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pmid: "40824954"
title: "O DMSO induz alterações morfológicas e fisiológicas importantes em embriões de zebrafish."
authors: "Gomes G, Andrade ACS, Vieira PC, Spineli MN, Costa ML, Mermelstein C"
journal: "PloS one"
pubdate: "2025"
doi: "10.1371/journal.pone.0330348"
source: "PMC Full Text"

O DMSO induz alterações morfológicas e fisiológicas importantes em embriões de zebrafish.

Autores

Gomes G, Andrade ACS, Vieira PC, Spineli MN, Costa ML, Mermelstein C

Periodico

PloS one (2025)

Conteudo

DMSO induz alterações morfológicas e fisiológicas importantes em embriões de zebrafish

O dimetilsulfóxido (DMSO) é um solvente aprótico polar que dissolve tanto compostos polares quanto apolares e é miscível em uma ampla gama de solventes orgânicos, bem como em água. Essas características tornam o DMSO um dos solventes mais utilizados na indústria farmacêutica, bem como na pesquisa biomédica básica, como em estudos de biologia do desenvolvimento. A análise dos efeitos do DMSO durante o desenvolvimento de larvas de zebrafish é particularmente importante, uma vez que o zebrafish é um dos modelos vertebrados mais estudados em biologia do desenvolvimento e em toxicologia. Foi relatado que concentrações de DMSO de até 1% são seguras para uso em ensaios de toxicidade do desenvolvimento de embriões de zebrafish, mas questões fundamentais, como se e como diferentes concentrações de DMSO afetam a morfologia e a fisiologia do zebrafish, não foram investigadas. Portanto, nosso estudo focou na análise do tratamento com DMSO durante o desenvolvimento do zebrafish usando microscopia óptica de alta resolução e videomicroscopia em tempo real do embrião inteiro, bem como com foco em alguns órgãos e tecidos. Nossos resultados mostram que concentrações acima de 5% de DMSO são letais para os embriões, enquanto concentrações entre 1–4% induzem diferentes alterações morfológicas e fisiológicas nos embriões. As alterações observadas incluem cauda curvada para cima, frequência de batimentos cardíacos, edema cardíaco, tamanho dos somitos, alinhamento das miofibrilas, tamanho dos melanócitos, morfologia da notocorda e da bexiga natatória. Esses resultados mostram, pela primeira vez, uma análise detalhada dos principais efeitos do solvente amplamente utilizado DMSO durante o desenvolvimento do zebrafish e chamam a atenção para o uso de DMSO em pesquisa básica e aplicada.

Introdução

O zebrafish (Danio rerio) é um modelo vertebrado poderoso e bem estabelecido para estudos de biologia do desenvolvimento. As vantagens desse modelo incluem alta fecundidade (centenas de embriões em uma única desova), fertilização externa, desenvolvimento rápido, transparência do embrião em desenvolvimento permitindo imageamento ao vivo nos níveis celular, tecidual e do organismo, fácil manipulação genética e experimental, genoma totalmente sequenciado, presença da maioria dos principais sistemas de órgãos dos vertebrados e características metabólicas semelhantes às humanas. Essas características e vantagens aumentaram fortemente o uso do zebrafish não apenas em estudos de biologia do desenvolvimento, mas também em outras áreas, como farmacologia e toxicologia. Um problema que surgiu com esse uso intenso de D. rerio foi o aumento concomitante no uso de dimetilsulfóxido (DMSO), um solvente comumente utilizado para dissolver compostos que não são miscíveis em água.
O DMSO é amplamente utilizado como controle ou como parte do componente do meio. Vários estudos relatam os efeitos do DMSO em zebrafish. Christou et al. mostraram que o DMSO afeta o comportamento larval do zebrafish em uma concentração ≥0,55%, com efeitos aditivos e de interação quando combinado com dois controles positivos para locomoção larval, flutamida e ácido perfluorooctanossulfônico (PFOS). Kyeongnam e Sung-Eun relataram que o DMSO não apresentou toxicidade aguda em embriões de zebrafish nas concentrações de 0,1%, enquanto foi encontrada toxicidade aguda sinérgica no tratamento simultâneo de DMSO e vanádio. A toxicidade combinada que observaram atrasou o desenvolvimento dos embriões de zebrafish e causou edema pericárdico. Confirmando esses resultados anteriores, Hoyberghs e colegas relataram que o DMSO em concentrações de até 1% é seguro para uso em ensaios de toxicidade do desenvolvimento de embriões de zebrafish. Hedge et al. relataram que o DMSO alterou a atividade locomotora e o comportamento do zebrafish após exposição durante o desenvolvimento em concentrações tão baixas quanto 0,5%. O conjunto desses resultados mostra que o DMSO pode induzir diferentes níveis de alterações morfológicas e comportamentais na larva de zebrafish dependendo de sua concentração, da duração do tratamento, de sua combinação com outros fármacos, dos tecidos/órgãos analisados e dos métodos/técnicas utilizados para analisar seus efeitos, entre outros parâmetros.
O mecanismo molecular de ação do DMSO foi dissecado por Gurtovenko e Anwar, que mostraram sua interação com membranas fosfolipídicas por três modos distintos de ação, cada um em uma faixa de concentração diferente. Em baixas concentrações, o DMSO induz o afinamento da membrana e aumenta a fluidez do núcleo hidrofóbico da membrana. Em concentrações mais altas, o DMSO induz poros de água transitórios na membrana. Em concentrações ainda mais altas, moléculas lipídicas individuais são dessorvidas da membrana, seguidas pela desintegração da estrutura da bicamada. Além disso, Tunçer e colegas mostraram que baixas doses de DMSO (0,1–1,5%) podem levar à estabilização do Z-DNA (uma forma alternativa de DNA), o que poderia estar relacionado a alterações na expressão gênica, diferenciação e epigenética.

Dessa forma, questões sobre se, em que extensão e como diferentes concentrações de DMSO afetam a morfologia e fisiologia do zebrafish não foram suficientemente investigadas. Aqui, focamos na análise do tratamento com DMSO durante o desenvolvimento do zebrafish usando microscopia óptica de alta resolução e videomicroscopia em tempo real do embrião inteiro, além de focar em alguns órgãos e tecidos. Nossos resultados mostram que o DMSO induz grandes mudanças na morfologia, fisiologia e locomoção do zebrafish. Destacamos o fato de que deve-se ter cuidado ao usar DMSO em estudos com zebrafish.

Materiais e métodos
Manutenção e tratamento do zebrafish
Peixes adultos da linhagem selvagem de Danio rerio foram mantidos em água de sistema a 28 ± 1°C, em ciclo claro/escuro de 14:10, em uma instalação animal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil, de acordo com procedimentos padrão. Os animais foram manuseados conforme os protocolos do Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal sob o número 036/21. Embriões e larvas foram coletados, descorionados e o tratamento iniciou-se às 24 horas pós-fertilização (hpf) com concentrações crescentes de Dimetilsulfóxido (DMSO 1, 2, 3, 4 e 5%, v/v, da Sigma-Aldrich, código D8418, pureza 99,9%) até 72 hpf. O DMSO foi diluído em solução E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2 e 0,33 mM MgSO4 em água destilada, pH 7,2, preparada em nosso laboratório) antes de cada experimento. Placas de seis poços foram utilizadas para os experimentos. Para experimentos com 72 hpf, 10 embriões foram distribuídos por poço contendo 2 mL de solução. Foram realizadas dez réplicas técnicas (embriões com o mesmo tratamento dentro da mesma placa) e três réplicas biológicas (embriões com o mesmo tratamento, mas realizados em dias e acasalamentos diferentes) (n = 30). Quatro réplicas biológicas foram utilizadas para experimentos com 7 dpf. Embriões e larvas de zebrafish mantidos em solução E3 sem DMSO foram considerados controle negativo.

Microscopia de campo claro, imageamento e quantificação
Embriões vivos foram visualizados em um microscópio invertido Zeiss Axiovert 100 (Carl Zeiss, Alemanha). As imagens foram adquiridas com uma câmera de alta resolução Olympus DP71 (Olympus, Japão). As imagens foram analisadas e processadas com o software ImageJ, baseado no programa NIH Image de domínio público (desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA e disponível na Internet em http://rsb.info.nih.gov/nih-image/). As placas foram preparadas usando Adobe Photoshop (Adobe Systems Incorporated, EUA). As seguintes características morfológicas de embriões controle e tratados com DMSO foram quantificadas: comprimento caudal do embrião, espessura do embrião, área do pericárdio, área do vitelo, razão comprimento vitelo-caudal, índice de curvatura (IC) e tamanho do somito (medido no meio do somito). O IC foi calculado como a razão entre o diâmetro de Feret e o comprimento da cauda (uma linha reta tem IC de 1). Todos os dados quantitativos brutos para cada parâmetro medido podem ser encontrados na Tabela S1.

Microscopia de imunofluorescência
Análise de embriões de zebrafish por microscopia de fluorescência foi realizada de acordo com procedimentos previamente descritos. Embriões de zebrafish descorionados (controle e tratados com DMSO) foram fixados em paraformaldeído a 4% em PBS por 1 hora à temperatura ambiente. Eles foram permeabilizados com Triton X-100 a 0,5% em PBS (PBS-T) por 30 minutos e incubados por 1 hora a 37°C com anticorpo monoclonal primário anti-vinculina (código # V4505, Sigma-Aldrich, diluído 1:200 em PBS/T). Após lavagem de 30 minutos com PBS-T, os embriões foram corados com anticorpo secundário Alexa Fluor 488 anti-camundongo (ThermoFisher, diluído 1:200). Os embriões foram lavados por 30 minutos com PBS e incubados com Alexa Fluor 647-Faloidina (diluído 1:200 em PBS) por 1 hora a 37°C. Em seguida, os embriões foram lavados por 30 min com PBS e incubados com 0,1 μg/mL de DAPI (Thermofisher, diluído 1:2000 em NaCl) para coloração nuclear. Os embriões foram lavados por 5 minutos com NaCl e montados em lamínulas de vidro de 24 × 60 mm (com espaçadores) usando Prolong Gold (Thermofisher). Os embriões foram observados em um microscópio confocal DSU Spinning Disk (Olympus, Japão). Experimentos de controle apenas com anticorpos secundários mostraram apenas uma coloração de fundo fraca (dados não mostrados). O processamento de imagens (ajustes de brilho, contraste e quantificação do tamanho dos somitos) foi realizado usando o software Fiji e os painéis de figuras foram montados com o software Adobe Photoshop (Adobe Systems Inc., EUA).

Análise funcional
Os batimentos cardíacos de embriões de 72 hpf foram registrados em embriões controle e tratados com DMSO, conforme descrito anteriormente. Para analisar os batimentos cardíacos para cada condição experimental, os embriões de zebrafish foram observados em um microscópio invertido Zeiss Axiovert 100 (Carl Zeiss, Alemanha) e os corações foram registrados com uma câmera de alta resolução Olympus DP71 (Olympus, Japão). Os vídeos foram analisados e processados com o software ImageJ.

Larvas com 7 dpf foram colocadas em placas de cultura de 35 mm preenchidas com 2 mL de solução E3. Os movimentos das larvas (10 larvas por placa) foram registrados com um telefone celular (4k, 30fps, zoom óptico de 3x) por 10 minutos. Os filmes foram analisados pelo programa de domínio público ImageJ e a área de natação das larvas foi quantificada. Subtraímos o fundo de cada quadro (o fundo de todas as imagens do filme foi gerado por uma projeção Z média) e usamos uma projeção Z dos valores mínimos para gerar a imagem final com todas as posições. As áreas escuras nas projeções finais representam todas as posições que os embriões ocuparam no filme e foram quantificadas por limiarização com o mesmo valor para todas as condições.

Análise estatística
A análise estatística foi realizada usando o software GraphPad Prism versão 9. Os resultados de pelo menos três experimentos independentes foram comparados. A análise estatística dos dados relacionados à quantificação de células foi realizada com ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Resultados
DMSO é um solvente universal para compostos que não são miscíveis em água. Uma análise do número de artigos publicados no banco de dados Europe PMC (https://europepmc.org/) usando o descritor “DMSO” resultou em 484.992 artigos publicados (dados da pesquisa em 01 de junho de 2025) em um período que abrangeu os anos de 1963 a 2025. A partir de 2007, houve um aumento exponencial ao longo do tempo no número de publicações com DMSO. Notavelmente, em apenas um ano (2022) foram publicados mais de 45.000 artigos com o descritor DMSO, confirmando que o DMSO tem sido amplamente utilizado durante os últimos 60 anos. A análise do conteúdo desses artigos mostrou que o DMSO é utilizado em pesquisa biomédica básica, criopreservação, indústria farmacêutica, bem como em estudos de biologia do desenvolvimento. Uma busca por artigos no Europe PMC usando tanto “DMSO” quanto “biologia do desenvolvimento” resultou em 15.863 (dados da pesquisa em 01 de junho de 2025) em um período que abrangeu os anos de 1971 a 2025.

O uso indiscriminado de DMSO em pesquisas de biologia do desenvolvimento nos levou a questionar se esse solvente poderia ter efeitos indesejados em zebrafish (Danio rerio) nos níveis celular, tecidual e do organismo como um todo. Testamos concentrações variando de 1 a 5% de DMSO, além do controle sem DMSO. Primeiro, analisamos a taxa de sobrevivência dos embriões após 24 e 48 h de tratamento com 1–5% de DMSO (Fig 1A-C). As taxas de sobrevivência foram semelhantes às dos embriões controle (não tratados), exceto para 5% de DMSO, quando nenhum embrião sobreviveu após 48 h de tratamento (Fig 1C). A análise da morfologia geral dos embriões tratados sob microscopia óptica de campo claro mostrou que o DMSO induziu um fenótipo de curvatura para cima dependente da dose em embriões tratados com 3–5% de DMSO por 24 h (Fig 1A). Embriões tratados com DMSO por 48 h apresentaram fenótipo de curvatura para cima com 2–5% de DMSO (Fig 1B). É importante destacar que todos os embriões morreram após 48 h de tratamento com 5% de DMSO, e 98% desses embriões mortos apresentavam curvatura para cima. Esses resultados mostram que os efeitos do DMSO em embriões de zebrafish são dependentes da concentração e do tempo/duração do tratamento. Quantificamos a porcentagem de embriões não tratados e tratados com DMSO que apresentam fenótipo de curvatura para cima e descobrimos que 6,6% dos embriões estavam curvados em 1% de DMSO, 16,6% em 2% de DMSO, 36,6% em 3% de DMSO, 66,6% em 4% de DMSO e 96,6% em 5% de DMSO após 24 h de tratamento, enquanto 66,6% dos embriões estavam curvados em 2% de DMSO, 73,3% em 3% de DMSO, 93,4% em 4% de DMSO e 96,6% em 5% de DMSO após 48 h de tratamento (Fig 1C).

Taxa de sobrevivência de embriões de zebrafish após tratamento com DMSO.
Embriões de zebrafish com 48 h foram tratados com DMSO em concentrações variando de 1 a 5% e a taxa de sobrevivência foi quantificada após 24 h e 48 h de tratamento. Observe que quase todos os embriões morrem após 48 h de tratamento com 5% de DMSO. Barras de escala = 500 μm. Número de embriões analisados por grupo experimental = 30.
Análise de embriões tratados com DMSO mostrou alterações morfológicas, além da cauda curvada para cima, em várias estruturas e órgãos, incluindo coração, somitos, notocorda e bexiga natatória. Decidimos então investigar e quantificar mais essas alterações morfológicas. Todos os embriões tratados com DMSO a 5% morrem após 48 h (Fig 1C). O comprimento dos embriões diminuiu após o tratamento com 2–4% de DMSO, enquanto a espessura dos embriões diminuiu após o tratamento com DMSO a 4% (Fig 2A-B). A análise do coração de embriões de zebrafish mostrou diminuição na área pericárdica após tratamento com DMSO a 3% e 4% (Fig 2C) e edema cardíaco em 7% dos embriões tratados com DMSO a 2%, 17% com DMSO a 3% e 19% com DMSO a 4% após 48 h de tratamento. Não apenas a morfologia do coração foi alterada, mas a frequência cardíaca diminuiu em embriões tratados com DMSO a 3 e 4% (Fig 3A-F, Arquivo S1). A área do vitelo e a razão entre o comprimento do vitelo e da cauda aumentaram após DMSO a 3 e 4% (Fig 2D-E). Medições do índice de curvatura dos embriões mostraram diminuição após tratamento com DMSO a 3 e 4% (Fig 2F).

O DMSO altera a morfologia de embriões de zebrafish.
Embriões de zebrafish com 48 ou 72 hpf foram tratados com DMSO em concentrações variando de 1 a 5%. Imagens de campo claro foram adquiridas após 24 h de tratamento e a quantificação de vários parâmetros morfológicos foi realizada. Barra de escala = 1 mm. Número de embriões analisados por grupo experimental = 30.

O DMSO induz edema cardíaco em zebrafish.
Embriões de zebrafish com 48 hpf foram tratados com DMSO em concentrações variando de 1 a 5%, e edema cardíaco e frequência cardíaca foram quantificados. Barras de escala = 1 mm e 100 μm. Número de embriões analisados por grupo experimental = 30.

A morfologia da notocorda também foi alterada em embriões tratados com 2–5% de DMSO (Fig 4). Em embriões de zebrafish normais, a notocorda apresenta um arranjo colunar de células dentro da bainha da notocorda, que é uma camada externa semelhante a epitélio. O tratamento com DMSO alterou a estrutura colunar da notocorda de maneira dose-dependente (Fig 4). Curiosamente, nas imagens da Fig 4 é possível observar que o DMSO induz uma diminuição dose-dependente nos melanócitos. Embriões tratados com DMSO a 5% apresentaram melanócitos menores, em comparação com embriões não tratados (Fig 4).

O DMSO induziu alterações na notocorda de zebrafish.
Embriões de zebrafish com 48 h foram tratados com DMSO em concentrações variando de 1 a 5%, e imagens de campo claro foram adquiridas após 24 h de tratamento. As setas pretas apontam para alterações na morfologia da notocorda de zebrafish tratados com DMSO. Barra de escala = 50 μm. Número de embriões analisados por grupo experimental = 30.

O DMSO altera os somitos musculares.
Embriões de zebrafish foram observados sob microscopia de luz polarizada e fluorescente. Os embriões foram marcados para F-actina com Faloidina (vermelho), para vinculina (verde) e com DAPI (azul). O tamanho e a forma dos somitos foram alterados após o tratamento com DMSO, o que pode ser observado pelas imagens birrefringentes dos músculos esqueléticos dos embriões (imagens superiores centrais na coluna do meio). Barra de escala = 1 mm. Número de embriões analisados por grupo experimental = 30.

Curiosamente, a análise de embriões de zebrafish sob microscopia de luz polarizada mostrou que o tamanho e a forma dos somitos também foram alterados após o tratamento com DMSO, o que pode ser observado pelas imagens birrefringentes dos músculos esqueléticos dos embriões (imagens superiores na coluna do meio da Fig 5). Para explorar mais os efeitos do DMSO nos somitos musculares, marcamos embriões de zebrafish com a sonda específica para F-actina, Faloidina (para corar miofibrilas estriadas) e DAPI (para corar os núcleos). Uma observação mais detalhada mostrou que as miofibrilas estriadas estavam desalinhadas após a exposição ao DMSO e a actina estava anormalmente concentrada próximo aos septos (Fig 6). Os embriões apresentaram uma diminuição significativa e dependente da dose no tamanho dos somitos com o tratamento com DMSO (Fig 7). Os somitos em embriões controle não tratados mediram 81,1 μm (± 1,8 EPM) e em embriões tratados com DMSO, os somitos mediram entre 60,5–78,9 μm de espessura (Fig 7D).

O tratamento com DMSO interfere no alinhamento das miofibrilas.
Análise confocal de larvas de zebrafish com 48 hpf coradas com a sonda específica para F-actina, Faloidina (vermelho) e DAPI (azul). Em embriões controle, podem ser observadas miofibrilas estriadas alinhadas, enquanto miofibrilas desalinhadas são vistas em embriões tratados com DMSO 4%. Barra de escala = 50 μm. Número de embriões analisados por grupo experimental = 30.

O DMSO induz uma redução no tamanho dos somitos.
Embriões de zebrafish (A) foram analisados sob microscopia de Contraste de Interferência Diferencial (DIC) em um microscópio Confocal de Disco e os somitos (B) foram medidos em sua linha média (C). A espessura dos somitos diminui significativamente após o tratamento com DMSO 2%, 3% e 4% (D). ns = não significativo. Número de embriões analisados por grupo experimental = 30.
Também analisamos os efeitos do DMSO no movimento de larvas de zebrafish. Larvas controle e tratadas com DMSO com 7 dpf foram colocadas no centro de uma placa de cultura de 35 mm e seus movimentos foram registrados. Embriões tratados com 1% e 2% de DMSO mostraram uma diminuição significativa dependente da dose na motilidade (Arquivo S2). Embriões não sobreviveram após 7 dias em doses superiores a 2% de DMSO. Em seguida, testamos se concentrações abaixo de 1% de DMSO poderiam levar a alterações no movimento de larvas de zebrafish. Larvas foram tratadas com 0,1%, 0,3%, 0,5%, 1% e 2% de DMSO e seus movimentos foram registrados por 10 minutos. A área total de natação das larvas foi quantificada, e nenhuma alteração significativa foi encontrada (Arquivo S3), embora uma tendência dependente da dose de diminuição na locomoção tenha sido observada. Não podemos descartar a possibilidade de que o DMSO em concentrações abaixo de 1% possa alterar a morfologia das larvas de zebrafish. Estudos adicionais são necessários para elucidar essa possibilidade.

Em seguida, decidimos comparar os efeitos do tratamento com DMSO de curto prazo (24 e 48 horas) versus tratamento com DMSO de longo prazo (6 dias) em embriões de zebrafish. Notavelmente, todos os embriões morreram após 6 dias de tratamento com doses mais altas de DMSO (mais de 3% de DMSO). Nenhum fenótipo curvado para cima foi observado em embriões tratados com doses mais baixas (menos de 2%) de DMSO por 6 dias (Fig 8), mas essas baixas concentrações de DMSO induziram alterações significativas dependentes da dose nos embriões, como um aumento na espessura do corpo e diminuição no tamanho da bexiga natatória (Fig 9). Nenhuma alteração aparente foi observada na morfologia dos somitos após tratamento com DMSO de longo prazo (Fig 10).

O tratamento com DMSO de longo prazo não induz um fenótipo curvado para cima.
Embriões de zebrafish foram tratados com DMSO por 6 dias e nenhuma alteração na curvatura do corpo foi observada sob microscopia de campo claro. Barra de escala = 1 mm. Número de embriões analisados por grupo experimental = 40.

O tratamento com DMSO de longo prazo induz alterações na bexiga natatória dos peixes.
Embriões de zebrafish foram tratados com DMSO por 6 dias e o comprimento da cauda, a espessura do corpo e o tamanho da bexiga natatória dos embriões foram medidos (A-C). A espessura dos embriões aumentou enquanto o tamanho da bexiga natatória diminuiu após o tratamento de longo prazo. Imagens em D mostram as alterações induzidas pelo tratamento com DMSO de longo prazo na bexiga natatória. Barras de escala = 1 mm em C e 0,5 mm em D. Número de embriões analisados por grupo experimental = 40.

O tratamento com DMSO de longo prazo não altera os somitos de zebrafish.
Embriões de zebrafish foram tratados com DMSO por 6 dias e observados sob microscopia de luz polarizada e fluorescente. Embriões foram marcados para F-actina com Faloidina (vermelho), para vinculina (verde) e com DAPI (azul). O tamanho e a forma dos somitos não foram alterados após o tratamento com DMSO, o que pode ser observado pelas imagens birrefringentes dos músculos esqueléticos dos embriões. Barra de escala = 1 mm. Número de embriões analisados por grupo experimental = 40.
A coleta dos resultados descritos acima mostra que o DMSO pode alterar significativamente, de maneira dose-dependente, a morfologia e fisiologia de embriões de zebrafish, incluindo alterações no tamanho e curvatura do embrião, frequência de batimento cardíaco, tamanho dos somitos e alinhamento das miofibrilas, tamanho dos melanócitos e morfologia do coração, notocorda e bexiga natatória (Tabela 1).
Efeitos do DMSO na morfologia e fisiologia dos embriões de zebrafish. O DMSO pode alterar significativamente, de maneira dose-dependente, a morfologia e fisiologia dos embriões de zebrafish, incluindo alterações no tamanho e curvatura do embrião, frequência de batimento cardíaco, área do pericárdio, tamanho dos somitos e alinhamento das miofibrilas, tamanho dos melanócitos e morfologia da notocorda e bexiga natatória. () apenas a área da bexiga natatória foi quantificada em larvas de zebrafish de 7 dpf tratadas com 2% de DMSO, enquanto todas as outras medidas foram quantificadas em embriões de zebrafish de 72 hpf tratados com 4% de DMSO. CI = índice de curvatura.
Fenótipo de embriões de zebrafish tratados com DMSO % de alterações (controle vs. 4% DMSO 72 hpf embriões) valores (média ± EPM) linearidade do corpo (CI) diminuição de 22% 0,99 ± 0,001 – normal 0,78 ± 0,030 – cauda curvada para cima (p < 0,0001) comprimento caudal (mm) diminuição de 0,7% 2,69 ± 0,023 – controle 2,40 ± 0,025 – 4% DMSO (p < 0,0001) espessura do corpo (mm) diminuição de 22% 0,37 ± 0,004 – controle 0,28 ± 0,005 – 4% DMSO (p < 0,0001) relação comprimento vitelo-caudal aumento de 37% 0,08 ± 0,001 controle 0,11 ± 0,002 – 4% DMSO (p < 0,0001) área do pericárdio (mm²) diminuição de 43% 0,03 ± 0,001 – controle 0,02 ± 0,002 – 4% DMSO (p < 0,0001) batimento cardíaco (por min) diminuição de 70% 159,20 ± 9,282 controle 48,98 ± 8,737 – 4% DMSO (p < 0,0001) células da notocorda intumescidas qualitativo (não medido) melanócitos menores qualitativo (não medido) miofibrilas musculares desalinhadas qualitativo (não medido) tamanho dos somitos (μm) diminuição de 19% 81,15 ± 1,761 – controle 65,54 ± 1,437 – 4% DMSO (p < 0,0001) área da bexiga natatória (mm²) diminuição de 48% () 0,04 ± 0,002 – controle 0,02 ± 0,001 – 2% DMSO (*) (p < 0,0001)
Discussão
Aqui analisamos os efeitos do DMSO durante o desenvolvimento do zebrafish. Nossos resultados mostram que concentrações acima de 5% de DMSO são letais para os embriões, enquanto concentrações mais baixas (1–4% de DMSO) induzem alterações morfológicas e fisiológicas dose-dependentes nos embriões. As alterações observadas em embriões vivos de 24 hpf tratados com 1–4% de DMSO por 48 h foram: cauda curvada para cima (em 3–4% de DMSO), tamanho do embrião (em 2–4% de DMSO), frequência de batimento cardíaco (em 3–4% de DMSO), área do pericárdio (em 3–4% de DMSO), tamanho dos somitos (em 2–4% de DMSO), área do vitelo (em 3–4% de DMSO), melanócitos menores (em 2–4% de DMSO) e morfologia da notocorda (em 2–4% de DMSO). Essas alterações destacam grandes preocupações quanto ao uso de DMSO como solvente para estudos in vivo. A relevância do nosso estudo é que o zebrafish é um dos modelos de vertebrados mais estudados em biologia do desenvolvimento e em toxicologia, e vários desses estudos utilizam DMSO para dissolver compostos polares e não polares.
Notavelmente, nossos resultados mostram que 96% dos embriões de zebrafish apresentaram curvatura para cima após tratamento com 4% de DMSO por 48 h e 98% com 5% de DMSO por 24 e 48 h. O fenótipo de curvatura da cauda para cima (curvado para cima, enrolado para cima ou em forma de U) é bem caracterizado para mutantes de PDK2/ALK5 em zebrafish. A disfunção mitocondrial pode alterar a via de sinalização ALK5. Curiosamente, vários estudos mostraram que o DMSO afeta a fisiologia mitocondrial em diferentes tipos celulares. Podemos levantar a hipótese de que o DMSO interfere na fisiologia mitocondrial em embriões de zebrafish, causando alteração na sinalização ALK5, o que poderia levar a um fenótipo de curvatura para cima com efeitos adicionais dependendo do tipo celular/tecidos/órgãos. Por que as mitocôndrias são afetadas pelo DMSO? Gurtovenko e Anwar sugeriram que a interação do DMSO com as membranas pode induzir o afinamento da membrana, aumentar a fluidez da membrana e induzir poros de água transitórios na membrana. Essas alterações na membrana plasmática permitem que o DMSO entre na célula e, uma vez dentro, pode induzir a formação de poros de água nas mitocôndrias, levando a uma alteração na fisiologia mitocondrial (Fig 11). Essa hipótese poderia ser testada com uma análise detalhada das possíveis alterações na função e morfologia mitocondriais após o tratamento com DMSO. Sondas fluorescentes distintas estão disponíveis para rastrear o consumo de oxigênio e alterações no potencial da membrana mitocondrial, fornecendo informações sobre a respiração mitocondrial e a permeabilidade da membrana. Além disso, os efeitos do DMSO em embriões de zebrafish também poderiam ser investigados em nível molecular e bioquímico por meio da análise da expressão de genes e proteínas envolvidos na fisiologia mitocondrial e na via de sinalização ALK5, bem como marcadores de estresse oxidativo ou apoptose.
Representação esquemática das alterações induzidas por DMSO em embriões de zebrafish.
Nossos resultados mostram que 96% dos embriões de zebrafish apresentaram curvatura para cima após tratamento com 4% de DMSO por 48 h e 98% com 5% de DMSO por 24 e 48 h. O fenótipo de curvatura da cauda para cima é bem caracterizado para mutantes de PDK2/ALK5 em zebrafish. A disfunção mitocondrial pode alterar a via de sinalização ALK5. Nossa hipótese é que o DMSO altera a permeabilidade da membrana plasmática nas células dos embriões de ZF, permitindo que o DMSO entre nas células e, uma vez dentro, pode induzir a formação de poros de água nas mitocôndrias, levando a uma alteração na fisiologia mitocondrial e na sinalização ALK5.
Um dos efeitos mais marcantes do DMSO em embriões de zebrafish foram alterações musculares. O tamanho dos somitos foi reduzido e o alinhamento das miofibrilas foi alterado com o tratamento com DMSO. Esses resultados podem ter impacto na interpretação dos efeitos de medicamentos específicos dissolvidos em DMSO usados em vários estudos anteriores de músculo de zebrafish, particularmente, em estudos onde nenhuma condição de controle não tratado (sem DMSO) é usada em comparação com o tratamento com DMSO. Podemos levantar a hipótese de que o DMSO afeta o músculo por sua interação com as membranas fosfolipídicas das células musculares. Alterações nas membranas das células musculares (adelgaçamento da membrana e aumento da fluidez da membrana) poderiam ter impacto na comunicação intercelular entre células musculares e entre células musculares e a matriz extracelular presente nos septos. Além disso, a presença de agregados de actina (corados com Faloidina) em somitos próximos aos septos de embriões de zebrafish tratados com DMSO sugere fortemente que as fibras musculares são fortemente afetadas pelo DMSO. Foi demonstrado que a presença de agregados citoplasmáticos de actina em somitos de zebrafish se correlaciona com função muscular esquelética reduzida (Sztal et al., 2015).

O único parâmetro morfológico que aumentou com o tratamento com DMSO foi a área do vitelo. Podemos levantar a hipótese de que os embriões tratados com DMSO foram tão profundamente afetados que não conseguiram consumir o vitelo, como ocorre durante o desenvolvimento normal do zebrafish. Outra possibilidade é que o próprio DMSO induz o aumento do tamanho do vitelo por um acúmulo exacerbado de substâncias. Essas duas hipóteses precisam ser testadas em experimentos futuros.

Notavelmente, o tratamento com 1% e 2% de DMSO por 6 dias induziu mudanças significativas nos embriões, como aumento da espessura corporal e diminuição do tamanho da bexiga natatória. Esses resultados potencialmente contrastam com o estudo de Hoyberghs e colegas, que relataram que o DMSO em concentrações de até 1% é seguro para uso em ensaios de desenvolvimento de embriões de zebrafish. Essas diferenças poderiam ser explicadas pelo tempo de desenvolvimento em que os embriões foram observados após o tratamento. Analisamos embriões após 6 dias de exposição a 1% de DMSO e os observamos após 120 hpf.
O tratamento de curto prazo com DMSO (24 e 48 hs) induziu alterações importantes no tamanho e formato dos sómitos, mas, inesperadamente, a morfologia dos sómitos permaneceu inalterada após exposição prolongada ao DMSO (6 dias). Podemos levantar a hipótese de que as células musculares, entre outras células em embriões de zebrafish, adquirem resistência ao DMSO ao longo do tempo. Os transportadores de cassete de ligação de ATP (ABC), uma família ubíqua de proteínas integrais de membrana, desempenham um papel significativo na resistência celular a medicamentos. Os transportadores ABC utilizam ATP para translocar substratos através da membrana plasmática, removendo-os da célula. É possível que alterações nas mitocôndrias pelo tratamento de longo prazo com DMSO possam alterar a produção de ATP e modular a resistência das células musculares ao DMSO. Apoiando essa hipótese, foi demonstrado que o ATP mitocondrial abastece a effluxo de medicamentos mediado por transportadores ABC na quimiorresistência celular.

Finalmente, a questão de por que o DMSO ainda é amplamente utilizado como parte do meio, se vários estudos levantaram preocupações sobre seu uso, está relacionada às suas propriedades químicas únicas. O DMSO é um solvente aprótico polar que dissolve tanto compostos polares quanto apolares e é miscível em uma ampla variedade de solventes orgânicos, bem como na água. Esforços devem ser feitos para encontrar novos solventes com menor toxicidade para estudos de biologia do desenvolvimento. Sugerimos que estudos com zebrafish que utilizam DMSO como solvente façam esforços para usar a concentração mais baixa de DMSO que solubiliza o fármaco de interesse e incluam uma condição experimental de controle não tratado onde não haja DMSO presente. A comparação entre o controle tratado com DMSO e o não tratado é essencial para avaliar a extensão da toxicidade do DMSO em qualquer desenho experimental in vivo.

Importante, em cenários específicos, as concentrações de 1–5% de DMSO ainda podem ser usadas experimentalmente em embriões de zebrafish, apesar dos riscos conhecidos descritos. Por exemplo, nossos dados mostram que a frequência dos batimentos cardíacos e a área do pericárdio de embriões de zebrafish de 24 hpf foram afetadas após 48 hs na presença de 3–4% de DMSO, mas 2% de DMSO poderiam ser usados em estudos relacionados ao coração, embora esses 3–4% de DMSO possam afetar outros órgãos ou sistemas.

É surpreendente que os efeitos gerais de um fármaco utilizado em um número tão elevado de publicações (475.368 artigos de 1963–2025) não tivessem sido estudados em detalhes anteriormente. Os efeitos deletérios do DMSO (2–5%) que descrevemos aqui são perturbadores e exigem atenção da comunidade científica para explorar melhor as alterações em células, tecidos e órgãos específicos não apenas de embriões de zebrafish, mas também de outros animais modelo em biologia do desenvolvimento.
A novidade do nosso estudo reside em uma caracterização fenotípica abrangente e detalhada dos efeitos do DMSO em múltiplos sistemas biológicos do zebrafish, incluindo coração, notocorda, musculatura, pigmentação e motilidade. Nosso estudo descreve um mapeamento fenotípico sistemático dos efeitos morfológicos e fisiológicos de diferentes concentrações de DMSO em embriões de zebrafish e poderia ser expandido para testar outros solventes com propriedades semelhantes ao DMSO. Os fenótipos associados ao DMSO descritos aqui podem ser usados como controles positivos ou modelos de referência para estudos de toxicidade do desenvolvimento utilizando zebrafish.

Informações de suporte
Referências
Dissecando o metabolismo usando modelos de doenças em zebrafish
O uso emergente do zebrafish para modelar doenças metabólicas
Zebrafish como um vertebrado modelo para investigar toxicidade química
Modelo de zebrafish na avaliação de segurança de medicamentos
Dimetilsulfóxido (DMSO): uma revisão
Dimetilsulfóxido: história, química e utilidade clínica em dermatologia
Efeitos do DMSO no comportamento larval do zebrafish (Danio rerio), com efeitos aditivos e de interação quando combinado com controles positivos
Influência do Azul de Metileno ou Dimetilsulfóxido no Desenvolvimento e Comportamento Larval do Zebrafish
Concentrações de DMSO de até 1% são Seguras para Uso no Ensaio de Toxicidade do Desenvolvimento de Embriões de Zebrafish
Toxicidade combinada de dimetilsulfóxido (DMSO) e vanádio em embriões de zebrafish (Danio rerio): Efeito sinérgico inesperado do DMSO
Modulando a estrutura e propriedades das membranas celulares: o mecanismo molecular de ação do dimetilsulfóxido
Mudanças moleculares globais induzidas por baixa dose de dimetilsulfóxido têm potencial para interferir em vários processos celulares
Algumas características distintivas da miogênese do zebrafish baseadas em distribuições inesperadas das proteínas do citoesqueleto muscular actina, miosina, desmina, alfa-actinina, troponina e titina
Fiji: uma plataforma de código aberto para análise de imagens biológicas
Alterações no desenvolvimento do zebrafish induzidas por sinvastatina: Estudo morfológico e fisiológico abrangente, com foco no músculo
Uma triagem química de alto rendimento em zebrafish revela ALK5 e sinalização androgênica não canônica como moduladores do fenótipo pkd2-/-
Disfunção mitocondrial induz hipovascularização mediada por ALK5-SMAD2 e malformações arteriovenosas em retinas de camundongos
Dimetilsulfóxido: um protagonista central desde o alvorecer da criobiologia, a eficácia é equilibrada pela toxicidade?
Toxicidade inesperada de baixa dose do solvente universal DMSO
Dimetilsulfóxido (DMSO) produz apoptose generalizada no sistema nervoso central em desenvolvimento
Dimetilsulfóxido danifica a integridade mitocondrial e o potencial de membrana em astrócitos cultivados
Modelos de zebrafish para miopatia nemalínica revelam um espectro de corpos nemalínicos contribuindo para a redução da função muscular
Transportadores ABC: o poder de mudar
O ATP mitocondrial alimenta o efluxo de medicamentos mediado por transportadores ABC na quimiorresistência ao câncer
10.1371/journal.pone.0330348.r001
Carta de Decisão 0
Xu
Hai O.
Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados.
27 de junho de 2025
PONE-D-25-27082DMSO induz grandes alterações morfológicas e fisiológicas em embriões de zebrafishPLOS ONE
Prezado Dr. Mermelstein,

Obrigado por submeter seu manuscrito ao PLOS ONE. Após uma análise cuidadosa, consideramos que ele possui mérito, mas não atende totalmente aos critérios de publicação do PLOS ONE em seu estado atual. Portanto, convidamos você a submeter uma versão revisada do manuscrito que aborde os pontos levantados durante o processo de revisão.

Por favor, submeta seu manuscrito revisado até 11 de agosto de 2025, às 23h59. Se precisar de mais tempo do que este para concluir suas revisões, responda a esta mensagem ou entre em contato com o escritório da revista pelo e-mail plosone@plos.org. Quando estiver pronto para submeter sua revisão, acesse https://www.editorialmanager.com/pone/ e selecione a pasta 'Submissões que Necessitam de Revisão' para localizar o arquivo do seu manuscrito.

Ao submeter seu manuscrito revisado, inclua os seguintes itens:

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Uma versão não marcada do seu artigo revisado, sem controle de alterações. Você deve enviar isto como um arquivo separado nomeado 'Manuscrito'.

Se desejar fazer alterações em sua declaração financeira, inclua sua declaração atualizada em sua carta de apresentação. As diretrizes para reenvio dos arquivos de figuras estão disponíveis abaixo dos comentários dos revisores no final desta carta.

Se aplicável, recomendamos que você deposite seus protocolos de laboratório em protocols.io para aumentar a reprodutibilidade de seus resultados. O protocols.io atribui ao seu protocolo um identificador próprio (DOI) para que ele possa ser citado independentemente no futuro. Para instruções, veja: https://journals.plos.org/plosone/s/submission-guidelines#loc-laboratory-protocols. Além disso, o PLOS ONE oferece uma opção para publicar artigos de Protocolos de Laboratório revisados por pares, que descrevem protocolos hospedados em protocols.io. Leia mais informações sobre o compartilhamento de protocolos em https://plos.org/protocols?utm_medium=editorial-email&utm_source=authorletters&utm_campaign=protocols.

Aguardamos ansiosamente o recebimento do seu manuscrito revisado.

Atenciosamente,

Hai O. Xu
Editor Acadêmico
PLOS ONE

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Ao submeter sua revisão, precisamos que você atenda a estes requisitos adicionais.

1. Por favor, certifique-se de que seu manuscrito atende aos requisitos de estilo do PLOS ONE, incluindo aqueles para nomeação de arquivos. Os modelos de estilo do PLOS ONE podem ser encontrados em

https://journals.plos.org/plosone/s/file?id=wjVg/PLOSOne_formatting_sample_main_body.pdf e
https://journals.plos.org/plosone/s/file?id=ba62/PLOSOne_formatting_sample_title_authors_affiliations.pdf
2. Agradecemos por declarar em sua Declaração de Financiamento:
 [Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, número de financiamento 302961/2021-6 para C.M., 308192/2021-4 para M.L.C.) e pela Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, número de financiamento E-26/203.930/2024 para C.M., E-26/204.077/2024 para M.L.C.).].
Por favor, forneça uma declaração alterada que declare todo o financiamento ou fontes de apoio (seja externo ou interno à sua organização) recebido durante este estudo, conforme detalhado online em nosso guia para autores em http://journals.plos.org/plosone/s/submit-now.  Inclua também a declaração “Não houve financiamento externo adicional recebido para este estudo.” em sua Declaração de Financiamento atualizada.
Por favor, inclua sua Declaração de Financiamento alterada em sua carta de apresentação. Nós alteraremos o formulário de submissão online em seu nome.
3. Sua declaração de ética deve aparecer apenas na seção de Métodos do seu manuscrito. Se sua declaração de ética estiver escrita em qualquer outra seção além dos Métodos, por favor, mova-a para a seção de Métodos e exclua-a de qualquer outra seção. Certifique-se de que sua declaração de ética está incluída em seu manuscrito, pois a declaração de ética inserida no formulário de submissão online não será publicada junto com seu manuscrito.
Comentários Adicionais do Editor (se fornecidos):
[Nota: A marcação HTML está abaixo. Por favor, não edite.]
Comentários dos Revisores:
Respostas do Revisor às Perguntas
Comentários ao Autor

1. O manuscrito é tecnicamente sólido e os dados apoiam as conclusões?
   O manuscrito deve descrever uma pesquisa científica tecnicamente sólida com dados que apoiem as conclusões. Os experimentos devem ter sido conduzidos rigorosamente, com controles apropriados, replicação e tamanhos amostrais. As conclusões devem ser tiradas adequadamente com base nos dados apresentados.
   Revisor #1: Sim
   Revisor #2: Sim
   Revisor #3: Sim
   Revisor #4: Sim

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2. A análise estatística foi realizada de forma apropriada e rigorosa?
   Revisor #1: Sim
   Revisor #2: Sim
   Revisor #3: Sim
   Revisor #4: Sim

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3. Os autores disponibilizaram integralmente todos os dados subjacentes às descobertas em seu manuscrito?
   A política de dados da PLOS exige que os autores disponibilizem integralmente todos os dados subjacentes às descobertas descritas em seu manuscrito sem restrições, com rara exceção (consulte a Declaração de Disponibilidade de Dados no arquivo PDF do manuscrito). Os dados devem ser fornecidos como parte do manuscrito ou de suas informações de apoio, ou depositados em um repositório público. Por exemplo, além das estatísticas resumidas, os pontos de dados por trás de médias, medianas e medidas de variância devem estar disponíveis. Se houver restrições quanto ao compartilhamento público de dados—por exemplo, privacidade dos participantes ou uso de dados de terceiros—essas devem ser especificadas.
   Revisor #1: Sim
   Revisor #2: Sim
   Revisor #3: Sim
   Revisor #4: Sim

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4. O manuscrito é apresentado de forma inteligível e redigido em inglês padrão?
   O PLOS ONE não realiza revisão de texto em manuscritos aceitos, portanto, o idioma nos artigos submetidos deve ser claro, correto e inequívoco. Quaisquer erros tipográficos ou gramaticais devem ser corrigidos na revisão; portanto, observe quaisquer erros específicos aqui.
   Revisor #1: Sim
   Revisor #2: Sim
   Revisor #3: Sim
   Revisor #4: Sim

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5. Comentários de Revisão ao Autor
   Use o espaço fornecido para explicar suas respostas às perguntas acima. Você também pode incluir comentários adicionais para o autor, incluindo preocupações sobre publicação duplicada, ética em pesquisa ou ética em publicação. (Faça o upload de sua revisão como anexo se ela exceder 20.000 caracteres)
   Revisor #1: Resumo e introdução: bem escritos e adequados, com fluxo lógico.
   Metodologia:

• Bem escrita, metodologia robusta, configuração experimental rigorosa.
• Os detalhes do DMSO utilizado neste estudo não são fornecidos (ou seja, fonte, grau, qualidade etc.), apesar de ser o produto químico de referência. A preparação do DMSO, como sua qualidade é mantida ao longo dos experimentos, também não são mencionados.
  Resultados:
• Bem escritos, explicações são completas. Imagens de boa qualidade utilizadas.
• Figuras e análises estatísticas são abrangentes e ilustram efetivamente o efeito dose-dependente do DMSO.
• A Tabela 1 é qualitativa. Poderia ser fortalecida usando valores quantificados, se disponíveis (por exemplo, porcentagem de mudanças etc. com valores de p concomitantes).
  Discussão:
• Bem escrita, hipótese interessante sobre envolvimento mitocondrial, sinalização ALK5 e fluidez da membrana. Poderia ser fortalecida com um diagrama esquemático resumindo o mecanismo hipotético.
• Sugiro adicionar direções futuras sobre como validar essas hipóteses.
• Sugiro comentar um pouco mais sobre o efeito de longo prazo do DMSO, adicionando detalhes sobre por que a morfologia dos somitos permaneceu inalterada pela exposição prolongada ao DMSO (apesar dos efeitos iniciais).
  Revisor #2: Revisão:
  O artigo intitulado "DMSO induz alterações morfológicas e fisiológicas importantes em embriões de zebrafish" é uma pesquisa única onde os autores analisam a influência do DMSO sobre o desenvolvimento de larvas de zebrafish. No geral, é um artigo excelente que mostra a importância de estar ciente de todos os componentes que um meio possui. Tenho algumas preocupações que aponto a seguir:
• …"clareza óptica do embrião em desenvolvimento…", o autor poderia usar "transparência" para ilustrar o que estão tentando dizer.
• Eliminar a palavra "Todas" na linha …"Todas essas características…".
• O segundo parágrafo, onde os autores apresentam a problemática do DMSO, é meio estranho. “…A característica mais importante de um solvente a ser usado como controle, além da capacidade de dissolver um determinado composto, é a ausência de efeitos no modelo…” Os autores poderiam introduzir imediatamente que o DMSO é usado como controle, para os diferentes usos, e exemplificar que é amplamente utilizado como controle ou faz parte do componente do meio.
• Uma questão surge: por que o DMSO é comumente utilizado como parte dos meios ou componentes alimentares? Se vários autores levantaram preocupações sobre diferentes resultados obtidos antes do uso de DMSO em seus experimentos, por que ainda é utilizado? Concordo com os autores que é essencial compreender os mecanismos e padronizar isso, mas essas são perguntas válidas que poderiam alterar alguns resultados obtidos anteriormente por outros autores.
• Na seção de materiais e métodos: é importante esclarecer todos os componentes utilizados neste estudo, principalmente porque os autores estão tentando explicar uma concentração de DMSO que não afeta ou afeta os embriões e larvas de zebrafish. Portanto, as características químicas e físicas da água são importantes de se conhecer. O controle negativo de embriões e larvas é o meio sem DMSO?
• Linha: “…No total, o experimento foi repetido 3 vezes.” Repetição técnica ou repetição biológica? Em dias diferentes?
• A solução E3 precisa esclarecer os componentes químicos ou é uma solução industrial?
• Seção de resultados: “O DMSO é um solvente universal para compostos que não são miscíveis em água. Uma análise do número de artigos publicados no banco de dados Europe PMC usando o descritor DMSO resultou em 475.368 artigos publicados em um período que abrangeu os anos de 1963 a 2025. Figura 1.” Primeiro, é bastante ambíguo pesquisar apenas “DMSO” como descritor, porque uma vasta maioria dos tampões usados em diferentes experimentos ou ensaios utiliza DMSO como componente químico crítico ou subcrítico. Segundo, não considero que essa informação seja crítica, pois os autores estão tentando relacionar o uso de DMSO em estudos de desenvolvimento ao longo do tempo.
• Discussão: Poderia ser benéfico para os autores e para os leitores que os autores se refiram às concentrações que afetam as alterações fisiológicas. Além disso, todos esses efeitos do DMSO em nível embriológico poderiam ser explicados em nível molecular e bioquímico?
  Revisor #3: 1. Esclarecer a natureza confirmatória e a relevância prática do estudo.
  Os autores devem reconhecer explicitamente, tanto na Introdução quanto na Discussão, que os efeitos tóxicos gerais do DMSO em concentrações acima de 1% já estão bem documentados na literatura e, portanto, eram esperados. A novidade do presente estudo não reside em estabelecer que o DMSO é prejudicial, mas sim na caracterização fenotípica abrangente e detalhada de seus efeitos em múltiplos sistemas biológicos, incluindo o coração, notocorda, musculatura, pigmentação e motilidade. Apresentar o estudo como um mapeamento fenotípico sistemático refletirá com mais precisão seu valor científico.
  Além disso, incentiva-se os autores a esclarecerem as implicações práticas de suas descobertas, particularmente considerando que a maioria dos pesquisadores já está ciente de que concentrações de DMSO acima de 1% devem ser evitadas. O manuscrito se beneficiaria de uma discussão mais explícita sobre as aplicações potenciais desses dados. Por exemplo:
  Os fenótipos descritos aqui poderiam servir como controles positivos ou modelos de referência para toxicidade do desenvolvimento?
  Existem cenários específicos em que concentrações de 1–5% de DMSO ainda são usadas experimentalmente apesar dos riscos conhecidos?
  Toxicologistas geralmente evitam ultrapassar os limites de segurança conhecidos sem justificativa. Portanto, fortaleceria o manuscrito contextualizar quando e por que tais concentrações mais altas ainda podem ser relevantes em pesquisa.

2. Sugestões Adicionais:
   Incluir concentrações mais baixas de DMSO (<1%) para ajudar a identificar efeitos sutis ou de limiar que podem ser perdidos em doses mais altas.
   Incorporar desfechos moleculares (por exemplo, marcadores de estresse oxidativo ou apoptose) para conectar melhor as alterações morfológicas aos mecanismos subjacentes.
   Declarar claramente o número de embriões (n) analisados por grupo experimental tanto na seção de Resultados quanto nas legendas das figuras.
   Considerar fornecer uma tabela suplementar com dados brutos ou quantitativos resumidos (média ± DP ou EPM) para cada parâmetro medido, a fim de aumentar a transparência e a reprodutibilidade.
   Revisor #4: O manuscrito adiciona dados a um fenômeno já extensivamente estudado. Em suma, os resultados apoiam a noção bem estabelecida de que o DMSO é tóxico em concentrações iguais ou superiores a 1%. Vale notar que os autores estão bem conscientes disso, pois citam a maior parte da literatura relevante. Na minha opinião, o manuscrito mostra que os autores estabeleceram as condições para conduzir técnicas de ponta, como microscopia de alta resolução e microscopia de vídeo em tempo real. Agora eles podem testar hipóteses mais arriscadas que produzam resultados claramente originais. Só me vem à mente que eles testem concentrações abaixo de 1% de DMSO ou testem solventes que tenham propriedades semelhantes ao DMSO. Outra opção é que eles produzam uma revisão crítica da literatura atual, pois pelo meu entendimento a última foi produzida há 10 anos.

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6. Os autores da PLOS têm a opção de publicar o histórico de revisão por pares de seu artigo (o que isso significa?). Se publicado, isso incluirá sua revisão completa e quaisquer arquivos anexados.
   Se você escolher "não", sua identidade permanecerá anônima, mas sua revisão ainda poderá ser tornada pública.
   Você deseja que sua identidade seja pública para esta revisão por pares? Para informações sobre esta escolha, incluindo retirada de consentimento, consulte nossa Política de Privacidade.
   Revisor #1: Sim: INTAN SUHANA ZULKAFLI
   Revisor #2: Sim: Dr Alan Briones
   Revisor #3: Sim: Jordana Andrade Santos
   Revisor #4: Sim: Alberto Jose Cabrera Quintero

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[NOTA: Se os comentários do revisor foram enviados como um arquivo anexo, eles estarão anexados a este e-mail e acessíveis através do site de submissão. Por favor, faça login em sua conta, localize o registro do manuscrito e verifique o link de ação "Ver Anexos". Se este link não aparecer, não há arquivos anexos.]
Ao revisar sua submissão, faça o upload dos arquivos de figuras para a ferramenta de diagnóstico digital Preflight Analysis and Conversion Engine (PACE), disponível em https://pacev2.apexcovantage.com/. O PACE ajuda a garantir que as figuras atendam aos requisitos da PLOS. Para usar o PACE, você deve primeiro se registrar como usuário. O registro é gratuito. Em seguida, faça login e navegue até a guia UPLOAD, onde encontrará instruções detalhadas sobre como usar a ferramenta. Se encontrar problemas ou tiver dúvidas ao usar o PACE, envie um e-mail para a PLOS em figures@plos.org. Observe que os arquivos de Informações de Suporte não precisam desta etapa.
10.1371/journal.pone.0330348.r002
Resposta do autor à Carta de Decisão 1
4 de julho de 2025
Prezado Dr. Hai Xu,
A revisão por pares do nosso manuscrito "DMSO induz alterações morfológicas e fisiológicas importantes em embriões de zebrafish" (PONE-D-25-27082) foi recebida e, de acordo com os Revisores, nosso manuscrito tem mérito, mas não é adequado para publicação em seu estado atual. Foi solicitado que submetêssemos uma versão revisada do manuscrito abordando os pontos levantados por ambos os revisores. Agora, abordamos suas críticas e incorporamos suas sugestões em uma nova versão do manuscrito. Destacamos as alterações ao longo do texto usando a cor amarela. Também incluímos uma resposta ponto a ponto aos seus comentários, que foram úteis para melhorar a apresentação e interpretação dos dados. Agradecemos aos Revisores por sua análise cuidadosa e adequada. As correções detalhadas são as seguintes.
Revisor #1:
1 - Resumo e introdução: bem escritos e adequados, com fluxo lógico.
Metodologia:

• Bem escrita, metodologia robusta, configuração experimental rigorosa.
• Os detalhes do DMSO utilizado neste estudo não são fornecidos (ou seja, fonte, grau, qualidade etc.), apesar de ser o produto químico de referência. A preparação do DMSO e como sua qualidade é mantida ao longo dos experimentos também não são mencionados.
  Resposta do autor: Agradecemos ao revisor por esses comentários. Agora adicionamos mais informações sobre a fonte do DMSO, número de catálogo, pureza e preparação. O novo texto é: "Embriões e larvas foram coletados, descorionados e o tratamento iniciou-se às 24 horas pós-fertilização (hpf) com concentrações crescentes de Dimetilsulfóxido (DMSO 1, 2, 3, 4 e 5%, v/v, da Sigma-Aldrich, código D8418, pureza de 99,9%) até 72 hpf".
  2 - Resultados:
• Bem escritos, explicações são completas. Imagens de boa qualidade utilizadas.
• Figuras e análises estatísticas são abrangentes e ilustram efetivamente o efeito dose-dependente do DMSO.
• A Tabela 1 é qualitativa. Poderia ser ainda mais fortalecida usando valores quantificados, se disponíveis (por exemplo, porcentagem de alterações etc., com valores de p concomitantes).
  Resposta do autor: Agradecemos este importante comentário, e agora incluímos valores de quantificação e valores de p na nova Tabela 1.
  3 - Discussão:
  Hipótese bem escrita e interessante sobre o envolvimento mitocondrial, sinalização de ALK5 e fluidez de membrana. Poderia ser fortalecida por um diagrama esquemático resumindo o mecanismo hipotético.
  Resposta do autor: Elaboramos um diagrama esquemático resumindo nossos resultados e o mecanismo hipotético sugerido. O diagrama está na nova Figura 11.
  4 - Sugerir adicionar direção futura sobre como validar essas hipóteses.
  Resposta do autor: Incluímos direções futuras sobre como essas hipóteses poderiam ser validadas na seção Discussão do manuscrito. O novo texto é: “Esta hipótese poderia ser testada com uma análise detalhada de possíveis alterações na função e morfologia mitocondrial após o tratamento com DMSO. Sondas fluorescentes distintas estão disponíveis para rastrear o consumo de oxigênio e alterações no potencial de membrana mitocondrial, fornecendo informações sobre a respiração mitocondrial e a permeabilidade da membrana. Além disso, os efeitos do DMSO em embriões de zebrafish também poderiam ser investigados em nível molecular e bioquímico através da análise da expressão de genes e proteínas envolvidos na fisiologia mitocondrial e na via de sinalização de ALK5, bem como marcadores de estresse oxidativo ou apoptose”.
  5 - Sugerir comentar um pouco mais sobre o efeito de longo prazo do DMSO, adicionando detalhes sobre por que a morfologia dos somitos não foi alterada pela exposição prolongada ao DMSO (apesar dos efeitos iniciais).
  Resposta do autor: Incluímos comentários e hipóteses na Discussão do manuscrito sobre por que a morfologia dos somitos não foi alterada pela exposição prolongada ao DMSO, apesar dos efeitos iniciais. O novo texto é: “O tratamento de curto prazo com DMSO (24 e 48 hs) induziu mudanças importantes no tamanho e forma dos somitos, mas inesperadamente a morfologia dos somitos não foi alterada pela exposição prolongada ao DMSO (6 dias). Podemos hipotetizar que as células musculares, entre outras células em embriões de zebrafish, adquirem resistência ao DMSO ao longo do tempo. Os transportadores ABC (ATP-binding cassette), uma família ubíqua de proteínas integrais de membrana, desempenham um papel significativo na resistência celular a drogas (Rees et al., 2009). Os transportadores ABC usam ATP para translocar substratos através da membrana plasmática, removendo-os da célula. É possível que alterações nas mitocôndrias pelo tratamento de longo prazo com DMSO possam alterar a produção de ATP e modular a resistência das células musculares ao DMSO. Apoiando essa hipótese, foi demonstrado que o ATP mitocondrial alimenta a efluxo de drogas mediado por transportadores ABC na quimioresistência celular (Giddings et al., 2021)”.
  Revisor #2:
  O artigo intitulado “DMSO induz alterações morfológicas e fisiológicas importantes em embriões de zebrafish” é uma pesquisa única onde os autores analisam a influência do DMSO no desenvolvimento de larvas de zebrafish. No geral, é um excelente artigo que mostra a importância de estar ciente de todos os componentes que o meio possui. Tenho algumas preocupações que aponto a seguir:
  6 - …”clareza óptica do embrião em desenvolvimento…”, o autor poderia usar a “transparência” para ilustrar o que está tentando dizer.
  7 - Elimine a palavra “Todos” na linha…” Todas essas características…”.
  Resposta do autor: Agradecemos ao revisor por apontar algumas partes do texto que poderiam ser melhoradas. Agora alteramos essas partes na nova versão do manuscrito.
  8 - O segundo parágrafo, no qual os autores apresentam a problemática do DMSO, é meio estranho. “…A característica mais importante de um solvente a ser usado como controle, além da capacidade de dissolver um determinado composto, é a ausência de efeitos no modelo…” Os autores poderiam introduzir imediatamente que o DMSO é usado como controle, para os diferentes usos, e exemplificar que é amplamente utilizado como controle ou faz parte do componente do meio.
  Resposta do autor: Concordamos com o revisor que esta parte da Introdução não estava clara, e a alteramos de acordo com a sugestão do revisor.
  9 - Surge uma questão: por que o DMSO é comumente usado como parte dos componentes do meio ou da alimentação? Se vários autores levantaram preocupações sobre diferentes resultados obtidos antes do uso do DMSO em seu experimento, por que ele ainda é usado? Concordo com os autores que é essencial entender os mecanismos e padronizar isso, mas estas são questões válidas que poderiam alterar alguns resultados obtidos anteriormente por outros autores.
  Resposta do autor: Incluímos uma discussão no manuscrito sobre por que o DMSO ainda é usado como parte dos componentes do meio ou da alimentação. O novo texto é: “Finalmente, a questão de por que o DMSO ainda é amplamente utilizado como parte do meio, se vários estudos levantaram preocupações sobre seu uso, está relacionada às suas propriedades químicas únicas. O DMSO é um solvente aprótico polar que dissolve tanto compostos polares quanto apolares e é miscível em uma ampla gama de solventes orgânicos, bem como em água. Esforços devem ser feitos para encontrar novos solventes com menor toxicidade para estudos de biologia do desenvolvimento”.
  10 - Na seção de material e métodos: é importante esclarecer todos os componentes utilizados neste estudo, principalmente porque os autores estão tentando explicar que encontraram uma concentração de DMSO que não afeta ou afeta os embriões e larvas de zebrafish, portanto, as características químicas e físicas da água são importantes de se conhecer. O controle negativo de embriões e larvas é o meio sem DMSO?
  Resposta do autor: Incluímos no manuscrito uma descrição detalhada sobre o DMSO, a solução E3 e a água que utilizamos. Também descrevemos que o controle negativo de embriões e larvas que utilizamos foi o meio sem DMSO. O novo texto é agora: “Embriões e larvas foram coletados, descorionados e o tratamento iniciou-se às 24 horas pós-fertilização (hpf) com concentrações crescentes de Dimetilsulfóxido (DMSO 1, 2, 3, 4 e 5%, v/v, da Sigma-Aldrich, código D8418, pureza de 99,9%) até 72 hpf. O DMSO foi diluído em solução E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2 e 0,33 mM MgSO4 em água destilada, pH 7,2, preparada em nosso laboratório) antes de cada experimento”.

11 - Linha: “…No total, o experimento foi repetido 3 vezes.” Repetição técnica ou repetição biológica? Em dias diferentes?
Resposta do autor: Agradecemos ao revisor por este importante comentário. Agora adicionamos esta informação no manuscrito, conforme segue: “Placas de seis poços foram utilizadas para os experimentos. 10 embriões foram distribuídos por poço contendo 2 mL de solução. Dez réplicas técnicas (embriões com o mesmo tratamento dentro da mesma placa) e três réplicas biológicas (embriões com o mesmo tratamento, mas realizados em dia e acasalamento diferentes) foram feitas (n = 30). Embriões e larvas de zebrafish mantidos em solução E3 sem DMSO foram considerados controle negativo”.

12 - A solução E3 precisa esclarecer os componentes químicos ou é uma solução industrial?
Resposta do autor: Conforme explicamos acima, agora incluímos os componentes químicos da solução E3 (preparada em nosso laboratório) utilizada nos experimentos. O novo texto é: “O DMSO foi diluído em solução E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2 e 0,33 mM MgSO4 em água destilada, pH 7,2, preparada em nosso laboratório) antes de cada experimento”.

13 - Seção de Resultados: “O DMSO é um solvente universal para compostos que não são miscíveis em água. Uma análise do número de artigos publicados no banco de dados Europe PMC usando o descritor DMSO resultou em 475.368 artigos publicados em um período que abrangeu os anos de 1963 a 2025. Figura 1.” Primeiro, é bastante ambíguo pesquisar apenas “DMSO” como descritor, porque a grande maioria dos tampões usados em diferentes experimentos e ensaios utiliza DMSO como um componente químico crítico ou subcrítico. Segundo, não entendo que esta informação seja crítica, pois os autores estão tentando relacionar o uso de DMSO em estudos de desenvolvimento ao longo do tempo.
Resposta do autor: Agradecemos ao revisor por questionar esse ponto. Decidimos excluir a antiga Figura 1 com os dados do Europe PMC do manuscrito. No entanto, incluímos uma análise usando ambos os descritores “DMSO” e “biologia do desenvolvimento”. Acreditamos que agora essa análise está mais relacionada à pergunta do nosso manuscrito. O novo texto é: “DMSO é um solvente universal para compostos que não são miscíveis em água. Uma análise do número de artigos publicados no banco de dados Europe PMC (https://europepmc.org/) usando o descritor “DMSO” resultou em 484, 992 artigos publicados (dados da busca Junho 01, 2025) em um período que abrangeu os anos de 1963 a 2025. A partir de 2007, houve um aumento exponencial ao longo do tempo no número de publicações com DMSO. Notavelmente, em apenas um ano (2022) mais de 45,000 artigos com o descritor DMSO foram publicados, confirmando que o DMSO tem sido amplamente utilizado durante os últimos 60 anos. A análise do conteúdo desses artigos mostrou que o DMSO é usado em pesquisa biomédica básica, criopreservação, indústria farmacêutica, bem como em estudos de biologia do desenvolvimento. Uma busca por artigos no Europe PMC usando ambos “DMSO” e “biologia do desenvolvimento” resultou em 15,863 (dados da busca Junho 01, 2025) em um período que abrangeu os anos de 1971 a 2025”.
14 - Discussão: Poderia ser benéfico para os autores e os palestrantes que os autores se refiram às concentrações que afetam as alterações fisiológicas. Além disso, todos esses efeitos do DMSO em nível embriológico poderiam ser explicados em nível molecular e bioquímico?
Resposta do autor: Adicionamos agora o seguinte novo texto na Discussão do manuscrito: “Esta hipótese poderia ser testada com uma análise detalhada de possíveis alterações na função e morfologia mitocondrial após o tratamento com DMSO. Sondas fluorescentes distintas estão disponíveis para rastrear o consumo de oxigênio e mudanças no potencial de membrana mitocondrial, fornecendo informações sobre a respiração mitocondrial e a permeabilidade da membrana. Além disso, os efeitos do DMSO em embriões de zebrafish também poderiam ser investigados em nível molecular e bioquímico através da análise da expressão de genes e proteínas envolvidos na fisiologia mitocondrial e na via de sinalização ALK5, bem como marcadores de estresse oxidativo ou apoptose”.
Revisor #3:
15 - Esclarecer a natureza confirmatória e a relevância prática do estudo. Os autores devem reconhecer explicitamente, tanto na Introdução quanto na Discussão, que os efeitos tóxicos gerais do DMSO em concentrações acima de 1% já estão bem documentados na literatura e, portanto, eram esperados. A novidade do presente estudo não reside em estabelecer que o DMSO é prejudicial, mas sim na caracterização fenotípica abrangente e detalhada de seus efeitos em múltiplos sistemas biológicos, incluindo coração, notocorda, musculatura, pigmentação e motilidade. Enquadrar o estudo como um mapeamento fenotípico sistemático refletirá com mais precisão seu valor científico. Além disso, os autores são incentivados a esclarecer as implicações práticas de suas descobertas, considerando particularmente que a maioria dos pesquisadores já está ciente de que concentrações de DMSO acima de 1% devem ser evitadas. O manuscrito se beneficiaria de uma discussão mais explícita sobre as aplicações potenciais desses dados. Por exemplo: Os fenótipos descritos aqui poderiam servir como controles positivos ou modelos de referência para toxicidade do desenvolvimento?
Resposta do autor: Agradecemos ao revisor por esses importantes comentários. Agora adicionamos o seguinte novo texto ao final da seção de Discussão do manuscrito: "A novidade do nosso estudo reside em uma caracterização fenotípica abrangente e detalhada dos efeitos do DMSO em múltiplos sistemas biológicos do zebrafish, incluindo coração, notocorda, musculatura, pigmentação e motilidade. Nosso estudo descreve um mapeamento fenotípico sistemático dos efeitos morfológicos e fisiológicos de diferentes concentrações de DMSO em embriões de zebrafish e poderia ser expandido para testar outros solventes que possuem propriedades semelhantes ao DMSO. Os fenótipos associados ao DMSO descritos aqui poderiam ser usados como controles positivos ou modelos de referência para estudos de toxicidade do desenvolvimento usando zebrafish".
16 - Existem cenários específicos nos quais concentrações de 1–5% de DMSO ainda são utilizadas experimentalmente, apesar dos riscos conhecidos? Os toxicologistas normalmente evitam exceder os limites de segurança conhecidos sem justificativa. Portanto, fortaleceria o manuscrito contextualizar quando e por que tais concentrações mais altas ainda poderiam ser relevantes na pesquisa.
Resposta do autor: Esta é uma pergunta interessante. Adicionamos um comentário sobre isso na Discussão do manuscrito, da seguinte forma: "Importante notar que, em cenários específicos, as concentrações de 1-5% de DMSO ainda poderiam ser usadas experimentalmente em embriões de zebrafish, apesar dos riscos conhecidos descritos. Por exemplo, nossos dados mostram que a frequência de batimentos cardíacos e a área do pericárdio de embriões de zebrafish com 24 hpf foram afetadas após 48 h na presença de 3-4% de DMSO, mas 2% de DMSO poderia ser usado em estudos relacionados ao coração, mesmo que esses 3-4% de DMSO pudessem afetar outros órgãos ou sistemas".
2. Sugestões Adicionais:
17 - Incluir concentrações mais baixas de DMSO (<1%) para ajudar a identificar efeitos sutis ou de limiar que podem passar despercebidos em doses mais altas.
Resposta do autor: Agora incluímos uma nova figura (Figura Suplementar 4) no manuscrito com resultados de novos experimentos com concentrações mais baixas de DMSO (<1%). Incluímos o seguinte texto na seção de Resultados do manuscrito: “Como encontramos efeitos morfológicos e fisiológicos do tratamento com DMSO em embriões de 72 hpf com a concentração de 1%, decidimos testar se concentrações abaixo de 1% de DMSO poderiam levar a alterações na locomoção dos embriões. Embriões de zebrafish foram tratados com 0,1%, 0,3%, 0,5%, 1% e 2% de DMSO e seus movimentos foram registrados. A área de natação dos embriões foi quantificada, e nenhuma alteração significativa foi encontrada (Material Suplementar 4), embora uma tendência dose-dependente de diminuição na locomoção tenha sido observada”.

18 - Incorpore desfechos moleculares (por exemplo, marcadores de estresse oxidativo ou apoptose) para conectar melhor as alterações morfológicas aos mecanismos subjacentes.

Resposta do autor: Obrigado por esses comentários. Incluímos essas sugestões na Discussão do manuscrito: “Esta hipótese poderia ser testada com uma análise detalhada de possíveis alterações na função e morfologia mitocondrial após DMS

10.1371/journal.pone.0330348.r003
Carta de Decisão 1
Xu
Hai O.
Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Atribuição , que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor e a fonte originais sejam creditados.
31 de julho de 2025
DMSO induz alterações morfológicas e fisiológicas importantes em embriões de zebrafish
PONE-D-25-27082R1
Prezado Dr. Mermelstein,

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   Revisor #2: Sim
   Revisor #4: Sim

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   Revisor #4: Não tenho comentários adicionais. Os autores abordaram minhas preocupações anteriores. Inesperadamente, eles até incluíram mais experimentos.

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7. Os autores da PLOS têm a opção de publicar o histórico da revisão por pares de seu artigo (o que isso significa?). Se publicado, isso incluirá sua revisão por pares completa e quaisquer arquivos anexados.
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   Revisor #2: Sim: Dr. Alan Briones, PhD.
   Revisor #4: Sim: Alberto Jose Cabrera Quintero

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10.1371/journal.pone.0330348.r004
Carta de aceitação
Xu
Hai O.
Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor original e a fonte sejam creditados.
PONE-D-25-27082R1
PLOS ONE
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