pmid: "40431421"
title: "3,3'-Diindolilmetano Melhora a Doença Hepática Gordurosa Associada à Disfunção Metabólica via Sinalização AhR/p38 MAPK."
authors: "Su J, Fang H, Lin Y, Yao Y, Liu Y, Zhong Y, Li X, Sun S, Huang B, Yang G, Li W, Zhang Y, Li J, Wu J, Liu W, Hu Q, Zhu W"
journal: "Nutrients"
pubdate: "2025 May 15"
doi: "10.3390/nu17101681"
source: "PMC Full Text"
3,3'-Diindolilmetano Melhora a Doença Hepática Gordurosa Associada à Disfunção Metabólica via Sinalização AhR/p38 MAPK.
Autores
Su J, Fang H, Lin Y, Yao Y, Liu Y, Zhong Y, Li X, Sun S, Huang B, Yang G, Li W, Zhang Y, Li J, Wu J, Liu W, Hu Q, Zhu W
Periodico
Nutrients (2025 May 15)
Conteudo
3,3′-Diindolilmetano Melhora a Doença Hepática Gordurosa Associada à Disfunção Metabólica via Sinalização AhR/p38 MAPK
Contexto/Objetivos: A doença hepática gordurosa associada à disfunção metabólica (MAFLD) é uma condição hepática crônica marcada por acúmulo de lipídios, lipotoxicidade e inflamação. Pesquisas anteriores indicam que o 3,3′-Diindolilmetano (DIM), um fitoquímico natural do tipo indol, abundante em vegetais da família Brassicaceae, demonstrou reduzir o peso corporal e melhorar o metabolismo lipídico em camundongos submetidos a uma dieta rica em gordura (HFD). O receptor de hidrocarboneto arílico (AhR), um receptor nuclear envolvido no metabolismo lipídico e na regulação imune, serve como um receptor funcional para o DIM. No entanto, as vias de sinalização subjacentes que regulam a MAFLD permanecem incertas. Nosso objetivo é determinar o impacto benéfico do DIM na MAFLD e os mecanismos associados. Métodos: Coloração por hematoxilina e eosina, juntamente com coloração por Oil Red O, foram utilizadas para avaliar as alterações patológicas e a deposição de lipídios no fígado. A análise bioquímica foi empregada para medir os níveis de triglicerídeos (TG), colesterol total (TC), ácidos graxos livres (FFA), aspartato transaminase (AST), alanina transaminase (ALT), lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) e lipoproteína de alta densidade (HDL-C). A taxa de sobrevivência celular de células HepG2 tratadas com ácido palmítico (PA) e DIM foi avaliada usando o ensaio CCK-8. A citometria de fluxo foi empregada para medir a intensidade de fluorescência emitida por gotículas lipídicas dentro das células. A análise de Western blotting foi realizada para avaliar os níveis de expressão da via AhR e de transportadores de ácidos graxos no tecido hepático. Resultados: Nossos resultados mostraram que o DIM atenuou significativamente o ganho de peso corporal e a lesão hepática induzida pela HFD, diminuiu o acúmulo de gotículas lipídicas em células HepG2 e suprimiu efetivamente a fosforilação da p38 MAPK e os níveis de expressão proteica dos transportadores de ácidos graxos CD36 e FATP4. Conclusões: O DIM reduziu o acúmulo de lipídios ao ativar o AhR e suprimir a fosforilação da p38 MAPK, inibindo assim o transporte de ácidos graxos e as respostas inflamatórias. Esses achados sugerem que o DIM pode representar um candidato terapêutico promissor para a MAFLD, merecendo maior exploração para aplicações clínicas.
- Introdução
A doença hepática gordurosa associada à disfunção metabólica (DHGDM) é uma condição hepática crônica prevalente, afetando 25% da população global, e sua incidência continua aumentando devido às mudanças no estilo de vida e ao aumento da incidência de obesidade. Embora inúmeros estudos apoiem o tratamento da DHGDM, atualmente não há medicamentos explicitamente aprovados para essa enfermidade. De acordo com estudos, alimentos e plantas naturais contêm fitoquímicos chamados indóis e flavonoides que possuem efeitos modificadores de lipídios, antioxidantes e anti-inflamatórios. O 3,3′-Diindolilmetano (DIM) é sintetizado através da polimerização de seu precursor indol-3-carbinol (I3C) no suco gástrico. O I3C é um composto indólico natural derivado de glucosinolatos, prevalentes em vegetais crucíferos como aipo e cenoura, através da hidrólise da mirosinase. Estudos confirmaram que o DIM ou o I3C possui diversas funções biológicas, incluindo antioxidação, anti-inflamação, antimicrobiana, antiangiogênese e inibição tumoral. A regulação do metabolismo lipídico e pode tratar eficazmente a obesidade. A investigação de compostos indólicos com potencial terapêutico representa um avanço crucial no desenvolvimento de fármacos viáveis para abordar doenças crônicas não transmissíveis, incluindo obesidade e DHGDM.
Receptor de hidrocarboneto arílico (AhR), um ligante receptor extensivamente expresso em células, ativa fatores de transcrição e funciona para regular o metabolismo energético e doenças inflamatórias. Muitos compostos, notavelmente indóis derivados de vegetais crucíferos como I3C e DIM, ligam-se ao AhR com grande afinidade. Essa combinação permite que esses compostos participem de uma variedade de funções biológicas no corpo, incluindo metabolismo energético, regulação imunológica e metabolismo de xenobióticos. O AhR é um possível alvo para a intervenção e terapia de doenças hepáticas, uma vez que é extensivamente expresso no fígado e controla as respostas imunológicas e inflamatórias do fígado. Em camundongos, foi demonstrado que o AhR fosforila os fatores de transcrição alvo a jusante da cascata de sinalização p38 MAPK, incluindo elk-1, creb e atf-2, indicando que o AhR é essencial para a ativação da MAPK. A proteína quinase ativada por mitógeno p38 (p38 MAPK) é uma proteína quinase ativada por mitógeno serina/treonina; é expressa em várias células. Estudos conduzidos in vitro confirmaram que o AhR tem uma função no desencadeamento da ativação da p38 MAPK. A apoptose, o ciclo celular e a resposta inflamatória estão todos intimamente ligados a esta última. Estudos mostraram que a molécula a jusante ATF-3 é significativamente aumentada após a fosforilação da p38 em camundongos submetidos a HFD, causando acúmulo de lipídios no fígado, inflamação e fibrose. Estudos mostraram que o aumento da fosforilação da p38 MAPK promove o crescimento de células cancerígenas, enquanto o avanço da MAFLD pode resultar no desenvolvimento de câncer de fígado. O aumento da fosforilação da p38 MAPK diminui a eficácia do DIM no tratamento do câncer; portanto, investigar o impacto do DIM na p38 MAPK é de considerável importância prática para melhorar a MAFLD.
Este estudo investiga o efeito hepatoprotetor do DIM em camundongos com MAFLD induzida por HFD in vivo e em células com acúmulo de lipídios induzido por PA in vitro. Elucidamos ainda mais o mecanismo subjacente para mostrar que o DIM aliviou a MAFLD ao reduzir a fosforilação da p38 MAPK e reduzir o transporte de ácidos graxos. - Materiais e Métodos
2.1. Fármacos e Dosagens
Estudos anteriores demonstraram que, em experimentos baseados em população, a dose de ingestão do agente purificador DIM pode chegar a 300 mg/dia. Com base no coeficiente de conversão de dose equivalente, esse nível de ingestão humana é aproximadamente equivalente a uma ingestão de DIM de 50 mg/kg/dia em camundongos. Além disso, de acordo com os resultados farmacocinéticos relatados em estudos anteriores, o DIM apresenta excelente tolerância em uma dose única de até 300 mg, com sua concentração plasmática máxima atingindo estabilidade. Isso indica que as características farmacocinéticas do DIM se tornam saturadas nessa dose. Consequentemente, em nossos experimentos com animais, selecionamos uma dose de DIM de 50 mg/kg/dia.
2.2. Animais
Do Centro de Animais de Laboratório Médico de Guangdong, foram adquiridos trinta camundongos machos C57BL/6J pesando 18–20 g e com 6–8 semanas de idade. Todas as pesquisas com animais receberam aprovação do Comitê de Cuidado e Uso de Animais do GZCDC (número de protocolo: GZCDC-ACUC-2023057). Um ciclo de 12 h claro: 12 h escuro, temperatura de 22 ± 2 °C e umidade de 40–70% foram todas características do ambiente livre de patógenos específicos (SPF) no qual os camundongos foram mantidos. Após 7 dias de domesticação, os camundongos foram randomizados em 3 grupos: um grupo de camundongos alimentados com dieta controle normal (NCD, n = 10, 10 kcal% de gordura, 3,85 kcal/g de dieta), um grupo alimentado com dieta rica em gordura (HFD, n = 10, 60 kcal% de gordura, 5,24 kcal/g de dieta), e um grupo de camundongos alimentados com HFD recebeu 50 mg/kg/dia de DIM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA, HFD + DIM, n = 10) por via oral através de gavagem. Uma solução de carboximetilcelulose de sódio a 0,5% foi usada para dissolver o DIM, e tanto o grupo NCD quanto o HFD obtiveram uma capacidade equivalente da solução de carboximetilcelulose de sódio a 0,5%. Dezesseis semanas depois, os camundongos foram eutanasiados de forma humanitária e amostras de tecido e sangue foram coletadas para posterior exame aprofundado.
2.3. Análise Bioquímica
Colesterol total (CT), triglicerídeos (TG) e ácidos graxos livres (AGL) foram medidos após o tecido hepático ter sido homogeneizado em etanol a 95% e o sobrenadante coletado. As concentrações séricas de CT, TG, AGL, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-c) e colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-c) foram quantificadas utilizando kits fornecidos pelo Jiancheng BioEngineering Institute (Nanjing, China).
2.4. Análise Histopatológica
Os fígados foram preservados em paraformaldeído a 4%. Serviços de coloração com óleo vermelho O (ORO) e coloração com hematoxilina e eosina (H&E) foram realizados pela Servicebio (Wuhan, China). As imagens foram capturadas usando um microscópio de luz Leica (Wetzlar, Alemanha). A coloração com ORO foi usada para análise quantitativa utilizando o software Image J (Versão 1.53t, Bethesda, MD, EUA).
2.5. Cultura Celular e Tratamento Celular
HepG2 (ATCC, Manassas, VA, EUA), uma linhagem celular de carcinoma hepatocelular humano, foi cultivada em meio DMEM (Gibco, Grand Island, NY, EUA) com adição de 1% de penicilina-estreptomicina e 10% de soro fetal bovino (FBS). A 37 °C, a cultura foi mantida em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Quatro grupos de células foram criados para induzir acúmulo excessivo de lipídios em um modelo in vitro de esteatose hepática: (1) grupo controle (CON), (2) grupo modelo de estimulação com ácido palmítico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) (PA), (3) grupo modelo contendo DIM (PA + DIM), (4) grupo modelo contendo DIM e CH223191 (MCE, Monmouth Junction, NJ, EUA) (PA + DIM + CH223191). Todos os grupos celulares, com exceção do grupo controle, foram expostos por 24 h a meios suplementados com 0,3 mM de PA. Durante as últimas 24 h do tratamento de 48 h, as células foram tratadas com DIM após terem sido dissolvidas em DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA).
2.6. Ensaio CCK-8
Células HepG2 (1 × 10⁴ células/mL) foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas por 24 h sob condições padrão. Após incubação com PA em gradientes de concentração de 0, 25, 50, 100, 200, 400, 800 e 1600 μM, ou DIM em gradientes de concentração de 0, 10, 20, 40 e 80 μM, o meio de cultura foi aspirado. Para experimentos de inibição, cada poço foi preenchido com solução de CCK-8 a 10% (Beyotime, Xangai, China), que foi então incubada a 37 °C por aproximadamente 30 min. O leitor de microplacas BioTek (Biotek, Winooski, VT, EUA) foi então utilizado para avaliar a viabilidade celular em um comprimento de onda de 450 nm. A fórmula de viabilidade celular (%) = [(poço experimental - poço branco)/(poço controle - poço branco)] × 100% foi utilizada para analisar a viabilidade celular.
2.7. Coloração Oil Red O
Após o tratamento, as células HepG2 foram lavadas suavemente duas vezes com PBS antes de serem fixadas por 15 min à temperatura ambiente com paraformaldeído a 4%. Em seguida, as células passaram por diferenciação com isopropanol a 60% por 1 min e foram coradas usando solução Oil Red O (Solarbio, Pequim, China, preparada misturando Oil Red O saturado e água deionizada na proporção de 3:2). Antes de serem examinadas e fotografadas sob um microscópio óptico, as células foram primeiro incubadas por 20 min a 37 °C, depois eluídas por 1 min com isopropanol a 60% e, por último, enxaguadas com 1 mL de PBS.
2.8. Citometria de Fluxo
O meio de cultura foi removido da placa de 6 poços contendo as células HepG2 tratadas e lavado duas vezes com PBS a 37 °C. Um volume igual de solução de trabalho de coloração Bodipy 493/503 a 2,5 μM (GLPBIO, Montclair, CA, EUA) foi adicionado a cada poço, seguido de incubação em ambiente protegido da luz a 37 °C por 30 min. Em seguida, as células foram enxaguadas com PBS três vezes de maneira suave. As células foram raspadas e centrifugadas por cinco minutos a 1200 rpm, e os pellets celulares resultantes foram reconstituídos em 500 μL de PBS para criar a suspensão celular. A citometria de fluxo (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) foi então utilizada para avaliar a intensidade de fluorescência no canal FITC.
2.9. Western Blotting
O tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (KeyGEN BioTECH, Nanjing, China) foi utilizado para extrair proteínas totais, incluindo inibidores de protease e fosfatase e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF). O kit de ensaio de proteínas BCA (KeyGEN BioTECH, Nanjing, China) foi utilizado para produzir todos os extratos e medir as quantidades de proteínas. SDS-PAGE foi utilizado para resolver 40 µg de proteínas extraídas, que foram então transferidas para membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EUA). As membranas foram então bloqueadas usando leite desnatado a 5% ou albumina sérica bovina por duas horas à temperatura ambiente. Em seguida, os anticorpos primários foram mantidos a 4 °C durante toda a noite. Os anticorpos utilizados estão enumerados na Tabela S1. Os anticorpos secundários foram então incubados nas membranas por 2 h à temperatura ambiente. As bandas de proteínas foram visualizadas usando um kit de detecção de quimioluminescência ECL (Abclonal, Wuhan, China) e posteriormente analisadas com um sistema de imagem (Analytik Jena, Jena, TH, Alemanha) e quantificadas usando o software Image J (Bethesda, MD, EUA).
2.10. Análise Estatística
Os dados experimentais foram expressos como média ± desvio padrão ( ± DP) e o software denominado SPSS (Versão 25, Chicago, IL, EUA) foi utilizado para realizar análises estatísticas. A análise de variância de uma via (ANOVA) foi utilizada para comparações múltiplas entre grupos, e o teste LSD-t foi utilizado para analisar dados de medição com distribuição normal. Para criar os gráficos, foi utilizado o GraphPad Prism (Versão 10; La Jolla, CA, EUA). Valores de p abaixo de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. - Resultados
3.1. O DIM Amenizou a Obesidade e o Dano Hepático Induzidos pela HFD
Ao longo da duração do estudo, o peso corporal dos camundongos em cada coorte aumentou progressivamente. O tratamento com DIM foi eficaz em mitigar o ganho excessivo de peso (F = 28.94, p < 0.01) dos camundongos e reduzir o peso do fígado (F = 3.43, p < 0.05), embora não tenha reduzido significativamente o índice hepático (F = 2.50, p = 0.10) (Figura 1A–C). Em comparação com o grupo NCD, a HFD resultou em um aumento significativo nos níveis séricos de TG (F = 4.95, p < 0.05), CT (F = 5.195, p < 0.05), LDL-c (F = 9.99, p < 0.01) e TG hepático (F = 9.60, p < 0.01), e a intervenção com DIM reduziu significativamente os níveis séricos de TG, LDL-c (p < 0.05) e TG hepático (p < 0.05), CT (F = 9.57, p < 0.01), AGL (F = 2.58, p < 0.05) e aumentou os níveis de HDL-c (F = 5.79, p < 0.05) (Tabela 1 e Tabela 2). A extensão da lesão hepática foi avaliada por coloração H&E e coloração ORO (Figura 1D,E), e os níveis de ALT e AST no soro foram avaliados (Figura 1F,G). A análise histopatológica demonstrou esteatose, doença hepatocelular e expansão intersticial em camundongos alimentados com HFD. No entanto, a suplementação dietética com DIM melhorou os sintomas de esteatose hepática. Além disso, os níveis séricos de ALT (F = 4.60, p < 0.05) foram significativamente diminuídos nos camundongos tratados com DIM em comparação com os camundongos alimentados com HFD. Portanto, enquanto o DIM pode reduzir o acúmulo de gotículas lipídicas e aliviar os danos hepáticos, a HFD produz um acúmulo excessivo de gotículas lipídicas nos hepatócitos e resulta em lesão hepática.
3.2. Células HepG2 Acumularam Lipídios como Resultado da Ativação por PA, o que o DIM Reduziu
O impacto de diferentes PA (F = 88.86, p < 0.001) e DIM (F = 112.94, p < 0.001) na proliferação de células HepG2 foi avaliado usando o ensaio CCK-8. Os achados demonstraram que as concentrações empregadas nos experimentos não eram citotóxicas, garantindo assim a segurança das análises subsequentes. Para atingir uma viabilidade celular acima de 90%, determinamos a concentração de PA em 300 μM e DIM em 40 μM (Figura 2A,B). A coloração ORO das células HepG2 foi usada para avaliar quantitativamente o grau de acúmulo lipídico intracelular (Figura 2C,D). Os resultados demonstraram que, após a adição de PA, induziu-se a agregação de gotículas lipídicas intracelulares (F = 546.72, p < 0.01) em células HepG2 e aumentou significativamente os níveis de AST (F = 151.10, p < 0.01) e ALT (F = 15.84, p < 0.01) no meio de cultura (Figura 2E,F). No entanto, com a incorporação de DIM, o acúmulo lipídico foi atenuado, e os níveis de AST e ALT no meio de cultura caíram drasticamente. No entanto, o pré-tratamento com CH223191 aumentou drasticamente os níveis de AST e ALT e incentivou grandemente a produção de gotículas lipídicas intracelulares. Esses resultados sugerem que a estimulação com ácido palmítico desencadeia o acúmulo lipídico intracelular em células HepG2, que esse acúmulo é mitigado pela adição de DIM, e que o efeito inibitório do DIM é neutralizado pelo CH223191.
3.3. O DIM Reduziu a Fosforilação da p38MAPK em Camundongos e Células HepG2
Resultados de western blotting de tecido hepático de camundongos mostraram que a expressão da proteína AhR (F = 16,80, p < 0,01) diminuiu, a expressão da proteína de fosforilação da p38 MAPK (F = 25,58, p < 0,01) e NF-κB (F = 16,15, p < 0,01) aumentaram significativamente em camundongos tratados com HFD (Figura 3A–D). No entanto, camundongos que receberam DIM apresentaram níveis mais elevados de expressão da proteína AhR. Tanto a fosforilação da p38 MAPK quanto a expressão da proteína NF-κB foram marcadamente reduzidas. A expressão da proteína de fosforilação da p38 MAPK (F = 10,56, p < 0,01) e NF-κB (F = 14,83, p < 0,01) aumentou fortemente em células HepG2 tratadas com PA, enquanto a expressão da proteína AhR (F = 14,05, p < 0,05) reduziu. (Figura 3E–H). Quando DIM foi adicionado, a fosforilação da p38 MAPK e NF-κB caíram drasticamente, enquanto a produção da proteína AhR aumentou. A expressão proteica foi semelhante ao grupo PA. De acordo com os dados acima, o acúmulo de lipídios nos fígados de camundongos e células HepG2 elevou a fosforilação da p38 MAPK, a qual foi diminuída pelo tratamento com DIM.
3.4. DIM Atenuou o Transporte de Lipídios em Camundongos e Células HepG2
Como o transporte de ácidos graxos é essencial para a geração de gotículas lipídicas no fígado, examinamos a expressão de proteínas de transporte de ácidos graxos. Uma análise de Western blotting mostrou que camundongos submetidos à HFD apresentaram aumento acentuado nos níveis das proteínas CD36 (F = 7,64, p < 0,05) e FATP4 (F = 72,34, p < 0,01), mas os níveis da proteína PPARγ (F = 43,59, p < 0,01) foram significativamente reduzidos (Figura 4A–E). No entanto, os níveis de expressão das proteínas CD36 e FATP4 foram significativamente reduzidos em camundongos tratados com DIM. Não houve diferença significativa na expressão da proteína FABP1 (F = 2,64, p = 0,15) entre os três grupos. Os níveis de expressão das proteínas CD36 (F = 9,11, p < 0,01), FATP4 (F = 14,00, p < 0,01) e FABP1 (F = 10,08, p < 0,01) aumentaram, mas o nível de expressão da proteína PPARγ (F = 4,85, p < 0,05) foi notavelmente reduzido em células HepG2 estimuladas por PA (Figura 4F–J). Os níveis de expressão das proteínas CD36, FATP4 e FABP1 foram significativamente reduzidos com a adição de DIM, enquanto os níveis de expressão de CD36 e FATP4 foram significativamente aumentados após a administração de CH223191, mas o nível de expressão da proteína FABP1 (p > 0,05) não sofreu alteração significativa. Não houve diferença significativa na expressão da proteína PPARγ (p > 0,05) entre os outros dois grupos. Os dados acima sugerem que o transporte de ácidos graxos está aumentado no fígado de camundongos alimentados com HFD e em células HepG2 estimuladas por PA, que o DIM pode reduzir o transporte de ácidos graxos e que o DIM pode bloquear o efeito da PA. Após 24 horas de tratamento, os níveis de FFA no meio de cultura celular foram avaliados para verificar se o DIM melhora a absorção de ácidos graxos (Figura 4K). O conteúdo de FFA (F = 391,64, p < 0,001) do grupo PA foi muito menor do que o do grupo PA + DIM, indicando que o PA foi transferido para as células a partir do meio de cultura, enquanto o tratamento com DIM inibiu o transporte de FFAs para as células. O CH223191, um inibidor específico do DIM, bloqueou efetivamente o efeito inibitório do DIM sobre o transporte de ácidos graxos (Figura 4L,M). O Bodipy493/503, que pode permear a membrana celular e se ligar especificamente a gotículas lipídicas intracelulares, foi utilizado para refletir a captação celular de ácidos graxos. Os resultados indicaram que o grupo PA apresentou a intensidade máxima de fluorescência (F = 7,39, p < 0,01), enquanto o DIM reduziu significativamente o transporte celular de ácidos graxos, conforme evidenciado por uma diminuição acentuada na intensidade de fluorescência. - Discussão
MAFLD é um distúrbio complexo caracterizado pelo acúmulo de lipídios nos hepatócitos que resulta em fibrose, inflamação e esteatose. O metabolismo lipídico desregulado, a inflamação crônica e o estresse oxidativo estão intimamente relacionados à fisiopatologia da MAFLD. Após camundongos serem alimentados com dieta rica em gordura para induzir MAFLD, o peso corporal do grupo HFD aumentou em quase 20% em comparação com a dieta padrão. O modelo de camundongo com MAFLD foi estabelecido com sucesso. Como em estudos anteriores, camundongos obesos induzidos por HFD apresentaram maior índice hepático. Neste estudo, o peso do fígado do grupo HFD aumentou, mas menos que o peso corporal dos camundongos. Este estudo confirmou que a HFD aumentou os níveis de TG, LDL-c e HDL-c no sangue e no fígado, e diminuiu o HDL-c. O DIM pode reduzir os danos patológicos do fígado e diminuir os níveis sanguíneos de TG, CT e LDL-c. Esses achados sugeriram que o DIM pode reduzir o acúmulo de lipídios nos hepatócitos. AST e ALT são os indicadores mais sensíveis de lesão hepática, e os níveis séricos de AST e ALT estavam aumentados nos camundongos do modelo de alta gordura. Este estudo descobriu que o DIM reduziu os níveis sanguíneos de AST e ALT em camundongos alimentados com HFD, prevenindo danos ao fígado.
O fator de transcrição ativado por ligante AhR é essencial para controlar as respostas imunológicas e o metabolismo lipídico. O DIM demonstrou modular a sinalização do AhR, influenciando assim as vias downstream envolvidas na homeostase lipídica e na inflamação. A MAFLD pode causar armazenamento de gordura e inflamação nas células hepáticas ao ativar a p38 MAPK e aumentar seu nível de fosforilação. Além disso, a oxidação de ácidos graxos pode ser inibida pela ativação da p38 MAPK, resultando no acúmulo de gordura no fígado. Flavonoides cítricos têm efeitos terapêuticos em distúrbios do metabolismo lipídico ao inibir a fosforilação de MAPKs e NF-κB. Nossa pesquisa apoiou ainda mais a visão de que a suplementação com DIM poderia restaurar a fosforilação da p38 MAPK mediada por HFD e a expressão elevada da proteína NF-κB. Após intervenção com o inibidor de AhR CH223191 em experimentos celulares, o nível de expressão de sua proteína downstream NF-κB diminuiu. A reversão da terapia com DIM aumentou a fosforilação da p38 MAPK e a expressão da proteína NF-κB.
A inflamação e o metabolismo lipídico são rigorosamente regulados pela via da MAPK p38. A MAFLD está ligada à ativação da MAPK p38, que aumenta o armazenamento de lipídios e a inflamação hepática. As proteínas de transporte de lipídios, incluindo a CD36, desempenham papéis fundamentais na captação e no tráfego intracelular de ácidos graxos. A expressão elevada de MAPK p38 e CD36 tem sido associada ao aumento do acúmulo de lipídios na MAFLD. Nosso estudo demonstrou que o tratamento com DIM inibiu efetivamente a fosforilação da MAPK p38, consequentemente levando a uma redução na expressão de marcadores pró-inflamatórios como o NF-κB. Essa inibição da sinalização da MAPK p38 é essencial na redução do acúmulo de lipídios hepáticos e na mitigação da lesão hepática, conforme observado tanto in vivo quanto in vitro. O tratamento de macrófagos RAW 264.7 ativou a via da MAPK p38, aumentou a fosforilação da MAPK p38, regulou positivamente a expressão de NF-κB e impulsionou a expressão de CD36. A CD36, uma proteína transmembrana, transporta ácidos graxos de cadeia longa extracelulares para dentro das células para o metabolismo. Na MAFLD, a MAPK p38 afeta a captação e o metabolismo de lipídios ao regular a expressão de CD36. A CD36 é uma proteína fundamental no transporte de ácidos graxos, e sua expressão aumentada não apenas intensifica a captação de ácidos graxos, mas também agrava o acúmulo de lipídios no fígado ao promover a deposição intracelular de lipídios. Em todo o ensaio animal, o grupo HFD apresentou fosforilação da MAPK p38 e expressão de CD36 consideravelmente maiores. Resultados consistentes foram observados em células HepG2 expostas ao PA. O DIM reduziu significativamente a fosforilação da MAPK p38 e a expressão de CD36, bloqueando as vias de sinalização. Ele pode reduzir o acúmulo de lipídios e aliviar ainda mais a progressão da MAFLD, sugerindo que a MAPK p38 e a CD36 podem representar alvos terapêuticos promissores para o manejo da MAFLD.
Estudos demonstraram que a família de transportadores de ácidos graxos (FATP), particularmente o transportador de ácidos graxos 4 (FATP4), está intimamente associada à patogênese da MAFLD. Múltiplos órgãos metabólicos, incluindo intestino, fígado e tecido adiposo, contêm FATP4, uma proteína multifuncional. Ela transporta predominantemente ácidos graxos de cadeia longa do espaço extracelular para o intracelular. O FATP4 ativa ácidos graxos em acil-CoA graxo, o que auxilia o transporte e metabolismo intracelular de ácidos graxos, bem como a produção e armazenamento de triglicerídeos. No modelo de MAFLD induzido por HFD, o nível de expressão de FATP4 aumentou significativamente, o que por sua vez potencializou a captação e síntese de ácidos graxos, levando, em última análise, ao agravamento do acúmulo de ácidos graxos. Estudos mostraram que CD36 e FATP4 têm um efeito sinérgico na função de pacientes com MAFLD. A superexpressão de CD36 resulta no acúmulo intracelular de ácidos graxos, enquanto a regulação positiva de FATP4 influencia a ativação e o metabolismo dos ácidos graxos. Essas descobertas sugerem que os efeitos sinérgicos de CD36 e FATP4 podem levar ao acúmulo excessivo de lipídios nas células hepáticas. A proteína de ligação a ácidos graxos 1 (FABP1) é amplamente expressa no rim, intestino delgado e fígado, entre outros órgãos metabólicos. Os ácidos graxos de cadeia longa são transportados para as células por CD36 e FATP4 e, ao se ligarem às FABPs, são subsequentemente transportados para o retículo endoplasmático, mitocôndrias e núcleo para metabolização. Em um modelo de rato com fígado gorduroso gerado por HFD, a expressão de FABP1 aumentou drasticamente, o que prejudicou o metabolismo de ácidos graxos e foi crucial para o início e progressão da doença hepática gordurosa. Um estudo transversal descobriu que pacientes com MAFLD apresentavam níveis plasmáticos de FABP1 significativamente mais elevados e uma conexão positiva com o índice de massa corporal e a circunferência da cintura, sugerindo que a FABP1 pode ser importante na patogênese da MAFLD. Além disso, a FABP1 regulou negativamente a lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL). O aumento da expressão de FABP1 reduziu a produção de VLDL, levando ao acúmulo intracelular excessivo de TG e TC, o que contribuiu para distúrbios no metabolismo lipídico. Nossos resultados demonstraram que o nível de expressão de FABP1 em células HepG2 induzidas por PA aumentou significativamente, e DIM diminuiu significativamente a expressão de FABP1. No entanto, a intervenção com CH223191 não conseguiu reverter o efeito de DIM, indicando que DIM reduziu o transporte de ácidos graxos principalmente através da regulação de CD36 e FATP4.
5. Conclusões
A MAFLD está mais frequentemente associada à obesidade e ao diabetes tipo 2. Notavelmente, a MAFLD é prevalente em mais de 60% dos pacientes com DM2. Portanto, ensaios clínicos modernos de agentes hipoglicemiantes têm se concentrado cada vez mais em seus efeitos na MAFLD. Havia evidências convincentes de que as tiazolidinedionas (TZDs) e os agonistas do receptor do peptídeo semelhante ao glucagon-1 (GLP-1Ras) eram benéficos no tratamento da MAFLD, pois melhoram a resistência à insulina, controlam o metabolismo lipídico e reduzem drasticamente o peso corporal. Os dois principais tratamentos para a MAFLD são dieta e exercícios. As dietas mediterrâneas têm menos calorias e gorduras poli-insaturadas do que as dietas ocidentais. O peso e a função hepática melhoraram com a redução calórica de forma dose-resposta, mostrando que a dieta pode melhorar a MAFLD. Além disso, os adoçantes artificiais dietéticos melhoraram a composição e a diversidade da microbiota intestinal. O uso prolongado de adoçantes poderia diminuir a flora intestinal benéfica, causando desequilíbrio ecológico microbiano e redução da imunidade. Em camundongos, uma dieta enriquecida com I3C poderia normalizar a carga bacteriana intestinal, aumentar os níveis de imunoglobulina A e melhorar a saúde intestinal. A nutrição é vital ao longo da vida, pois promove o crescimento linear e o desenvolvimento em recém-nascidos e idosos; a insuficiência dietética pode causar disfunção intestinal, resposta inflamatória e anormalidades na regulação imunológica. Assim, a MAFLD pode ser prevenida com sucesso mantendo um equilíbrio dinâmico entre crescimento e nutrição.
Ao inibir a fosforilação da p38MAPK e suprimir as vias de transporte de ácidos graxos, o DIM pode reduzir o acúmulo de gotículas lipídicas e aliviar a MAFLD, fornecendo fortes evidências para o uso de fitoquímicos naturais na prevenção e tratamento de doenças metabólicas. No entanto, este trabalho tem algumas limitações que precisam ser investigadas mais a fundo. Primeiro, as diferenças fisiológicas e metabólicas entre animais e humanos podem limitar nossos achados aos humanos. As vias metabólicas hepáticas específicas da espécie entre camundongos e humanos podem afetar a aplicabilidade de nossos resultados. Segundo, nossos dados mostram que o DIM melhora a MAFLD ativando o AhR e inibindo a via de fosforilação da p38 MAPK, embora os mecanismos em outros tecidos ou tipos celulares sejam desconhecidos. A fisiopatologia da MAFLD envolve vias de sinalização complexas como estresse oxidativo e o eixo fígado-intestino, dificultando a compreensão dos benefícios terapêuticos do DIM. Terceiro, o DIM tem um perfil metabólico complicado e baixa biodisponibilidade in vivo. Nós não testamos os metabólitos do DIM em camundongos, o que pode limitar seu uso terapêutico. A pesquisa deve estudar vias alternativas pelas quais o DIM melhora a MAFLD e avaliar seus efeitos na saúde em ensaios populacionais de longo prazo.
Em conjunto, o estudo sugere que o DIM exerce efeitos hepatoprotetores significativos na DHGNA através da inibição mediada por AhR da via p38 MAPK e da regulação negativa das proteínas de transporte lipídico. Esses resultados demonstram o potencial do DIM como uma opção terapêutica para a DHGNA e justificam uma investigação mais aprofundada de suas aplicações clínicas. As futuras iniciativas de pesquisa devem se concentrar em elucidar as vias moleculares exatas pelas quais o DIM influencia a sinalização de AhR/p38 MAPK e o metabolismo lipídico. Além disso, estudos de longo prazo em coortes maiores de camundongos alimentados com HFD e ensaios clínicos em seres humanos são necessários para comprovar ainda mais a eficácia e segurança do DIM na DHGNA. O potencial do DIM para modular outras vias de sinalização e suas interações com outros componentes dietéticos também devem ser explorados para compreender completamente seu potencial terapêutico. No geral, nosso estudo ressalta a importância de compostos naturais na modulação de vias de sinalização chave envolvidas na patogênese da DHGNA e fornece uma via promissora para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras.
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Materiais Suplementares
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Contribuições dos Autores
Conceptualização, Q.H. e W.Z.; Metodologia, J.S., H.F., Y.L. (Yunfeng Lin), Y.Y., Y.L. (Yanxi Liu), Y.Z. (Yuquan Zhong) e X.L.; Software, J.S. e H.F.; Validação, S.S., B.H., G.Y. e W.L. (Wenxue Li); Investigação, Y.Z. (Yan Zhang), J.L., J.W. e W.L. (Weiwen Liu); Recursos, W.Z.; Curadoria de dados, J.S.; Redação — preparação do rascunho original, J.S.; Redação — revisão e edição, H.F., Y.L. (Yunfeng Lin), Y.Y. e Y.L. (Yanxi Liu); Visualização, J.S.; Supervisão, Q.H.; Administração do projeto, Q.H.; Aquisição de financiamento, W.Z. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Comitê de Revisão Institucional
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Comitê de Cuidado e Uso de Animais do GZCDC (número de protocolo: GZCDC-ACUC-2023057/14 de novembro de 2023). Todos os cuidados e experimentos com animais foram rigorosamente realizados de acordo com o sistema de gestão e uso de animais de laboratório.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados deste estudo são publicamente acessíveis e podem ser solicitados ao autor correspondente.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Referências
Uma nova definição para doença hepática gordurosa associada à disfunção metabólica: Uma declaração de consenso internacional de especialistas
Prevalência, incidência e desfecho da doença hepática gordurosa não alcoólica na Ásia, 1999–2019: Uma revisão sistemática e meta-análise
Alvos Moleculares Emergentes para o Tratamento da Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica
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Superexpressão de CD36 e das acil-CoA sintetases FATP2, FATP4 e ACSL1 aumenta a captação de ácidos graxos em células de hepatoma humano
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Proteína de ligação a ácidos graxos 1 circulante (FABP1) e doença hepática gordurosa não alcoólica em pacientes com diabetes mellitus tipo 2
A proteína de ligação a ácidos graxos 1 aumenta a deposição de gordura em novilhos facilitando a síntese e secreção de triacilglicerol no fígado
Prevalência global da doença hepática gordurosa não alcoólica no diabetes mellitus tipo 2: Uma revisão sistemática e meta-análise atualizada
Efetividade comparativa de múltiplos regimes de tratamento diferentes para doença hepática gordurosa não alcoólica com diabetes mellitus tipo 2: Uma revisão sistemática e meta-análise de rede bayesiana de ensaios clínicos randomizados
O papel dos agonistas do receptor do peptídeo semelhante ao glucagon-1 na esteato-hepatite associada à disfunção metabólica
Papel da semaglutida no tratamento da doença hepática gordurosa não alcoólica ou esteato-hepatite não alcoólica: Uma revisão sistemática e meta-análise
A eficácia e aceitabilidade da dieta mediterrânea e da restrição calórica na doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA): Uma revisão sistemática e metanálise
Efeitos potenciais da sucralose e da sacarina na microbiota intestinal: Uma revisão
A depleção de ligantes do receptor de hidrocarboneto arílico na dieta altera a composição e função da microbiota
Os efeitos da nutrição no crescimento linear
Desenvolvimento do trato gastrointestinal em recém-nascidos como desafio para uma nutrição adequada: Uma revisão narrativa
Desnutrição em idosos – avanços recentes e desafios remanescentes
O DIM reduziu o peso corporal e amenizou a lesão hepática em camundongos. (A) Tendências de peso corporal dos camundongos. (B) Diferenças no peso vivo. (C) Diferenças no índice hepático. (D) As imagens de H&E e ORO ilustram clara e precisamente a porcentagem de esteatose de hepatócitos; (E) Análise quantitativa das imagens de ORO. (F) Diferenças na AST sérica. (G) Diferenças na ALT sérica. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. grupo NCD, # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs. grupo HFD e % p < 0,05 indica diferenças entre grupos em vários momentos.
O DIM reduziu o acúmulo de gotículas em células HepG2. (A,B) O ensaio CCK-8 foi utilizado para avaliar o impacto do PA e do DIM na citotoxicidade das células HepG2. (C) Gotículas lipídicas em células HepG2 visualizadas por coloração com ORO. (D) Análise estatística das gotículas lipídicas das células HepG2 coradas com Oil Red O. (E,F) Efeito do DIM nos níveis de AST e ALT no meio de cultura de células HepG2. * p < 0,05, *** p < 0,001 vs. grupo CON, ### p < 0,001 vs. grupo PA, $ p < 0,05, $$$ p < 0,001 vs. grupo PA + DIM, e &&& p < 0,001 vs. grupo PA + DIM + CH223191.
O DIM reduziu a fosforilação de p38MAPK em camundongos e células. (A–D) Análise por Western blotting dos níveis proteicos de AhR, p-p38 MAPK, p38 MAPK e NF-kB em camundongos e sua quantificação densitométrica, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. grupo NCD, # p < 0,05, ## p < 0,01 vs. grupo HFD. (E–H) Análise por Western blotting dos níveis proteicos de AhR, p-p38 MAPK, p38 MAPK e NF-kB em células HepG2 e sua quantificação densitométrica, * p < 0,05, ** p < 0,01 vs. grupo CON, ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs. grupo PA, $ p < 0,05, $$ p < 0,01, $$$ p < 0,001 vs. grupo PA + DIM, e & p < 0,05, && p < 0,01 vs. grupo PA + DIM + CH223191.
DIM atenuou o transporte de ácidos graxos em camundongos e células. (A–E) Análise de Western blotting dos níveis das proteínas CD36, PPARγ, FATP4 e FABP1 em camundongos e quantificação densitométrica das mesmas, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. grupo NCD, ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs. grupo HFD. (F–J) Análise de Western blotting dos níveis das proteínas CD36, PPARγ, FATP4 e FABP1 em células HepG2 e quantificação densitométrica das mesmas; (K) Efeito do DIM sobre o nível de FFA no meio de cultura de células HepG2. (L,M) Gotículas lipídicas em células HepG2 foram coradas com Bodipy 493/503 para visualização. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vs. grupo CON, # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001 vs. grupo PA, $ p < 0,05, $$ p < 0,01, $$$ p < 0,001 vs. grupo PA + DIM, & p < 0,05, && p < 0,01, &&& p < 0,001 vs. grupo PA + DIM + CH223191.
Diferenças nos níveis séricos de CT, TG, FFA, LDL-c e HDL-c .
Item (mmol/L) NCD HFD HFD + DIM TG 0.37 ± 0.36 0.56 ± 0.62 * 0.43 ± 0.30 # TC 3.17 ± 1.48 4.58 ± 0.40 ** 4.02 ± 0.33 FFA 0.58 ± 0.26 0.66 ± 0.26 0.55 ± 0.59 LDL-c 0.39 ± 0.25 0.84 ± 0.10 * 0.56 ± 0.56 # HDL-c 8.37 ± 0.23 8.16 ± 0.30 9.47 ± 0.33 *##
- p < 0,05, ** p < 0,01 vs. grupo NCD, # p < 0,05, ## p < 0,01 vs. grupo HFD.
Diferenças nas concentrações hepáticas de CT, TG e FFA .
Item (mmol/L) NCD HFD HFD + DIM TG 17.06 ± 4.75 52.55 ± 8.78 ** 24.92 ± 2.98 ## TC 11.88 ± 0.62 13.09 ± 0.29 10.14 ± 0.47 *# FFA 1.01 ± 1.77 1.29 ± 0.32 0.51 ± 0.77 # - p < 0,05, ** p < 0,01 vs. grupo NCD, # p < 0,05, ## p < 0,01 vs. grupo HFD.