pmid: "35892596"
title: "Consequências Transcricionais e Epigenéticas do Tratamento com DMSO em Células HepaRG."
authors: "Dubois-Pot-Schneider H, Aninat C, Kattler K, Fekir K, Jarnouen K, Cerec V, Glaise D, Salhab A, Gasparoni G, Takashi K, Ishida S, Walter J, Corlu A"
journal: "Cells"
pubdate: "2022 Jul 26"
doi: "10.3390/cells11152298"
source: "PMC Full Text"

Consequências Transcricionais e Epigenéticas do Tratamento com DMSO em Células HepaRG.

Autores

Dubois-Pot-Schneider H, Aninat C, Kattler K, Fekir K, Jarnouen K, Cerec V, Glaise D, Salhab A, Gasparoni G, Takashi K, Ishida S, Walter J, Corlu A

Periodico

Cells (2022 Jul 26)

Conteudo

Consequências Transcricionais e Epigenéticas do Tratamento com DMSO em Células HepaRG

O dimetilsulfóxido (DMSO) é utilizado para sustentar ou favorecer a diferenciação de hepatócitos in vitro. Assim, o DMSO é empregado no protocolo de diferenciação das células HepaRG, que apresentam as atividades enzimáticas de metabolização de fármacos mais próximas às dos hepatócitos primários humanos em cultura. O objetivo do nosso estudo é esclarecer sua influência na expressão gênica específica do fígado. Para isso, realizamos uma análise em larga escala (expressão gênica e modificação de histonas) para determinar o papel global da exposição ao DMSO durante o processo de diferenciação das células HepaRG. A adição de DMSO induz a regulação positiva de genes principalmente regulados por PXR e PPARα, enquanto genes não afetados por essa adição são regulados por HNF1α, HNF4α e PPARα. As células HepaRG diferenciadas com DMSO apresentam expressão diferencial para genes regulados por acetilação de histonas, enquanto as células HepaRG diferenciadas sem DMSO mostram assinaturas gênicas associadas a histonas desacetilases. Além disso, observamos uma interação entre a organização do citoesqueleto e a remodelação da MEC com a maturação dos hepatócitos.

1. Introdução
   O fígado desempenha um papel importante no metabolismo de xenobióticos e no metabolismo energético, estando envolvido em um grande número de funções, incluindo síntese de proteínas plasmáticas, produção de bile, metabolismo do ferro e vigilância imunológica. Assim, como um órgão com funções pleiotrópicas, o fígado está associado a muitos tipos de doenças, incluindo hepatites, doenças colestáticas, distúrbios metabólicos, insuficiência aguda e crônica, cirrose e carcinomas. Com sua função de metabolização de fármacos, é também o principal local de lesão induzida por medicamentos. Para estudar o metabolismo e a potencial hepatotoxicidade de produtos químicos, as empresas farmacêuticas e as indústrias de biotecnologia estão atualmente interessadas em modelos de triagem ou teste in vitro relevantes que avaliem a segurança de compostos candidatos de forma precisa e eficaz, que permitam reduzir o teste de medicamentos em animais e falhas tardias dispendiosas durante os ensaios clínicos farmacêuticos. Como os hepatócitos são o principal constituinte celular do fígado e desempenham um papel importante na desintoxicação de xenobióticos, muitos modelos de cultura foram desenvolvidos na tentativa de relacionar achados in vitro com os in vivo, a fim de estudar o metabolismo de xenobióticos. Embora os níveis de expressão e as atividades de indução de enzimas metabolizadoras de fármacos estejam longe daqueles encontrados em hepatócitos, linhagens celulares estabelecidas, principalmente originárias de tumores, como HepG2, são amplamente utilizadas. Essas linhagens celulares carecem de um conjunto variável e substancial de funções específicas do fígado, tornando-as inadequadas como representantes das células parenquimatosas hepáticas in vivo. Portanto, até agora, os hepatócitos primários humanos (HPHs) permanecem como o sistema padrão-ouro para estudos de metabolismo e toxicidade de xenobióticos. Eles estão disponíveis e são amplamente utilizados no campo dos testes de hepatotoxicidade. No entanto, seu uso apresenta alguns defeitos. De fato, foram descritas diferenças na viabilidade celular entre lotes de hepatócitos, rápida diminuição da funcionalidade após seu isolamento e variação devido às diferenças interindividuais dos doadores. Novos modelos in vitro ainda estão em desenvolvimento ou caracterização. Células-tronco embrionárias (ES), células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), células-tronco hepáticas ou hepatócitos derivados de células-tronco mesenquimais (MSC) podem ser ferramentas promissoras para propor, posteriormente, uma alternativa adequada aos HPHs.
   No entanto, embora tenha sido demonstrado que essas células-tronco são capazes de se diferenciar em linhagem hepatocítica sob condições de cultura definidas, de repovoar o fígado e completar sua maturação in vivo, elas não são suficientemente funcionais para permitir estudos de metabolismo de drogas e modelagem de doenças in vitro. Recentemente, protocolos de cultura tridimensional melhoraram a diferenciação de células-tronco em células semelhantes a hepatócitos. No entanto, as células ainda coexpressam marcadores progenitores e de hepatócitos, mostrando que seu fenótipo permanece comparável ao de hepatócitos neonatais humanos. Entre todos os modelos in vitro, as células HepaRG diferenciadas são atualmente as mais próximas dos PHHs. As células HepaRG derivadas de um carcinoma hepatocelular humano mantêm atividades de muitas enzimas metabolizadoras e, portanto, fornecem um valioso modelo in vitro para estudos de metabolismo de drogas humanas em condições normais ou esteatóticas.
   Métodos para estabilizar as funções hepáticas específicas de hepatócitos in vitro, bem como a diferenciação de células ES, iPS e mesenquimais, envolvem fatores de crescimento, hormônios, como insulina e glicocorticoides, matrizes extracelulares ou co-cultura com células não parenquimais. O solvente aprótico dipolar dimetilsulfóxido (DMSO) também é amplamente utilizado para sustentar a expressão gênica específica do fígado. O DMSO foi utilizado pela primeira vez por Isom et al. em combinação com uma superfície revestida de colágeno, na tentativa de prolongar o tempo em que hepatócitos de rato permanecem diferenciados in vitro. Nessas condições, o DMSO aumenta a comunicação intercelular mediada por junções comunicantes entre hepatócitos de camundongo ou rato. Ele favorece a manutenção de padrões normais de fatores de transcrição hepáticos, citocromo P450 basal e perfis de receptores nucleares, bem como a síntese e secreção de lipídios. Por fim, medeia a inibição da apoptose por meio de uma inativação eficiente das caspases iniciadoras clivadas e prevenção das atividades de ASK1-JNK via regulação de GST. Na linhagem celular de hepatoma Huh-7, a exposição ao DMSO interrompe o ciclo celular no estado G0/G1 e aumenta o status de diferenciação celular, incluindo o metabolismo de fármacos. Em células HepG2, a incubação com DMSO altera os metabolismos lipídico e glicêmico, que se tornam mais próximos aos dos PHH. Mais recentemente, o DMSO foi incluído em protocolos de diferenciação de hepatócitos a partir de ES humanas, iPS de camundongo e MSC. Foi demonstrado inicialmente que a indução da diferenciação de hESC para endoderma definitivo antes do tratamento com DMSO seria crucial para levar a uma diferenciação mais eficiente de hepatócitos. Em seguida, observou-se que a adição de DMSO no estágio inicial da especificação do endoderma definitivo induz a rápida regulação negativa de genes pluripotentes, restaura o controle do ponto de verificação do ciclo celular, preparando a proliferação e a transição para fenótipos diferenciados.
   Os mecanismos subjacentes pelos quais o DMSO exerce seu efeito na sobrevivência e diferenciação celular ainda precisam de mais investigação. Vários estudos revelam alterações associadas ao DMSO no nível epigenético, em particular modificações de histonas. Por exemplo, enquanto o tratamento com DMSO de embriões de camundongo de 2 células resultou em uma redução geral na acetilação de proteínas, observou-se aumento da acetilação das histonas H3 e H4, juntamente com programas transcricionais prejudicados. Por outro lado, um estudo recente em HepG2 mostrou que o aumento da expressão de CYP3A4 induzido por DMSO é mediado por uma cascata de alterações na modificação de histonas. Embora esses estudos levantem possibilidades intrigantes de um efeito do DMSO mediado por modificação de histonas em programas transcricionais, até o momento faltam análises sistemáticas em todo o genoma.
   Assim, utilizamos a linhagem celular de hepatoma humano HepaRG para estudar o efeito do DMSO nos programas transcricionais e epigenéticos durante a diferenciação hepática. As células HepaRG exibem um cariótipo pseudodiploide e compartilham com as células progenitoras multipotentes do fígado fetal humano, isoladas e caracterizadas por Dan et al., uma alta capacidade proliferativa, um potencial de diferenciação para as linhagens biliar e hepatocítica, e a capacidade de se diferenciar em hepatócitos funcionais. Embora a diferenciação hepática ocorra espontaneamente nesta linhagem celular, a adição de DMSO durante o processo de diferenciação melhora a infectabilidade das células HepaRG pelo vírus da hepatite B e as expressões de genes específicos do fígado, incluindo enzimas metabolizadoras de fármacos, que atingem níveis próximos aos encontrados em PHHs. Assim, em comparação com outras linhagens de células de hepatoma, as células HepaRG fornecem uma ferramenta única para identificar mecanismos do DMSO que favorecem a expressão gênica hepática. Poucos estudos já foram realizados para analisar o impacto da adição de DMSO nas células HepaRG. Apenas um pequeno conjunto de genes (<50) relacionados à função de metabolismo e desintoxicação foi identificado em associação com o DMSO, embora análises de larga escala focadas na diferenciação de HepaRG estejam disponíveis.

Neste contexto, realizamos uma análise de larga escala para determinar o papel global da exposição ao DMSO durante o processo de diferenciação. Como as avaliações de toxicidade de fármacos são geralmente realizadas com um nível mais baixo de DMSO ou após a remoção do DMSO, também avaliamos o efeito da remoção do DMSO após a diferenciação.

2. Materiais e Métodos

2.1. Produtos Químicos
LY294002, um inibidor de PI3K (Tebu-bio, Le Perrayen Yvelines, França) foi utilizado a 10 µM. Colchicina (Merck, C3915) foi utilizada a 10 µM. DMSO foi adquirido da Sigma (St. Quentin Fallavier, França, D4540).

2.2. Cultura de Células
A linhagem celular HepaRG foi mantida (número de passagem 8–12) conforme descrito anteriormente. As células foram semeadas a uma densidade de 2,7 × 10⁴/cm² e mantidas por duas semanas em meio William's E suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 5 μg/mL de insulina e 50 μM de hidrocortisona. Em seguida, o meio de cultura foi ou não suplementado com 2% de DMSO por duas semanas adicionais. As células foram geralmente coletadas neste estágio (D30 − DMSO, D30 + DMSO). Para avaliar o impacto da remoção do DMSO, este foi eliminado da cultura de HepaRG diferenciada no dia 30 (D30 + DMSO) e as células foram coletadas 4 dias depois (D34 ± DMSO) (Figura S1). Para os tratamentos com LY294002 e colchicina, as células HepaRG foram expostas no dia 15 a 10 µM de LY294002 ou 2% de DMSO + 10 µM de colchicina por 24 h.

2.3. RT-PCR em Tempo Real
O RNA total foi purificado com um kit RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA, EUA). O cDNA foi obtido utilizando o High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Waltham, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A PCR em tempo real foi realizada com o Sistema StepOnePlus™ e a metodologia do corante fluorescente SYBR Green, utilizando o SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). A expressão foi normalizada com o gene de referência TBP (proteína de ligação à TATA). As sequências dos primers estão listadas na Tabela S1. Para o TDO2, a PCR em tempo real foi realizada com ensaios baseados em sondas Taqman (Applied Biosystems). Os primers Taqman humanos para PCK2 (Hs00388934_m1), TDO2 (Hs00194611_m1) e o gene de referência TBP (Hs00427620_m1) foram fornecidos pela Applied Biosystems. Os dados foram quantificados com o software StepOne Plus v2.2.1.
2.4. Análise de Microarranjo
mRNAs de quatro réplicas biológicas independentes de cada ponto temporal foram utilizados para realizar o experimento de microarranjo. O perfil de expressão genômica em larga escala foi realizado utilizando o kit de marcação QuickAmp de baixa entrada e microarranjos pan-genômicos humanos SurePrint G3 8x60K (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Os dados de expressão gênica foram processados utilizando o Feature Extraction (Agilent Technologies). Os dados discutidos nesta publicação foram depositados no Gene Expression Omnibus (GEO, RRID:SCR_005012) do NCBI e estão acessíveis através do número de acesso da série GEO GSE112123 desde 25 de julho de 2022 (). As análises estatísticas foram realizadas com o software GeneSpring GX v11.5 (Agilent Technology, Santa Clara, CA, EUA). Os genes diferencialmente expressos ao longo da diferenciação foram identificados por um teste ANOVA de um fator (com correção Bonferroni FWER) com um valor de p < 0,001 e uma mudança absoluta (|FC|) > 3. A análise de agrupamento foi realizada utilizando Cluster 3.0 e TreeView 1.6 (Java Treeview, RRID:SCR_016916) usando correlação não centrada e ligação completa. A anotação gênica foi baseada na ontologia genética e o enriquecimento para funções biológicas específicas foi determinado utilizando o programa FuncAssociate 2.0 (FuncAssociate: The Gene Set Functionator, RRID:SCR_005768). Para determinar genes significativamente desregulados entre duas condições (D30 + DMSO vs D30 − DMSO ou D34 ± DMSO vs D30 + DMSO), foi utilizado um teste t (com correção de Benjamini-Hochberg) com um valor de p < 0,005 e |FC| > 2. Os genes foram considerados estáveis entre duas condições (D30 + DMSO vs D30 − DMSO ou D34 ± DMSO vs D30 + DMSO) quando estavam desregulados durante a diferenciação de HepaRG (ANOVA de todas as condições, p < 0,01; |FC| > 2), mas apresentavam um coeficiente de variação inferior a 30% (%CV < 30%) e |FC| < 1,3 em ambas as condições comparadas.
2.5. Análise de Vias de Ingenuidade
Os reguladores upstream foram identificados utilizando a Ferramenta de Análise de Vias de Ingenuidade (IPA, Ingenuity Pathway Analysis, RRID:SCR_008653) com base nas listas de genes downregulados, upregulados ou estáveis.
2.6. Análise de Enriquecimento de Conjuntos Gênicos
Análise de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA, Gene Set Enrichment Analysis, RRID:SCR_003199) foi utilizada para verificar se um conjunto de genes definido a priori apresenta diferenças concordantes e estatisticamente significativas entre dois estados biológicos. O GSEA foi realizado utilizando a ferramenta Java desenvolvida no Broad Institute (Cambridge, MA, EUA). O GSEA não supervisionado foi realizado com toda a coleção C2 de conjuntos de genes curados do banco de dados de assinaturas moleculares (MSigDB). O escore de enriquecimento (ES) foi determinado após 1.000 permutações, conforme descrito anteriormente.
2.7. Mapa de Conectividade
O algoritmo do mapa de conectividade (Connectivity Map 02, RRID:SCR_015674) foi utilizado para associar assinaturas de expressão gênica a potenciais moléculas terapêuticas.
2.8. Imunoprecipitação de Cromatina Seguida de Sequenciamento de Próxima Geração (ChIP-seq)
Células HepaRG destacadas foram fixadas com 1% de formaldeído em meio William’s E por 10 min. A reticulação foi interrompida pela adição de glicina a uma concentração final de 125 mM por 5 min à temperatura ambiente. Se não mencionado de outra forma, as amostras foram mantidas em gelo ou a 4 °C e as centrifugações foram realizadas a 800 g por 5 min. Após lavagem duas vezes com 125 mM de glicina em PBS e uma vez em PBS, as células foram ressuspendidas consecutivamente em 5 mL de tampão A (10 mM HEPES-NaOH, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,25% Triton X-100, 1 X PIC (Comprimidos de Coquetel Inibidor de Protease Completo)), respectivamente, tampão B (10 mM HEPES-NaOH, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,01% Triton X-100, 1 X PIC) e agitadas por 10 min, seguidas de centrifugação cada. As células foram ressuspendidas em 600 μL de tampão C (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,25% SDS, 1 X PIC). A sonicação da cromatina em fragmentos entre 100 e 800 pb foi realizada usando o Bioruptor NGS (Diagenode, Liège, Bélgica) em potência alta em volumes de 200 μL, seja em tubos de cisalhamento de 0,5 mL com 30 ciclos ou em microtubos de 1,5 mL (Diagenode, Liège, Bélgica) com 10 ciclos e cada ciclo consistindo em 30 s de sonicação e 30 s de tempo de recuperação. As amostras foram diluídas com o dobro do volume de tampão de diluição (25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,75% Glicerol).
Para cada imunoprecipitação, 10 µL de beads de proteína G (Invitrogen, Carlsbad, EUA) foram combinados com 2 µg de anticorpo H3K4me3 (Diagenode Cat# pAb-003-050, RRID:AB_2616052), H3K27ac (Diagenode Cat# C15410196, RRID:AB_2637079) ou H3K4me1 (Diagenode Cat# C15410194, RRID:AB_2637078), 5 µL de BSA (NEB, Frankfurt am Main, Alemanha, 10 mg/mL) e incubados sob rotação por 2 h. Em seguida, foram adicionados 300 µL de cromatina sonicada (equivalente a 1 milhão de células). As imunoprecipitações de H3K27ac foram suplementadas com Na-Butirato até uma concentração final de 10 mM. Após rotação durante a noite, as beads foram lavadas consecutivamente com 1 mL de WB1 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,25% SDS), duas vezes com WB2 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,25% SDS), WB3 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonident P-40, 0,5% desoxicolato de sódio) e duas vezes com TE/NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) sob rotação por 10 min. A eluição foi realizada utilizando 200 µL de EB (100 mM NaHCO₃, 1% SDS) por 30 min em um agitador à temperatura ambiente. Os eluatos foram suplementados com solução de reversão de ligação cruzada (4 µL de NaCl 5 M, 2 µL de EDTA 0,5 M e 2,5 µL de Proteinase K (20 mg/mL)) e incubados durante a noite a 55 °C. O DNA de ChIP foi purificado por extração com fenol-clorofórmio seguida de precipitação com etanol. A preparação da biblioteca foi realizada usando o Truseq ChIP Sample Preparation Kit (Illumina, San Diego, CA, EUA) seguindo o manual, exceto por omitir a seleção de tamanho. Todas as bibliotecas de ChIP-seq foram sequenciadas em paired-end 2 × 100 pb em um HiSeq2500 (Illumina, San Diego, CA, EUA). Os dados brutos discutidos nesta publicação foram depositados no Gene Expression Omnibus (GEO, RRID:SCR_005012) do NCBI e estão acessíveis através do número de acesso da série GEO GSE179988 desde 25 de julho de 2022 ().
2.9. Análise de Dados de ChIP-seq
Extremidades de baixa qualidade (pontuação phred = 20) das leituras no formato FastQ foram cortadas, além da remoção de adaptadores, usando Trim Galore (versão 0.3.3) [ acessado em 13 de maio de 2022]. As leituras cortadas foram alinhadas ao genoma de referência humano (hs37d5) usando o mapeador GEM (versão 1.376 beta). O Samtools (versão 1.3) foi usado para converter o formato SAM para BAM. O MarkDuplicate (versão 1.115) das ferramentas Picard [ acessado em 13 de maio de 2022] foi usado para marcar duplicações de PCR. A análise diferencial e anotação de sítios diferenciais (DERs) para genes associados e regiões promotoras foram realizadas usando diffReps (versão 1.55.5) com padj < 0,001 e |FC| > 2. Um gráfico circular dos sítios diferenciais foi gerado usando Circlize (versão 0.3.10). O GREAT (versão 3.0.0) foi usado para previsão de termos GO associados com configurações de extensão padrão (valor-p binomial < 0,05). Trilhas de cobertura de ChIP-seq normalizadas para 1× profundidade de sequenciamento e gráficos de cobertura média ao redor do TSS (tamanho do bin = 50 pb) foram gerados com deepTools. As trilhas de cobertura foram visualizadas no navegador IGV. Dados de ATAC-seq de PHHs masculinos disponíveis no EGA (ID de acesso EGAS00001004201, n = 3) foram processados conforme descrito para dados de ChIP-seq. A chamada de picos ATAC foi realizada com MACS2 (versão 2.1.0, acessado em 13 de maio de 2022). A sobreposição da união dos picos ATAC de PHH e dos DERs de modificação de histonas foi calculada usando GenomicRanges (v1.36.0, GenomicRanges, RRID:SCR_000025).
2.10. Imunotransferência (Western blot)
As células foram lisadas usando um tampão HEPES (50 mM HEPES pH7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH8, 2,5 mM EGTA pH 7,4, 0,1% Tween20, 10% glicerol, 0,1 mM orto-vanadato de sódio, 1 mM NaF e 10 mM β-glicerofosfato). Após a lise celular, 50 µg de proteínas totais foram resolvidos em eletroforese em gel NuPAGE® 4–12% Bis-Tris (Invitrogen Waltham, MA, EUA), transferidos para membrana de nitrocelulose usando o sistema iBlot (Invitrogen). Imagens de quimioluminescência foram adquiridas com o software Chemi-Capt (Vilber Lourmat). Foram usados anticorpos dirigidos contra CYP3A4 (1:800, Millipore Cat# 250308-100UL, RRID:AB_211764), CYP2E1 (1:1000, Oxford Biomedical Research Cat# PA26, RRID:AB_10816092), ALDOB (1:1000, Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-12063, RRID:AB_2226680), CDK1 conforme descrito anteriormente, MCM7 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-9966, RRID:AB_627235), ciclina A (1:1000, Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-596, RRID:AB_631330) e HSC70 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-7298, RRID:AB_627761).
2.11. Imunocitoquímica
As células foram fixadas com 4% de paraformaldeído (PFA). A imunolocalização de F-actina foi realizada com Alexa Fluor 594 Faloidina (Thermo Fisher Scientific Cat# A12381, RRID:AB_2315633 Waltham, MA, EUA). Os núcleos celulares foram corados com Hoechst H33342 (B2261 Sigma) e as imagens foram adquiridas usando o Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader (Thermo Scientific). Para análise da matriz extracelular, a atividade da peroxidase endógena foi bloqueada e a incubação durante a noite a 4 °C com anticorpos contra Colágeno tipo III (Cell Sciences Cat# PS062, RRID:AB_2245094), Colágeno tipo I (Cell Sciences Cat# PS060, RRID:AB_420256), Colágeno tipo IV (Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-59814, RRID:AB_1121796), Fibronectina (Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-8422, RRID:AB_627598) ou Laminina (Thermo Fisher Scientific Cat# PA1-16730, RRID:AB_2133633) foi seguida por incubação com um anticorpo secundário acoplado à peroxidase de rábano (fragmento F(ab′)2 AffiniPure conjugado com peroxidase anti-IgG (Jackson ImmunoResearch Labs Cat# 111-036-006, RRID:AB_2313586). A coloração da peroxidase foi obtida com solução de 3,3-diaminobenzidina/H2O2. As células foram contracoradas com Hemalun de Masson e as imagens foram adquiridas usando um microscópio Zeiss.
2.12. Coloração de Deposição da Matriz Extracelular
A coloração da reticulina por impregnação de prata da matriz extracelular foi realizada conforme descrito anteriormente.
2.13. Síntese de DNA
As porcentagens de células HepaRG em proliferação foram estimadas pela quantificação de células que incorporaram 5-Bromo-2′-desoxiuridina (BrdU). O meio de cultura HepaRG foi suplementado com BrdU por 4 h e, em seguida, as células foram fixadas com 4% de PFA. Para a coloração, o anticorpo primário foi um anti-BrdU (1:200, Abcam Cambridge, Reino Unido Cat# ab8152, RRID:AB_308713) e o anticorpo secundário foi anti-IgG de camundongo-dylight488 (1:500, 072-03-18-18, KPL). As imagens foram adquiridas usando o Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader. As imagens foram analisadas com o Cell Health Profiling BioApplication do software Cellomics.
2.14. Atividades do Citocromo P450
Para determinar a atividade da CYP2A13, foi realizado um ensaio de 7-hidroxilação da cumarina. As células HepaRG foram incubadas por 2 h com 200 µM de cumarina (Ref C4261-Sigma Aldrich) em meio livre de vermelho de fenol, sem SFC e DMSO. Para remover a forma conjugada de 7-hidroxicumarina, os sobrenadantes foram incubados a 37°C por 2 h com glucuronidase/arilsulfatase (300 unidades Fishman/mL e 2400 unidades Roy/mL, respectivamente). A 7-hidroxilação da cumarina foi então estimada por HPLC (série Agilent 1100).
2.15. Análise Estatística
Os resultados são expressos como médias ± DP. Os dados foram analisados usando o software Graph Pad Prism (Versão 4.0; GraphPad Prism, RRID:SCR_002798). A significância foi avaliada pelo teste t de Student para comparação dois a dois ou por ANOVA de uma via seguida pelo post hoc de Tukey para comparações múltiplas.
3. Resultados
3.1. Progenitores HepaRG Diferenciam-se Espontaneamente em Células Semelhantes a Biliares e Hepatócitos
Para avaliar as mudanças na expressão gênica durante a diferenciação de HepaRG de progenitores para células hepáticas maduras e o papel do DMSO nesse processo, realizamos uma análise global da expressão gênica em vários pontos temporais durante a diferenciação de HepaRG. Selecionamos o estágio de progenitor, dia 4 após a semeadura celular (D4), um estágio intermediário, dia quinze (D15), que está comprometido na diferenciação e corresponde ao momento em que o DMSO poderia ser adicionado para diferenciação completa, o final do período de diferenciação na presença (D30 + DMSO) ou ausência de DMSO (D30 − DMSO) e, finalmente, após a remoção do DMSO, ou seja, células diferenciadas com DMSO por 30 dias mantidas por quatro dias adicionais sem DMSO (D34 ± DMSO) (Figura S1).

Por uma ANOVA de uma via, identificamos 775 genes desregulados (p < 0,001, FC > 3) em pelo menos uma condição durante a diferenciação de HepaRG. O agrupamento hierárquico dos genes diferencialmente expressos revelou dois ramos principais do dendrograma associados a funções biológicas relevantes (Figura 1). Ele separou as células progenitoras (D4) das células em diferenciação e diferenciadas (D15, D30 − DMSO, D30 + DMSO e D34 ± DMSO). Curiosamente, as mudanças transcricionais mais proeminentes durante a diferenciação ocorreram entre D4 e D15, destacando que a própria diferenciação de HepaRG ocorreu espontaneamente sem a adição de DMSO.
Os genes agrupados pelo dendrograma foram anotados com base no enriquecimento de ontologia gênica determinado pelo programa FuncAssociate 2.0. A parte superior do dendrograma incluiu 451 genes cujas expressões foram reguladas positivamente no dia 15 do programa de diferenciação. Entre esses genes regulados positivamente, encontram-se importantes fatores de transcrição hepáticos, como o Receptor Nuclear X do Fígado (LXR, NR1H3), o Receptor X Farnesoide (FXR, NR1H4), o Receptor Constitutivo de Androstano (CAR, NR1I3) ou o receptor nuclear Pregnano X (PXR, NR1I2) (Figura S2). De fato, a maioria dos genes pertencentes ao primeiro cluster estava envolvida no metabolismo de (i) drogas, como demonstrado pela presença de vários membros da família do citocromo P450 (CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9 ou CYP2E1), (ii) lipídios, como mostrado pelas expressões da acil-CoA oxidase 1 (ACOX1) e da peroxissomal trans-2-enoil-CoA redutase (PECR), que estão envolvidas na via de beta-oxidação e no alongamento da cadeia de ácidos graxos, respectivamente, (iii) aminoácidos, com o exemplo da arginase (ARG1), que está envolvida no ciclo da ureia, (iv) álcoois, demonstrado pela presença de vários membros da família da aldeído desidrogenase (ALDH2, ADH4, ADH6…), e (v) glicose, como mostrado pelas expressões da piruvato quinase PKLR, que desempenha um papel fundamental na glicólise, e da fosfoenolpiruvato carboxiquinase 2 (PCK2), uma enzima chave da gliconeogênese. Entre esses genes diferencialmente expressos (DEGs), também encontramos genes expressos por células biliares, como os fatores de transcrição HNF6A e SOX9, os transportadores ABCG5, ABCG8 e ABCA1, bem como o transportador de solutos orgânicos SLC51B e SLC28A1 (Figura 1 e dados não mostrados).

A parte inferior do dendrograma agrupou 324 genes cujas expressões foram principalmente reguladas negativamente durante a diferenciação de HepaRG. Esses genes estavam principalmente relacionados à progressão do ciclo celular e à proliferação. Este cluster incluiu a quinase dependente de ciclina 1 (CDK1) e o fator de transcrição E2F 1 (E2F1), ambos essenciais para a transição da fase G1/S e que podem regular outros genes neste cluster. Consistente com o papel dos componentes da membrana basal no comportamento celular, incluindo proliferação, este cluster também agrupou genes relacionados à região extracelular ou à ligação ao colágeno, como a laminina alfa 4 (LAMA4) e o colágeno tipo IV alfa 1 (COL4A1), dois constituintes principais da membrana basal. Esses genes foram altamente expressos no estágio progenitor e depois regulados negativamente durante o processo de diferenciação.

3.2. Efeitos Pleiotrópicos do DMSO Melhoram Várias Funções Hepáticas Específicas em Células HepaRG
O agrupamento hierárquico revelou que apenas grupos de genes eram sensíveis à exposição ao DMSO. A expressão desses genes começou espontaneamente a partir do D4 e continuou aumentando ao longo do tempo de cultura, mesmo na ausência de DMSO (D30 − DMSO, Figura 1). A adição de DMSO ao meio de cultura no D15 potencializa a regulação positiva de muitos genes que são regulados positivamente ao longo do programa de diferenciação. Para determinar mais especificamente os genes regulados positivamente pela exposição ao DMSO, uma comparação dois a dois de D30 − DMSO e D30 + DMSO revelou que as expressões de 465 genes (p < 0,005, FC > 2) foram moduladas pela adição de DMSO (Figura 2a) e, entre eles, a expressão de 177 genes foi altamente regulada positivamente pela exposição ao DMSO (Figura 2a,b e Tabela S2). Esses genes estavam envolvidos principalmente na função metabólica do fígado, como metabolismo de xenobióticos, incluindo CYP3A4, CYP2B6 e CYP2E1, aminoácidos, como S-metilmetionina-homocisteína S-metiltransferase (BHMT2), glutaminase 2 (GLS2) e metionina adenosiltransferase 1A (MAT1A), ácidos carboxílicos, como PCK2 e CYP2C9, álcoois, como catalase (CAT), 7-desidrocolesterol redutase (DHCR7) e CYP3A4, e lipídios, como acetil-CoA aciltransferase 1 (ACAA1), 2-hidroxiacil-CoA liase 1 (HACL1) e membro 1 da família 27 de transportadores de solutos (SLC27A1). A análise de vias por Ingenuity (IPA) indicou que seus reguladores upstream eram o PXR e o fator de transcrição nuclear alfa do receptor ativado por proliferador de peroxissomo (PPARα, ambos envolvidos no metabolismo de fármacos e lipídios (Figura S2). Entre esses genes regulados positivamente, validamos por RT-PCR em tempo real o forte aumento nos níveis de expressão de vários membros da família CYP, como CYP3A4 e CYP2C9, pela exposição ao DMSO (Figura 2c, painel esquerdo e dados não mostrados).

Além dos genes descritos acima, as expressões de 161 genes, representando 20,7% dos genes modulados durante o programa de diferenciação (ANOVA p < 0,001; FC > 3), não foram afetadas pela presença de DMSO (Tabela S3). Esses genes, envolvidos no metabolismo (principalmente lipídios, como apolipoproteína (APO) E e APOM, e ácidos carboxílicos, como triptofano 2,3-dioxigenase (TDO2) e metilmalonil-CoA mutase (MUT)), bem como na coagulação (como fator X de coagulação (F10) e fator II de coagulação (F2)), foram regulados tanto pelo PPARα quanto pelo fator nuclear de hepatócito (HNF) 1α e HNF4α, que atuam no desenvolvimento e na homeostase metabólica do organismo (Figura 2b). Consistentes com essas observações, os níveis de RNA da aldolase B (ALDOB), uma enzima glicolítica, e da APOE, envolvida no catabolismo de constituintes de lipoproteínas ricas em triglicerídeos, não são afetados pela exposição ao DMSO (Figura 2c, painel central).

3.3. O DMSO Desempenha um Papel na Remodelação da Matriz e do Citoesqueleto e Possui Propriedades Anti-inflamatórias
Embora o DMSO tenha sido até agora demonstrado principalmente como indutor de genes envolvidos no metabolismo de medicamentos, descobrimos que a expressão de 288 genes (62% dos genes modulados) associados a vários termos de ontologia genética, como secreção, sinalização celular ou organização do citoesqueleto, foi significativamente reduzida pela exposição ao DMSO (p < 0,005, |FC| > 2) (Figura 2b e Tabela S4). Por exemplo, os níveis de mRNA da metaloproteinase proteína A plasmática associada à gravidez (PAPPA), que cliva as proteínas de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina, da metalopeptidase 7 da matriz (MMP7), envolvida na degradação da matriz extracelular, ou da osteomodulina (OMD), uma molécula relacionada à organização da matriz que suprime a formação de fibras de colágeno, foram reduzidos na presença de DMSO (Figura 2c, painel direito). Alguns reguladores da polimerização da actina, como CDC42ep1 (proteína efetora CDC42 (ligação à Rho GTPase) (1), RHOBTB1 (domínio BTB relacionado a Rho contendo 1), ABLIM2 (proteína de ligação à actina da família LIM, membro (2) ou INF2 (forminina invertida, contendo domínios FH2 e WH2) também foram encontrados regulados negativamente pelo DMSO. Em concordância, a deposição de matriz extracelular (MEC), evidenciada pela coloração de reticulina, foi dificilmente detectada em HepaRG de D30 − DMSO, enquanto foi claramente observada ao redor dos hepatócitos HepaRG de D30 + DMSO (Figura 3a). De acordo, a proporção TIMP (inibidor tecidual de metaloproteinase 1)/MMP torna-se favorável à deposição de MEC na presença de DMSO (Figura 3b). Esta MEC era composta pelo menos por fibronectina, laminina e colágeno I, III e IV (Figura 3c). Algumas fibras de colágeno também estavam localizadas entre os cordões de hepatócitos. Em paralelo, a coloração de F-actina mostrou a presença de fibras de estresse em HepaRG cultivadas sem DMSO, enquanto revelou uma F-actina localizada principalmente na periferia celular, logo abaixo da membrana plasmática, na presença de DMSO (Figura 3d). Também foi observado um acúmulo de F-actina ao redor das estruturas semelhantes a canalículos biliares (Figura 3d).

O regulador upstream destes 288 genes identificado pelo IPA sugeriu que o DMSO possui propriedades anti-inflamatórias. De fato, o fator de necrose tumoral (TNF), uma citocina envolvida na regulação de um amplo espectro de processos biológicos, o lipopolissacarídeo (LPS), uma endotoxina que induz uma resposta imune, e a oncostatina M (OSM), uma citocina envolvida na regulação do crescimento, foram identificados como estando envolvidos na regulação destes 288 genes reprimidos, como o ligante 2 de quimiocina com motivo C-C (CCL2), o receptor 7 de quimiocina com motivo C-X-C (CXCR7) ou a proteína C reativa (PCR) (Figura 2b).

3.4. O DMSO Induz Padrões de Modificação de Histonas em Todo o Genoma durante a Diferenciação de HepaRG
A análise de enriquecimento de conjuntos gênicos não supervisionada (GSEA) indicou um efeito do DMSO na remodelação da cromatina. Identificamos enriquecimento (p < 0,05) de assinaturas gênicas associadas a modificações de histonas como acetilação ou metilação (Tabela S5). Por exemplo, células HepaRG diferenciadas com DMSO apresentam um enriquecimento do « PEART_HDAC_PROLIFERATION_CLUSTER_UP » correspondente a genes regulados positivamente por inibidores de histona deacetilase (HDAC). Também destacamos o « WP_ETHANOL_EFFECTS_ON_HISTONE_MODIFICATIONS » correspondente a uma via de modificação de histonas alterada. Para validar o papel do DMSO na diferenciação de HepaRG, analisamos os padrões genômicos de H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac. Essas três modificações canônicas de histonas são assinaturas características de promotores ativos (H3K4me3) e elementos intensificadores (H3K4me1 e H3K27ac). Utilizamos ChIP-seq para gerar e comparar perfis genômicos dessas marcas entre células HepaRG D30 − DMSO e D30 + DMSO. Todos os experimentos foram realizados em duas réplicas independentes (Figura S3).
Como primeira análise, comparamos alterações em todo o genoma usando o programa diffReps (padj < 0,001, FC > 2). Isso permite a identificação de regiões diferencialmente enriquecidas (DERs) e genes associados após exposição ao DMSO. Para H3K4me3 e H3K27ac, encontramos alterações distintas em resposta ao tratamento com DMSO (Figura 4a). Para H3K4me1, observamos apenas uma ligeira tendência de enriquecimento regional ao redor dos sítios de início de transcrição (TSS) de genes regulados positivamente (Figura 4b). Uma perda proeminente de H3K4me3 dependente de DMSO foi observada em 1140 DERs, enquanto apenas 86 DERs ganharam H3K4me3 (Tabela S6). Além disso, 690 DERs mostraram um aumento e 226 DERs uma diminuição em H3K27ac após tratamento com DMSO (Tabela S7).
A maioria das DERs de H3K4me3 (76%) e H3K27ac (63%) foi encontrada em contexto gênico (Figura S4). 54% das DERs de H3K4me3 estavam localizadas em regiões promotoras anotadas. As DERs de H3K27ac foram detectadas mais frequentemente em corpos gênicos (37%) ou regiões intergênicas (37%). Curiosamente, 73% das DERs com aumento de H3K27ac sobrepuseram-se à cromatina acessível em PHHs que podem corresponder a elementos reguladores relevantes para a identidade celular dos hepatócitos. Genes com expressão aumentada apresentaram maior cobertura média de H3K4me3 e H3K27ac em comparação com genes inalterados e especialmente com genes com expressão reduzida em células HepaRG expostas a DMSO (Figura 4b). De fato, 102 genes com expressão reduzida mostraram enriquecimento reduzido de H3K4me3 (141 DERs), com 8 genes também apresentando enriquecimento reduzido de H3K27ac (Tabela S4). Em 17 genes com expressão aumentada, observou-se maior H3K4me3 (20 DERs) e em 25 genes, aumento do enriquecimento de H3K27ac (136 DERs) (Tabela S2). No entanto, as DERs não coincidiram necessariamente com a expressão gênica diferencial. Sete DERs de H3K4me3 e dezenove DERs de H3K27ac foram associadas a genes não afetados pela exposição a DMSO (Tabela S3), incluindo genes relevantes para o fígado, como ALDOB (Figura S4b). Além disso, um baixo número de DERs mostrou correlação negativa com a expressão gênica. DERs com enriquecimento reduzido de H3K4me3 associadas a genes com expressão aumentada (5), como a UDP-glucuronosiltransferase família 1 membro A8 (UGT1A8), ou DERs de H3K27ac com enriquecimento aumentado localizadas em genes com expressão reduzida (6) podem representar promotores alternativos de variantes de transcritos ou elementos reguladores distais (Figura S4c).
As funções biológicas dos DEGs com expressão aumentada associados a DERs de H3K4me3 e/ou H3K27ac, como CYP2C9 ou CYP3A4 (Figura 4c), estavam principalmente relacionadas ao metabolismo de xenobióticos, lipídios, aminoácidos, ácidos carboxílicos e álcoois. Genes que não foram afetados por DMSO, mas que no entanto exibiram aumento do enriquecimento de H3K27ac, também foram associados a funções hepáticas específicas (Tabela S8). Genes estáveis sem alterações nas modificações de histonas também incluíam genes relacionados ao fígado, como APOE (Figura 4c). Exemplos proeminentes de genes com expressão reduzida por DMSO com alterações coincidentes nas modificações de histonas são OMD e MMP7, ambos envolvidos na remodelação da matriz extracelular (Figura 4c).
3.5. Identificação de Moléculas que Poderiam Mimetizar ou Reverter o Efeito do DMSO
Para caracterizar melhor o efeito do DMSO na expressão gênica, utilizamos uma abordagem de mapa de conectividade conforme descrito anteriormente. Entre as dez moléculas mais bem classificadas, identificamos seis moléculas que poderiam induzir uma assinatura semelhante à das células HepaRG tratadas com DMSO e quatro moléculas que apresentavam uma assinatura inversa, sugerindo que poderiam reverter o perfil global de expressão gênica induzido pela exposição ao DMSO (Tabela S9). Entre as moléculas que poderiam mimetizar os efeitos do DMSO, metade são inibidores de HDAC: vorinostat, tricostatina A (TSA) e CP-690334-01, corroborando as assinaturas encontradas anteriormente e reforçando o impacto do DMSO na remodelação da cromatina. Vale notar que o desenvolvimento do inibidor sintético de HDAC vorinostat teve origem no DMSO. Curiosamente, também identificamos moléculas com propriedades anti-inflamatórias, como withaferina A e LY-294002. Em relação às moléculas que exibiram assinatura inversa ao DMSO, encontramos moléculas com diversas funções. Entre elas está a colchicina, um fármaco citoesquelético bem conhecido que inibe a polimerização dos microtúbulos. A colchicina também demonstrou modular o acúmulo de matriz extracelular e possuir propriedades anti-inflamatórias. Para avaliar o papel do DMSO, selecionamos dois fármacos: LY294002, um potente inibidor de PI3K, que pode mimetizar o efeito do DMSO, e colchicina, que pode ter um efeito oposto. Conforme esperado, o tratamento de HepaRG-D15 por 24 h com LY294002 levou a um aumento na expressão de CYP3A4, um gene que anteriormente foi demonstrado ser induzido pelo DMSO, e a uma diminuição na expressão de MMP7, um gene regulado negativamente pelo DMSO (Figura 5a–c). Por outro lado, o tratamento de HepaRG-D15 por 24 h com 2% de DMSO na presença de colchicina mostrou que a colchicina aboliu o efeito do DMSO nas expressões de CYP3A4 e PAPPA (Figura 5b,c).
3.6. A Remoção do DMSO Induz Proliferação Celular Transitória
Como o DMSO é removido do meio de cultura no D30 em alguns protocolos de estudos de metabolismo, como em testes de indução de CYP, comparamos ainda os perfis de expressão de células das quais o DMSO foi removido do meio de cultura no dia 30 por um período de 4 dias (D34 ± DMSO) com células diferenciadas na presença de DMSO (D30 + DMSO).
Comparação dois a dois de D30 + DMSO e D34 ± DMSO revelou que as expressões de 394 genes foram moduladas pela remoção de DMSO (Figura 6a). Curiosamente, apenas 37% (107) dos genes significativamente reprimidos (p < 0,005; |FC| > 2) pela adição de DMSO também foram regulados positivamente pela remoção de DMSO com a mesma rigidez (Figura S5). Enquanto o agrupamento hierárquico de genes desregulados em pelo menos uma condição durante a diferenciação de HepaRG (D4, D15, D30 − DMSO, D30 + DMSO e D34 ± DMSO) revelou que genes relacionados ao ciclo celular foram fortemente regulados negativamente em células em diferenciação (Figura 1), a remoção de DMSO re-induziu suas expressões. De fato, 259 genes envolvidos principalmente na regulação e progressão do ciclo celular foram significativamente regulados positivamente após a remoção de DMSO (p < 0,005, FC > 2) (Figura 6b e Tabela S10). Os reguladores upstream desses genes são Ciclina D1 (CCND1) e E2F4 (Figura 6b). Entre esses genes, as expressões de E2F1, um fator de transcrição que controla genes que regulam a entrada na fase S e a síntese de DNA, bem como CDK1, que é essencial para as transições G1/S e G2/M dos hepatócitos, foram induzidas após a remoção de DMSO (Figura 6c, painel esquerdo).

Essas observações foram reforçadas com o aumento nas quantidades de proteína CDK1 e do componente 7 do complexo de manutenção do minicromossomo (MCM7) após a remoção de DMSO, ambos essenciais para o início da replicação do genoma eucariótico (Figura 7a). Da mesma forma, a expressão de Ciclina A (CCNA2), envolvida tanto na fase S quanto na transição G2/M do ciclo celular, foi induzida (FC = 7,3; valor-p = 0,007) pela remoção de DMSO (Figura 7a). No entanto, a capacidade das células HepaRG de replicar o DNA após a remoção de DMSO foi baixa e transitória (Figura 7b). Enquanto 1,5 a 2% das células HepaRG diferenciadas, principalmente hepatócitos, eram positivas para BrdU nas condições D30 − DMSO ou D30 + DMSO, 7% das células HepaRG diferenciadas tornaram-se positivas para BrdU dois dias após a remoção de DMSO (Figura 7b). Essa porcentagem retornou ao nível basal quatro dias depois. Consistentes com essas observações, a GSEA não supervisionada identificou enriquecimento significativo de várias assinaturas principalmente relacionadas à proliferação celular (55% das 20 principais assinaturas significativas), diferenciação celular, transição epitelial-mesenquimal (EMT), inflamação ou característica tumoral. Entre elas, a "CHIANG_LIVER_CANCER_SUBCLASS_PROLIFERATION_UP" descrita por Chiang et al. e a "FISCHER_G2_M_CELL_CYCLE" descrita por Fisher et al. (Figura 7c).

3.7. A Remoção de DMSO Modula Diferencialmente Algumas Funções Metabólicas
Entre os 394 genes modulados pela remoção do DMSO (D34 ± DMSO versus D30 + DMSO), 135 genes foram significativamente regulados negativamente (p < 0,005, |FC| > 2) (Tabela S11). Vale notar que 58,5% (79) desses 135 genes foram considerados significativamente induzidos pelo DMSO com o mesmo rigor (Figura S5). Esses genes estavam principalmente envolvidos em metabolismos (xenobióticos, aminoácidos, álcoois, lipídios, ácidos orgânicos…) e a IPA relatou que os reguladores upstream desses genes são PXR e PPAR α. Entre esses genes regulados negativamente, identificamos vários membros da família do citocromo P450, como CYP3A4, CYP2B6, CYP2E1 ou CYP2A13 (Figura 6b). Conforme descrito anteriormente em outros estudos, confirmamos que os níveis de mRNA de CYP2E1 e CYP3A4 diminuíram fortemente 4 dias após a remoção do DMSO (Figura 6c painel central e Figura 7d). De acordo, uma redução na atividade da CYP3A4 após a remoção do DMSO foi detectada (Figura S6). Além disso, a CYP2A13 foi identificada como regulada negativamente após a remoção do DMSO em nossos dados de expressão gênica global. Consistente com essa observação, a atividade da CYP2A13, medida pela detecção da 7-hidroxilação da cumarina, foi aumentada em células HepaRG diferenciadas na presença de DMSO em comparação com aquelas diferenciadas na ausência de DMSO e, como esperado, sua atividade foi fortemente diminuída após a remoção do DMSO (Figura 7e).
Finalmente, a GSEA não supervisionada também identificou uma perda significativa de várias assinaturas relacionadas principalmente ao metabolismo (65% das 20 principais assinaturas significativas) ou ao estado de diferenciação (35%). Entre elas estão a via KEGG “KEGG_METABOLISM_OF_XENOBIOTICS_BY_CYTOCHROME_P450” e a “Wakabayashi_adipogenesis_PPARG_RXRA_bound_with_H4K20me1_mark” descrita por Wakabayashi et al., observadas em células HepaRG após a remoção do DMSO (Figura 7f). Curiosamente, nossa comparação também destacou que a expressão de 26,7% dos genes modulados durante o programa de diferenciação (ANOVA p < 0,001; |FC| > 3) não foi afetada pela remoção do DMSO (Tabela S12 e Figura 6b). Esses genes também estavam envolvidos em metabolismos (xenobióticos, lipídios, ácidos orgânicos) e coagulação. Alguns membros da família do citocromo P450, como CYP2C18, e outros genes, como ALDOB e APOE, foram encontrados nesse grupo de genes (Figura 6c painel direito e Figura 7d). Seus reguladores upstream, de acordo com a previsão da IPA, eram PPARα, HNF1α e HNF4α (Figura 6b e Figura S2). Vale notar que 41% (95) desses genes não foram considerados regulados pela adição de DMSO (Figura S5). Entre eles estão o fator de transcrição FXR, a lipoproteína circulante APOE e APOH, envolvidas no metabolismo de lipoproteínas e coagulação, a Acetil-CoA Aciltransferase 2 (ACAA1), a Paraoxonase (PON1), uma enzima secretada que compartilha atividade de éster hidrolase, ou F2. Portanto, a remoção do DMSO modula apenas alguns genes envolvidos em vários metabolismos.
4. Discussão
DMSO é um dos solventes mais comuns utilizados em estudos biológicos e foi o primeiro produto químico usado para induzir a parada do crescimento e a diferenciação terminal. O DMSO parece alterar a estrutura secundária de proteínas, bem como a estrutura de ácidos nucleicos. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais o DMSO influencia os processos celulares não são bem compreendidos e seu papel parece depender do tipo celular. Em relação à diferenciação de hepatócitos, o DMSO é geralmente utilizado a 2%. Nessa concentração, foi demonstrado que ele mantém o fenótipo diferenciado de PHHs e melhora a maturação de células semelhantes a hepatócitos HepaRG, que expressam marcadores hepáticos em níveis comparáveis aos expressos por PHHs. Em hepatócitos de ratos adultos, o DMSO pode atuar como um sequestrador de radicais hidroxila, estabilizando os níveis da proteína CYP3A4, enquanto modula o metabolismo lipídico em células HepG2 de hepatoblastoma humano. Em hepatócitos de ratos neonatais, o DMSO reduz a transição epitélio-mesenquimal. Poucos estudos descrevem o efeito do DMSO no metabolismo de drogas em HepaRG. Diante da multiplicidade de efeitos do DMSO, realizamos uma análise transcriptômica e de ChIP-seq em todo o genoma de células HepaRG para caracterizar melhor seus alvos moleculares. Descobrimos que a diferenciação de progenitores hepáticos é caracterizada por alterações extensas nos níveis de mRNA e que o DMSO induz a maturação de hepatócitos por meio da regulação do mRNA e de mudanças generalizadas na modificação de histonas. Além de um efeito indubitável no metabolismo de drogas, identificamos que o tratamento com DMSO induziu um impacto global nos processos fisiológicos celulares em células HepaRG diferenciadas. Juntamente com propriedades anti-inflamatórias, o DMSO induz uma diminuição da sinalização PI3K, bem como da organização do citoesqueleto e remodelação da MEC. Notavelmente, o efeito do DMSO pode ser parcialmente imitado pela Ly-294002, um inibidor de PI3K, ou inibido pela colchicina, um agente desagregador de microtúbulos.
Sabe-se que a colchicina e a sinalização PI3K modulam funções citoesqueléticas, como polaridade celular, compartimentalização intracelular, movimento e divisão celular, bem como remodelamento da MEC. Por exemplo, a ativação da via de sinalização PI3K induz a expressão de MMP2 em resposta à desestabilização do citoesqueleto em células endoteliais durante a angiogênese, enquanto a inibição de PI3K por Ly-294002 reduz a expressão de MMP7 em células de câncer de mama triplo-negativo MDA-MB468 e células de câncer colorretal. Essas inibições foram associadas à redução da proliferação e migração. Consequentemente, a MMP7 é regulada negativamente pelo DMSO em células HepaRG. Particularmente, a ativação de PI3K foi recentemente demonstrada como capaz de aumentar os fluxos de glicólise ao remodelar o citoesqueleto de actina e mobilizar a aldolase a partir da F-actina através da ativação de Rac em células epiteliais mamárias. Por outro lado, o inibidor de PI3K reduz a glicólise. Essa observação é coerente com o fato de que a glicólise é atenuada em favor da fosforilação oxidativa e da oxidação de ácidos graxos em hepatócitos adultos.

Quanto à colchicina, ela possui propriedades anti-inflamatórias, bloqueia a dinâmica dos microtúbulos e modula a expressão de MMP e TIMP, contribuindo para o remodelamento da MEC. No fígado, a colchicina diminui a deposição de MEC e a presença de moléculas inflamatórias, enquanto aumenta a expressão de marcadores de proliferação de hepatócitos. Além disso, foi demonstrado anteriormente que a colchicina, ao alterar a rede de microtúbulos, regula negativamente a expressão e os níveis proteicos dos genes controlados pelo receptor de glicocorticoide, como CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP3A4 e CYP1A2.

A importância dos genes relacionados ao citoesqueleto na expressão e indução de genes de CYP e transportadores de fármacos também foi enfatizada pela similaridade entre os perfis gênicos de HepG2 em culturas 2D tratadas com docetaxel, um agente estabilizador de tubulina, e em culturas 3D, o que aumenta a expressão de uma variedade de genes relacionados ao metabolismo de fármacos e de vários componentes dos microtúbulos.

Importante, foi demonstrado mais recentemente que as redes do citoesqueleto (microfilamentos de actina, microtúbulos e filamentos intermédios de queratina 8/18) estavam envolvidas na interação adequada entre o receptor de insulina, o transportador de glicose e as mitocôndrias nos hepatócitos. Da mesma forma, a sinalização de integrina-quinase de adesão focal e a mecanotransdução de E-caderina foram demonstradas como moduladoras do metabolismo das células epiteliais e da função mitocondrial através da ativação de STAT3 e da quinase ativada por AMP (AMPK), respectivamente.

Assim, o DMSO, através do seu impacto na organização do citoesqueleto e no remodelamento da MEC, ambos processos previamente descritos como coordenadores da regulação da expressão gênica hepática específica, poderia favorecer a maturação dos hepatócitos HepaRG. Em conjunto, essas observações também enfatizam a ligação entre forma celular, metabolismo e diferenciação.
Esse amplo impacto no processo fisiológico celular levando a alterações fenotípicas está associado a modificações pós-traducionais nos N-terminais das histonas, conhecidas por desempenharem um papel crítico no mecanismo epigenético de regulação gênica. O DMSO induziu um efeito distinto nas modificações de histonas ativas H3K4me3 e H3K27ac durante a diferenciação de HepaRG, coincidindo parcialmente com alterações na expressão gênica. Esses resultados são semelhantes aos achados obtidos pelo tratamento com TSA em linhagens de células hepáticas e PHHs, demonstrando uma boa correlação entre a expressão de mRNA e a modificação de histonas. Enquanto as células HepaRG diferenciadas sem DMSO mostraram assinaturas gênicas associadas a HDACs e genes com marcas H3K4me3 em promotores, as células HepaRG diferenciadas na presença de DMSO apresentaram um enriquecimento de genes regulados pela acetilação de histonas. A maioria dos DERs de H3K27ac, características de regiões ativas, mostrou maior enriquecimento em resposta à exposição ao DMSO, enquanto os DERs de H3K4me3 apresentaram predominantemente enriquecimento reduzido. Portanto, a exposição prolongada ao DMSO tem um efeito significativo na acetilação de histonas específicas de promotores e enhancers, acompanhada de uma influência principalmente sobre a H3K4me3 nos promotores. Alguma metilação da arginina 3 da histona H4 foi identificada em promotores alvo de RARA em células HL60 tratadas com DMSO por 16–24 h. Recentemente, a modificação de histonas (metilação e acetilação) foi descrita na região regulatória do PXR em células de hepatoblastoma HepG2 transfectadas estavelmente com 3xFlag-PXR e tratadas por 18 h com DMSO. Essa modificação foi dependente da dose e transitória, uma vez que 72 h após a remoção do DMSO, as células tratadas e ingênuas não apresentaram diferença na indução do gene alvo do PXR. Em nosso modelo HepaRG, observamos que os 15 dias de exposição ao DMSO reprimiram MMP7 com alta correlação com o padrão de modificação de histonas. Também induziu modificações de histonas em vários receptores nucleares envolvidos na regulação de enzimas metabolizadoras de fármacos. A H3K27ac no promotor aumentou para PXR e a H3K4me3 no promotor aumentou para CAR. Em relação ao AHR, observamos um aumento na H3K27ac no promotor e uma diminuição na H3K4me3 no corpo do gene. Em relação aos PPARs, a H3K27ac aumentou no corpo do gene PPARG, enquanto nenhum enriquecimento de modificação de histona foi detectado para PPARD e PPARA, apesar de terem sido induzidos, assim como seus genes alvo, pelo DMSO (Figura 2 e Figura S2).
No geral, nossos resultados mostraram que o DMSO leva ao aumento dos metabolismos de fármacos e lipídios, à regulação da biossíntese de colesterol, bem como à indução dos metabolismos de aminoácidos, vitaminas e cofatores, e de esteroides. No entanto, é interessante notar que não foram observadas alterações significativas para HNF4α e HNF1α, que contribuem para o desenvolvimento hepático e a expressão de vários genes hepáticos, assim como para LXR e FXR, que funcionam como sensores intracelulares de esteróis e ácidos biliares, respectivamente (Figura S2). Suas expressões foram de fato rapidamente induzidas durante o programa de diferenciação das células HepaRG e antes da adição de DMSO. Mais especificamente, a expressão espontânea de HNF4α, que precede a maturação das células HepaRG em diferenciação, resultou de uma mudança na 5-hmC no locus HNF4α que ocorre durante a primeira semana de cultura celular. Assim, esses resultados mostraram a expressão sequencial de receptores nucleares ao longo do programa de diferenciação hepática e destacaram aqueles que desencadeiam a maturação dos hepatócitos.
Além das modificações nos receptores nucleares, também observamos que a expressão de várias enzimas metabolizadoras estava correlacionada com um aumento nas marcas H3K4me3 (CYP2E1, CYP2B6, CYP2C19, CYP4F2) ou marcas H3K27ac (CYP2C9, CYP3A5, UGT2B15, UGT1A6, UGT1A8), enquanto CYP3A4 apresentou ambas as marcas H3K4me3 e H3K27ac. Importante, detectamos que o aumento nas marcas H3K27ac no corpo do gene da citocromo P450 oxirredutase (POR) está associado à sua maior expressão. Isso é particularmente interessante em relação ao papel essencial dessa enzima no funcionamento adequado do CYP. De fato, ao doar elétrons diretamente do NADPH para todas as enzimas P450 microssomais, o POR permite a oxidação de seus substratos. Em relação à organização da MEC, entre os genes regulados negativamente, encontramos OMD, MMP7 e 19, que apresentam uma diminuição em H3K4me3. Interessantemente, OMD está envolvida na organização da matriz extracelular e suprime a formação de fibras de colágeno, enquanto MMP19 e MMP7 hidrolisam componentes da MEC, como colágeno tipo IV, laminina, nidogênio e fibronectina. Portanto, sua regulação negativa após tratamento com DMSO favorece a organização e deposição da matriz, retardando a taxa de destruição da membrana basal e remodelação da MEC.
O efeito do DMSO foi parcialmente reversível, uma vez que apenas parte dos genes reprimidos pela exposição ao DMSO foram regulados positivamente pela remoção do DMSO. Interessantemente, a remoção do DMSO induz novos genes-alvo, principalmente envolvidos na proliferação celular, embora a taxa de proliferação tenha permanecido baixa (7%). Esses dados estão de acordo com estudos anteriores que relatam que o DMSO diminui a proliferação celular e a produção de citocinas em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC). Da mesma forma, pouco menos da metade dos genes induzidos pela exposição ao DMSO foram regulados negativamente pela remoção do DMSO. Esses genes estavam principalmente sob controle de reguladores a montante, como PXR, regulado pela exposição ao DMSO. Os genes com expressão inalterada estavam principalmente sob controle de fatores transcricionais como HNF4α, HNF1α, insensíveis à exposição ao DMSO, e PPARγ, cuja expressão permaneceu estável após a remoção do DMSO.
5. Conclusões
Em conclusão, nossos resultados mostraram que o DMSO favorece a maturação de hepatócitos, parcialmente por meio de modificações pós-traducionais nos terminais N das histonas. Nosso estudo também destacou a expressão sequencial de receptores nucleares, que pontuam o programa de diferenciação de progenitores hepáticos em direção a hepatócitos maduros, e demonstrou a interação entre o citoesqueleto e a remodelação da MEC com a maturação e metabolismo dos hepatócitos, levando, em conjunto, a um aumento em nossa compreensão da diferenciação/maturação de hepatócitos e do uso adequado das células HepaRG em estudos toxicológicos.
Nota do Editor: A MDPI permanece neutra em relação a reivindicações jurisdicionais em mapas publicados e afiliações institucionais.
Materiais Suplementares
As seguintes informações de suporte podem ser baixadas em: , Figura S1: Procedimentos de diferenciação de células HepaRG; Figura S2: Expressão dos principais fatores de transcrição durante o processo de diferenciação de HepaRG; Figura S3: Qualidade dos dados de ChIP-seq; Figura S4: Resultados de modificação de histonas; Figura S5: Impacto da adição e remoção de DMSO na expressão gênica; Figura S6: Efeito da remoção de DMSO nas atividades de enzimas metabolizadoras de fármacos em células HepaRG; Tabela S1: Sequências de primers utilizadas para RT-PCR em tempo real; Tabela S2: Lista de genes significativamente regulados positivamente pela exposição ao DMSO (p < 0,005, FC > 2); Tabela S3: Lista de genes não afetados pela exposição ao DMSO (p < 0,005, FC > 2); Tabela S4: Lista de genes significativamente regulados negativamente pela exposição ao DMSO (p < 0,005, FC > 2); Tabela S5: GSEA usando toda a coleção C2 do MsigDB; Tabela S6: Localização genômica de DERs de H3K4me3 incluindo valores de p ajustados (padj), fold changes (log2FC), genes associados (GName) e características genômicas (Feature); Tabela S7: Localização genômica de DERs de H3K27ac (B) incluindo valores de p ajustados (padj), fold changes (log2FC), genes associados (GName) e características genômicas (Feature); Tabela S8: 100 principais termos de processo biológico da ontologia gênica; Tabela S9: Resultados do Connectivity Map (Cmap); Tabela S10: Lista de genes significativamente regulados positivamente após remoção de DMSO (p < 0,005, FC > 2); Tabela S11: Lista de genes significativamente regulados negativamente após remoção de DMSO (p < 0,005, FC > 2); Tabela S12: Lista de genes não afetados após remoção de DMSO.
Contribuições dos Autores
Conceitualização, A.C., C.A., H.D.-P.-S. e S.I.; metodologia, A.C., C.A., H.D.-P.-S., S.I., J.W., K.K. e V.C.; investigação, H.D.-P.-S., C.A., K.K., K.F., D.G., K.J., G.G., A.S., V.C. e K.T.; recursos, A.C., C.A. e H.D.-P.-S.; curadoria de dados: A.C., H.D.-P.-S. e J.W; redação—rascunho original, A.C., C.A., H.D.-P.-S., K.K., J.W. e S.I.; supervisão, A.C., S.I. e J.W.; aquisição de financiamento, A.C., S.I. e J.W. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Declaração do Conselho de Revisão Institucional
Não aplicável.
Declaração de Consentimento Informado
Não aplicável.
Declaração de Disponibilidade de Dados
Os dados discutidos nesta publicação foram depositados no Gene Expression Omnibus (GEO, RRID:SCR_005012) do NCBI. Os dados transcriptômicos são acessíveis através do número de acesso da série GEO GSE112123 desde 25 de julho de 2022 (). Os dados de ChIP-seq são acessíveis através do número de acesso da série GEO GSE179988 desde 25 de julho de 2022 ().
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Modelos de células hepáticas em toxicologia in vitro
Uso de culturas de hepatócitos humanos para estudos de metabolismo de fármacos
Sistemas de cultura de hepatócitos humanos para a avaliação in vitro da expressão e regulação do citocromo P450
As células HepaRG de hepatoma humano: Um modelo altamente diferenciado para estudos de metabolismo hepático e toxicidade de xenobióticos
Uma Comparação dos Perfis de Expressão Gênica de Todo o Genoma de Células HepaRG e Células HepG2 com Hepatócitos Humanos Primários e Tecidos Hepáticos Humanos
Diferenças interindividuais na suscetibilidade de hepatócitos humanos primários à colestase induzida por fármacos são dependentes do composto e do tempo
Variabilidade interindividual nos perfis de expressão gênica em hepatócitos humanos e comparação com células HepaRG
Diferenciação e caracterização de hepatócitos metabolicamente funcionais a partir de células-tronco embrionárias humanas
Geração de hepatócitos funcionais a partir de células-tronco embrionárias humanas sob condições quimicamente definidas que recapitulam o desenvolvimento hepático
Células semelhantes a hepatócitos derivadas de células-tronco para avaliação de lesão hepática induzida por fármacos
Terapia celular autóloga e heteróloga para hemofilia B visando à restauração funcional do fator IX
O transplante de hepatócitos derivados de hESC protege camundongos contra lesão hepática
A comunicação multilinhagem regula o desenvolvimento do broto hepático humano a partir da pluripotência
Geração de células semelhantes a hepatócitos derivadas de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de toxicidade de fármacos
Um estudo transcriptômico sugerindo que hepatócitos derivados de iPSC humanos potencialmente oferecem um melhor modelo in vitro de hepatotoxicidade do que a maioria das linhagens de hepatoma
Caracterização de hepatócitos humanos primários, células HepG2 e células HepaRG no nível de mRNA e atividade de CYP em resposta a indutores e sua preditividade para a detecção de hepatotoxinas humanas
Avaliação da inibição de CYP3A4 e hepatotoxicidade usando células de hepatoma humano HuH-7 tratadas com DMSO
Expressão de citocromos P450, enzimas conjugadoras e receptores nucleares em células de hepatoma humano HepaRG
Otimização do modelo celular HepaRG para estudos de metabolismo e toxicidade de fármacos
Esteatose hepática induzida por fármacos na ausência de disfunção mitocondrial grave em células HepaRG: Prova de toxicidade baseada em múltiplos mecanismos
O bisfenol A induz esteatose em células HepaRG usando um modelo de exposição perinatal
Avaliação de células HepaRG como modelo in vitro para estudos de metabolismo de fármacos humanos
Um modelo celular para estudar lesão hepática induzida por fármacos na doença hepática gordurosa não alcoólica: Aplicação ao acetaminofeno
Desafios biotecnológicos para a maturação in vitro de células-tronco hepáticas
Hepatócitos derivados de células-tronco e seu uso em toxicologia
De células-tronco pluripotentes a hepatócitos, a jornada até agora
Manutenção do conteúdo total de citocromo P-450 em cultura de hepatócitos de rato e abundância dos mRNAs de CYP1A2 e CYP2B1/2
Manutenção de hepatócitos de rato diferenciados em cultura primária
Persistência de RNA mensageiro específico do fígado em hepatócitos cultivados: Diferentes eventos regulatórios para diferentes genes
Comunicação intercelular mediada por junções comunicantes em um sistema de cultura primária de hepatócitos de camundongo de longo prazo
Dimetilsulfóxido mantém a comunicação intercelular preservando a proteína de junção comunicante connexina32 em dupletos de hepatócitos primários cultivados de ratos
Dimetilsulfóxido aumenta a síntese e secreção de lipídios em culturas de longo prazo de hepatócitos de ratos adultos
Impacto do dimetilsulfóxido na expressão de receptores nucleares e citocromos P450 induzíveis por fármacos em hepatócitos primários de rato
Proteção hepática contra apoptose requer tanto o bloqueio das atividades das caspases iniciadoras quanto a inibição da via ASK1/JNK via regulação da glutationa S-transferase
Caracterização do aumento da atividade do metabolismo de drogas em células de hepatoma Huh7 tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO)
Produção de vírus da hepatite C infeccioso por células derivadas de hepatoma humano bem diferenciadas e com crescimento interrompido
Otimização de modelos de hepatócitos humanos para fenótipo metabólico e função: Efeitos do tratamento com dimetilsulfóxido (DMSO)
O efeito do dimetilsulfóxido na diferenciação hepática de células-tronco mesenquimais
Diferenciação e transplante de hepatócitos derivados de células-tronco embrionárias humanas
Diferenciação direta de células-tronco embrionárias humanas em células semelhantes a hepatócitos exibindo atividades funcionais
Diferenciação e maturação hepática de células-tronco embrionárias humanas cultivadas em um biorreator tridimensional perfundido
Uma ferramenta simples para melhorar a diferenciação de células-tronco pluripotentes
O DMSO regula eficientemente para baixo genes de pluripotência em células-tronco embrionárias humanas durante a derivação do endoderma definitivo e aumenta a proficiência da diferenciação hepática
O DMSO prejudica o programa transcricional para a transição materno-embrionária alterando a acetilação de histonas
O DMSO induz mudanças drásticas nos processos celulares humanos e no panorama epigenético in vitro
Sensibilização epigenética da expressão gênica regulada pelo receptor de pregnano X pelo dimetilsulfóxido
Infecção de uma linhagem celular de hepatoma humano pelo vírus da hepatite B
Transdiferenciação de células semelhantes a hepatócitos a partir da linhagem celular de hepatoma humano HepaRG através de progenitor bipotente
Isolamento de células progenitoras multipotentes do fígado fetal humano capazes de se diferenciar em linhagens hepáticas e mesenquimais
Comparação de HepG2 e HepaRG por análise de expressão gênica de todo o genoma para fins de identificação de perigo químico
A linhagem celular HepaRG é adequada para aplicação em fígado bioartificial
A capacidade de carregamento de ferro de hepatócitos está associada à diferenciação e repressão da motilidade na linhagem celular HepaRG
Ensaio de micronúcleo por citometria de fluxo e análise de biomarcador transcriptômico TGx-DDI de dez produtos químicos genotóxicos e não genotóxicos em células HepaRG™ humanas
Uma adaptação das células HepaRG humanas para o ensaio de micronúcleo in vitro
Análise transcriptômica de células HepaRG diferenciadas não tratadas e tratadas com drogas durante um período de 2 semanas
Software de próxima geração para análise de tendência funcional
Genes responsivos ao PGC-1α envolvidos na fosforilação oxidativa são coordenadamente regulados negativamente no diabetes humano
Análise de enriquecimento de conjuntos gênicos: Uma abordagem baseada em conhecimento para interpretar perfis de expressão de todo o genoma
O Mapa de Conectividade: Usando assinaturas de expressão gênica para conectar pequenas moléculas, genes e doenças
O mapeador GEM: Alinhamento rápido, preciso e versátil por filtração
O formato Sequence Alignment/Map e as ferramentas SAMtools
diffReps: Detectando Sítios de Modificação Diferencial da Cromatina a partir de Dados de ChIP-seq com Réplicas Biológicas. Mantovani, R.; editor
circlize implementa e aprimora a visualização circular em R
GREAT melhora a interpretação funcional de regiões cis-regulatórias
deepTools: Uma plataforma flexível para explorar dados de sequenciamento profundo
Integrative Genomics Viewer (IGV): Visualização e exploração de dados genômicos de alto desempenho
Software para Computação e Anotação de Intervalos Genômicos
Expressão e ativação de cdks (1 e 2) e ciclinas na progressão do ciclo celular durante a regeneração hepática
Uma proteína de membrana plasmática está envolvida na regulação mediada por contato celular de genes tecido-específicos em hepatócitos adultos
Ensaios baseados em fluorescência para triagem de nove atividades do citocromo P450 (P450) em células intactas que expressam enzimas P450 humanas individuais
Novo método sensível de cromatografia líquida de alto desempenho para ensaio da 7-hidroxilação da cumarina
Estrutura primária e expressão de uma nova cadeia alfa 4 de laminina humana
Identificação e significado funcional de genes regulados por inibidores de histona desacetilase estruturalmente diferentes
O inibidor de HDAC vorinostat potencializa o efeito antitumoral do gefitinibe no carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço ao modular a expressão do receptor ErbB e reverter a EMT
Fitoestrógenos regulam a proliferação e a expressão de fatores de células-tronco em linhagens celulares de tumores germinativos testiculares malignos
A inibição da histona desacetilase suprime a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo fator de crescimento transformador beta1 em hepatócitos
Do dimetilsulfóxido ao vorinostate: Desenvolvimento deste inibidor de histona desacetilase como fármaco anticancerígeno
Colchicina—Atualização sobre mecanismos de ação e usos terapêuticos
A colchicina atenua a infiltração de células inflamatórias e o acúmulo de matriz extracelular na nefropatia diabética
A quinase dependente de ciclina 1 desempenha um papel crítico no controle da replicação do DNA durante a regeneração hepática em ratos
Papel do E2F no controle tanto da replicação do DNA quanto das funções mitóticas, conforme revelado pela análise de microarranjos de DNA
Ganhos focais de VEGFA e classificação molecular do carcinoma hepatocelular
A integração das análises de genes-alvo de TP53, DREAM, MMB-FOXM1 e RB-E2F identifica redes regulatórias de genes do ciclo celular
O heterodímero do receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo/receptor alfa de retinóide X tem como alvo o gene da enzima de modificação de histonas PR-Set7/Setd8 e regula a adipogênese através de um ciclo de feedback positivo
Síntese de hemoglobina em células leucêmicas murinas induzidas por vírus in vitro: Estimulação da diferenciação eritroide pelo dimetilsulfóxido
Mudanças moleculares globais induzidas por baixas doses de dimetilsulfóxido têm o potencial de interferir em vários processos celulares
Modulação induzida por DMSO dos níveis de RNA em estado estacionário do c-myc em uma variedade de diferentes linhagens celulares
Utilização multidisciplinar do dimetilsulfóxido: Aspectos farmacológicos, celulares e moleculares
Mecanismo de manutenção de funções específicas do fígado pelo DMSO em hepatócitos de rato cultivados
Elevação pós-traducional dos níveis e atividade do citocromo P450 3A pelo dimetilsulfóxido
O dimetilsulfóxido reduz o acúmulo de lipídios hepatocelulares através da indução de autofagia
A transição epitélio-mesenquimal de hepatócitos neonatais de rato cultivados é regulada diferencialmente em resposta ao fator de crescimento epidérmico e ao dimetilsulfóxido
A via da fosfoinositídeo 3-quinase
A ativação diferencial da via Wnt-β-catenina no câncer de mama triplo negativo aumenta a MMP7 de maneira dependente de PTEN
O celastrol inibe a proliferação e migração de células de câncer colorretal através da supressão de MMP3 e MMP7 pela via de sinalização PI3K/AKT
A fosfoinositídeo 3-quinase regula a glicólise através da mobilização da aldolase do citoesqueleto de actina
Expressão in vitro da metaloproteinase-1 da matriz, inibidor tecidual de metaloproteinase-1 e fator de crescimento transformador beta1 em fibroblastos do ligamento periodontal humano
Efeitos da colchicina em moléculas metabólicas e inflamatórias em adultos com obesidade e síndrome metabólica: Resultados de um ensaio clínico randomizado piloto controlado
Efeitos da colchicina nas funções hepáticas de ratos cirróticos: Efeitos benéficos resultam da inativação de células estreladas e inibição da expressão de TGF beta1
Papel da rede de microtúbulos na expressão de genes CYP
A colchicina regula negativamente o citocromo P450 2B6, 2C8, 2C9 e 3A4 em hepatócitos humanos, afetando sua regulação mediada pelo receptor de glicocorticoide
Fatores fisiopatológicos que afetam a expressão do gene CAR
Agentes que interferem nos microtúbulos restringem a indução de CYP1A2 mediada pelo receptor de hidrocarboneto arílico em culturas primárias de hepatócitos humanos via quinase c-jun-N-terminal e receptor de glicocorticoide
Alterações globais na expressão gênica, incluindo metabolismo e disposição de fármacos, induzidas pela cultura tridimensional de células HepG2 - Envolvimento de microtúbulos
Impacto dos filamentos intermediários de queratina na regulação do metabolismo da glicose mediada pela insulina no fígado e associação com doenças
Ligando a mecanotransdução da E-caderina ao metabolismo celular através da ativação da AMPK mediada por força
A sinalização Integrina-FAK promove rápida e potentemente a função mitocondrial através de STAT3
Evidências para a implicação do código de histonas na construção da estrutura do genoma
H3K27me3 não orquestra a expressão de marcadores específicos de linhagem em hepatócitos derivados de hESC in vitro
Identificação de genes regulados positivamente pela inibição da histona desacetilase com microarray de cDNA e exploração de alterações epigenéticas em células de hepatoma
Localização genômica da metilação da arginina 3 da histona 4 em uma linhagem celular de leucemia mieloide primed para diferenciação
A 5-hidroximetilação catalisada por TET precede a escolha do promotor de HNF4A durante a diferenciação de progenitores hepáticos bipotentes
A osteomodulina regula o diâmetro e altera a forma dos fibrilas de colágeno
Assinatura de expressão gênica hepática de fibrose leve em pacientes com hepatite C crônica
Metaloproteinases de matriz no desenvolvimento hepático humano precoce

Dimetilsulfóxido (DMSO) diminui a proliferação celular e a produção das citocinas TNF-α, IFN-γ e IL-2 em culturas de linfócitos do sangue periférico

Perfil global de expressão gênica durante a diferenciação de células HepaRG. Dados globais de expressão gênica foram obtidos de células HepaRG ao final de cada condição de cultura (D4, D15, D30 − DMSO, D30 + DMSO e D34 ± DMSO). Cada condição de cultura foi realizada quatro vezes. Os dados globais de expressão gênica foram filtrados e os 775 genes significativamente desregulados (p < 0,001, FC > 3) foram agrupados hierarquicamente com o Gene Cluster 3.0. Agrupamentos e dendrogramas de experimentos e genes foram visualizados pelo Treeview. Verde indica menor expressão e vermelho indica maior expressão. As funções biológicas representativas de cada agrupamento foram avaliadas utilizando o programa FuncAssociate 2.0 com um ponto de corte de significância de 0,005.

Efeitos do DMSO na diferenciação de células HepaRG. Os genes foram agrupados com base nos efeitos da adição de DMSO durante a parte final do procedimento de diferenciação de células HepaRG. (a) Mapa de calor dos 3 grupos de genes: superexpressos, não afetados e subexpressos pela exposição ao DMSO. Verde indica menor expressão e vermelho indica maior expressão. (b) As principais categorias funcionais e reguladores transcricionais a montante associados a cada grupo de genes destacados pelo IPA foram resumidos na tabela. O coeficiente de correlação (entre dados de microarray e RT-PCR em tempo real) foi calculado para cada gene mencionado. (c) Genes cujas expressões foram superexpressas (painel esquerdo), não afetadas (painel central) e subexpressas (painel direito) foram selecionados com base nos dados de microarray. A expressão de cada gene selecionado foi confirmada por RT-PCR em tempo real (n = 3). Os resultados são expressos em relação à condição D4, definida arbitrariamente como 1. ** p < 0,01; **** p < 0,001; ns: não significativo.

Efeitos do DMSO na remodelação da matriz e na organização celular. (a) A deposição de MEC foi detectada por coloração de reticulina em células HepaRG diferenciadas a partir de D15 de cultura na presença (D30+ DMSO) ou na ausência de DMSO (D30 − DMSO). (b) Os dados de microarray para TIMP1, TIMP2, MMP7, MMP19 e MMP24 são expressos em relação às condições D30 − DMSO, definidas arbitrariamente como 1. A significância do tratamento com DMSO (D30 + DMSO vs D30 − DMSO) foi avaliada por um teste t não pareado * p < 0,05, ns: não significativo. (c) Imunomarcação de fibronectina, laminina, colágeno tipo I, III e IV em células HepaRG diferenciadas na presença de DMSO (D30+ DMSO). A imunolocalização sem anticorpo primário foi realizada como controle. (d) Imunolocalização de F-actina em células HepaRG diferenciadas a partir de D15 de cultura na presença (D30+ DMSO, painel esquerdo) ou na ausência de DMSO (D30 − DMSO, painel direito). Os núcleos foram visualizados por coloração com Hoechst (mostrados em azul). Barras de escala = 7 µm.
Efeito do DMSO nos padrões de modificação de histonas em todo o genoma durante a diferenciação de HepaRG. (a) Distribuição em todo o genoma de DEGs (1, p < 0,005, FC > 2), regiões diferencialmente enriquecidas (DERs) de H3K4me3 (2) e DERs de H3K27ac (3) após exposição ao DMSO (padj < 0,001, FC > 2). Aumento na expressão ou enriquecimento é colorido em vermelho, diminuição em verde. As DERs são plotadas como alterações log2 de dobra variando de −3 a 3. (b) Cobertura média de H3K4me1, H3K4me3 e H3K27ac em células HepaRG diferenciadas com e sem DMSO (não tratadas) em uma janela de 2 kb ao redor do TSS de genes com expressão aumentada (vermelho), diminuída (verde) ou inalterada (preto) pelo cultivo com DMSO. (c) Padrões exemplares de modificação de histonas em genes não afetados (APOE), regulados positivamente pelo DMSO (CYP2C9, CYP3A4) e regulados negativamente pelo DMSO (OMD, MMP7). A cobertura de H3K4me1 é exibida em cinza, H3K4me3 em laranja e H3K27ac em azul. As faixas de cobertura foram normalizadas para sua profundidade de sequenciamento.

Comparação dos efeitos do DMSO com os efeitos de LY294002 e colchicina. No dia 15 da diferenciação, células HepaRG foram tratadas por 24 h com 2% de DMSO como controle positivo ou com 10 µM de LY294002, ou 2% de DMSO + 10 µM de colchicina ou mantidas em meio clássico sem DMSO (controle negativo). (a) O efeito do tratamento com LY294002 nas expressões de CYP3A4 e MMP7 foi confirmado por RT-PCR em tempo real. (n = 4). (b) O efeito do tratamento com colchicina nas expressões de CYP3A4 e PAPPA foi confirmado por RT-PCR em tempo real. (n = 4). Os resultados são expressos como relativos à condição HepaRG D15 (24 h), arbitrariamente definidos como 1. * p < 0,05, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. ns: não significativo. (c) Os efeitos do DMSO, Ly294002 e colchicina no nível proteico de CYP3A4 foram analisados por Western blot após 24 h e 48 h de tratamento.

Efeitos da remoção do DMSO da cultura de células HepaRG diferenciadas nas expressões gênicas. O DMSO foi removido do meio de cultura de células HepaRG após a conclusão da diferenciação hepatocitária em D30 + DMSO. Os genes foram agrupados com base nos efeitos da remoção do DMSO. (a) Mapa de calor dos 3 grupos de genes: regulados negativamente, regulados positivamente e não afetados pela remoção do DMSO. Verde indica menor expressão e vermelho indica maior expressão. (b) As principais categorias funcionais e reguladores transcricionais a montante associados a cada grupo de genes, destacados pelo IPA, foram resumidos na tabela. (c) Genes cujas expressões foram reguladas negativamente (painel superior), reguladas positivamente (painel intermediário) e não afetadas (painel inferior) após a remoção do DMSO foram selecionados com base nos dados de microarranjo. A expressão de cada gene selecionado foi confirmada por RT-PCR em tempo real. (n = 3). Os resultados são expressos como relativos à condição D30 + DMSO, arbitrariamente definidos como 1. * p < 0,05, ** p < 0,01.
Entrada transitória no ciclo celular e modulação das funções metabólicas de células HepaRG diferenciadas após remoção de DMSO. (a) Os efeitos da remoção de DMSO no nível proteico de genes regulados pelo ciclo celular (CDK1, MCM7 e CyclinA) foram analisados por Western blot (n = 3). HSC70 foi medida como controle interno. (b) A indução transitória da proliferação de células HepaRG após remoção de DMSO foi analisada medindo-se a incorporação de BrdU (n = 3). Imunolocalização de células HepaRG com anticorpo anti-BrdU. Células positivas para BrdU foram mostradas em verde, e os núcleos em azul (Hoechst). Barras de escala = 50 µm. A quantificação da incorporação de BrdU foi realizada pelo Cell Health Profiling BioApplication do software Cellomics. * p < 0,05. (c) Análise de GSEA usando os perfis de expressão gênica de HepaRG em D30 + DMSO e HepaRG em D34 ± DMSO. Repartição funcional das 20 principais assinaturas significativas enriquecidas após remoção de DMSO. O GSEA revelou um enriquecimento da assinatura “Chiang_liver_cancer_subclass_proliferation_up” e da assinatura “Stein_ESR1_targets”. (d) O nível proteico de genes do metabolismo de fármacos (CYP3A4, CYP2E1 e ALDOB) foi analisado por Western blot para confirmar as alterações na expressão gênica após remoção de DMSO do meio de cultura (n = 3). HSC70 foi medida como controle interno. (e) Efeito da remoção de DMSO nas atividades de enzimas metabolizadoras de fármacos em células HepaRG. As células HepaRG foram incubadas por 2 h com 200 µM de cumarina para medir a atividade de CYP2A13. A 7-hidroxilação da cumarina foi estimada por HPLC (n = 3). * p < 0,05. (f) Análise de GSEA usando os perfis de expressão gênica de HepaRG em D30 + DMSO e HepaRG em D34 ± DMSO. Repartição funcional das 20 principais assinaturas significativas perdidas após remoção de DMSO. O GSEA revelou um enriquecimento da assinatura “Metabolism_of_xenobiotics_by_cytochromes_P450” e da assinatura “Wakabayashi_adipogenesis_PPARG_RXRA_bound_with_H4K20me1_mark”.