de Kaplan-Meier derivadas do banco de dados de pacientes corroboram o fato de que a alta expressão de N-caderina e a baixa expressão de E-caderina estão associadas a uma alta taxa de mortalidade em pacientes com TNBC (Fig. S2A). Embora, de acordo com o TNMplot, tenha sido observado um aumento significativo na expressão de N-caderina em amostras metastáticas de TNBC em comparação com o grupo controle e o grupo de tumor não metastático (Fig. S2B). No entanto, não houve diferenças discerníveis na expressão de E-caderina entre indivíduos normais e os grupos de pacientes com tumor e TNBC metastático (Fig. S2B). Não obstante, é evidente a partir dos dados do paciente que, em contraste com o grupo respondedor, os não respondedores à DOX apresentaram maior expressão de N-caderina e menor expressão de E-caderina (Fig. S2C). Isso sugere que a resistência à DOX não está relacionada apenas aos marcadores de EMT, como N-caderina e E-caderina, mas também contribui para a virulência do câncer por meio de falha terapêutica e aumento da metástase. Isso foi confirmado ainda mais pela comparação da expressão de BRCA1 em células 4T1 com tumores metastáticos derivados de CSCs, controle e tratados com DOX, bem como entre pulmões de camundongos portadores de tumor desses grupos (Fig. 2F). BRCA1 é um marcador de câncer de mama que se expressa proeminentemente em células 4T1. No entanto, foi intrigante descobrir que a superexpressão de BRCA1 poderia ser observada nos pulmões de camundongos portadores de tumor derivado de 4T1, o que sugere metástase à distância das células neoplásicas. A taxa de metástase foi ainda maior em tumores originados de CSCs derivadas de 4T1, evidenciado pelo aumento da expressão de BRCA1 nos pulmões desses grupos de camundongos (Fig. 2F). No entanto, a DOX aumentou significativamente a expressão de BRCA1 tanto em células 4T1 quanto em pulmões metastáticos derivados de CSCs em comparação com o grupo controle (Fig. 2F). Esses resultados sugerem que as CSCs expostas à DOX foram capazes de induzir EMT e metástase de forma mais significativa do que as células cancerosas não expostas, as células cancerosas expostas à DOX e as CSCs não expostas. Como BRCA1 é um conhecido ativador de genes supressores de tumor, na região tumoral ortotópica do coxim mamário de camundongos injetados com células 4T1 e CSCs, a expressão de BRCA1 foi reduzida nos grupos tratados com DOX em comparação com os controles (Fig. 2F). Esses resultados confirmaram ainda mais o potencial pró-metastático e indutor de EMT da DOX no caso do câncer de mama triplo negativo.
DIM e DOX inibiram sinergicamente a viabilidade de células TNBC
Efeito sinérgico de DIM e DOX. A Modelo de radar de biodisponibilidade, B modelo de ovo cozido e C propriedades SwissADME do DIM e DOX nativos estão representados na figura. A análise CompuSyn de DIM e DOX representa. D Gráfico de efeito de dose de DIM, DOX e D + D (DIM + DOX), E gráficos com valores de CI < 1 indicando sinergismo entre D + D (DIM + DOX), F isobolograma representando as doses efetivas necessárias para inibição em 50% (Fa 0,5), 75% (Fa 0,75) e 90% (Fa 0,9) para cada fármaco individual. O sinergismo é demonstrado pelo par de doses plotado como um ponto (símbolo) abaixo de sua respectiva isóbole ou linha de Fa. G O DRI da combinação de fármacos de DIM e DOX é apresentado e o valor de DRI > 1 indica uma combinação favorável de fármacos. H Todos os dados são a representação de três repetições experimentais independentes. Fa, fração afetada; CI, índice de combinação; DRI, índice de redução de dose. I Os dados de MTT demonstram os efeitos individuais e combinatórios de DIM e DOX em ambas as linhagens celulares MDAMB-231 e 4T1 após 24 h de tratamento. Nesta figura, a + b = DIM 10 µM + DOX 4 µM, c + d = DIM 20 µM + DOX 8 µM, e + f = DIM 30 µM + DOX 12 µM, g + h = DIM 40 µM + DOX 16 µM e i + j = DIM 50 µM + DOX 20 µM
O DIM é um composto heterocíclico e bioativo que representa um potencial agente anticancerígeno promissor. O efeito sinérgico do DIM e DOX na indução de EMT, metástase e apoptose em TNBC, por outro lado, não é claro, o que poderia ser útil para o desenvolvimento terapêutico futuro. Diferentes estudos de farmacocinética baseados em bioinformática foram conduzidos para determinar a biodisponibilidade do DIM e DOX. O modelo de radar revelou que o DIM possui alta insaturação e baixa solubilidade, enquanto o DOX é um composto polar com alto peso molecular e baixa biodisponibilidade (Fig. 3A). Além disso, as propriedades farmacocinéticas do DIM e DOX também foram previstas usando o modelo BOILED-Egg. Foi justificado por este modelo que o DIM tem a capacidade de ser absorvido por absorção gastrointestinal passiva (HIA), enquanto o DOX mostra baixo potencial de absorção pelo trato gastrointestinal (Fig. 3B). Além disso, o gráfico BOILED-Egg indicou penetração inadequada do DOX através da junção estreita como a barreira hematoencefálica (BBB) (Fig. 3B). O DIM, no entanto, parece ter a capacidade de atravessar a BBB neste cenário. Além disso, as propriedades baseadas no SwissADME indicam as propriedades físico-químicas, lipofilicidade, farmacocinética e semelhança com fármacos do DIM e DOX. Enquanto moléculas com área de superfície polar ou TPSA < 60 Ų seriam eficientemente absorvidas (> 90%), aquelas com TPSA > 140 Ų e além seriam mal absorvidas (< 10% de absorção fracionada). A partir da Fig. 3C foi confirmado que o DIM poderia ser eficientemente absorvido através da membrana celular, enquanto o DOX poderia não passar pela mesma. Para a previsão de ligantes terapêuticos potenciais, as análises de ADME dos fármacos foram significativamente mais importantes. A ferramenta SwissADME foi aplicada para prever propriedades de ADME usando a regra dos cinco de Lipinski (RO5) amplamente utilizada (ou seja, a absorção apropriada é mais provável quando MW < 500 Da, AlogP < 5, Hdon < 5, Hacc < 10). De acordo com esta regra, o DIM cumpriu os critérios, mas o DOX teve 3 violações e a biodisponibilidade do DIM foi maior que a do DOX (Fig. 3C). Concentrações de 10, 20, 30, 40 e 50 µM de DIM e 4, 8, 12, 16 e 20 µM de DOX foram usadas para gerar uma curva dose-efeito. Uma razão constante (10/4 = 5:2) foi usada para estabelecer as dosagens usadas nos grupos de tratamento combinatório (10 + 4, 20 + 8, 30 + 12, 40 + 16 e 50 + 20 µM). DIM e DOX apresentaram um efeito sinérgico (Fig. 3D–H). Os efeitos dose-resposta de DIM, DOX e DIM + DOX foram apresentados na Fig. 3D.
Valores de CI (< 1), uma definição quantitativa para sinergismo, foram encontrados na Fig. 3E, indicando assim uma combinação favorável de fármacos que pode exercer inibição sinérgica da viabilidade celular. Isobologramas, representando combinações equipotentes de dois fármacos administrados em diferentes dosagens, também foram estabelecidos por meio da análise do CompuSyn. As dosagens das combinações de fármacos reveladas pelo isobolograma também sugeriram que DIM e DOX apresentaram efeitos sinérgicos (Fig. 3F). Os valores do índice de redução de dose (DRI) foram revelados como > 1 para cada fármaco no tratamento combinado, o que indica uma combinação favorável de fármacos (Fig. 3G). Isso mediu o número de vezes que a dosagem de um único fármaco poderia ser reduzida quando usada em combinação.

Os dados obtidos por meio da análise do CompuSyn foram apresentados na Fig. 3H. A Fig. 3I mostrou que o efeito combinatório de DIM e DOX foi mais eficiente do que as dosagens individuais de DIM e DOX nas linhagens celulares MDAMB-231 e 4T1. O valor de IC50 foi reduzido para 21 µM para DIM e 8 µM para DOX na terapia combinada em MDAMB-231, em comparação com o valor de IC50 individual de 48 µM e 22 µM para DIM e DOX, respectivamente. Por outro lado, em 4T1, os valores de IC50 de DIM e DOX foram de 17 µM e 7 µM para a terapia combinada, o que foi muito menor do que o IC50 individual, ou seja, 30 µM e 16 µM para DIM e DOX, respectivamente. Doravante, essas dosagens de IC50 para o tratamento combinado com compostos nativos foram utilizadas para investigações in vitro.
Efeito combinatório de DIM e DOX nos marcadores de EMT e na sobrevivência celular
Efeito da combinação de DIM e DOX na indução de EMT ou apoptose do TNBC. A (i) Expressão de N-caderina após tratamento combinatório em comparação com o controle. Aqui, “1” = DIM 10 µM + DOX 4 µM, “2” = DIM 21 µM + DOX 8 µM e “3” = DIM 30 µM + DOX 12 µM. (ii) A representação gráfica mostra alteração significativa da expressão de N-caderina em células MDAMB-231 tratadas com DIM e DOX em comparação ao controle, * denota P < 0,05. (iii) O immunoblotting mostra as expressões de N-caderina e E-caderina. α-Tubulina é considerada o controle de carga. (iv) Gráficos de barras mostram diferenças significativas nas expressões de N-caderina e E-caderina entre o controle e outros grupos em células 4T1 (P < 0,001). Aqui, “1” = DIM 10 µM + DOX 4 µM, “2” = DIM 17 µM + DOX 7 µM e “3” = DIM 30 µM + DOX 12 µM. B (i, iii) Os blots mostrados são representativos da expressão de Snail, Slug e Vimentina em células MDAMB-231 e 4T1 tratadas com DOX em comparação ao controle. α-Tubulina é usada como controle de carga. (ii, iv) A representação gráfica ilustra alterações significativas nas expressões de Snail, Slug e Vimentina em comparação ao controle (P < 0,002). C A análise de FACS avalia a população de células apoptóticas após 48 h de tratamento com DIM e DOX em combinação em células MDAMB-231 e 4T1. O painel mais à esquerda mostra o gráfico controle de células não tratadas. Este experimento é representado graficamente no painel mais à direita (P < 0,0001). D A figura mostra a porcentagem de células viáveis após 24 h de tratamento com DOX ou DIM e DOX em combinação em células MCF 10A. Aqui, a + b = DIM 30 µM + DOX 4 µM, c + d = DIM 40 µM + DOX 8 µM, e + f = DIM 50 µM + DOX 12 µM, g + h = DIM 60 µM + DOX 16 µM e i + j = DIM 70 µM + DOX 20 µM.
O Western blotting foi utilizado para identificar a dose combinada de DIM e DOX na qual as expressões dos marcadores de EMT foram alteradas nas células MDAMB-231 e 4T1, na tentativa de diminuir os efeitos nocivos da DOX (Fig. 4A). Foi constatado que, quando DIM e DOX foram tratados juntos nas dosagens IC50, a expressão de N-caderina diminuiu dramaticamente (P < 0.05) (Fig. 4A). O tratamento com uma dosagem aumentada da mesma combinação resultou em uma diminuição contínua na expressão de N-caderina (Fig. 4A). Por outro lado, em contraste com a N-caderina, a expressão de E-caderina foi elevada nas células 4T1 (Fig. 4Aiii, iv). Além disso, o tratamento combinatório de DIM e DOX na dosagem IC50 por 4 h em ambas as linhagens celulares resultou em expressões mais baixas de outros marcadores de EMT, como Snail, Slug e Vimentina (Fig. 4B). No entanto, em um ponto de tempo posterior de 48 h, a mesma dosagem dessa combinação desencadeou apoptose em ambas as linhagens celulares, já que a maioria das células exibiu anexina V-FITC/PI positiva quando a análise citométrica de fluxo foi realizada (Fig. 4C). Curiosamente, no caso da linhagem celular normal de mama MCF-10A, a mesma dosagem da combinação de DIM e DOX não conseguiu atingir a concentração IC50 alcançada pelo tratamento individual com DOX (IC50 = 6,9 µM) com as mesmas dosagens da combinação (Fig. 4D). Portanto, isso prova que a combinação de DIM e DOX pode restringir a progressão de EMT em TNBC em uma dose significativamente baixa e que essa combinação não afeta a viabilidade das células normais da mama.
Mitigação da EMT mediada por CSCs das células TNBC pelo DDMSNP
Efeito do DDMSNP em células TNBC e CSCs envolvidas na EMT. A O diagrama de barras representa os dados do MTT mostrando as porcentagens de células viáveis após 24 h de tratamento com DDMSNP encapsulando a + b = DIM 0,13 µM + DOX 0,05 µM, c + d = DIM 0,25 µM + DOX 0,1 µM, e + f = DIM 0,5 µM + DOX 0,2 µM, g + h = DIM 1 µM + DOX 0,4 µM, i + j = DIM 2 µM + DOX 0,8 µM e k + l = DIM 4 µM + DOX 1,6 µM. B (i) A análise por Imunoblotting de células MDAMB-231 tratadas com DDMSNP (DIM 0,77 µM + DOX 0,31 µM) e células 4T1 tratadas com DDMSNP (DIM 0,57 µM + DOX 0,23 µM) mostra a expressão das proteínas envolvidas na EMT. (ii) A representação gráfica mostra alterações significativas nas expressões de N-caderina, Snail, Slug e Vimentina (P < 0,05) em MDAMB-231 e de E-caderina juntamente com as mesmas proteínas (P < 0,05) em 4T1 após o tratamento com DDMSNP. C (i, ii) As figuras comparam o número e o diâmetro dos CESs tratados com DDMSNP em relação ao grupo controle (P < 0,01). D A análise por FACS para as expressões de N-caderina e E-caderina na população de CSCs CD44 + /CD24-/baixa no grupo tratado com DDMSNP em comparação ao controle em CSCs derivadas de CESs de MDAMB-231 e 4T1. E A ilustração gráfica denota alteração na expressão de marcadores da EMT em CSCs derivadas de CESs de MDAMB-231 e de 4T1. A figura não mostra alteração significativa dos marcadores nas CSCs de MDAMB-231 e alteração significativa nas CSCs de 4T1 (P < 0,0001). F A análise por Western blot (painel esquerdo) e diagrama de barras (painel direito) representa a comparação entre as expressões de N-caderina, E-caderina, Snail, Slug e Vimentina nos grupos de CSCs tratados e não tratados com DDMSNP provenientes de CESs derivadas de MDAMB-231 (P < 0,01) e de 4T1 (P < 0,001). G Identificação da expressão de BRCA1 (vermelho) no coxim adiposo mamário e no pulmão metastático de camundongos BALB/c injetados com ambas as células 4T1 e CSCs por estudo de imunofluorescência
Regulação da alteração in vitro dos marcadores EMT pelo DDMSNP. A RNA total extraído de CSCs derivadas de MDAMB-231 e 4T1 tratadas e não tratadas com DOX e DDMSNP é analisado por qRT-PCR para N-caderina e E-caderina. B (i) Os dados de Western blot mostram as diferenças entre as expressões de N-caderina, E-caderina, Snail, Slug e Vimentina na presença de DDMSNP em comparação com CSCs EMT induzidas ou não induzidas não tratadas. β-actina é usada como controle de carga. (ii) Os diagramas de barras mostram as expressões relativas de proteínas. * denota P < 0,05. C (i) Os dados de Western blot de CSCs de MDAMB-231 (painel esquerdo) e 4T1 (painel direito) transfectadas com vetores de expressão de E-caderina mostram expressões diferenciais de N-caderina e E-caderina em controle não transfectado, controle transfectado e CSCs transfectadas tratadas com DDMSNP. (ii) A comparação densitométrica da expressão de N-caderina e E-caderina entre controle não transfectado, controle transfectado e CSCs transfectadas tratadas com DDMSNP é representada por gráficos de barras. * denota P < 0,05. D (i) As expressões de N-caderina e E-caderina em CSCs controle não transfectadas, CSCs controle transfectadas e CSCs transfectadas com siE Caderina (siE CAD) tratadas com DDMSNP são representadas nos dados de Western blot. (ii) Gráficos de barras mostram a comparação densitométrica da expressão de N- e E-caderina em controle não transfectado, controle transfectado com siE CAD e CSCs transfectadas com siE CAD tratadas com DDMSNP. * denota P < 0,05.
Em seguida, utilizamos as formas nanotizadas desses compostos para aumentar sua eficácia e comprovar seu efeito sinérgico. Uma curva dose-efeito foi estabelecida utilizando concentrações de 0,25, 0,5, 1, 2 e 4 µM de DIM nanotizado (NDIM) e 0,1, 0,2, 0,4, 0,8 e 1,6 µM de DOX nanotizado (NDOX). As dosagens utilizadas nos grupos de tratamento combinatório (0,25 + 0,1, 0,5 + 0,2, 1 + 0,4, 2 + 0,8 e 4 + 1,6 µM) foram determinadas usando uma razão constante (0,25/0,1 = 2,5:1). De acordo com a Fig. S3A-E, NDIM e NDOX produziram um impacto sinérgico. Os efeitos de NDIM, NDOX e de MSNP carregados com DIM e DOX (DDMSNP) na resposta à dose foram exibidos na Fig. S3A. Uma combinação favorável de fármacos que pode exibir inibição sinérgica da viabilidade celular foi observada na Fig. S3B, apresentando valores de CI (< 1), uma definição quantitativa para sinergismo. As dosagens das combinações de fármacos reveladas pelo isobolograma também sugeriram que DIM e DOX em sua forma nanotizada (DDMSNP) exibiram efeitos sinérgicos (Fig. S3C). Descobriu-se que os valores do índice de redução de dose (DRI) para cada fármaco no tratamento combinado foram > 1, indicando uma combinação benéfica de fármacos (Fig. S3D). Isso determinou quantas vezes as dosagens de fármacos individuais podem ser reduzidas quando administrados juntos. Os dados gerados pela análise CompuSyn mostraram que DIM e DOX nativos, DIM e DOX nanotizados na forma de DDMSNP também apresentaram atividade sinérgica durante o tratamento (Fig. S3E). A partir dos dados, observamos que o efeito de NDIM e NDOX foi mais proeminente do que as dosagens individuais da forma nativa desses fármacos contra ambas as linhagens celulares MDAMB-231 e 4T1 (Fig. S3F). No entanto, quando tratadas com DDMSNP, as células MDAMB-231 tiveram os valores de IC50 para DIM e DOX reduzidos para 0,77 µM e 0,31 µM, respectivamente, a partir de seus valores individuais de IC50 de 5,7 µM e 1,4 µM (Fig. 5A, Fig. S3F). Em contraste, os valores de IC50 de DIM e DOX em 4T1 foram de 0,57 µM e 0,23 µM para o tratamento com DDMSNP, que foram significativamente menores do que os valores individuais de IC50 de 4,14 µM e 0,96 µM para NDIM e NDOX, respectivamente (Fig. 5A, Fig. S3F). A partir de então, essas concentrações de IC50 para o tratamento combinatório com fármacos nativos foram eventualmente empregadas em estudos in vitro.
Em seguida, foi realizada a imunotransferência para examinar a regulação de marcadores de EMT em ambas as linhagens celulares após o tratamento com DDMSNP, sendo observada a redução das expressões de N-caderina, Snail, Slug e Vimentina, e o aumento da expressão de E-caderina em 4T1 em comparação ao controle (Fig. 5Bi, ii). Além disso, houve uma redução significativa no número e diâmetro dos CESs tratados com DDMSNP em comparação ao controle (Fig. 5Ci, ii), o que confirmou o efeito oposto da DOX, pois ela manteve a propagação dos CESs (Fig. 2Bi, ii). No entanto, o tratamento com DDMSNP nas células cancerosas causou uma redução significativa (P < 0,005) na expressão de N-caderina nas células MDAMB-231 e um aumento notável na expressão de E-caderina nas células 4T1 (Fig. S4A–C). Não foram observadas alterações significativas nas expressões de E-caderina em MDAMB-231 e N-caderina em células 4T1 (Fig. S4A–C). Doravante, para verificar a regulação dos marcadores de EMT após o tratamento com DDMSNP, foi realizada análise de FACS. Observou-se que, na população CD44+/CD24−/low, diferentemente dos grupos tratados com DOX, nem a N-caderina nem a E-caderina apresentaram alterações significativas nas CSCs derivadas de MDAMB-231 tratadas com DDMSNP, o que sugeriu uma progressão restrita da EMT (Fig. 5Di, E). No caso das CSCs derivadas de 4T1, após o tratamento com DDMSNP, a expressão de N-caderina diminuiu de 23,5% para 15% e a de E-caderina aumentou de 66% para 72,3%, o que também sugeriu uma regulação da EMT (Fig. 5Dii, E). Isso foi confirmado ainda mais em CSCs purificadas de CESs derivados de MDAMB-231 e 4T1 por análise de imunotransferência. Observou-se que, quando as CSCs foram tratadas com DDMSNP, a expressão de E-caderina aumentou, enquanto a expressão de N-caderina, Snail, Slug e Vimentina diminuiu (Fig. 5F). Além disso, a metástase pós-EMT para os pulmões de camundongos injetados com células TNBC (4T1) ou CSCs derivadas de células 4T1 foi comparada pela intensidade de imunofluorescência do marcador BRCA1. Pelos resultados, confirmou-se que, em comparação aos grupos injetados com células 4T1, os grupos injetados com CSCs apresentaram maior metástase para os pulmões de camundongos portadores de tumor, o que foi denotado pelo aumento da expressão de BRCA1 (Fig. 5G). Mas ficou evidente pela análise de imunofluorescência de BRCA1 que o DDMSNP foi capaz de reduzir a metástase pós-EMT de células tumorais para os pulmões em ambos os camundongos portadores de tumor injetados com 4T1 e CSCs (Fig. 5G), o que foi exatamente o oposto do nosso resultado anterior, onde descobrimos que a DOX induziu metástase pós-EMT (Fig. 2F).
Além disso, as expressões de N-caderina e E-caderina em nível de mRNA também foram verificadas por RT-PCR quantitativo (Fig. 6A). Após o tratamento com DOX, a expressão de N-caderina aumentou e a expressão de E-caderina diminuiu, o que foi revertido quando tratado com DDMSNP em CSCs derivadas de MDAMB-231 (Fig. 6A). Os mesmos resultados foram observados para CSCs geradas a partir de 4T1 (Fig. 6A). A eficácia do DDMSNP foi ainda comprovada em CESs enriquecidos com CSCs expostos ou não expostos a meio indutor de EMT. O resultado foi contraditório ao efeito da DOX na superexpressão de N-caderina e na expressão diminuída de E-caderina em CSCs geradas a partir de células TNBC (Fig. 2E). As CSCs derivadas de MDAMB-231 e 4T1 expostas à indução de EMT apresentaram menor expressão de N-caderina e maior expressão de E-caderina na presença de DDMSNP em comparação com as CSCs induzidas ou não induzidas por EMT que não foram tratadas com DDMSNP (Fig. 6Bi, ii). Além disso, o DDMSNP também reduziu a expressão de outros marcadores de EMT, como Snail, Slug e Vimentina, mesmo quando a EMT foi induzida (Fig. 6Bi, ii). Após a transfecção transitória de CSCs derivadas de MDAMB-231 e 4T1 com E-caderina, o efeito do DDMSNP foi bastante perceptível, pois suprimiu a expressão de N-caderina ao mesmo tempo que aumentou a expressão de E-caderina em comparação com os controles não transfectados e transfectados (Fig. 6Ci, ii). Por outro lado, quando o siRNA específico causou uma diminuição na expressão de E-caderina em comparação com o controle, o DDMSNP recuperou a expressão quando tratado tanto em CSCs derivadas de MDAMB-231 quanto de 4T1 (Fig. 6Di, ii). Em contraste, o tratamento com DDMSNP reduziu a expressão de N-caderina mesmo na presença de siRNA de E-caderina (Fig. 6Di, ii). Portanto, todos esses dados indicam que o DDMSNP foi capaz de controlar a indução de EMT regulando as expressões de marcadores proeminentes de EMT.
Efeito antimetastático de exossomos carregados com DDMSNP (e-DDMSNP) em camundongos BALB/c com tumor sólido induzido por CSC
Efeito antimetastático de e-DDMSNP em tumores derivados de TNBC-CSCs. A (i) Encapsulação de DDMSNP em exossomos, (ii) A morfologia de um exossomo vazio e exossomos carregados com DDMSNP capturada por MET. B Imagens de microscopia confocal representam a captação de e-DDMSNP em células (painel superior esquerdo) e esferas (painel inferior esquerdo). A análise Z-stacking mostra a internalização de e-DDMSNP em células (painel superior direito) e na esfera (painel inferior direito). C Representação esquemática do desenho experimental para estudar a eficácia de DOX e e-DDMSNP em camundongos com tumor derivado de CSC 4T1. D A figura representa a inibição do crescimento de tumores derivados de CSCs 4T1 em camundongos BALB/c após tratamento com DOX e e-DDMSNP. E A figura mostra o tamanho reduzido dos tumores nos grupos tratados em comparação com o grupo não tratado. F O gráfico representa as alterações de peso corporal durante o tratamento. Os dados são expressos como média ± DP (n = 6). G O diagrama de barras representa o volume tumoral e o peso tumoral de camundongos controle e camundongos que receberam DOX ou e-DDMSNP (n = 6, média ± DP), * denota P < 0,0001. H A análise espectrométrica de massas mostra a internalização de e-DDMSNP nos tumores. O pico de maior intensidade na representação gráfica denota a massa molecular de DIM nativo e DOX nativo. O gráfico mostra o mesmo pico com maior intensidade, definindo a massa molecular exata de DIM e DOX em extratos de tecido de tumores tratados com e-DDMSNP. I Imagens de fluorescência e campo claro representam tecidos tumorais dos grupos controle, DOX e e-DDMSNP tratados. J Imagem de fluorescência do pulmão dos grupos tratados e não tratados indica metástase pulmonar. K Efeito do tratamento com DOX e e-DDMSNP na sobrevivência de camundongos com tumor sólido derivado de CSCs 4T1 que expressam RFP. Os dados são analisados usando o método de Kaplan-Meier. L As imagens denotam coloração H&E (magnificação de ×20) de tumores e pulmões dos grupos tratados e não tratados. M O ensaio de imunofluorescência representa as expressões de N-cadherina (vermelho) e E-cadherina (verde) em tumores sólidos derivados de CSC 4T1 não tratados (controle) e tratados com DOX ou e-DDMSNP.
Para garantir a biocompatibilidade, a captação celular adequada, a preferência por direcionamento tumoral e a eficácia de direcionamento aprimorada, esses DDMSNPs foram encapsulados em exossomos extraídos de células cancerígenas usando um procedimento estabelecido. O aprisionamento dos DDMSNPs dentro dos exossomos foi posteriormente comprovado por microscopia de fluorescência, onde foi observada a colocalização do marcador de exossomo CD63, marcado com fluoróforo verde (FITC), e da DOX de cor vermelha (Fig. 7Ai). Além disso, dados de MET sugeriram que o tamanho dos e-DDMSNPs era de 100 a 180 nm de diâmetro (Fig. 7Aii). Adicionalmente, a captação celular desses e-DDMSNPs foi confirmada por microscopia confocal (Fig. 7B, painel superior), cuja imagem 3D comprovou a ligação e internalização adequadas dos e-DDMSNPs nas células TNBC (vídeo 1). Isso comprovou o direcionamento adequado desses exossomos carregados para as células. A captação celular dos e-DDMSNPs foi ainda comparada com DIM nativo, DOX nativa, DIM nanotizada, DOX nanotizada, DDMSNP1 e DDMSNP2, onde a captação do composto mais eficiente foi observada no caso de e-DDMSNPs tratados em células MDAMB-231 e 4T1 (Fig. S5A). A microscopia confocal, por outro lado, também verificou que os e-DDMSNPs conseguiam penetrar na massa celular 3D dos esferoides, indicando que eles poderiam atingir o núcleo dos esferoides, que se assemelhavam à massa tumoral (Fig. 7B, painel inferior; vídeo 2).
Efeito do e-DDMSNP no volume tumoral e na sobrevivência de camundongos portadores de tumor
Grupos Volume tumoral (mm3) Contagem de células tumorais (× 106) SVM (dias) Aumento da sobrevida (%) T/C (%) TIR (%) Controle tumoral 245,310 ± 0,28 27,26 ± 1,2 44 – – – CSC 4T1 + exossomos 237,128 ± 0,25 26,85 ± 1,30 – – – – CSC 4T1 + MSNPs 240,039 ± 0,20 27,28 ± 1,4 – – – – CSC 4T1 + DOX 136,125 ± 0,22# 11,32 ± 0,7# 58# 42# 142# 42,13# CSC 4T1 + e-DDMSNP 13,662 ± 0,24* 3,8 ± 0,6* 75* 74* 174* 87,12*
Os dados foram representados como média ± DP, n = 6
#P < 0,05 significativamente diferente do grupo controle de tumor sólido
*P < 0,05 significativamente diferente do grupo tratado com DOX. (ANOVA de uma via seguida pelo teste post hoc de Tukey)
Além disso, CSCs derivadas de esferas 4T1 com expressão estável de RFP foram injetadas em camundongos BALB/c singênicos para formar tumores mamários ortotópicos. Esses modelos tumorais foram desenvolvidos para determinar e comparar o efeito das e-DDMSNPs com a DOX. Portanto, para atender a isso, os camundongos foram tratados com DOX e e-DDMSNPs por 10 dias antes de serem sacrificados. Este esquema de tratamento foi apresentado por diagrama esquemático na Fig. 7C. A DOX, um quimioterápico bem conhecido, foi capaz de reduzir o tamanho do tumor após 10 dias de terapia; no entanto, a maior redução no tamanho do tumor foi observada no grupo de tumor tratado com e-DDMSNP em comparação com os grupos controle ou tratados com DOX (Fig. 7D, E). Embora nenhuma diferença significativa no tamanho do tumor tenha sido observada nos grupos tratados com nanopartículas vazias (MSNPs) e exossomos vazios em comparação com os grupos controle (Fig. S5B-C). Por outro lado, a administração de DOX reduziu significativamente (P < 0,05) o peso corporal do hospedeiro, enquanto um ganho mínimo de peso corporal foi observado nos camundongos dos grupos controle e tratado com e-DDMSNP (Fig. 7F). Além disso, uma redução significativa no volume e peso do tumor foi observada no grupo tratado com e-DDMSNP em comparação com os grupos controle e tratado com DOX (Fig. 7G). Todos esses dados sugerem um efeito in vivo proeminente da e-DDMSNP. Isso foi validado ainda mais por espectrometria de massas, que verificou a presença de DIM e DOX no microambiente tumoral do grupo tratado com e-DDMSNP (Fig. 7H). Como resultado dessa investigação in vivo, a existência de DIM e DOX em e-DDMSNP foi confirmada mais uma vez. A redução mais significativa na intensidade de fluorescência foi observada após o tratamento com e-DDMSNP em tumores derivados de CSCs que expressam RFP de forma estável, em comparação com tumores controle ou tratados com DOX (Fig. 7I). Isso confirma o crescimento e a divisão celular restritos das CSCs após o tratamento com e-DDMSNP. Como consequência, a menor ocorrência de metástase pulmonar foi observada em camundongos portadores de tumor que expressam RFP tratados com e-DDMSNP, em contraste com camundongos controle e tratados com DOX (Fig. 7J). Embora a DOX tenha sido capaz de reduzir o tamanho do tumor, a metástase à distância para o pulmão e o fenômeno induzido por EMT foram aumentados nesse grupo, o que foi apoiado pelos dados de imagem de órgãos (Fig. 7J). Isso confirma novamente as desvantagens da DOX quando tratada individualmente para TNBC. No entanto, a DOX mostrou-se mais eficaz do que os controles não tratados quando a taxa de sobrevivência desses grupos de camundongos foi considerada por um período prolongado de tempo (Fig. 7K). Porém, os camundongos tratados com e-DDMSNP tiveram a maior taxa de sobrevivência efetiva (Fig. 7K). Isso foi ainda mais apoiado quando o tempo médio de sobrevivência (MST), ILS (%), T/C (%) e TIR (%) foram significativamente (P < 0,05) aumentados nos camundongos tratados com e-DDMSNPs em comparação com o grupo controle de tumor sólido (Tabela 1). O tratamento combinado mostrou-se mais eficaz do que a monoterapia na supressão do volume tumoral e no aumento do tempo de vida do hospedeiro portador de tumor.
As arquiteturas teciduais dos tumores e pulmões dos camundongos desses grupos foram posteriormente avaliadas por coloração H&E. As observações nesta coloração confirmaram perda máxima das arquiteturas celulares e compactação tecidual, bem como aparecimento de estruturas vacuolares com regiões necróticas nos tecidos tratados com e-DDMSNP em comparação aos controles não tratados e grupos tratados com DOX (Fig. 7L, painel esquerdo). Além disso, a histologia pulmonar dos camundongos portadores de tumor tratados com e-DDMSNP, DOX e animais controle não tratados demonstrou a maior supressão da expansão metastática após o tratamento com e-DDMSNP (Fig. 7L, painel direito). Adicionalmente, os pulmões dos camundongos portadores de tumor tratados com e-DDMSNP não exibiram os focos metastáticos com densidade celular aumentada e estruturas alveolares aberrantes observados nos campos teciduais dos grupos controle não tratado e tratado com DOX. Em vez disso, os pulmões se assemelhavam amplamente ao tecido pulmonar normal (Fig. 7L, painel direito). No entanto, MSNPs vazios e exossomos vazios não conseguiram alterar as arquiteturas teciduais dos tumores TNBC de camundongos, o que comprovou os efeitos específicos da combinação DIM e DOX in vivo (Fig. S5D). Juntamente com isso, e-DDMSNP não demonstrou qualquer toxicidade orgânica nos camundongos hospedeiros (Fig. S5E). Isso esclareceu a eficácia desta nanoformulação exossomal contra TNBC. Além disso, os resultados dos ensaios de imunofluorescência tecidual em seções tumorais dos grupos controle não tratado, tratado com DOX e tratado com e-DDMSNP corroboraram todas essas observações in vivo. Consistente com os achados in vitro, a maior expressão de N-caderina e a expressão diminuída de E-caderina em tumores não tratados e tratados com DOX apoiaram a noção de que o início da EMT nesses cânceres os levou a metastatizar para o pulmão (Fig. 7M). O e-DDMSNP, por outro lado, não apenas diminuiu a expressão de N-caderina enquanto aumentava a expressão de E-caderina, mas também inibiu a indução de EMT pelas CSCs do TNBC (Fig. 7M). Portanto, todos esses achados in vitro e in vivo sugerem que e-DDMSNP é uma nanoformulação exossomal eficiente que pode interromper o avanço da EMT induzida por DOX no TNBC.
Discussão
A recapitulação da ontogenia em células cancerígenas causa ativação inadequada da EMT. A capacidade de disseminação das células cancerígenas está relacionada às transições entre estados epiteliais e mesenquimais. A EMT ocorre em uma fração das células cancerígenas em tumores primários, resultando em características migratórias e invasivas aprimoradas. Esta é a fase preliminar da metástase e da formação de tumores secundários. Portanto, no contexto da cascata metastática, a EMT é considerada um mecanismo biológico crucial.

Por outro lado, a heterogeneidade fenotípica das CSCs representa um obstáculo significativo para o desenvolvimento de terapias contra o câncer. As CSCs podem modificar seu nicho manipulando várias vias de sinalização celular para sustentar processos homeostáticos como a EMT. Portanto, há uma correlação substancial entre o enriquecimento de CSCs e a EMT na invasão e metástase de células tumorais. A aquisição de quimiorresistência em células tumorais está ligada a essas CSCs e à EMT.

Para obter respostas seguras e eficazes a longo prazo, as terapias direcionadas para a supressão tumoral devem, portanto, ser capazes de atingir todo o tumor, incluindo os nichos de CSCs, em qualquer estágio do desenvolvimento do tumor e erradicar tanto as células cancerígenas quanto as CSCs com seletividade adequada. Esse tipo de modificação terapêutica é altamente necessário para o TNBC, pois os tratamentos atuais para pacientes com TNBC são limitados em comparação com os pacientes não-TNBC que apresentam expressão de ER, PR e/ou HER2. Devido à sua resistência inerente, as CSCs do TNBC não podem ser tratadas com medicamentos quimioterápicos tradicionais como a DOX. Essa resistência a medicamentos do TNBC está altamente associada ao aumento da taxa de metástase em pacientes. No entanto, após o tratamento, os tumores restantes exibem enriquecimento de CSCs com todas as características da EMT. Como resultado, os pacientes com TNBC apresentam as menores taxas de sobrevida livre de metástase e geral entre todos os subtipos de câncer de mama. Eles também são mais propensos a recair e morrer dentro de 5 anos após o diagnóstico e tratamento iniciais. Portanto, uma nova estratégia benéfica para combater essa progressão da EMT mediada por CSCs no TNBC é altamente necessária.

De acordo com as diretrizes da National Comprehensive Cancer Network (NCCN) de 2020, uma das opções de tratamento mais recomendadas para pacientes com TNBC metastático é a DOX. No entanto, a DOX, quimioterápico de primeira linha contra o TNBC, não apenas desenvolve resistência a medicamentos, mas também induz metástase.
De acordo com nossos resultados, a DOX poderia aumentar o número de CSCs e causar superexpressão de fatores promotores de EMT, como N-caderina, Snail, Slug e Vimentina, bem como a regulação negativa de marcadores epiteliais, como E-caderina, em CSCs (Fig. 2C–E). Semelhante à hipótese sobre a metástase induzida por DOX, observamos um aumento na taxa de metástase pulmonar em camundongos portadores de tumores gerados a partir de CSCs derivadas de 4T1 ou células 4T1 (Fig. 2F). Tumores gerados em camundongos a partir de CSCs-4T1, por outro lado, apresentaram uma taxa de metástase maior do que as células cancerígenas (4T1), indicando que as CSCs são mais virulentas no TNBC (Fig. 2F). A integração da fitoterapia e quimioterapia no tratamento com múltiplos fármacos é uma estratégia útil focada na redução da toxicidade e no ajuste de dose de cada parceiro individual da combinação de medicamentos. Portanto, para superar o efeito da DOX na indução de EMT mediada por CSC, foi investigado um efeito sinérgico positivo de um fitoquímico e um fármaco quimioterápico convencional para alcançar os melhores resultados. Por esta razão, o composto indólico DIM foi selecionado para investigação e análise a fim de confirmar seu efeito sinérgico com foco em estratégias anti-TNBC. Os resultados não apenas mostram sinergismo positivo entre DIM e DOX, mas também confirmam um melhor efeito antiproliferativo contra células TNBC em comparação com o tratamento individual (Fig. 3). O efeito anti-EMT desta combinação foi confirmado adicionalmente pela verificação das alterações na expressão de proteínas como N-caderina, E-caderina, Snail, Slug e Vimentina em células TNBC (Fig. 4A, B). No entanto, o efeito desta combinação sobre as CSCs foi posteriormente avaliado, uma vez que as CSCs são altamente resistentes à quimioterapia convencional. Assim, para aumentar a eficácia desta combinação contra CSC e para administrar DIM e DOX concomitantemente, ambos foram encapsulados em uma única nanopartícula de sílica mesoporosa. Isso evoluiu como uma formulação com tamanhos de ~100 nm, que é um tamanho favorável para superar os obstáculos da junção apertada e do mecanismo de efluxo de fármacos presentes nas CSCs (Fig. 1). Além disso, a liberação prolongada de DIM e DOX como resultado desta nanoformulação manteve esses compostos ativos na faixa terapêutica por um período de tempo mais longo (Fig. 1F). Como esperado, este DDMSNP foi capaz de atingir as CSCs regulando sua atividade promotora de EMT (Fig. 5). Portanto, a metástase pulmonar induzida por DOX em camundongos portadores de tumor TNBC foi restringida por esta nova nanoformulação que administra tanto DIM quanto DOX ao nicho tumoral desenvolvido a partir de CSCs ou células cancerígenas (Fig. 5G).
Contudo, a metástase pulmonar mais agressiva de tumores derivados de CSC em comparação com tumores derivados de células cancerígenas também foi restringida pelo DDMSNP. No entanto, o DDMSNP também foi capaz de reduzir a indução forçada de EMT e a superexpressão de marcadores de EMT in vitro (Fig. 6B–D). Portanto, o DDMSNP emergiu como uma proeminente nanoformulação sintética que suporta a combinação e co-entrega de DIM e DOX. Contudo, acredita-se que uma plataforma de administração de medicamentos mais potente sejam as nanopartículas biomiméticas, que combinam as características únicas de biomateriais naturais, como os exossomos, com a versatilidade funcional das nanopartículas sintéticas. Assim, para aumentar a potência dos DDMSNPs, eles foram encapsulados em exossomos (Fig. 7A). Devido à sua biocompatibilidade, baixa toxicidade, imunogenicidade mínima e estabilidade na circulação, esses exossomos têm sido empregados como nanocarreadores eficientes. Além disso, esses nanocarreadores exossomais apresentam captação celular eficiente e capacidade de direcionamento a alvos, o que por sua vez pode afetar as CSCs ou células cancerígenas. Foi comprovado pelos resultados que esses e-DDMSNPs têm capacidade máxima de captação celular em comparação com DIM ou DOX nativos e nanoencapsulados (Fig. S5A), bem como mostraram direcionamento celular em cultura de monocamada e também ao núcleo dos esferoides enriquecidos com CSCs (Fig. 7B). Assim como os DDMSNPs, os e-DDMSNPs também foram capazes de atingir eficientemente as CSCs e reduzir a progressão do crescimento tumoral mediada por CSCs em modelo de camundongos. Além disso, os e-DDMSNPs inibiram a progressão da EMT mediada por CSCs e a metástase à distância in vivo (Fig. 7I, J, L, M). Adicionalmente, a análise histológica após administração de e-DDMSNPs em doses repetidas não detectou danos teciduais ou outras anormalidades em vários órgãos principais do corpo. Portanto, este estudo sugere que os e-DDMSNPs são um candidato promissor para o tratamento combinado do TNBC, visando a EMT mediada por CSCs.
Conclusão
As CSCs apresentam uma série de propriedades, algumas das quais são indicativas de características de EMT. As CSCs contribuem para a progressão metastática, seguida por um comportamento tumoral agressivo, o que pode ser um dos alvos da terapia anticâncer. Portanto, a e-DDMSNP, ou nanopartícula de sílica mesoporosa revestida por exossomo, foi sintetizada para tratar essas CSCs indutoras de EMT no TNBC. Em conjunto, todos os resultados mostraram que as e-DDMSNPs tiveram um efeito antitumoral sinérgico em células de TNBC e CSCs in vitro, e um efeito antitumoral significativo in vivo. Embora esta nova nanoformulação exossomal tenha grande potencial para atingir as CSCs, bem como a EMT, estudos adicionais são necessários para elucidar o perfil benefício-risco da e-DDMSNP para entrada nas fases de ensaios clínicos. Em conjunto, essas evidências podem abrir caminho para uma abordagem eficaz no combate ao TNBC, desde que essa estratégia envolva a combinação de DIM e DOX.
Informações Suplementares
Abreviações
TNBC
Câncer de mama triplo negativo
EMT
Transição epitélio-mesenquimal
CSC
Célula-tronco cancerígena
DOX
Doxorrubicina
DIM
3,3′-Diindolilmetano
MSNP
Nanopartícula de sílica mesoporosa
DDMSNP
MSNP carregada com DIM e DOX
e-DDMSNP
Exossomo carregado com DDMSNP
CTAB
Brometo de cetiltrimetilamônio
TEOS
Orto-silicato de tetraetila
APTES
3-Aminopropiltrietoxissilano
NDIM
DIM encapsulado em MSNP
NDOX
DOX encapsulado em MSNP
DOX-fMSNPs
MSNPs amino-funcionalizadas carregadas com DOX
SEM
Microscópio eletrônico de varredura
TEM
Microscópio eletrônico de transmissão
DLS
Espalhamento dinâmico de luz
FTIR
Espectrômetro de infravermelho por transformada de Fourier
PBS
Solução salina tamponada com fosfato
EGF
Fator de crescimento epidérmico
TPSA
Área de superfície polar topológica
CI
Índice de combinação
Fa
Fração afetada
DRI
Índice de redução de dose
DDMSNP1
DIM encapsulado em DDMSNP
DDMSNP2
DOX encapsulado em DDMSNP
MTT
Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
PI
Iodeto de propídio
MST
Tempo de sobrevida mediano
ILS
Aumento na expectativa de vida
TIR
Taxa de inibição do crescimento tumoral
CES
Esferoide enriquecido com CSC
BBB
Barreira hematoencefálica
Nota do Editor
A Springer Nature permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Contribuições dos autores
Subhadip Hajra: conceituação, obtenção de financiamento, discutiu os resultados e comentou o manuscrito. Arijit Bhowmik: conceituação, redação do rascunho original, discutiu os resultados e comentou o manuscrito. Rupali Sarkar, Souradeep Biswas: realizaram os experimentos, discutiram os resultados, redação do rascunho original, Rituparna Ghosh, Priya Samanta, Shampa Pakhira, Mrinmoyee Mondal, Yashaswi Dutta Gupta: prestaram assistência, discutiram os resultados e comentaram o manuscrito. Suman Bhandary, Prosenjit Saha: delinearam os experimentos, discutiram os resultados.
Financiamento
Este trabalho é apoiado pelos projetos patrocinados pela SERB (EEQ/2020/000601 e CRG/2021/007813).
Disponibilidade de dados e materiais
Todos os dados gerados ou analisados durante o estudo estão incluídos no artigo e podem ser produzidos sempre que necessário.
Declarações
Aprovação ética e consentimento para participação
Todos os procedimentos experimentais foram realizados seguindo rigorosamente as diretrizes do Comitê de Ética Animal Institucional (CPCSEA Reg. No.-1774/GO/RBi/S/14/CPCSEA, Índia.
Consentimento para publicação
Todos os autores do artigo concordam com a publicação.
Interesses concorrentes
Os autores declaram que não possuem interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Referências
Subtipo molecular do câncer de mama triplo-negativo e progresso do tratamento
Dissecando a cascata metastática
Transição epitélio-mesenquimal — uma marca da metástase do câncer de mama
Células-tronco cancerígenas como impulsionadoras chave da progressão tumoral
Células-tronco cancerígenas: uma breve revisão do estado atual
Células-tronco cancerígenas e EMT em carcinoma
Sobre as conexões entre células-tronco cancerígenas e EMT
Ligações entre células-tronco cancerígenas e transição epitélio-mesenquimal
Atenuação da cardiotoxicidade e genotoxicidade induzidas por doxorrubicina por um composto natural à base de indol, 3,3′-diindolilmetano (DIM), através da ativação das vias de sinalização Nrf2/ARE e inibição da apoptose
Direcionamento de células-tronco cancerígenas por nutracêuticos para terapia do câncer
Uma combinação de resveratrol e 3,3′-diindolilmetano, um potente radioprotetor
Novos insights moleculares e bioquímicos da hepatotoxicidade induzida por doxorrubicina
Fármacos anticancerígenos: estratégias recentes para melhorar o perfil de estabilidade, propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas
Revisão crítica sobre os diferentes papéis dos exossomos no TNBC e a entrega mediada por exossomos de microRNA/siRNA/lncRNA e direcionamento de fármacos para vias de sinalização no câncer de mama triplo-negativo
A biologia, função e aplicações biomédicas dos exossomos
Crescimento controlado de esferas de sílica monodispersas na faixa de tamanho mícron
A hipóxia modula a população de células-tronco e induz EMT na linhagem de células epiteliais mamárias MCF-10A
Formulação e atividades antitumorigênicas de nifetepimina nanoencapsulada: uma abordagem promissora no tratamento do carcinoma de mama triplo-negativo
Avaliação da atividade citotóxica de Tamarix articulata e seu potencial anticancerígeno em células de câncer de próstata
Entrega direcionada de nanopartículas potentes de PLGA encapsuladas com 3,3′-diindolilmetano baseadas no peptídeo anti-SSTR2 através da barreira hematoencefálica previne a progressão do glioma
A regulação negativa transcricional da E-caderina por metilação do promotor, mas não por mutação, está relacionada à transição epitélio-mesenquimal em linhagens celulares de câncer de mama
Caracterização multi-ômica do modelo tumoral de glândula mamária murina 4T1
Em busca das funções supressoras de tumor de BRCA1 e BRCA2
Transições epitélio-mesenquimais na progressão tumoral
Transições entre estados epiteliais e mesenquimais: aquisição de características malignas e de células-tronco
Heterogeneidade tumoral e plasticidade das células cancerígenas
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O nicho de células-tronco cancerígenas: quão essencial é o nicho na regulação da stemness das células tumorais?
Resistência a medicamentos no câncer de mama metastático: nanomedicina direcionada ao tumor como salvação
Transição epitélio-mesenquimal, células-tronco cancerígenas e resistência ao tratamento
Padrão de disseminação metastática no câncer de mama triplo-negativo
Significado prognóstico do subtipo molecular, sítio metastático e cirurgia do tumor primário para sobrevida no câncer de mama metastático primário: um estudo baseado no SEER
Fatores prognósticos de sobrevida entre mulheres com câncer de mama metastático e impacto da natureza primária ou secundária da doença na sobrevida: um estudo populacional francês
Câncer de mama triplo-negativo: prática atual e direções futuras
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