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pmid: "31268698"
title: "Poli(anfólito) sinteticamente escalável que melhora dramaticamente a criopreservação celular."
authors: "Bailey TL, Stubbs C, Murray K, Tomás RMF, Otten L, Gibson MI"
journal: "Biomacromolecules"
pubdate: "2019 Aug 12"
doi: "10.1021/acs.biomac.9b00681"
source: "PMC Full Text"

Poli(anfólito) sinteticamente escalável que melhora dramaticamente a criopreservação celular.

Autores

Bailey TL, Stubbs C, Murray K, Tomás RMF, Otten L, Gibson MI

Periodico

Biomacromolecules (2019 Aug 12)

Conteudo

Poli(anfólito) Sinteticamente Escalável que Melhora Dramaticamente a Criopreservação Celular

O armazenamento e transporte de células congeladas sustentam as terapias celulares emergentes/existentes e são utilizados em todos os laboratórios de pesquisa biomédica globalmente. O crioprotetor padrão-ouro atual, dimetilsulfóxido (DMSO), não proporciona recuperação celular quantitativa em suspensão ou em modelos celulares bidimensionais (2D) ou tridimensionais (3D), e o solvente e os debris celulares devem ser removidos antes da aplicação/transfusão. Há uma necessidade real de melhorar este método de 50 anos para sustentar as terapias regenerativas e celulares emergentes. Aqui, apresentamos um potencializador de criopreservação polimérico potente e sinteticamente escalável, facilmente obtido em uma única etapa a partir de um precursor de baixo custo e biocompatível, o poli(metil vinil éter-alt-anidrido maleico). Este poli(anfólito) permite recuperações pós-descongelamento de até 88% para um modelo de monocamada celular 2D, em comparação com apenas 24% usando a criopreservação convencional com DMSO. O poli(anfólito) também permite a redução da [DMSO] de 10% em peso para apenas 2,5% em peso na criopreservação em suspensão, o que pode reduzir os efeitos colaterais negativos e acelerar o processamento pós-descongelamento. Após o descongelamento, as células apresentam danos reduzidos na membrana e taxas de crescimento mais rápidas em comparação com aquelas sem o polímero. O polímero parece funcionar por um mecanismo extracelular único, através da estabilização da membrana celular, em vez da modulação da formação e crescimento de gelo. Este novo crioprotetor macromolecular encontrará aplicações em toda a ciência biomédica básica e translacional e pode melhorar a cadeia de frio para terapias celulares.

Introdução
A criopreservação é um processo essencial para o armazenamento de longo prazo de células e tecidos. Os glóbulos vermelhos (hemácias) são o produto sanguíneo mais frequentemente transfundido, com 12 a 16 milhões de unidades transfundidas por ano apenas nos Estados Unidos, mas o processamento difícil deslocou o uso de hemácias criopreservadas para ambientes onde sua disponibilidade é limitada. A terapia da leucemia é sustentada pela transfusão de células-tronco hematopoiéticas criopreservadas com dimetilsulfóxido (DMSO), e as células de mamíferos são amplamente utilizadas na indústria biofarmacêutica para a produção de proteínas terapêuticas recombinantes (biológicos). No entanto, atualmente não é possível ou prático fornecer esse material de forma reprodutível devido às alterações fenotípicas das culturas em crescimento e, portanto, o congelamento desses materiais é essencial. Além disso, a capacidade de preservar células como monocamadas, que podem ser prontamente utilizadas e não precisam ser propagadas, seria revolucionária ao fornecer materiais de partida idênticos, por exemplo, garantindo que linhagens repórteres precisamente projetadas não sofram qualquer tipo de "deriva fenotípica" propagada que alteraria seus mecanismos precisos de relato. Além disso, há evidências de que a resposta central das células à criopreservação é diferente se as células fizerem parte de uma rede, e a ampliação dos procedimentos de um nível celular microscópico para uma escala tecidual macroscópica introduzirá novos modos de lesão específicos ao congelamento de tecidos. Nossos resultados com monocamadas podem abrir caminho para melhorar os resultados da preservação de órgão-em-um-chip ou talvez até ser a chave para a preservação bem-sucedida de tecidos.

O protocolo padrão ouro para a criopreservação (em suspensão) de células de mamíferos é o congelamento em frascos em uma solução contendo 5–10% do agente crioprotetor, DMSO, que é capaz de entrar nas células e reduzir parcialmente a lesão ao moderar o aumento da concentração de solutos durante o congelamento.− Além disso, as células congeladas em frascos devem ser propagadas por várias passagens antes de estarem estáveis o suficiente para serem usadas em ensaios reprodutíveis. Embora o congelamento em frascos com DMSO funcione para a maioria das linhagens celulares, muitos tipos são altamente sensíveis ao DMSO. A capacidade de armazenar todas as células de forma confiável e empregar concentrações mais baixas de DMSO ajudaria múltiplas áreas, aumentando a viabilidade pós-descongelamento e reduzindo o processamento. Em comparação com o congelamento em solução, o DMSO não funciona bem para monocamadas celulares, resultando tipicamente em apenas cerca de 20–35% de recuperação celular. Claramente, existe uma necessidade real de transformar nossa abordagem à criopreservação para aumentar a recuperação e função celular e reduzir os desafios de processamento.
Apesar dos desafios de criopreservação mencionados acima, os extremófilos evoluíram na natureza para permitir a sobrevivência em condições abaixo de zero, tanto promovendo quanto inibindo a formação e o crescimento de gelo, apresentando grandes oportunidades para a biomedicina. Além dessas estratégias, os extremófilos utilizam a produção de protetores osmóticos, como trealose, prolina e sacarose, bem como macromoléculas, como proteínas anticongelantes ou proteínas abundantes na embriogênese tardia. Polímeros sintéticos, que imitam as propriedades de inibição da recristalização do gelo (IRI) das proteínas anticongelantes, surgiram nos últimos anos como crioprotetores promissores. A recristalização do gelo durante o descongelamento é uma das principais causas de morte celular, e polímeros com atividade IRI, como o poli(álcool vinílico) (PVA), podem levar a aumentos no rendimento pós-descongelamento. A poliprolina, que apresenta IRI moderada, demonstrou melhorar a recuperação pós-descongelamento de monocamadas celulares, potencialmente por interagir com as membranas celulares. Esses exemplos mostram que crioprotetores macromoleculares podem ser projetados para modular a estabilidade da membrana, bem como o crescimento do gelo, apresentando uma oportunidade empolgante. A polilisina carboxilada e outros poli(anfólitos) sintéticos com cargas positivas e negativas mistas podem interagir com as membranas celulares e foram avaliados na vitrificação em criotubos, na vitrificação lenta de monocamadas ou no congelamento lento em criotubos, mas nunca no congelamento lento de monocamadas. Isso resulta em boas recuperações pós-descongelamento, mas requer, por exemplo, soluções de etilenoglicol a 6,5 M e taxas de resfriamento frequentemente muito rápidas; além disso, há a questão de remover uma concentração tão alta de solvente das células antes que ocorra toxicidade. Eles também não foram sintetizados em larga escala, necessária para uma mudança significativa na forma como a criopreservação é conduzida e, portanto, não foram amplamente adotados.

Apesar do progresso mencionado, os rendimentos celulares reais obtidos com poli(anfólitos) ainda podem ser baixos e frequentemente exigem vitrificação (formação de um estado livre de gelo usando cargas muito altas de solvente), o que geralmente não é prático para a maioria dos cenários de criopreservação celular. Um crioprotetor polimérico ideal aumentaria o rendimento celular pós-descongelamento, seria facilmente removido, estaria disponível em escala comercial para uso amplo, permitiria a criopreservação de células em monocamada, bem como em suspensão, e melhoraria a criopreservação de todos os tipos celulares com requisitos mínimos de reformulação.
Aqui, relatamos um criopreservante de poli(anfólito) que aumenta significativamente o rendimento celular pós-descongelamento de uma ampla gama de tipos celulares, incluindo células nucleadas e anucleadas em suspensão e monocamadas sob condições de congelamento lento. O polímero é facilmente obtido a partir de um precursor clinicamente utilizado e de baixo custo, o que garante escalabilidade. Além disso, parece que o polímero protege externamente as membranas celulares durante o congelamento como seu principal modo de ação, em vez da modulação do crescimento de gelo, e como não entra nas células, é facilmente removido. Também demonstramos que a concentração de DMSO necessária pode ser reduzida para apenas 2,5% em peso através do uso de uma concentração maior de polímero.
Métodos e Materiais
Materiais
Soluções de tampão fosfato-salino (PBS) foram preparadas usando comprimidos pré-formulados (Sigma-Aldrich) em 200 mL de água Milli-Q (>18,2 Ω de resistividade média) para obter [NaCl] = 0,138 M, [KCl] = 0,0027 M e pH 7,4. Poli(metil vinil éter-alt-anidrido maleico) Mn 80.000 e 311.000 g.mol–1, dimetilaminoetanol e N-[4-(aminometil)benzil]rodamina 6G-amida bis(trifluoroacetato) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Poli(metil vinil éter-alt-anidrido maleico) Mn médio 20.000 g mol–1 foi adquirido da Scientific Polymer Products; a dispersividade do polímero P2 do fabricante é 2,7 e a do P3 é 3,47; o fornecedor do P1 não listou o valor de Mw, apenas o Mn. Cloreto de sódio foi adquirido da Fisher Scientific. Todos os solventes foram adquiridos da VWR ou Sigma-Aldrich, e os reagentes foram utilizados sem purificação adicional, salvo indicação contrária.
Nota sobre a Escolha do Polímero
A funcionalidade dimetilamino foi selecionada para o componente catiônico. Isso foi motivado por nossas observações anteriores sobre o papel da hidrofobicidade no crescimento de cristais de gelo, onde modificações etílicas e propílicas resultaram em menor atividade. Em segundo lugar, houve razões de solubilidade; quando grupos pendentes mais hidrofóbicos são instalados (dietil e diisopropil), a dissolução torna-se um problema, com essas amostras apresentando solubilidade limitada em concentrações superiores a 20 mg mL–1. Para que esses polímeros sejam práticos em laboratório, é necessário preparar estoques de concentração, o que significa que concentrações de pelo menos 2× o necessário para a criopreservação devem ser alcançadas. A funcionalidade dimetilamino proporcionou esse equilíbrio.
Síntese de Poli(anfólitos)
Como exemplo representativo, poli(metil vinil éter-alt-anidrido maleico), Mn médio ≈ 80.000 Da (1 g), foi dissolvido em tetraidrofurano (50 mL) e aquecido a 50 °C com agitação. Após dissolução, dimetilamino etanol (2 g) foi adicionado em excesso, formando um sólido ceroso rosa, que foi deixado sob agitação por 30 min. Água (50 mL) foi adicionada, e a reação foi deixada sob agitação durante a noite, seguida de purificação em membrana de diálise (Spectra/Por, 12–14 kDa MWCO) por 48 h com sete trocas de água. A solução resultante foi liofilizada para obter um sólido branco.
RMN de 1H (DMSO): δ 2,30–2,80 (CH2CH(OCH3)CH2, br), 2,42 ((CH3)2NCH2, s, 6H), 2,50 (CH2CH(OCH3)CH2, s, 3H), 2,66 (NCH2CH2COO, t, 2H), 3,02–3,37 (CH2CH(OCH3)CH2), 3,41–4,48 (CH(OCH3)CH(COOH)CH(COOC), CH(OCH3)CH(COOH)CH(COOC), br), 3,56 (NCH2CH2COO, t, 2H). RMN de 13C (DMSO): δ 42 ((CH3)2NCH2), 55 (NCH2CH2COO), 58 (NCH2CH2COO). IV: 1220 cm–1 (C–O), 1342 (C–N), 1560 (O=C–O– carboxilato), 1724 (C=O), 2364 (Me2N–H+ amônio).

Síntese de Poli(anfólitos) Marcados Fluorescentemente

Como um exemplo representativo, poli(éter metil vinílico-alt-anidrido maleico), Mn médio ≈ 80 000 Da (300 mg), foi dissolvido em tetra-hidrofurano (50 mL) e aquecido a 50 °C sob agitação. Após dissolução, N-[4-(aminometil)benzil]rodamina 6G-amida bis(trifluoroacetato) (3 mg) e trietilamina (10 mg) foram adicionados e deixados por 20 min antes de dimetilamino etanol (2 g) ser adicionado em excesso, formando um sólido ceroso rosa, que foi agitado por 30 min. Água (50 mL) foi adicionada, e a reação foi deixada sob agitação durante a noite, seguida de purificação em tubo de diálise (Spectra/Por, 12–14 kDa MWCO) por 48 h com sete trocas de água. A solução resultante foi liofilizada para obter um sólido branco.

Métodos Físicos e Analíticos

Espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C foram registrados em um espectrômetro Bruker AVANCE III HD 300 MHz, HD 400 MHz ou HD 500 MHz utilizando solventes deuterados obtidos da Sigma-Aldrich. Os deslocamentos químicos são relatados em relação ao solvente não deuterado residual.

Ensaio de IRI

Pastilhas de gelo foram recozidas em um sistema Linkam Biological cryostage BCS196 com um controlador de sistema T95-Linkpad equipado com uma bomba de resfriamento de nitrogênio líquido LNP95, usando nitrogênio líquido como refrigerante (Linkam Scientific Instruments UK, Surrey, Reino Unido). Um microscópio Olympus CX41 equipado com uma lente UIS-2 20×/0,45/∞/0-2/FN22 (Olympus Ltd., Southend on Sea, Reino Unido) e uma câmera digital Canon EOS 500D SLR foi utilizado para obter todas as imagens. O processamento de imagens foi realizado utilizando ImageJ, que está disponível gratuitamente em . O log P foi calculado a partir da hidrofobicidade do grupo pendente usando ChemDraw Professional 16.0.

Avaliação de IRI

Uma gota de 10 μL de polímero em solução de PBS foi gotejada de 1,4 m sobre uma lamínula de microscópio de vidro em cima de uma placa de alumínio resfriada a −78 °C usando gelo seco. A gota congelou instantaneamente ao impactar a placa, espalhando-se e formando uma pastilha fina de gelo. Essa pastilha foi então colocada em uma criostase resfriada a nitrogênio líquido mantida a −8 °C. A pastilha foi então deixada recozer por 30 min a −8 °C. O número de cristais na imagem foi contado, novamente usando ImageJ, e a área do campo de visão dividida pelo número de cristais fornece o tamanho médio dos cristais por pastilha e relatado como uma porcentagem da área em comparação ao controle de PBS.

Calorimetria Diferencial de Varredura
As amostras foram preparadas pesando-se panelas e tampas padrão de alumínio de 40 μL (Mettler Toledo, Leicestershire, Reino Unido) e adicionando-se 20 μL de solução antes de lacrar hermeticamente e pesar novamente para quantificar a massa exata da amostra. Cada amostra foi então transferida para um calorímetro diferencial de varredura resfriado a nitrogênio líquido (sistema DSC 1 STAR, Mettler Toledo). A massa da panela de alumínio e a massa da amostra foram inseridas no software complementar de análise térmica STARe para manter um registro digital e auxiliar a análise.
Congelamento e Descongelamento de Amostras de DSC e Avaliação dos Espectros de DSC
Cada amostra de calorimetria diferencial de varredura (DSC) foi resfriada individualmente de +25 a −150 °C a uma taxa de 10 °C·min–1 enquanto monitorava simultaneamente o fluxo de calor (mW) do sistema para detectar quaisquer transições endotérmicas ou exotérmicas. Quando as amostras atingiram −150 °C, cada amostra foi mantida por 10 min e então aquecida a uma taxa de 10 °C·min–1 de −150 a +25 °C.
Protocolo de Teste de Sangue
Sangue de ovelha (10 mL) em solução de Alsever foi adicionado a um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugado a 2000 rpm por 5 min para concentrar a solução; 7 mL do sobrenadante foram removidos e substituídos por 7 mL de solução de PBS. Soluções de polímero foram preparadas a 2× a concentração necessária para garantir a concentração correta do crioprotetor final. Solução de sangue (0,5 mL) foi adicionada a 0,5 mL das soluções de polímero em crioviais de 2 mL. Estas foram então incubadas na geladeira por 30 min antes de congelar em vapor de nitrogênio líquido. Após 1 h, as amostras foram descongeladas em banho-maria a 45 °C por 10 min, após o que foram transferidas para tubos Eppendorf e centrifugadas a 2000 rpm por 5 min. O sobrenadante (40 μL) foi removido e adicionado a 750 μL de solução de Hematina Alcalina D-575. Após vórtex, as amostras foram pipetadas em uma placa de 96 poços em triplicata (3 × 200 μL por amostra), e a absorbância foi registrada a 580 nm em um leitor de placas BioTek. As amostras foram comparadas com amostras de PBS não congelado e tampão de lise como amostras de 0% e 100% de lise, respectivamente.
Células de carcinoma pulmonar humano (A549) foram obtidas da European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) (Salisbury, Reino Unido) e cultivadas em frascos Nunc de 175 cm² para cultura celular (Corning Incorporated, Corning, NY). O meio de cultura celular padrão foi composto por Meio Ham’s F-12K (Kaighn’s) (F-12K) (Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) de origem dos EUA adquirido da Sigma-Aldrich (Dorset, Reino Unido), 100 unidades·mL⁻¹ de penicilina, 100 μg·mL⁻¹ de estreptomicina e 250 ng·mL⁻¹ de anfotericina B (PSA) (Hyclone, Cramlington, Reino Unido). Células osteoblásticas de calvária de camundongo (MC-3T3) foram obtidas da ECACC e cultivadas em frascos Nunc de 75 cm² para cultura celular. O meio de cultura celular padrão foi composto por meio essencial mínimo α (Gibco) suplementado com 10% de SFB de origem dos EUA, 100 unidades·mL⁻¹ de penicilina, 100 μg·mL⁻¹ de estreptomicina e 250 ng·mL⁻¹ de anfotericina B (PSA). Células de neuroblastoma de cérebro de camundongo (Neuro-2a) foram obtidas da American Tissue Culture Collection (ATCC) (Middlesex, Reino Unido) e cultivadas em frascos Nunc de 75 cm² para cultura celular. O meio de cultura celular padrão foi composto por meio essencial mínimo de Eagle (Gibco) suplementado com 10% de SFB de origem dos EUA, 100 unidades·mL⁻¹ de penicilina, 100 μg·mL⁻¹ de estreptomicina e 250 ng·mL⁻¹ de anfotericina B (PSA). Todas as células foram mantidas em atmosfera umidificada com 5% de CO₂ e 95% de ar a 37 °C, e o meio de cultura foi renovado a cada 3–4 dias. As células foram subcultivadas a cada 7 dias ou antes de atingir 90% de confluência. Para subcultivar, as células foram dissociadas usando 0,25% de tripsina mais 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em solução salina balanceada (Gibco). As células A549 foram ressemeada a 1,87 × 10⁵ células por frasco de cultura celular de 175 cm². As células MC-3T3 foram ressemeada a 1,87 × 10⁵ células por frasco de cultura celular de 75 cm². As células Neuro-2a foram ressemeada a 7,5 × 10⁴ por frasco de cultura celular de 75 cm².
Preparação da Solução Celular
Soluções para experimentos de incubação celular foram preparadas dissolvendo os compostos individuais no meio celular base suplementado com 10% de SFB e 1× PSA (soluções usadas como tampões de congelamento não continham PSA) e filtradas de forma estéril antes do uso.
Triagem de Citotoxicidade
Citotoxicidade do Poli(anfólito)
As células A549 foram semeadas a 4 × 10⁴ células por poço em 200 μL de meio de cultura celular com concentrações indicadas de poli(anfólito) em placas de 96 poços (Thermo Fisher). As células foram incubadas com o polímero por 10 min e trocadas por meio celular completo ou incubadas com o polímero por 24 h em atmosfera umidificada com 5% de CO₂ e 95% de ar a 37 °C. Após o período de incubação, o sal de sódio de resazurina (Sigma-Aldrich) foi dissolvido em PBS (Sigma-Aldrich) e adicionado aos poços em uma quantidade de 1/10 do volume inicial do poço. As leituras foram realizadas usando o Leitor Multi-Modo Synergy HTX (BioTek, Swindon, Reino Unido) a 570/600 nm de absorbância a cada 30 min até que as células de controle atingissem ∼70% de redução.
Citotoxicidade do DMSO
Células A549 foram semeadas a 1 × 10⁴ células por poço em 100 μL de meio de cultura celular com concentrações indicadas de DMSO em placas de 96 poços. As células foram incubadas por 30 min em atmosfera umidificada com 5% de CO₂ e 95% de ar a 37 °C. Após 30 min, o meio foi trocado por meio celular fresco, e um ensaio com sal de sódio de resazurina foi realizado conforme descrito anteriormente. Os valores foram normalizados dividindo-se os valores experimentais pelos valores de controle.

Cinética de Membrana
Métodos adaptados de Su. Células A549 foram dissociadas e incubadas com 1 μM de calceína-AM (BD Biosciences, Wokingham, Reino Unido) em meio celular completo por 30 min a 37 °C com agitação frequente. As células foram então centrifugadas e lavadas duas vezes com meio. As células foram plaqueadas a uma densidade de 4 × 10⁵ células por poço em 100 μL em placas de suspensão de 96 poços em U (Sarstedt Ltd., Leicester, Reino Unido) e centrifugadas a 500 rpm por 2 min. Soluções experimentais de 50 μL foram adicionadas a 4×, e 50 μL de azul de tripano a 0,32% foram adicionados para uma concentração final de 0,08%. A placa foi colocada no leitor de placas BioTek a 37 °C e lida a cada 10 min a 494/517 nm por 4 h. A placa foi então imageada com um microscópio CKX41 com iluminação por diodo emissor de luz (LED) e uma câmera XC30 e processada usando o software cellSens.

Coloração de Células Vivas/Mortas por Incubação com Poli(anfólito)
Células A549 foram semeadas a 4 × 10⁵ células por poço em 500 μL de meio de cultura celular em placas de 24 poços. As células foram incubadas com o polímero por 24 h em atmosfera umidificada com 5% de CO₂ e 95% de ar a 37 °C. Após a incubação de 24 h, as células foram incubadas com 0,3 μM de calceína (Thermo Fisher) e 10 μM de homodímero de etídio-1 (Thermo Fisher) em PBS. As células foram incubadas à temperatura ambiente por 45 min. A solução de corante foi removida, e os poços foram lavados duas vezes com PBS. A placa foi lida usando um leitor de placas BioTex a 494/517 nm e 528/617 nm. A placa foi então imageada com um microscópio CKX41 com iluminação LED pE-300-W e uma câmera XC30 e processada usando o software cellSens.

Criopreservação de Suspensões Celulares
Células A549 para congelamento em suspensão foram removidas da cultura aderente por tratamento com 0,25% de tripsina mais 1 mM de EDTA em solução salina balanceada por 5 min em atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar a 37 °C. O número de células viáveis foi determinado por contagem com hemocitômetro (Sigma-Aldrich) à temperatura ambiente após diluição de 1:1 da amostra com solução de azul de tripano a 0,4% (Sigma-Aldrich). A densidade celular foi ajustada para obter uma suspensão celular de 1 × 105 células·mL–1. Soluções contendo o poli(anfólito) foram preparadas a 2× a concentração final em meio F12-K contendo 20% de SBF e 2× a concentração indicada de DMSO. A suspensão celular (500 μL) e 500 μL da solução de congelamento foram adicionadas a criotubos individuais (2 mL, Nalgene, Thermo Scientific, NY) e misturadas três vezes com uma pipeta de 1000 μL. A concentração final de SBF nas soluções de congelamento foi de 10%. Os criotubos foram colocados em um recipiente de congelamento CoolCell LX (BioCision, LLC, Larkspur, CA) e transferidos para um freezer a −80 °C, onde foram congelados a uma taxa de 1 °C·min–1. Após 2 h a −80 °C, os frascos foram transferidos para a fase de vapor de um dewar de nitrogênio líquido a −196 °C por 24 h. Após 24 h a −196 °C, as células foram rapidamente descongeladas colocando os frascos em um suporte de espuma em banho-maria ajustado a 37 °C. O conteúdo de cada frasco foi adicionado a 9 mL de meio F-12K completo e centrifugado a 2g por 5 min para sedimentar as células. O sobrenadante foi descartado, e o sedimento celular foi ressuspenso em 500 μL de meio celular completo e então transferido para poços individuais de uma placa de 24 poços (Corning Incorporated, Corning, NY). As células foram colocadas em atmosfera umidificada por 24 h e então dissociadas usando 0,25% de tripsina mais 1 mM de EDTA em solução salina balanceada. O número de células viáveis foi então determinado por contagem com hemocitômetro à temperatura ambiente após diluição de 1:1 da amostra com solução de azul de tripano a 0,4%. O meio celular inicial foi descartado de modo que quaisquer células não aderidas não fossem incluídas na avaliação. A porcentagem de células recuperadas foi calculada dividindo o número de células com membranas intactas após congelamento e descongelamento pelo número de células inicialmente congeladas e multiplicado por 100.
Criopreservação de Monocamadas Celulares
Métodos adaptados de Bailey. Células A549 a serem congeladas no formato de monocamada foram semeadas em 4 × 10⁵ células por poço em 500 μL de meio de cultura celular em placas de 24 poços. Células MC-3T3 e Neuro-2a a serem congeladas no formato de monocamada foram semeadas em 5 × 10⁵ células por poço em 500 μL de meio de cultura celular em placas de 24 poços (as células Neuro-2a foram congeladas em placas revestidas com colágeno). As placas tinham um volume total disponível de 3,4 mL com uma área de crescimento aproximada de 1,9 cm²; não foram utilizadas lamínulas; e as placas foram utilizadas com a tampa correspondente. As células foram deixadas aderir a toda a superfície livre do fundo do poço e formaram uma camada confluente com altura não superior a uma célula. Antes dos tratamentos experimentais, as células foram deixadas aderir às placas por 2 h em atmosfera umidificada de 5% CO₂ e 95% ar a 37 °C. O meio foi trocado por meio fresco para remover todas as células não aderidas e, em seguida, incubado por 24 h em atmosfera umidificada de 5% CO₂ e 95% ar a 37 °C. Após o período de incubação, o meio de cultura foi removido e as células foram expostas por 10 min à temperatura ambiente a diferentes concentrações de solutos dissolvidos em meio base suplementado com 10% de SBF e as concentrações indicadas de DMSO. Após 10 min, as soluções de congelamento foram removidas e a placa foi colocada dentro de uma placa CoolCell MP (BioCision), transferida para um freezer a −80 °C e congelada a uma taxa de 1 °C·min⁻¹. Após 24 h a −80 °C, as células foram rapidamente descongeladas pela adição de 500 μL de meio de cultura celular aquecido a 37 °C. As células foram colocadas em atmosfera umidificada por 24 h e, em seguida, dissociadas usando tripsina a 0,25% mais 1 mM de EDTA em solução salina balanceada. O número de células viáveis foi então determinado pela contagem com um hemocitômetro à temperatura ambiente após diluição 1:1 da amostra com solução de azul de tripano a 0,4%. O meio celular inicial foi descartado de modo que quaisquer células não aderidas não fossem incluídas na avaliação. A porcentagem de células recuperadas foi calculada dividindo o número de células com membranas intactas após congelamento e descongelamento pelo número de células presentes antes do congelamento (ou seja, após a aplicação dos pré-tratamentos) e, em seguida, multiplicado por 100.
Revestimento da Placa com Colágeno
Colágeno I de cauda de rato (Sigma-Aldrich) foi diluído para 50 μg·mL⁻¹ em ácido acético 200 mM (Sigma) e adicionado a cada poço da placa de cultura celular a 5 μg de colágeno·cm⁻². As placas foram incubadas com o colágeno dissolvido por 1 h e, após esse período de incubação, a solução de colágeno foi removida e as placas foram enxaguadas três vezes com 200 μL de PBS para remover qualquer resíduo de solução de ácido acético. As placas tratadas com colágeno foram deixadas secar por 1 h em uma cabine de fluxo laminar e armazenadas por menos de 1 semana a 4 °C antes do uso.
Viabilidade Pós-congelamento
As células A549 foram criopreservadas conforme indicado anteriormente. Após dissociação e contagem, as células foram plaqueadas a uma densidade de 1,25 × 104 por poço em uma placa de 6 poços (Thermo Fisher). Para recuperação de baixo rendimento, múltiplos poços de congelamento foram combinados para fornecer um número adequado de células. Células controle foram plaqueadas na mesma densidade, sem manipulação prévia. As células foram incubadas em atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar a 37 °C pelo número de dias indicado e, em seguida, dissociadas usando tripsina 0,25% mais EDTA 1 mM em solução salina balanceada para contagem. O meio celular foi substituído no quarto dia por meio fresco. As taxas de crescimento foram calculadas dividindo o número de células presentes pela densidade de plaqueamento inicial.

Permeabilidade da Membrana Pós-Congelamento
As células A549 foram criopreservadas conforme indicado anteriormente. Após a incubação de 24 h pós-descongelamento, as células foram incubadas com 0,3 μM de calceína e 10 μM de homodímero de etídio-1 em PBS. As células foram incubadas à temperatura ambiente por 45 min. A solução de corante foi removida e os poços foram lavados duas vezes com PBS. A placa foi lida usando o leitor de placa BioTex a 494/517 nm e 528/617 nm. A placa foi então imageada com um microscópio CKX41 com iluminação LED pE-300-W e uma câmera XC30 e processada usando o software cellSens.

Análises Estatísticas
Os dados foram analisados com uma análise de variância univariada por postos, seguida pela comparação dos grupos experimentais com o grupo controle adequado (método de Holm–Sidak), seguido pelo teste post hoc de Tukey. Excel 2013 (Microsoft, Redmond, WA) e R (R Foundation for Statistical Computing, Viena, Áustria) foram usados para as análises e gráficos. Os conjuntos de dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM).

Resultados
Poly(methyl vinyl ether-alt-maleic anhydride) Mn = 20 kDa (P1), 80 kDa (P2), e 311 kDa (P3) foi selecionado como precursor de um poli(anfolítico), pois é produzido em escalas de múltiplas toneladas e é seguro tanto como aditivo alimentar quanto como bioadesivo. O anidrido foi aberto por anel pela adição de dimetilamino etanol para dar um poli(anfolítico) com hidrofobicidade e solubilidade apropriadas (Figura 1a, dados de caracterização mostrados na Figura S1). Outros substituintes amina mais hidrofóbicos resultam em materiais menos solúveis, e o dimetil foi considerado na triagem como o que oferece o melhor equilíbrio. Ao usar um precursor anidrido, garantimos a proporção 1:1 de grupos catiônicos/aniônicos e a regiorregularidade, não obtidas por outros métodos de copolimerização. Os ensaios de IRI (onde cristais de gelo menores indicam mais atividade) mostraram que P1–P3 apresentaram apenas atividade de IRI fraca e dependente do peso molecular (Figura 1b), abaixo da de outros poli(anfolíticos). Para referência, a proteína anticongelante tipo I, usada como controle positivo, leva a <20% do tamanho médio de grão (TMG) em concentrações <1 mg mL–1 (Figura S2) e, portanto, os poli(anfolíticos) podem ser considerados muito fracamente ativos em IRI ao discutir os mecanismos de criopreservação (abaixo). A DSC confirmou a cristalização do gelo na presença de P2, descartando assim efeitos não coligativos e mostrando que a vitrificação (uma abordagem de criopreservação completamente diferente onde um vidro é formado em vez de gelo) não está ocorrendo (Figura 1c). As pequenas mudanças na entalpia de cristalização são o que esperaríamos devido aos efeitos da concentração de soluto no abaixamento do ponto de congelamento. Traços completos de DSC e temperaturas de fusão iniciais são mostrados nas Figuras S3 e S4, respectivamente. Como há apenas atividade fraca de IRI, quaisquer propriedades crioprotetoras emergentes (vide infra) podem ser correlacionadas com interações celulares únicas, como com a membrana celular.
Síntese de polímeros
e atividade do gelo. (a) Síntese dos poli(anfolíticos) utilizados. (b) Ensaio de IRI
de P1–P3. TMG comparado a um controle de PBS
após 30 min de recozimento a −8 °C. Barras de erro representam
±EPM de três repetições. (c) Entalpia de cristalização (proporcional
ao volume de gelo) para soluções de criopreservação contendo P2 (NP = sem polímero) via DSC a uma taxa de resfriamento de 1 °C·min–1. (N = 24, P = 0.0000000004,
*P < 0.001 em relação a NP com 0% de DMSO, **P < 0.001 em relação a NP com 10% de DMSO). Barras de erro representam ±EPM de
três repetições.
A criopreservação de eritrócitos foi utilizada inicialmente como um modelo simples de triagem celular para dano/estabilização de membrana. A Figura 2a mostra que 100 mg mL–1 (∼10% p/p) de todos os pesos moleculares de poli(anfólitos) resultou em >60% de recuperação, superior ao obtido apenas com polímeros com atividade de IRI (como PVA, Figura S5), demonstrando que este material único não funciona (primariamente) por modulação do crescimento de gelo. Concentrações mais altas não puderam ser testadas devido aos limites de solubilidade do polímero, que é preparado em concentração 2 vezes maior. Os níveis de recuperação aqui são comparáveis aos obtidos com 20–40% p/p de glicerol, que também requer extensa lavagem pós-descongelamento, resultando em perda celular significativa.

O P2 foi identificado como o peso molecular mais potente do crioprotetor, proporcionando >80% de recuperação em comparação com polímeros mais longos/mais curtos, e os eritrócitos congelados em P2 também apresentaram fragilidade osmótica ligeiramente menor do que os controles não congelados (Figura S6). Os valores de recuperação pós-descongelamento utilizando 100 mg mL–1 de P2 também foram independentes do tempo/temperatura de incubação pré-congelamento (Figura 2b), em nítido contraste com o glicerol, que requer adição/remoção cuidadosamente controlada para reduzir a toxicidade e maximizar a recuperação, introduzindo desafios de processamento que são superados neste sistema polimérico. Deve-se notar que a adição de macromoléculas solúveis em água não carregadas frequentemente reduz a hemólise pós-descongelamento de eritrócitos [como glicerol e polivinilpirrolidona (Figura S5)], e o objetivo principal aqui foi garantir que o material fosse adequado para criopreservação; esses resultados foram utilizados para triagem primária para garantir compatibilidade antes de prosseguir para células nucleadas (abaixo).

Recuperação pós-descongelamento de hemácias [definida como (1 – hemólise
(×100))] com polímeros crioprotetores. (a) Hemácias congeladas rapidamente
a −196 °C/descongeladas a 45 °C. (b) Efeito do tempo e temperatura de incubação
pré-congelamento na recuperação pós-descongelamento com 100 mg
mL–1 de P2. Tempo de incubação (0, 15, 30
min, 24 h), temperatura de incubação (4 ou 23 °C) e condições de congelamento
[diretamente submerso (direto) ou em vapor (vapor) de N2
líquido]. Todas as barras de erro representam ±EPM de um mínimo
de três repetições.

O congelamento de monocamadas de células de mamíferos é significativamente mais desafiador do que o congelamento em suspensão, mas é importante para medicina regenerativa, biotecnologia e aplicações de pesquisa básica, sendo, portanto, escolhido como um desafio robusto. Monocamadas confluentes de células A549 (carcinoma epitelial pulmonar) foram selecionadas para triagem de criopreservação, utilizando o polímero como suplemento ao DMSO para aumentar a recuperação, que já é baixa (veja dados abaixo).
As células A549 foram criopreservadas a −80 °C a 1 °C·min⁻¹, após uma incubação de 10 min com 10% em peso de DMSO contendo um gradiente de concentração de P2 ou PVA. O PVA foi utilizado por ser um potente IRI e ter sido relatado por melhorar a recuperação celular ao inibir a recristalização do gelo, permitindo-nos, assim, comparar a utilidade deste novo material e também os mecanismos de ação, já que o P2 não é um IRI potente. As células foram subsequentemente descongeladas, deixadas recuperar por 24 h, e o rendimento total de células foi determinado (Figura 3b). [Nota: é crucial permitir 24 h de incubação pós-descongelamento, pois períodos mais curtos fornecem resultados falso-positivos e superestimam a recuperação celular. A adição de 40 mg mL⁻¹ de P2 resultou em um aumento >4 vezes nas células recuperadas (89%) em comparação com DMSO sozinho (20%). Concentrações mais baixas de P2 também proporcionaram recuperação celular significativa, com apenas 1 mg mL⁻¹ resultando em um aumento de 2,5 vezes, o que é notável para um aditivo tão diluído, e superou outros polímeros criopreservativos. O PVA, que demonstrou proteger células em solução durante a criopreservação, foi menos eficaz na preservação de monocamadas. Células congeladas em criotubos estão em uma grande quantidade de solução, o que pode tornar a atividade de IRI o fator de dano mais importante, enquanto células congeladas como monocamadas existem apenas em uma fina camada líquida e, portanto, o benefício do IRI pode não ser suficiente para a proteção de monocamadas. Esses resultados apoiam nossa hipótese de que o P2 é um crioprotetor polimérico único que supera o desempenho de materiais relatados anteriormente e pode funcionar por um mecanismo único. Os efeitos do peso molecular do polímero também foram avaliados, com o P2 superando o P1 e o P3 neste sistema de criopreservação, mas todos podem ser considerados crioprotetores muito potentes (Figura 3c).

Criopreservação de monocamadas celulares
e citotoxicidade. As células recuperadas foram contadas pelo ensaio de exclusão de azul de tripano
em relação aos controles não congelados. Todas as células foram criopreservadas
por 24 h a −80 °C e, em seguida, incubadas por 24 h pós-descongelamento.
(a) Esquema do protocolo de criopreservação/descongelamento; (b) Recuperação celular pós-descongelamento
(como % dos controles não congelados) de células A549 criopreservadas
com 10% de DMSO mais concentrações variáveis de P2 ou PVA
(NP = sem polímero) (N = 39, P = 0,000000002,
*P < 0,001 em relação a NP com 10% de DMSO). Os dados representam a
média ± EPM de três experimentos independentes com duas réplicas aninhadas
cada. (c) Efeito do peso molecular do polímero (P1–P3, NP = sem polímero) e da concentração na recuperação de células A549 (N = 42, P = 0,000006, *P < 0,001 em relação a NP com 10% de DMSO). Os dados representam a média ±
EPM de três experimentos independentes com duas réplicas aninhadas cada.
(d) Recuperação pós-descongelamento de células Neuro-2a e MC-3T3 após criopreservação
com 10% de DMSO mais concentrações variáveis de P2. Os
dados representam a média ± EPM de quatro experimentos independentes
com duas réplicas aninhadas cada (Neuro-2a: N = 28, P = 0,0005, *P < 0,001 em relação a Neuro-2a
com 0 mg mL⁻¹ de P2; MC-3T3: N = 28, P = 0,02, *P < 0,01 em relação a
MC-3T3 com 0 mg mL⁻¹ de P2). (e) Mudança relativa (em relação a 10% de DMSO) na recuperação pós-descongelamento para todas as linhagens celulares em função da concentração de P2. (f) Citotoxicidade do P2 contra células A549; o tempo de incubação é de 10 min ou 24 h (N = 48, P = 0,0000000001, *P < 0,001 em relação a 0 mg mL⁻¹ de P2). Os dados representam a média ± EPM de três experimentos independentes.

Duas linhagens celulares de mamíferos adicionais, Neuro-2a e MC-3T3, também foram exploradas. A criopreservação apenas com DMSO resultou em <20% de recuperação celular, pois essas células parecem mais delicadas do que a linhagem A549 (robusta), e existem maneiras de ajustar finamente as recuperações dessas células, uma vez que pode ser simplesmente que a osmolaridade dessas formulações seja muito alta, já que o estresse hiperosmótico tem sido implicado na parada do ciclo celular, danos ao DNA, estresse oxidativo, inibição da transcrição e tradução e despolarização mitocondrial, sendo uma consequência conhecida da criopreservação. No entanto, a suplementação com P2 proporcionou um aumento de 3 vezes na recuperação celular pós-descongelamento em ambos os casos (Figura 3d), mostrando que células mais frágeis também responderão bem a esse novo crioprotetor. Resumimos o aumento relativo na recuperação pós-descongelamento em comparação com apenas 10% de DMSO para todas as linhagens celulares na Figura 3e, demonstrando a aplicabilidade universal do nosso novo material.

O teste de citotoxicidade do P2 não revelou diminuição na viabilidade celular para tempos curtos de exposição, que são utilizados em nosso protocolo de criopreservação (já que o excesso de solução é removido antes do congelamento) e é menos citotóxico do que o DMSO (Figura 3f). Uma incubação de 24 h, como forma de estresse extremo fora do nosso protocolo, foi realizada para exagerar quaisquer efeitos e fornecer uma visão mecanicista. Acima de 20 mg mL⁻¹, a incubação de 24 h reduziu o metabolismo celular, e a microscopia sugeriu perturbações na membrana para tempos longos de exposição (Informações de Apoio, Figura S7), o que orientou investigações adicionais sobre como esses polímeros funcionam (vide infra).
Além do desafio (principal) do congelamento de monocamadas de células, a criopreservação em suspensão também é desafiadora para células que não toleram altas concentrações (10% em peso) de DMSO, que demonstrou causar toxicidade a jusante após apenas 30 min de exposição (Figura S8). Portanto, exploramos se o P2 poderia resgatar a recuperação celular pós-descongelamento quando utilizado em concentrações de DMSO normalmente muito baixas para permitir a criopreservação. O congelamento em suspensão de A549 mostrou que a suplementação de P2 com 10% em peso de DMSO não melhorou a recuperação das células em suspensão, sugerindo um teto para a recuperação total e distinto dos resultados em monocamada (destacando o desafio da criopreservação). No entanto, a adição de 20 mg mL⁻¹ de P2 permitiu a redução do DMSO para 5% em peso e até mesmo 2,5% em peso, com níveis de recuperação celular comparáveis aos de 10% em peso de DMSO sem polímero (Figura 4a). A capacidade de reduzir o DMSO para 2,5%, com a adição de P2, e manter recuperações semelhantes às de 10% em peso de DMSO é um achado notável e permitirá a criopreservação de células incapazes de tolerar altas concentrações de DMSO. Além disso, a capacidade de reduzir drasticamente o DMSO pode permitir recuperações mais altas e possibilitar, por exemplo, a infusão de uma quantidade maior de células progenitoras do sangue periférico humano em pacientes. Para células A549 congeladas como monocamadas, descobrimos que 40 mg mL⁻¹ de P2 proporcionou recuperação celular significativa com 5% em peso de DMSO, demonstrando as potentes propriedades criopreservativas deste polímero macromolecular. Também foi observado que uma redução do DMSO para 5% em peso, combinada com 5 mg mL⁻¹ de P2, permitiu uma recuperação semelhante à do DMSO a 10% sem polímero e também comparável a concentrações ainda mais baixas de DMSO a 2% em peso com 40 mg mL⁻¹ de P2 (Figura 4b). A importância disso não pode ser subestimada, pois a redução do DMSO (mantendo o rendimento celular) aumentará drasticamente a disponibilidade de células para a medicina regenerativa, reduzirá os desafios de toxicologia a jusante e permitirá o armazenamento de células que não toleram concentrações mais altas de DMSO. Para comparação, outros poli(anfólitos) relatados para criopreservação exigiram uma solução complexa e com alto teor de solvente orgânico de 6,5 M de etilenoglicol (40% em peso), 0,5 M de sacarose (15% em peso) e 10% em peso de polímero para obter um resultado semelhante ou produziram rendimentos celulares inferiores aos do DMSO sozinho, destacando a potência única do presente sistema.
Criopreservação variável de DMSO/P2 em suspensão e monocamada de A549.
As células recuperadas foram contadas por ensaio de exclusão de azul de tripano
em relação aos controles não congelados. As células em suspensão foram criopreservadas
por 24 h a −196 °C, as células em monocamada foram criopreservadas
por 24 h a −80 °C, e ambos os métodos foram incubados por 24 h pós-descongelamento.
(a) Impacto na recuperação pós-descongelamento de suspensão com variação das concentrações de DMSO e P2 (NP = sem polímero) (N =
90, P = 0,0000000001, *P < 0,001
em relação a NP com 10% de DMSO). Os dados representam a média ± EPM de pelo
menos três experimentos independentes. (b) Impacto na recuperação pós-descongelamento de monocamada
com variação das concentrações de DMSO e P2 (NP =
sem polímero) (N = 60, P = 0,0000000001,
*P < 0,001 de NP com 10% DMSO). Os dados representam
a média ± SEM de três experimentos independentes com duas
réplicas aninhadas cada.
Embora a integridade da membrana após o descongelamento seja uma medida geral de sobrevivência celular, ela não fornece qualquer informação sobre danos a longo prazo. Assim, um ensaio de crescimento de 6 dias foi conduzido para avaliar a função celular. As taxas de proliferação pós-descongelamento das células A549, que foram criopreservadas em formato de monocamada com/sem P2, foram medidas e comparadas com células controle não congeladas semeadas em densidade idêntica (Figura 5a). As células criopreservadas com 10 mg mL⁻¹ de P2 se recuperaram em taxas iguais ou mais rápidas do que aquelas em 10% DMSO sozinho, mas 40 mg mL⁻¹ resultaram em taxas de crescimento mais lentas do que 10 mg mL⁻¹. Portanto, 10 mg mL⁻¹ pode ser considerada a formulação ideal para este formato e linhagem celular para garantir alto rendimento e retenção de função. Como a interação e estabilização da membrana são um mecanismo de ação potencial, apoiado pelas observações em eritrócitos (Informações de Suporte, Figura S6), a permeação da membrana após o descongelamento também foi avaliada. Os corantes homodímero de etídio-1 (EhtD-1)/calceína-AM (ensaio LIVE/DEAD) foram utilizados. Células saudáveis internalizam a calceína-AM e a convertem em calceína, que então fluoresce em verde; o EthD-1 passa através de membranas danificadas até os núcleos, onde fluoresce intensamente em vermelho. Células previamente criopreservadas em 10% DMSO apresentaram números significativos de membranas comprometidas, mas, em contraste, a adição de P2 levou a muito menos núcleos vermelhos, apoiando a hipótese de que o P2 estabiliza as membranas celulares durante ciclos de congelamento/descongelamento (Figura 5b); os valores gráficos são mostrados na Figura S9. Os poli(anfólitos) são conhecidos por interagir com membranas fosfolipídicas modelo em maior extensão do que outros zwitterions, como as poli(sulfobetainas), e mostramos que os poli(anfólitos) não oferecem qualquer estabilização para procariotos, que possuem composições fosfolipídicas marcadamente diferentes, apoiando uma interação específica com a membrana.
Crescimento pós-descongelamento e interação do polímero. (a) Proliferação celular pós-descongelamento por 6 dias; as células foram semeadas a 1,25 × 10⁴ células por poço. (b) Coloração LIVE/DEAD das células A549; 24 h após o descongelamento após criopreservação usando os crioprotetores indicados. A barra de escala é 50 μm. (c) Microscopia confocal de fluorescência de células A549 incubadas com 10% DMSO ou P2 (sem DMSO) pelo tempo e concentração indicados. Os núcleos são corados com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e incubados com P2 marcado com rodamina 6G, que é fluorescente verde. A barra de escala é 10 μm.
Para visualizar a captação ou ligação celular, um poli(anfólito) marcado com rodamina 6G (confirmado na Figura S10) foi sintetizado e exposto a células A549 por 10 min e 24 h. A microscopia confocal não revelou fluorescência intracelular ou extracelular associada ao polímero (Figura 5c) após uma única etapa de lavagem e, portanto, o modo de ação único deste polímero é puramente extracelular, embora não por meio de interações com gelo, ao contrário de crioprotetores poliméricos anteriores. É extremamente benéfico que o polímero pareça ser removido por lavagem simples, em vez das múltiplas lavagens e/ou equilíbrios necessários para DMSO ou glicerol (para hemácias), o que é um grande problema na logística de terapias baseadas em células.
Para investigar melhor o impacto dos polímeros na integridade da membrana, um ensaio de fluxo de membrana foi modificado a partir de Su et al. Células A549 foram carregadas com calceína-AM, e o supressor azul de tripano foi adicionado exogenamente, permitindo que o fluxo da membrana fosse monitorado continuamente por uma redução na fluorescência associada à calceína (Figura 6a). DMSO a 20% em peso (acima dos níveis de criopreservação como controle positivo) levou a uma perda significativamente maior de calceína em comparação com outras soluções, enquanto DMSO a 10% em peso não mostrou redução no fluxo, apoiando a hipótese de que 10% em peso afina as membranas enquanto 20% em peso promove a formação de poros, mas ainda assim permanece que DMSO a 10% em peso reduz o metabolismo celular após apenas 30 min à temperatura ambiente (Figura S8). No entanto, todas as outras formulações não alteraram drasticamente a taxa de fluxo, e P2 até levou a uma pequena redução na taxa de fluxo em concentrações mais altas, apoiando a hipótese de estabilização da membrana. Sob condições idênticas, a coloração LIVE/DEAD foi novamente aplicada a monocamadas de A549 (não congeladas). Após 24 h com P2, não houve alterações significativas nos núcleos vermelhos a 5 mg mL–1 e apenas um pequeno aumento a 10 mg mL–1 (Figura 6c), mas esses períodos de tempo são muito mais longos do que nosso tempo real de exposição de 10 min (que é usado no protocolo de incubação pré-criopreservação). Em conjunto, esses dados suportam um mecanismo de estabilização externa da integridade da membrana polimérica durante o processo de congelamento que permite que as células se recuperem e proliferem mais rapidamente.
Impacto do polímero no
fluxo e permeabilidade da membrana. (a) Representação gráfica do ensaio de vazamento de corante. (b) Ensaio contínuo de vazamento de corante em células vivas a partir de células A549 carregadas com calceína-AM tratadas com concentrações variadas de P2. A diminuição da fluorescência corresponde a um aumento do fluxo da membrana.
(c) Coloração LIVE/DEAD de células A549 após 24 h de incubação com P2. A barra de escala é de 50 μm.
Discussão
A criopreservação de células é um processo incrivelmente complexo, no qual fatores bioquímicos, mecânicos e físicos governam tanto a recuperação total de células quanto a retenção de função/viabilidade. A recuperação de um grande número de células, com retenção de função, é essencial em terapias celulares (para garantir o desfecho terapêutico) e na pesquisa biomédica básica (onde estudos celulares orientam novos tratamentos e compreensão). Aqui, apresentamos um criopreservante macromolecular único, que permite que as células sejam congeladas em formato de monocamada com alta recuperação, possibilita uma redução na concentração de DMSO necessária para a criopreservação de células em suspensão e monocamada, aumenta a viabilidade das células recuperadas e reduz a extensão do dano à membrana. Este criopreservante macromolecular, um poli(anfólito), foi obtido em uma única etapa a partir de um polímero commodity clinicamente utilizado, com rendimento quantitativo. Relatos anteriores de criopreservantes poliméricos focaram em materiais que podem mimetizar proteínas anticongelantes controlando a formação e/ou crescimento de cristais de gelo, o que beneficia a criopreservação celular. O poli(anfólito) que introduzimos aqui teve efeitos muito moderados no crescimento de cristais de gelo, mas levou a aumentos notáveis na viabilidade pós-descongelamento de mais de 400%, em comparação com DMSO sozinho para monocamadas celulares, e permitiu que a [DMSO] fosse reduzida para apenas 2% em alguns casos. Verificou-se que um peso polimérico de 80 kDa foi o ideal (P2), embora todos os pesos moleculares fossem extremamente potentes. Estudos mecanísticos mostraram que este polímero não entra nas células e parece funcionar na membrana, estabilizando-a durante o congelamento, mas sem promover a formação de poros ou afetar o fluxo intrínseco da membrana. Isso é apoiado por estudos com eritrócitos (hemácias), que são um modelo útil para dano/estabilização de membrana, além de ser um componente crucial da medicina moderna. Utilizando o polímero ideal, foi possível obter >80% de recuperação pós-descongelamento de hemácias usando apenas o polímero, sem solventes adicionais, comparável ao padrão ouro de glicerol, mas com a vantagem de menos desafios de processamento e fácil remoção, uma vez que nosso polímero não é permeável às células. Em conjunto, esses dados apoiam um mecanismo onde este novo crioprotetor macromolecular parece estabilizar as membranas celulares contra o resfriamento sem afetar o fluxo de dentro para fora da célula, permitindo uma recuperação pós-descongelamento mais rápida com membranas mais intactas e taxas de proliferação rápidas. O aumento dos rendimentos celulares acelerará a pesquisa biomédica (reduzindo o tempo do descongelamento ao ensaio), bem como diminuirá o número de células doadoras necessárias para terapias celulares, garantindo maior recuperação na etapa crítica da criopreservação. Criopreservantes mais simples e/ou mais eficazes também podem melhorar a cadeia de frio, levando a reduções no custo associado a terapias celulares e medicina regenerativa. Conclusões
Demonstramos que nosso poli(anfólito) regio-regular potente e facilmente escalável melhora significativamente as recuperações celulares pós-descongelamento, alcançando até 88% para monocamadas de células aderentes, em comparação com apenas 24% usando criopreservação convencional com DMSO. O poli(anfólito) também permite a redução da [DMSO] de 10% em peso para apenas 2,5% em peso na criopreservação em suspensão com resultados comparáveis, o que pode viabilizar a preservação de linhagens celulares intolerantes ao DMSO. Também mostramos que este polímero leva a células com menor dano à membrana e taxas de crescimento pós-descongelamento mais rápidas, podendo adicionalmente criopreservar hemácias. Nosso poli(anfólito) parece funcionar extracelularmente, sendo assim não penetrante e facilmente removido. Este novo crioprotetor polianfolítico melhorará aplicações em ciências biomédicas básicas e translacionais e pode aprimorar drasticamente os processos da cadeia de frio para materiais biológicos.
Informações de Suporte Disponíveis
Fragilidade osmótica, coloração com vermelho do Nilo, captação confocal de poli(anfólito), coloração com vermelho neutro, caracterização do polímero, imagens de splat de exemplo, traços de DSC, temperaturas de fusão incipiente, congelamento de sangue com outros compostos protetores, fenótipo de células de mamíferos, toxicidade do DMSO, representação gráfica da coloração vivo/morto pós-congelamento e confirmação do P2 marcado com rodamina-6G (PDF)
As Informações de Suporte estão disponíveis gratuitamente no site da ACS Publications no DOI: 10.1021/acs.biomac.9b00681.
Material Suplementar
Contribuições dos Autores
T.L.B. conduziu experimentos com células de mamíferos. C.S. realizou a síntese do polímero. C.S. e L.O. realizaram os dados de triagem de eritrócitos. K.M. conduziu o congelamento de células de mamíferos em suspensão e a toxicidade do DMSO. R.M.F.T. realizou a microscopia confocal. M.I.G. concebeu os experimentos em conjunto com os outros autores e dirigiu a pesquisa. Todos os autores contribuíram para a redação do manuscrito.
Os autores declaram o seguinte interesse financeiro concorrente: CS, TB e MIG são nomeados em um pedido de patente relacionado a este trabalho.
Referências
Tempo de Armazenamento de Hemácias & Transfusão: Prática Atual, Preocupações e Perspectivas Futuras
Benchmarks Biofarmacêuticos 2006
Congelamento de Células de Mamíferos para Produção de Biofármacos
Melhorando a Descoberta de Medicamentos com Triagens Fenotípicas de Alto Conteúdo por Seleção Sistemática de Linhagens Celulares Repórteres
Armazenamento de Longo Prazo de Tecidos por Criopreservação: Questões Críticas
Desenvolvimento Sinérgico de Biochips e Metodologias de Preservação Celular: Uma História de Tecnologias Convergentes
Criopreservação de Hepatócitos: É Hora de Mudar a Estratégia?
Criobiologia: O Congelamento de Sistemas Biológicos
Sobrevivência de células de cultura de tecido de hamster após congelamento e descongelamento
Considerações sobre o Uso de Solventes em Ensaios Celulares In Vitro
Os Papéis das Vias Apoptóticas na Baixa Taxa de Recuperação após Criopreservação de Células-Tronco Embrionárias Humanas Dissociadas
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Polímeros Sintéticos Permitem a Criopreservação Celular Não Vitrea ao Reduzir o Crescimento de Cristais de Gelo Durante o Descongelamento

Polímeros Sintéticos Permitem a Criopreservação Celular Não Vitrea ao Reduzir o Crescimento de Cristais de Gelo Durante o Descongelamento

Poliprolina como um Mimético Mínimo de Proteína Anticongelante que Melhora a Criopreservação de Monocamadas Celulares

Vitrificação Eficaz de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas Usando ε-Poli-L-Lisina Carboxilada

Criopreservação de uma Monocamada Bidimensional Usando um Método de Vitrificação Lenta com Polianfólito para Inibir a Formação de Cristais de Gelo

Polianfólitos como Agentes Crioprotetores Eficientes e de Baixa Toxicidade com Propriedades de Proteínas Anticongelantes

Polianfólitos Alternados Regiorregulares Têm Atividade de Recristalização de Gelo Biomimética Aprimorada em Comparação com Copolímeros Aleatórios e o Papel da Hidrofobicidade da Cadeia Lateral versus Cadeia Principal

Peptídeos Citolíticos Induzem Alterações Bifásicas de Permeabilidade em Membranas Celulares de Mamíferos

Parecer Científico sobre a Segurança do “Copolímero de Metil Vinil Éter e Anidrido Maleico” (Ingrediente de Base de Goma de Mascar) como Novo Ingrediente Alimentar

Efeitos de Solutos na Recristalização de Gelo: Uma Técnica de Avaliação

Estudo Quantitativo sobre as Propriedades de Inibição do Crescimento de Gelo Miméticas de Proteínas Anticongelantes de Poli(Anfólitos) Derivados de Polímeros à Base de Vinil

Correção para Interação Soluto/Solvente Estende a Teoria Precisa de Depressão do Ponto de Congelamento para Faixa de Alta Concentração
Rumo a uma Compreensão Molecular do Mecanismo de Criopreservação por Polianfólitos: Interações com a Membrana Celular e Hidrofobicidade
Membrana Eritrocitária: Passado, Presente e Futuro
Mimetizando a Atividade de Recristalização de Gelo de Anticongelantes Biológicos. Quando um Novo Polímero é "Ativo"?
Um Experimento com Hemácias Congeladas com Glicerol Armazenadas a -80°C por até 37 Anos
Inibidores de Recristalização de Gelo de Pequenas Moléculas Mitigam a Lise de Hemácias durante o Congelamento, Aquecimento Transitório e Descongelamento
A relevância da "toxicidade" dos crioprotetores para a criobiologia
Um Método para Congelar e Lavar Hemácias Utilizando Alta Concentração de Glicerol
Crio-Lesão e Biopreservação
Criopreservação Não-Vítrea Aprimorada de Células Imortalizadas e Primárias por Polímeros Inibidores do Crescimento de Gelo
Resposta Celular a Estresses Hiperosmóticos
Uma hipótese de dois fatores para a lesão por congelamento
Criopreservação de células progenitoras do sangue periférico humano com 5% em vez de 10% de DMSO resulta em menor apoptose e necrose em células CD34+
Polianfólitos Sintéticos como Agentes Crioprotetores Macromoleculares
Polímeros Inibidores de Recristalização de Gelo Permitem a Criopreservação Livre de Glicerol de Microrganismos
Modulando a Estrutura e as Propriedades das Membranas Celulares: O Mecanismo Molecular de Ação do Dimetilsulfóxido
Das Proteínas de Ligação ao Gelo aos Materiais Anticongelantes Bioinspirados
Mimetizadores Poliméricos de Anticongelantes Biomacromoleculares