pmid: "36884218"
title: "Variantes heterozigotas germinativas de ganho de função do STAT6 em humanos causam doença alérgica grave."
authors: "Sharma M, Leung D, Momenilandi M, Jones LCW, Pacillo L, James AE, Murrell JR, Delafontaine S, Maimaris J, Vaseghi-Shanjani M, Del Bel KL, Lu HY, Chua GT, Di Cesare S, Fornes O, Liu Z, Di Matteo G, Fu MP, Amodio D, Tam IYS, Chan GSW, Sharma AA, Dalmann J, van der Lee R, Blanchard-Rohner G, Lin S, Philippot Q, Richmond PA, Lee JJ, Matthews A, Seear M, Turvey AK, Philips RL, Brown-Whitehorn TF, Gray CJ, Izumi K, Treat JR, Wood KH, Lack J, Khleborodova A, Niemela JE, Yang X, Liang R, Kui L, Wong CSM, Poon GWK, Hoischen A, van der Made CI, Yang J, Chan KW, Rosa Duque JSD, Lee PPW, Ho MHK, Chung BHY, Le HTM, Yang W, Rohani P, Fouladvand A, Rokni-Zadeh H, Changi-Ashtiani M, Miryounesi M, Puel A, Shahrooei M, Finocchi A, Rossi P, Rivalta B, Cifaldi C, Novelli A, Passarelli C, Arasi S, Bullens D, Sauer K, Claeys T, Biggs CM, Morris EC, Rosenzweig SD, O'Shea JJ, Wasserman WW, Bedford HM, van Karnebeek CDM, Palma P, Burns SO, Meyts I, Casanova JL, Lyons JJ, Parvaneh N, Nguyen ATV, Cancrini C, Heimall J, Ahmed H, McKinnon ML, Lau YL, Béziat V, Turvey SE"
journal: "The Journal of experimental medicine"
pubdate: "2023 May 01"
doi: "10.1084/jem.20221755"
source: "PMC Full Text"

Variantes heterozigotas germinativas de ganho de função do STAT6 em humanos causam doença alérgica grave.

Autores

Sharma M, Leung D, Momenilandi M, Jones LCW, Pacillo L, James AE, Murrell JR, Delafontaine S, Maimaris J, Vaseghi-Shanjani M, Del Bel KL, Lu HY, Chua GT, Di Cesare S, Fornes O, Liu Z, Di Matteo G, Fu MP, Amodio D, Tam IYS, Chan GSW, Sharma AA, Dalmann J, van der Lee R, Blanchard-Rohner G, Lin S, Philippot Q, Richmond PA, Lee JJ, Matthews A, Seear M, Turvey AK, Philips RL, Brown-Whitehorn TF, Gray CJ, Izumi K, Treat JR, Wood KH, Lack J, Khleborodova A, Niemela JE, Yang X, Liang R, Kui L, Wong CSM, Poon GWK, Hoischen A, van der Made CI, Yang J, Chan KW, Rosa Duque JSD, Lee PPW, Ho MHK, Chung BHY, Le HTM, Yang W, Rohani P, Fouladvand A, Rokni-Zadeh H, Changi-Ashtiani M, Miryounesi M, Puel A, Shahrooei M, Finocchi A, Rossi P, Rivalta B, Cifaldi C, Novelli A, Passarelli C, Arasi S, Bullens D, Sauer K, Claeys T, Biggs CM, Morris EC, Rosenzweig SD, O'Shea JJ, Wasserman WW, Bedford HM, van Karnebeek CDM, Palma P, Burns SO, Meyts I, Casanova JL, Lyons JJ, Parvaneh N, Nguyen ATV, Cancrini C, Heimall J, Ahmed H, McKinnon ML, Lau YL, Béziat V, Turvey SE

Periodico

The Journal of experimental medicine (2023 May 01)

Conteudo

Variantes heterozigóticas de ganho de função na linhagem germinativa humana do STAT6 causam doença alérgica grave
Sharma et al. definem um novo distúrbio atópico primário causado por variantes heterozigóticas de ganho de função no STAT6. Isso resulta em alergias graves de início precoce, e é observado em 16 pacientes de 10 famílias. O tratamento com anticorpo anti-IL-4Rα e inibidor de JAK foi altamente eficaz.
STAT6 (transdutor de sinal e ativador da transcrição 6) é um fator de transcrição que desempenha um papel central na fisiopatologia da inflamação alérgica. Identificamos 16 pacientes de 10 famílias abrangendo três continentes com um fenótipo profundo de desregulação imune alérgica de início precoce, dermatite atópica generalizada resistente ao tratamento, hipereosinofilia com doença gastrointestinal eosinofílica, asma, IgE sérica elevada, alergias alimentares mediadas por IgE e anafilaxia. Os casos eram esporádicos (sete famílias) ou seguiam um padrão de herança autossômica dominante (três famílias). Todos os pacientes apresentavam variantes raras monoalélicas no STAT6 e estudos funcionais estabeleceram seu fenótipo de ganho de função (GOF) com fosforilação sustentada do STAT6, aumento da expressão de genes alvo do STAT6 e polarização para TH2. O tratamento de precisão com o anticorpo anti-IL-4Rα, dupilumabe, foi altamente eficaz, melhorando tanto as manifestações clínicas quanto os biomarcadores imunológicos. Este estudo identifica variantes heterozigóticas de GOF no STAT6 como um novo distúrbio alérgico autossômico dominante. Antecipamos que nossa descoberta de múltiplas famílias com variantes germinativas de GOF no STAT6 facilitará o reconhecimento de mais indivíduos afetados e a definição completa deste novo distúrbio atópico primário.
Introdução
Estima-se que a asma e doenças atópicas relacionadas, incluindo dermatite atópica, alergia alimentar, rinite alérgica e doenças gastrointestinais eosinofílicas, afetem ∼20% da população global, impondo enormes encargos de saúde e econômicos. Identificar defeitos genéticos humanos de gene único que levam a doenças alérgicas graves—os chamados distúrbios atópicos primários (PADs)—é uma estratégia poderosa para definir os mecanismos celulares e moleculares que impulsionam a inflamação alérgica humana. Identificar novos PADs acelera o diagnóstico e tratamento de indivíduos afetados e pode revelar novos alvos moleculares para prevenir e tratar doenças alérgicas comuns.
Atualmente, existem apenas alguns erros inatos da imunidade (EIIs) conhecidos que são a base de doenças alérgicas graves. De fato, a maioria dos casos é de etiologia desconhecida, particularmente aqueles que são isolados ou esporádicos. Neste estudo, descrevemos uma nova doença alérgica primária humana (DAP) causada por variantes germinativas heterozigóticas de ganho de função (GOF) no gene STAT6, encontradas em 16 indivíduos de 10 famílias não aparentadas abrangendo três continentes. O transdutor de sinal e ativador da transcrição 6 (STAT6) é o principal fator de transcrição que medeia os efeitos biológicos da IL-4, uma citocina chave necessária para a diferenciação tipo 2 das células T, sobrevivência, proliferação e troca de classe para IgE das células B, bem como da IL-13, uma citocina ligada à anafilaxia. Os indivíduos afetados apresentaram doença alérgica multissistêmica grave, precoce e, por vezes, fatal, que era refratária aos tratamentos convencionais. Notavelmente, terapêuticas de precisão destinadas a visar a sinalização exacerbada de STAT6 foram benéficas naqueles que as receberam.
Resultados
Identificação de 16 pacientes de 10 famílias com doença alérgica grave de início precoce, heterozigóticos para variantes raras prejudiciais do STAT6
Estudamos 16 pacientes de 10 famílias com doença alérgica grave de início precoce abrangendo três continentes. Os pacientes foram identificados por seus médicos especialistas como candidatos à avaliação genética com base em seu fenótipo extremo e, em alguns casos, em seu histórico familiar (veja as narrativas clínicas em Dados S1; Tabelas S4 e S5; e Fig. 1 A). Os pacientes eram de etnias diversas, especificamente europeia (Famílias D, F e J), do Oriente Médio (Famílias A e C), hispânica (Família B), sul-asiática (Família H), leste-asiática (Família E) e sudeste-asiática (Família Y). Os casos eram esporádicos (sete famílias) ou afetavam múltiplos indivíduos de ambos os sexos em diferentes gerações, consistente com herança autossômica dominante (AD) (Famílias C, F e J). Todos os pacientes apresentavam variantes raras monoalélicas em STAT6 (NM_001178079.2). A pontuação de seleção negativa consenso do STAT6 revela uma pontuação de seleção negativa que se sobrepõe às IEIs AD conhecidas, consistente com o padrão de herança AD observado nas Famílias C, F e J (Fig. 1 B). Além disso, e também consistente com um distúrbio AD, ao sequenciar ambos os pais saudáveis (quando disponíveis), estabelecemos que a mutação STAT6 era de novo no Paciente 2 (P2), P5, P10 e P12 (das Famílias B, D, G e I, respectivamente; Fig. 1 A). A doença foi completamente penetrante nas famílias estudadas, pois todos os portadores da variante STAT6 eram afetados. Nenhuma das variantes foi relatada anteriormente em bancos de dados populacionais (Fig. 1 C; ou seja, gnomAD). Todas as variantes eram privadas das famílias estudadas, exceto a variante p.D419G, que era comum nas Famílias A e E. Modelos de predição de patogenicidade identificam todas essas variantes como patogênicas, evidenciado pelas altas pontuações patogênicas CADD, SIFT e Polyphen-2 (Tabelas S4 e S5). Notavelmente, nove pacientes de seis famílias apresentavam uma variante que afetava o aminoácido D419. Importante, variantes que levam a alterações de aminoácidos em p.D419, p.D519 e p.P643 podem ser encontradas no banco de dados Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC) como variantes somáticas recorrentes em linfoma, com alguma evidência experimental de fenótipo de ganho de função (GOF) para variantes em p.D419 (; Fig. S1 A). As variantes relatadas estão localizadas em diferentes domínios proteicos do STAT6, incluindo o domínio de ligação ao DNA (p.E382 e p.D419), o domínio linker (p.D519) e o domínio SH2 (p.K595), enquanto p.P643 está em estreita proximidade com o sítio de fosforilação p.Y641 (Fig. 1, D–F).
Embora as variantes estivessem localizadas em diferentes domínios da proteína STAT6, a modelagem da interação da STAT6 com o DNA revela que todas as variantes identificadas (com exceção de p.P643) situam-se próximas à interface proteína–DNA e resultam em alterações de aminoácidos que aumentam a eletropositividade em pH fisiológico (Fig. 1 E). Notavelmente, E382 e D419 estão localizadas em regiões responsáveis pelo reconhecimento proteína–DNA. As alterações nessas variantes diminuem a eletronegatividade da proteína perto da interface de ligação ao DNA e são previstas para aumentar a ligação da STAT6 ao DNA (Fig. 1 E e Fig. S1 B). Em conjunto, esses dados sugerem que as variantes monoalélicas germinativas da STAT6 identificadas nos pacientes são a base da doença alérgica grave por um mecanismo de GOF.
16 pacientes com doença alérgica grave e variantes de STAT6 em diferentes domínios proteicos. (A) Heredograma familiar dos 16 pacientes de 10 famílias diferentes. Símbolos preenchidos = indivíduo afetado; símbolos não preenchidos = indivíduo não afetado. (B) Escore de seleção negativa consensual (CoNeS) para STAT6 em relação ao escore para genes de IEI conhecidos relatados com padrão de herança AD, AR ou ambos (AD + AR). (C) Frequência e escore CADD para variantes de STAT6 missense (preto) e LOF previstas (pLOF, azul) relatadas em um banco de dados público e variantes de STAT6 relatadas em nossa coorte de pacientes (vermelho). A linha pontilhada corresponde ao ponto de corte de significância da mutação (MSC). (D) Esquema ilustrando os domínios proteicos de STAT6. A localização dos aminoácidos das variantes mostradas é destacada, com o comprimento da barra correspondendo ao número de pacientes relatados com variantes naquele local. (E) Modelo estrutural do complexo homodímero DNA-STAT6 mostrando a localização das diferentes variantes de STAT6 em relação à interface de ligação ao DNA.

Variantes patogênicas da linhagem germinativa de STAT6 estão localizadas em diferentes domínios proteicos e são frequentemente identificadas como variantes somáticas. (A) Contagens de mutações somáticas para diferentes alterações de aminoácidos conforme relatado pelo COSMIC para STAT6. Alterações destacadas em vermelho são aquelas variantes germinativas também identificadas em nossa coorte que causam doença alérgica grave. (B) Modelo estrutural do complexo homodímero DNA-STAT6 mostrando a localização das diferentes variantes de STAT6 em relação à interface de ligação ao DNA. Especificamente, ampliações para variantes em cada local são mostradas em relação a variantes previamente descritas conhecidas por afetar a função de STAT6.

Características clínicas unificadoras dos 16 pacientes com doença alérgica grave

Os pacientes da coorte tinham idades entre 3 e 60 anos. Narrativas clínicas completas são fornecidas no Dados S1, e suas características clínicas estão resumidas na Fig. 2A. Todos apresentavam doença alérgica grave que começou no primeiro ano de vida. Dermatite atópica grave e resistente ao tratamento (15/16) e alergias alimentares (15/16) foram as manifestações clínicas mais comuns, seguidas por asma (11/16) e doença eosinofílica gastrointestinal (10/16) e episódios graves de anafilaxia (9/16). Os testes laboratoriais clínicos foram notáveis por eosinofilia e níveis séricos de IgE acentuadamente elevados (Fig. 2, B e C). Outros aspectos da avaliação laboratorial clínica e imunológica foram em grande parte normais, embora sinais clínicos de inflamação sistêmica crônica estivessem presentes em alguns pacientes (ou seja, elevações nas contagens de glóbulos brancos, plaquetas e níveis séricos de imunoglobulinas). Os números de células T, B e natural killer (NK) estavam tipicamente na faixa normal (Fig. S2). Biópsias clínicas confirmaram a presença de eosinófilos na pele e no trato gastrointestinal (Fig. 2, E–G). A visualização endoscópica do esôfago revelou traquealização e sulcos consistentes com esofagite eosinofílica (; Fig. 2, H e I).
Principais características clínicas dos 16 pacientes. (A) Tabulação e comparação do fenótipo clínico de 16 pacientes. Observe que os valores de eosinófilos e IgE no sangue estavam disponíveis apenas para 15 pacientes. (B) Concentração de IgE no sangue total de 15 dos 16 pacientes. A área sombreada representa IgE < 240 µg/litro, que é o limite superior típico do normal. (C) Contagem de eosinófilos no sangue total de 15 dos 16 pacientes. A área sombreada representa contagens <0,5 × 10⁹/litro, que é o limite superior típico do normal. A linha tracejada horizontal denota uma contagem de eosinófilos de 1,5 × 10⁹/litro, uma vez que a síndrome hipereosinofílica é tradicionalmente definida como eosinofilia no sangue periférico >1,5 × 10⁹/litro persistindo por ≥6 meses. (D) Fotografia de doença atópica disseminada e grave. (E) Fotomicrografia da biópsia de pele mostrando hiperplasia pseudoepiteliomatosa acentuada com acantose, hiperceratose e paraceratose focal, sugestiva de líquen simples crônico (coloração H&E, ampliação original de 2×). Inflamação crônica moderada na derme papilar na qual eosinófilos dispersos (setas brancas) são conspícuos (inserção, coloração H&E; ampliação original de 40×). (F) Fotomicrografia de biópsia duodenal mostrando eosinófilos abundantes (setas brancas) entre linfócitos (coloração H&E; ampliação original de 40×). (G) Fotomicrografia de biópsia antral gástrica mostrando infiltrado abundante de eosinófilos (setas) entre linfócitos e plasmócitos (coloração H&E; ampliação original de 40×). (H e I) Imagens endoscópicas mostrando (H) sulcamento e (I) traquealização no esôfago médio, sugestivos de esofagite eosinofílica.
Hemogramas completos e avaliação imunológica de pacientes com variantes patogênicas de STAT6. (A–G) Hemograma completo para 15 dos 16 pacientes e referências baseadas na idade (área sombreada em laranja) para as seguintes populações: (A) hemoglobina, (B) plaquetas, (C) leucócitos, (D) linfócitos, (E) neutrófilos, (F) basófilos e (G) monócitos. (H–L) Avaliação imunológica para 15 dos 16 pacientes mostrando referências baseadas na idade (área sombreada em laranja) e quantificação das populações para: (H) células T CD3+, (I) células T CD4+ CD3+, (J) células T CD8+ CD3+, (K) células NK e (L) células B CD19+. (M–O) Concentrações de imunoglobulinas para 15 dos 16 pacientes mostrando referências baseadas na idade (área sombreada em laranja): (M) IgA, (N) IgM e (O) IgA.
Além da doença atópica, metade dos pacientes apresentou infecções recorrentes de pele, respiratórias e virais, embora não tenham ocorrido infecções profundas ou fatais. Baixa estatura (menor que o terceiro percentil para a idade) foi uma característica comum (7/16), e 5/16 apresentaram outras alterações esqueléticas, como fraturas patológicas e hipermobilidade generalizada. Finalmente, dois dos pacientes faleceram devido à doença; um por anafilaxia aos 20 anos de idade e outro por um aneurisma cerebral aos 35 anos de idade. Essas apresentações clínicas destacam a gravidade da doença multissistêmica encontrada nesta coorte de pacientes.
A análise funcional das variantes de STAT6 confirma sua atividade GOF
Para avaliar o impacto funcional das variantes de STAT6, selecionamos células HEK293 como nosso sistema modelo, pois essas células não possuem STAT6 endógeno, mas expressam outros componentes da via de IL-4R (Fig. 3 A). Células HEK293 foram transfectadas com cada uma das 10 variantes de STAT6 de pacientes, juntamente com três controles diferentes: STAT6 WT, uma variante de STAT6 prevista como prejudicial encontrada no banco de dados de população saudável gnomAD (p.A321V) e uma variante de STAT6 bioquimicamente inativa (p.Y641F).

Para investigar a atividade do fator de transcrição STAT6, realizamos ensaios de luciferase com três diferentes plasmídeos repórteres contendo sítios de ligação de STAT6. Embora houvesse algumas diferenças relacionadas às combinações específicas de plasmídeos repórteres e variantes de pacientes, houve evidência de atividade GOF com todas as variantes de STAT6 de pacientes, resultando em maior atividade promotora no basal e após estimulação em comparação aos controles (Fig. 3 B e Fig. S3, A e B).

O status de fosforilação das variantes de STAT6 também foi quantificado por citometria de fluxo e confirmou-se ser maior no basal e após estimulação em comparação ao WT (Fig. 3, C e D; e Fig. S3 C). A fosforilação de STAT6 não foi detectável por citometria de fluxo para a variante p.P643R; no entanto, o aumento da fosforilação basal foi confirmado por imunoblotting (Fig. 3 E e Fig. S3, D e E). Isso pode indicar uma mudança conformacional na estrutura terciária de STAT6 próximo ao sítio de fosforilação p.Y641 para esta variante, que a tornou inacessível ao anticorpo de citometria de fluxo.
Variantes do STAT6 levam ao aumento da atividade do STAT6 em células HEK293 e células T Jurkat. (A) Esquema ilustrando a ativação clássica do STAT6 mediada por IL-4, dimerização e fosforilação. (B) Ensaio de luciferase da atividade do STAT6 em um plasmídeo contendo um sítio de ligação 4× STAT6 (TTCCCAAGAA; as bases sublinhadas representam dois meio-sítios para ligação específica do STAT6) para células HEK293 transfectadas com WT e diferentes variantes do STAT6 antes e após estimulação com IL-4 (0,02 ng/ml por 4 h); n = 3. (C) Expressão de STAT6 fosforilado (Y641) em células HEK293 transfectadas com WT e variantes do STAT6 antes e após tratamento com IL-4 (10 ng/ml por 30 min). A estratégia de gate para células pSTAT6+ pode ser encontrada na Fig. S3 C. (D) Quantificação de C; n = 4. (E) Imunoblot em células HEK293 transfectadas com variantes WT, inativa (p.Y641F), p.P643R e p.D419G do STAT6 para pSTAT6 e tag Myc antes e após tratamento com IL-4 (10 ng/ml por 30 min); n = 3. O imunoblot completo para isso pode ser encontrado na Fig. S3, D e E. (F) Análise de componentes principais (PCA) comparando células T Jurkat transduzidas com STAT6 WT (verde), p.E382Q (azul) e p.D419G (roxo) não estimuladas e estimuladas (100 ng/ml de IL-4 por 4 h). Símbolos individuais representam réplicas técnicas de um pool transduzido para cada genótipo. A contribuição de PC1 e PC2 é mostrada entre parênteses. (G) Contagens normalizadas comparando WT estimulado (verde) vs. p.E382Q (azul) ou p.D419G (roxo), para IL4R, CISH e XBP1. (H) Representação em heatmap das contagens normalizadas de um conjunto de transcrição definido como alvos de IL-4 em células T Jurkat transduzidas. (I e J) O asterisco indica valor de P ajustado <0,05. Gráficos de GSEA para (I) genes alvo do STAT6 curados comparando WT vs. p.E382Q (azul) ou p.D419G (roxo) na condição basal, ou (J) genes alvo de IL-4-TH2 comparando WT vs. p.E382Q (azul) ou p.D419G (roxo) após estimulação com IL-4. O escore de enriquecimento normalizado e o valor de P ajustado são mostrados. Os dados de origem estão disponíveis para esta figura: SourceData F3.
Ensaios in vitro demonstram que variantes de STAT6 levam ao aumento da atividade de STAT6. (A e B) Ensaio de luciferase da atividade de STAT6 em um plasmídeo contendo (A) o promotor de CCL26 e (B) o promotor de FcεR2 para células HEK293 transfectadas com STAT6 selvagem (WT) ou com diferentes variantes de STAT6, antes e após estímulo com IL-4 (100 ng/ml por 40 h), n = 3. (C) Estratégia de gating para determinar a porcentagem de células HEK293 pSTAT6 positivas: um dot plot para fluorescência menos um (FMO) é apresentado e foi utilizado para estabelecer células pSTAT6+. (D e E) Imunoblots de comprimento total dos imunoblots recortados mostrados na Fig. 3 E, exibindo células HEK293 transfectadas com variantes de STAT6 WT, inativa (p.Y641F), p.P643R e p.D419G para (D) Myc-tag e β-actina, bem como (E) pSTAT6 antes e após tratamento com IL-4 (10 ng/ml por 30 min). (F) Genes significativamente regulados positivamente (i) e regulados negativamente (ii) após tratamento com IL-4 em células Jurkat WT (verde), p.E382Q (azul) e p.D419G (roxo) conforme mostrado no diagrama de Venn. (G) Análises de enriquecimento em nível de amostra de vias imunes significativamente enriquecidas do MSigDB Hallmark em amostras não estimuladas e estimuladas com IL-4, comparando WT vs. p.E382Q ou p.D419G. O heatmap é normalizado entre as linhas e mostrado como expressão relativa.

Em seguida, avaliamos se o aumento da atividade do promotor leva a alterações transcriptômicas globais. Como estudos transcriptômicos em células HEK293 após estímulo com IL-4 têm sido difíceis de interpretar, expressamos de forma estável p.E382Q e p.D419G STAT6 por transdução lentiviral em células T Jurkat, que expressam STAT6 endógeno e servem como modelo de heterozigosidade. Aqui, observamos que as células transduzidas com WT, p.E382Q e p.D419G se agruparam separadamente umas das outras tanto no estado basal quanto após estímulo com IL-4 (Fig. 3 F). A análise de expressão gênica diferencial revelou um aumento significativo na abundância de transcritos de genes alvo conhecidos de STAT6, incluindo IL4R, CISH e XBP1, em células transduzidas com p.E382Q e p.D419G em comparação com o controle transduzido com WT (Fig. 3 G). Curiosamente, p.E382Q e p.D419G tiveram 67 e 80 hits aumentados de forma única, que não se sobrepuseram com WT nem entre si (Fig. 3 H, Fig. S3 F e Tabela S6). Isso sugere que a atividade alterada de ambos p.E382Q e p.D419G não se restringe apenas ao aumento da atividade dos alvos conhecidos de STAT6. Uma investigação adicional por meio de análises de enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA) mostrou aumento do enriquecimento em genes alvo de IL-4-STAT6 no estado basal (Fig. 3 I e Tabela S7), aumento do enriquecimento em drivers de T helper 2 (TH2) após estímulo (; Fig. 3 J e Tabela S7) e aumento do enriquecimento em vias de proliferação para p.D419G, consistente com sua conhecida atividade oncogênica (; Fig. S3 G).

Pacientes com variantes de GOF STAT6 apresentam cinética de desfosforilação de STAT6 mais lenta após estímulo com IL-4 e uma assinatura TH2 aumentada.
Para investigar melhor o papel das variantes GOF de STAT6 em células primárias, a fosforilação de STAT6 foi quantificada em amostras de pacientes. Inesperadamente, não encontramos diferenças na porcentagem de células positivas para fosfo-STAT6 entre pacientes e controles saudáveis após estimulação com IL-4 ao longo de um período de 60 min, nem após estimulação com diferentes doses de IL-4 (Fig. S4, A e B). No entanto, diferenças surgiram quando monitoramos a cinética de desfosforilação de STAT6 após a estimulação (Fig. 4, A e B; e Fig. S4 C). Especificamente, a remoção de IL-4 por lavagem levou a uma cinética de desfosforilação mais lenta de STAT6 na maioria das células de pacientes em comparação com controles saudáveis (Fig. 4, A e B; e Fig. S4 D), corroborando um mecanismo GOF em linfócitos de pacientes. Observamos que um de nossos grupos familiares não apresentou desfosforilação retardada (Fig. S4 D), sugerindo que este pode não ser o único mecanismo GOF. De fato, o aumento da atividade de STAT6 sem fosforilação foi previamente relatado em pesquisas sobre linfoma folicular que estudam o ponto de mutação p.D419.
Medida da atividade de STAT6 em linfócitos primários de pacientes. (A) Curso temporal de 1 h para medir a fosforilação de STAT6 em diferentes populações de linfócitos de cinco pacientes (vermelho) e um controle saudável (azul) após estimulação com IL-4 (10 ng/ml). (B) Resposta à dose em LCLs do paciente um (vermelho) vs. um controle saudável (azul) após estimulação das células com várias doses de IL-4 por 15 min. (C) Estratégia de gating para determinar % de células pSTAT6 positivas em LCLs: dot plot para FMO é apresentado e foi usado para estabelecer células pSTAT6+. (D) Histogramas mostrando a fosforilação de STAT6 em controle saudável (azul) e pacientes com genótipo p.D419Y (vermelho, n = 2), p.D519H (roxo, n = 4), p.D419N (rosa, n = 1) e controles saudáveis (azul, n = 5) em blastos de células T que foram estimulados com IL-4 (10 ng/ml) por 15 min, lavados com PBS e subsequentemente incubados em meio livre de IL-4 por 60 min. A quantificação de células pSTAT6+ é apresentada e normalizada para a estimulação máxima (observada aos 15 min). ANOVA de duas vias seguida de comparações múltiplas de Šídák foi realizada. **, P < 0,01. (E) Leitura de 92 biomarcadores para P5 usando proteômica Olink de alto rendimento. Oito distribuições de controles saudáveis são mostradas como um gráfico de violino em azul. O paciente é mostrado como um círculo vermelho. Citocinas-chave, IL-4 e IL-13, são destacadas em amarelo. (F) Distribuição de células T auxiliares para nove pacientes (vermelho) e 15 controles saudáveis pareados por idade (azul) cada. (G) Comparação transcriptômica de células T CD4+ ingênuas e CD8+ ingênuas entre P6 e um controle saudável medida por scRNAseq. Genes em vermelho são enriquecidos no paciente; genes em azul são enriquecidos no controle saudável. As duas linhas pontilhadas são o valor de P e o valor de P ajustado, respectivamente. (H) Quantificação da % de células CD23 positivas em células B ingênuas, de memória não trocada de classe e de memória trocada de classe entre pacientes (vermelho, n = 7) e controles saudáveis (azul, n = 9) após estimulação com IL-4 (10 ng/ml) por 20 h. Teste t não pareado. *, P < 0,05; **, P < 0,01.
Linfócitos primários de pacientes com GOF de STAT6 apresentam maior atividade de STAT6 e polarização TH2.
(A) Histogramas mostrando a fosforilação de STAT6 em LCLs de controle saudável (azul) e paciente (vermelho) estimuladas com IL-4 (10 ng/ml) por 15 min, lavadas com PBS e subsequentemente incubadas em meio sem IL-4 por 15, 30 e 60 min. A estratégia de gate para células pSTAT6+ pode ser encontrada na Fig. S4 C.
(B) Quantificação de células pSTAT6+ de três experimentos separados realizados em A, teste t não pareado múltiplo corrigido para comparação múltipla usando o método de Benjamini–Hochberg. ***, P < 0,001.
(C) Frequência de células IL5+, IL13+ e IL4+ em células T CD4+ de memória de um paciente representativo, juntamente com um controle saudável representativo.
(D) Quantificação de C mostrando células IL5+, IL13+ e IL4+ em pacientes juntamente com 15 controles saudáveis pareados por idade. **, P < 0,01; ***, P < 0,001.
(E) Visualização por aproximação e projeção de manifold uniforme (UMAP) de scRNAseq realizado em células T enriquecidas comparando um paciente com um controle saudável pareado por idade.
(F) Gráfico de pontos mostrando a expressão de genes diferencialmente expressos selecionados (valor P ajustado < 0,05) observados no scRNAseq entre paciente e controle saudável e associados a células T, células B, monócitos ou células dendríticas.
Dado que o eixo STAT6 é crítico para a diferenciação de células TH2, um subconjunto de células T auxiliares CD4+ que é um grande contribuinte para a patogênese da doença alérgica, investigamos em seguida as assinaturas TH2 nesses pacientes. Os pacientes mostraram polarização em direção à atividade da via TH2 em comparação com controles saudáveis com base em níveis mais elevados das citocinas TH2 IL-5, IL-13 e IL-4, conforme medido por citometria de fluxo (Fig. 4, C e D), ou por assinatura transcriptômica por sequenciamento de RNA de célula única (scRNAseq; Fig. 4 E). A proteômica de alto rendimento também validou o aumento da expressão de IL-4, mas não a alta expressão de IL-13 (Fig. S4 E). Diferenças nas proporções de outros subconjuntos de células T auxiliares foram restritas a maiores células IL-21+ em células T CD4+ de memória de pacientes (Fig. S4 F). O scRNAseq mostrou que as células B de pacientes expressavam altos níveis de IGHE e baixos níveis de IGHG3 (Fig. 4 F), refletindo padrões opostos aos observados em camundongos knockout para STAT6, e as células T CD4+ expressam altos níveis de GATA3. O scRNAseq demonstrou ainda que IL4R, um gene que codifica um receptor chave que medeia a ativação de STAT6, foi regulado positivamente em todos os subconjuntos de células B e T (Fig. 4 F e Fig. S4 G).
Usando citometria de fluxo, confirmamos que a expressão de IL-4Rα era significativamente maior tanto nas células T CD4+ naive quanto de memória de sete pacientes de três diferentes famílias em comparação com nove controles saudáveis (Fig. 5 A). A expressão de IL-4Rα também foi encontrada como maior nas células B de memória não comutada e comutada de células primárias de pacientes não estimuladas (Fig. 5 B). Esses achados sugerem uma maior atividade basal de STAT6 nas células dos pacientes, impulsionando a expressão de IL-4Rα, semelhante ao observado em nosso modelo Jurkat (Fig. 3, G–J; e Tabelas S6 e S7). Finalmente, medimos a expressão de CD23 (o receptor de IgE de baixa afinidade, FcεRII) que é conhecido por ser regulado positivamente por STAT6 (Fig. S3 B) e encontramos maior expressão de CD23 em todos os subconjuntos de células B dos pacientes na linha de base (Fig. 5 B) e após estimulação com IL-4 (Fig. S4 H). Em conjunto, esses experimentos conduzidos com células primárias de pacientes confirmam ainda mais o fenótipo GOF de STAT6.

Linfócitos primários de pacientes com GOF de STAT6 exibem alta expressão de genes alvo de STAT6. (A) A expressão de IL4Rα em células CD4+ naive e de memória é quantificada como % de células positivas em células primárias de pacientes (n = 7, vermelho) e controles saudáveis (n = 9, azul). A estratégia de gate para células CD4+ naive e de memória é apresentada juntamente com um dot plot para uma amostra de fluorescência menos um (FMO) IL-4Rα para exibir a definição de gate IL-4Rα+, bem como um dot plot representativo de um paciente e um controle saudável. (B) A expressão de CD23 e IL4Ra em células B naive, de memória não comutada e de memória é quantificada como % de células positivas em células primárias de pacientes (n = 7, vermelho) e controles saudáveis (n = 9, azul). A estratégia de gate para subconjuntos de células B é apresentada juntamente com um dot plot para uma amostra FMO IL-4Rα para exibir a definição de gate IL-4Rα+, bem como um dot plot representativo de um paciente e um controle saudável. Teste t não pareado. **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Inibidores de JAK e anticorpo monoclonal IL-4Rα podem ser usados como potenciais terapêuticas para pacientes com variantes GOF de STAT6

Devido à gravidade da doença alérgica multissistêmica experimentada pelos pacientes em nossa coorte, várias abordagens de tratamento foram utilizadas ao longo dos anos. Os corticosteroides, administrados topicamente e sistemicamente, foram a base do tratamento para a maioria dos pacientes. Infelizmente, mesmo altas doses de corticosteroides não foram capazes de controlar a inflamação alérgica e foram responsáveis por muitos efeitos colaterais, incluindo catarata e osteoporose. Outros tratamentos utilizados nesta coorte que se mostraram ineficazes incluíram tacrolimo tópico, metotrexato oral e mepolizumabe (um anticorpo monoclonal anti-IL-5).
Tendo demonstrado que variantes heterozigóticas do STAT6 levam a maior atividade do STAT6 e desvio imunológico TH2, testamos in vitro se o direcionamento da via do STAT6 poderia ser clinicamente benéfico. Com base em nossos achados de maior fosforilação do STAT6 e maior expressão de IL-4Rα, selecionamos os inibidores de JAK, ruxolitinibe e tofacitinibe, e o anticorpo anti-IL-4Rα, dupilumabe, como drogas para testar in vitro, pois todos são usados clinicamente para tratamento de doenças alérgicas. Demonstramos que tanto ruxolitinibe quanto tofacitinibe diminuíram efetivamente a fosforilação/ativação aumentada específica do paciente do STAT6 em células HEK293 na linha de base e após estimulação com IL-4, enquanto dupilumabe inibiu o aumento mediado por IL-4 na atividade do STAT6 (Fig. 6 A e Fig. S5 A). Confirmamos ainda em células primárias de pacientes que tofacitinibe acelerou a desfosforilação do STAT6 após estimulação com IL-4 (Fig. 6 B). Esses dados sugerem o potencial benefício clínico de direcionar diretamente a via IL-4/STAT6 em pacientes com variantes GOF do STAT6.

Inibidores de JAK e anticorpo IL-4Rα podem ser usados como potenciais terapêuticas para pacientes com variantes GOF do STAT6. (A) Quantificação da expressão de fosfo-STAT6 em células HEK293 transfectadas não tratadas (preto) pré-tratadas com ruxolitinibe (10 μM, 1 h; rosa), tofacitinibe (10 μM, 1 h; verde) ou dupilumabe (10 nM, 1 h; azul), antes e após estimulação com IL-4 (10 ng/ml, 30 min). Pontos individuais representam transfectações separadas para cada genótipo (n = 4). A estratégia de gating para células pSTAT6+ pode ser encontrada na Fig. S3 C. Teste ANOVA de uma via e pós-teste de Tukey. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001. (B) Quantificação de células pSTAT6+ em LCLs de paciente (vermelho) e controle saudável (azul) estimuladas com IL-4 (10 ng/ml por 15 min), lavadas e incubadas com tofacitinibe (10 μM) por 15, 30 e 60 min. Linhas pontilhadas translúcidas indicam ausência de tratamento com tofacitinibe (Fig. 4 B); n = 1. A estratégia de gating para células pSTAT6+ pode ser encontrada na Fig. S4 C. (C) Assinatura gênica de proporção de tipos celulares determinada pelo software Cibersort, em um paciente em tratamento com dupilumabe por 2 anos e cinco controles saudáveis. Os rótulos das células estão listados à direita. (D) Gráfico de rosca mostrando frequências de subconjuntos de linfócitos T CD4+ auxiliares em um paciente, um controle saudável pareado por idade (Fig. 4 E) e uma amostra de paciente 2 anos após tratamento com dupilumabe, medida por scRNAseq em células T enriquecidas. A frequência de células TH2 é quantificada nos gráficos de rosca das diferentes amostras. (E) Gráficos de violino mostrando expressão de IL4R no paciente (vermelho), controle saudável (azul) e uma amostra 2 anos após dupilumabe (verde). (F) Pontuação de eczema, EASI e SCORAD, para dois pacientes após tratamento com múltiplas doses de dupilumabe. (G e H) Fotografias das mãos mostrando (G) a gravidade da dermatite atópica antes e (H) a melhora após tratamento com dupilumabe.
A atividade do STAT6 pode ser alvo terapêutico e pode resolver a gravidade clínica da doença. (A) Quantificação do ensaio de luciferase em células HEK293 transfectadas pré-tratadas com ruxolitinibe (10 μM, 1 h), tofacitinibe (10 μM, 1 h) ou dupilumabe (10 nM, 1 h), antes e após estimulação com IL-4 (0,02 ng/ml, 4 h). n = 4. ANOVA de uma via e teste post-hoc de Tukey. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001. (B) As contagens de eosinófilos antes e após o início do tratamento com dupilumabe são apresentadas. Os pontos em vermelho correspondem aos dados transcriptômicos deste paciente apresentados na Fig. 6 C. (C) PCA comparando RNAseq em massa de sangue total de P6 antes do tratamento com dupilumabe e quatro pontos temporais após o tratamento, juntamente com cinco controles saudáveis. (D) Assinaturas de heatmap de genes expressos diferencialmente comparando amostras de pacientes pré-tratamento com cinco controles saudáveis. Os genes são normalizados por linha. (E) Genes-chave, previamente descritos como biomarcadores para doença alérgica em RNA de sangue total, são apresentados para as amostras do paciente. A área sombreada em cinza é o intervalo de expressão desses genes em cinco controles saudáveis.
Uma vez que sua variante GOF do STAT6 foi identificada, três dos pacientes iniciaram o tratamento com dupilumabe e todos apresentaram melhora clínica significativa. P6, que está em tratamento com dupilumabe há mais de 2 anos, serve como exemplo ilustrativo. Espelhando as contagens de eosinófilos no sangue periférico (Fig. S5 B), o RNAseq repetido de sangue total mostrou alterações transcriptômicas globais que sugeriam um aumento leve nas assinaturas de genes eosinofílicos e alérgicos após 38 dias, seguidas por uma mudança do transcriptoma em direção aos controles saudáveis após 123 e 492 dias, respectivamente (Fig. 6 C e Fig. S5, C–E). O scRNAseq confirmou uma diminuição nas assinaturas de genes TH2 dois anos após o início do dupilumabe, acompanhada por uma diminuição na expressão de IL-4R tanto em células T CD4+ quanto CD8+ ingênuas (Fig. 6, D–E). Clinicamente, essas alterações foram acompanhadas por um aumento dramático na velocidade de crescimento, melhora da condição da pele quantificada pelos escores SCORAD (SCORing atopic dermatitis) e EASI (eczema area and severity index), e a capacidade de reduzir os corticosteroides orais (Fig. 6, F–H). Da mesma forma, P1 experimentou benefícios clínicos notáveis com dupilumabe, com melhora da inflamação cutânea (Fig. 6 D), resolução do prurido e capacidade de descontinuar os corticosteroides orais diários em altas doses. Além da resolução da inflamação cutânea com dupilumabe, P2 conseguiu descontinuar a budesonida ingerida sem exacerbação da gravidade de sua esofagite eosinofílica. Nossos dados pré-clínicos também sugeriram que os inibidores de JAK podem ser benéficos (Fig. 6, A e B), e P4 havia recebido tofacitinibe (5 mg/dia) por 2 meses no momento em que este manuscrito foi finalizado. Sua resposta inicial ao tofacitinibe foi encorajadora, com menos disfagia, menos impactação alimentar esofágica, melhora na aparência endoscópica do esôfago e uma redução acentuada no número de eosinófilos intraepiteliais.
Apresentamos uma combinação de evidências clínicas, genéticas, moleculares e transcricionais de uma nova doença humana causada por variantes germinativas autossômicas dominantes com ganho de função (AD GOF) no gene STAT6 em 16 pacientes com doença alérgica grave ao longo da vida. Essas variantes levaram à fosforilação sustentada de STAT6, ao aumento da expressão de genes-alvo de STAT6 e a um perfil transcricional polarizado para TH2. De forma importante, demonstramos em três pacientes que o tratamento com dupilumabe é uma opção terapêutica altamente eficaz e direcionada, melhorando tanto as manifestações clínicas da doença quanto os biomarcadores imunológicos.

Embora o fenótipo completo dos indivíduos com variantes GOF no STAT6 só seja descoberto por meio da identificação de mais indivíduos afetados, propomos classificar a síndrome humana germinativa AD GOF STAT6 como uma doença de predisposição alérgica (PAD). Com base em nosso estudo, possíveis "sinais de alerta" clínicos para essa nova doença incluem: (i) início precoce na vida; (ii) eosinofilia no sangue periférico; (iii) níveis elevados de IgE sérica; (iii) dermatite atópica generalizada e resistente ao tratamento; (iv) múltiplas alergias alimentares e a medicamentos; (v) anafilaxia grave (e até fatal); (vi) infecções recorrentes de pele e respiratórias; (vii) distúrbio gastrointestinal eosinofílico, incluindo esofagite eosinofílica; (viii) asma; (ix) rinoconjuntivite alérgica; (x) baixa estatura; e possivelmente (xi) malformações vasculares cerebrais.

O STAT6 está intimamente ligado à biologia da inflamação alérgica. O papel central e mais estudado do STAT6 é mediar os efeitos biológicos da IL-4, uma citocina necessária para a diferenciação de células TH2, sobrevivência e proliferação de células B, mudança de classe para IgE, bem como para direcionar a polarização de macrófagos M2. Em células T, a ativação do STAT6 induz a expressão de GATA3, o regulador mestre da diferenciação TH2, que por sua vez aumenta a expressão de IL-4, IL-5 e IL-13, citocinas necessárias para promover respostas alérgicas ao ativar mastócitos e eosinófilos. A presença de populações maiores de células TH2, ou células TH2 produzindo quantidades abundantes de IL-4/IL-5/IL-13, pode ser um impulsionador do fenótipo alérgico observado em nossos pacientes. Níveis elevados de IgE em parceria com mastócitos são importantes tanto para manifestações agudas quanto crônicas de distúrbios alérgicos e podem ser um impulsionador adicional da diátese alérgica. A hiperativação do STAT6 em células epiteliais das vias aéreas e células dendríticas residentes pode criar ainda mais um ambiente favorável à asma e doença pulmonar crônica, pois isso induziria a produção de quimiocinas que promovem células TH2 e recrutamento de eosinófilos. A genética populacional fornece suporte adicional para o papel central que o STAT6 desempenha no desenvolvimento de doenças alérgicas humanas. Múltiplos estudos de associação genômica ampla (GWAS) independentes descobriram que polimorfismos no STAT6 estão associados a várias condições alérgicas (Tabela 1). Nosso estudo expande essa compreensão do papel do STAT6 em doenças humanas ao estabelecer que variantes heterozigóticas de ganho de função causam uma forma monogênica de doença alérgica grave.
Número de estudos de GWAS publicados ligando polimorfismos (SNPs) no STAT6 a doenças alérgicas comuns na população
Fenótipo Número de associações publicadas Referências Asmaa 14 Contagem de eosinófilos 7 Doença alérgica 3 Dermatite atópica/eczema 3 Nível sérico de IgE 2 Sensibilização alérgica 2 Rinite alérgica 1 Distúrbios gastrointestinais eosinofílicos 1
Associações genômicas significativas (P < 5 × 10−8) entre SNPs no STAT6 e todas as características alérgicas relevantes foram obtidas através do National Human Genome Research Institute–European Bioinformatics Institute GWAS Catalog (https://www.ebi.ac.uk/gwas/).
Inclui asma, asma de início na infância, asma de início na idade adulta e asma atópica.
O aneurisma cerebral fatal em P10 (p.E382Q) não foi clinicamente previsto, mas é possível que a variante GOF do STAT6 também tenha aumentado o risco de desenvolvimento de aneurismas cerebrais. De fato, P1 (p.D419G) também apresentou múltiplas variantes anatômicas raras nas artérias do Polígono de Willis. Aneurismas intracranianos foram relatados em pacientes com perda de função (LOF) do STAT3 e ganho de função (GOF) do STAT1. O aumento da ativação de outros membros da família STAT, incluindo STAT2, STAT3 e STAT5, também foi observado em aneurismas da aorta abdominal humana (STAT6 não foi avaliado), embora não esteja claro se o aumento da fosforilação de STAT contribui para aneurismas ou é resultado da inflamação causada por aneurismas. À medida que mais indivíduos com variantes GOF do STAT6 são identificados, a possibilidade de anomalias vasculares cerebrais merece investigação.

Vale notar que o paciente mais velho desta coorte, P7 (p.D419H), apresentou linfoma de células B recorrente—linfoma folicular aos 49 anos e linfoma difuso de grandes células B aos 60 anos. Mutações somáticas ativadoras no STAT6 são bem documentadas em linfoma de células B, sendo o aminoácido D419 um ponto de mutação particular. A variante p.D419H do paciente foi relatada várias vezes como uma mutação somática no COSMIC, assim como outras variantes encontradas em nossa coorte de pacientes (ou seja, p.D419, p.D519 e p.P643). Mais pacientes precisarão ser identificados e acompanhados para definir completamente o fenótipo causado por variantes germinativas GOF do STAT6, mas é biologicamente plausível que esses pacientes possam ter maior risco de desenvolver malignidades de células B, justificando maior vigilância clínica.
Um modelo GOF de STAT6 (designado STAT6VT) foi previamente descrito in vitro e tem sido utilizado para estudar dermatite atópica crônica em modelos de camundongos. O STAT6VT apresenta a substituição de dois resíduos de aminoácidos, nas posições 547 e 548, no domínio SH2, resultando em um mutante de STAT6 que é constitutivamente ativo de forma independente de IL-4 e não responde à estimulação por IL-4. Os humanos que identificamos com variantes GOF de STAT6 e os camundongos STAT6VT compartilham uma série de características-chave da diátese alérgica, incluindo IgE sérica elevada e dermatite atópica crônica. Muito recentemente, foi publicado um relato descrevendo um pai e seus dois filhos com doença alérgica grave, todos heterozigotos para a variante GOF de STAT6 p.E377K. Esta nova família compartilha muitas das características que relatamos em nossa coorte de 10 famílias (Fig. 2 A), enfatizando ainda mais que pacientes com doença alérgica grave de início precoce devem ser avaliados quanto a defeitos genéticos monogênicos subjacentes, incluindo STAT6.

Atualmente, existe uma lista crescente de defeitos genéticos únicos em humanos que causam a tríade fenotípica clássica de hiper-IgE: eczema, infecções recorrentes de pele e pulmão e IgE sérica elevada. A síndrome de hiper-IgE AD causada por variantes dominantes negativas em STAT3 (ou seja, síndrome de Job ou LOF de STAT3) é a melhor caracterizada dessas condições, mas essa lista de distúrbios também inclui outros distúrbios AD (IL6ST) e autossômicos recessivos (AR; ZNF341, IL6ST). Notavelmente, os pacientes que identificamos com variantes GOF de STAT6 apresentaram algumas das características extra-imunológicas típicas de LOF de STAT3, especificamente articulações hipermóveis, fraturas patológicas e anomalias vasculares.

Além de definir o fenótipo de GOF de STAT6, também apresentamos evidências laboratoriais e clínicas que apoiam a eficácia do tratamento com dupilumabe e tofacitinibe nesses pacientes. Foi notável que os três pacientes (P1, P2 e P6) que receberam dupilumabe experimentaram melhora dramática da dermatite atópica e puderam ser desmamados dos corticosteroides sistêmicos. O P6, que apresentava baixa estatura e idade óssea atrasada antes de iniciar o agente biológico, experimentou rápido ganho de altura e peso após o início do dupilumabe. Além dos benefícios clínicos documentados da terapia com dupilumabe em pacientes com GOF de STAT6, também apresentamos dados iniciais sugerindo que os inibidores de JAK, ruxolitinibe ou tofacitinibe, podem ser eficazes nesses pacientes.
Embora este estudo tenha muitos pontos fortes, notavelmente o fenótipo alérgico extremo dos 16 pacientes combinado com uma avaliação funcional aprofundada de suas variantes do STAT6; devido à natureza global de nossa coorte, o estudo apresenta limitações. Primeiro, os pacientes foram identificados por seus médicos especialistas locais como candidatos para avaliação genética com base em seu fenótipo alérgico extremo e, em alguns casos, em seu histórico familiar. Como resultado, não temos critérios de inclusão definidos de forma prospectiva. Segundo, a natureza global da coorte e a variação no acesso local a medicamentos como dupilumabe limitaram nossa capacidade de realizar os mesmos ensaios em células primárias pré-tratamento de todos os pacientes. Apesar dessas limitações, nosso estudo identifica variantes GOF no STAT6 como um novo distúrbio alérgico monogênico. Também apresentamos evidências clínicas e de célula única da eficácia do dupilumabe em pacientes com GOF no STAT6. Antecipamos que essa descoberta facilitará o reconhecimento e o tratamento direcionado de mais indivíduos afetados e que, com o tempo, surgirá uma definição completa da relação genótipo-fenótipo humano causada por variantes GOF da linhagem germinativa do STAT6 humano, incluindo a compreensão do risco de linfoma.

Com base em nossos achados relatados neste estudo, sugerimos que variantes GOF heterozigotos no STAT6 sejam adicionadas à lista de causas de herança autossômica dominante do fenótipo hiper-IgE. Embora cada uma das condições conhecidas por causar um fenótipo hiper-IgE tenha algumas características clínicas específicas (por exemplo, infecções virais da pele são uma característica definidora da deficiência de DOCK8), há uma sobreposição clínica considerável e testes aprovados clinicamente dessas vias raramente estão disponíveis. Portanto, recomendamos o teste genético como a abordagem diagnóstica inicial mais eficiente para pacientes que apresentam doença alérgica grave com início muito precoce na vida. Finalmente, demonstramos que o dupilumabe e a inibição de JAK podem ser opções de tratamento direcionado eficazes para pacientes com variantes GOF no STAT6.

Materiais e métodos
Considerações éticas
Todos os procedimentos realizados no estudo estavam de acordo com os padrões éticos do comitê de pesquisa institucional e com a declaração de Helsinque de 1964 e suas emendas posteriores ou padrões éticos comparáveis. Todos os participantes do estudo e/ou seus pais/responsáveis forneceram consentimento informado por escrito. Os protocolos de estudo de pesquisa foram aprovados pelas instituições locais, especificamente: The University of British Columbia Clinical Research Ethics Board (H09-01228, H15-00641), University College London Research Ethics Committee (04/Q0501/119, 06/Q0508/16), University of Hong Kong Institutional Review Board (UW 08-301), National Institutes of Health Institutional Review Board (NCT01164241), Children’s Hospital of Philadelphia Institutional Review Board (19-016617), Children’s Hospital Bambino Gesù Ethical Committee (1702_OPBG_2018).
Com base na disponibilidade local, o sequenciamento de nova geração, seja de pesquisa ou clínico, do DNA genômico foi realizado usando exoma completo ou uma abordagem de painel direcionado (conforme descrito anteriormente). Após análise bioinformática, variantes de novo e herdadas do STAT6 que foram previstas como prejudiciais e que segregaram com a doença foram identificadas em cada família (Tabelas S4 e S5).
Geração e expressão de plasmídeos variantes do STAT6
As variantes do STAT6 descritas neste estudo foram geradas por meio de mutagênese sítio-dirigida (SDM) para fins de transfecção. A expressão do STAT6 WT ou de variantes do STAT6 foi induzida transitoriamente em células HEK293 usando lipofectamina, ou estavelmente em células T Jurkat usando uma abordagem lentiviral. Consulte os métodos suplementares no final do PDF para obter detalhes.
Ensaios repórteres de luciferase
Plasmídeos repórteres de luciferase codificando um sítio de ligação 4× STAT6 (TTCCCAAGAA; as bases sublinhadas representam os dois meios-sítios para ligação específica do STAT6), codificando o sítio promotor para CCL26 e codificando o sítio promotor para FCER2 foram usados para avaliar a atividade promotora do STAT6 WT e variante. Consulte os métodos suplementares no final do PDF para obter detalhes.
Citometria de fluxo
(a) Fosfo-citometria de fluxo: A fosforilação do STAT6 foi determinada via fosfo-citometria de fluxo para células HEK293 transfectadas com STAT6, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), blastos de células T e linhagens de células B linfoblastoides transformadas por EBV (LCLs). (b) Coloração intracelular de citocinas: A coloração intracelular de citocinas foi realizada em nove PBMCs de pacientes, juntamente com 15 controles saudáveis, para estudar subconjuntos de células T CD4+ auxiliares conforme descrito anteriormente. (c) A expressão de CD23 e IL-4Rα foi estudada em sete PBMCs de pacientes e nove PBMCs de controles saudáveis. Consulte os métodos suplementares no final do PDF para obter detalhes.
Imunotransferência
A imunotransferência foi realizada conforme descrito anteriormente para avaliar o estado de fosforilação da variante p.P643R do STAT6, uma vez que a fosforilação desta variante não pôde ser detectada por citometria de fluxo, usando um anticorpo contra o sítio de fosforilação da tirosina 641. Consulte os métodos suplementares no final do PDF para obter detalhes.
RNAseq
(a) Células Jurkat: Para modelar as alterações transcriptômicas causadas por variantes do STAT6, células T Jurkat foram transduzidas com c.1144G>C, p.E382Q, c.1256A>G, p.D419G ou STAT6 WT. As células foram deixadas não estimuladas ou estimuladas com 100 ng/ml de IL-4 por 4 h e posteriormente usadas para extração e sequenciamento de RNA. (b) Sangue total: O RNAseq em massa foi realizado em 10 amostras: uma amostra de paciente antes do início do tratamento com dupilumabe, quatro amostras de paciente após o início do tratamento com dupilumabe e cinco controles saudáveis. (c) scRNAseq: Realizado em PBMCs e células T enriquecidas da amostra do paciente antes e 2 anos após o tratamento com dupilumabe, juntamente com um controle saudável pareado por idade. Consulte os métodos suplementares no final do PDF para obter detalhes.
Histologia
Tecido gástrico, duodenal e de pele fixado em formalina e embebido em parafina foram seccionados e submetidos à coloração H&E.
Modelagem estrutural
Os efeitos das variantes do STAT6 na função e estrutura da proteína foram analisados usando modelos tridimensionais. O SWISS-MODEL foi utilizado para modelar as variantes com base em uma estrutura modelo do fator de transcrição STAT6 humano resolvido como um homodímero e em complexo com DNA (PDB: 4Y5W, resolução: 3,1 Å, cadeias A, C, M e N). As estruturas foram visualizadas com o UCSF Chimera.
Material suplementar online
As narrativas clínicas de cada paciente são apresentadas como Dados S1. A Fig. S1 é um modelo estrutural detalhado mostrando a interface entre o DNA e a variante do STAT6. A Fig. S2 mostra o hemograma completo e a avaliação imunológica de todos os pacientes. A Fig. S3 mostra dados in vitro adicionais confirmando a natureza GOF das variantes do STAT6. A avaliação adicional das células primárias dos pacientes é mostrada na Fig. S4. Dados adicionais de tratamento com anticorpo IL4Rα e inibidor de JAK em células e pacientes são apresentados na Fig. S5. A Tabela S1 lista os iniciadores usados para mutagênese sítio-dirigida. A Tabela S2 lista os anticorpos usados para fosfo-fluxo em diferentes subconjuntos imunes. A Tabela S3 lista os anticorpos usados para fenotipagem de TH em PBMCs de pacientes. As previsões de patogenicidade das variantes são apresentadas nas Tabelas S4 e S5. As Tabelas S6 e S7 são listas de genes da análise GSEA mostrada na Fig. 3. Métodos suplementares estão listados no final do PDF.
Material Suplementar
Referências
Um método e servidor para prever mutações missense prejudiciais
Análise baseada em referência do sequenciamento de células únicas pulmonares revela um macrófago profibrótico transicional
O panorama alélico da variação de características de células sanguíneas humanas e ligações com doenças complexas comuns
Dupilumabe em crianças com asma moderada a grave não controlada
Tratamento com dupilumabe em adultos com dermatite atópica moderada a grave
Uma atualização sobre síndromes com fenótipo de hiper-IgE
O fator de transcrição XBP1 é seletivamente necessário para a diferenciação de eosinófilos
Uma forma recessiva da síndrome de hiper-IgE por desregulação da transcrição e atividade do STAT3 dependente de ZNF341
Humanos com deficiência hereditária de CD28 em células T são suscetíveis a papilomavírus cutâneos, mas são saudáveis em outros aspectos
Mutações dominante-negativas no IL6ST humano estão subjacentes à síndrome de hiper-IgE
Deficiência de DOCK8: Insights sobre fisiopatologia, características clínicas e manejo
Tofacitinibe tópico para dermatite atópica: Um ensaio randomizado de fase IIa
Esofagite eosinofílica em crianças: Achados endoscópicos no diagnóstico e pós-intervenção
Meta-análise de estudos de associação genômica ampla identifica dez loci que influenciam a sensibilização alérgica
A expressão de um Stat6 constitutivamente ativo in vivo altera a homeostase de linfócitos com efeitos distintos em células T e B
Infecções virais respiratórias em humanos saudáveis com deficiência hereditária de IRF7
Anormalidades vasculares frequentes e generalizadas na deficiência humana do transdutor de sinal e ativador da transcrição 3
Genética de células sanguíneas transétnica e específica de ancestralidade em 746.667 indivíduos de 5 populações globais
Dos reads aos genes às vias: Análise de expressão diferencial de experimentos de RNA-seq usando rsubread e o pipeline de quasi-verossimilhança do edgeR
Determinar geneticamente faixas de referência clínica individualizadas para o biomarcador triptase pode limitar procedimentos desnecessários e desmascarar neoplasias mieloides
Manifestações cutâneas da síndrome de deficiência de DOCK8
Mutações de ganho de função do STAT1 estão associadas a aneurismas intracranianos
Uma mutação de ganho de função no STAT6
A fenotipagem de lesões semelhantes à dermatite atópica aguda e crônica em camundongos Stat6VT identifica um papel da IL-33 na patogênese da doença
Estudo de associação multirrânico genômico e HLA do nível total de IgE sérica
Estudo de associação em populações miscigenadas africanas nas Américas recapitula loci de risco de asma em populações não africanas
Estudo de associação multiancestral identifica novos loci de risco de asma que colocalizam com marcas de intensificadores de células imunes
Carga e socioeconomia da asma, rinite alérgica, dermatite atópica e alergia alimentar
Perfil genômico global da regulação do fator de transcrição interleucina-4 e STAT6 na programação de células Th2 humanas
Origem genética compartilhada da asma, febre do feno e eczema elucida a biologia das doenças alérgicas
Arquiteturas genéticas da asma de início na infância e na idade adulta são parcialmente distintas
Informações sobre idade de início ajudam a identificar 76 variantes genéticas associadas a doenças alérgicas
A criança com IgE elevada e suscetibilidade a infecções
Clivagem dependente de MALT1 do HOIL1 modula a sinalização canônica de NF-κB e a responsividade inflamatória
IgE e mastócitos na doença alérgica
Novas percepções sobre o conceito multidimensional da ontogenia, ativação e função dos macrófagos
Regulação transcricional pelo STAT6
Identificação de um subconjunto de células T auxiliares foliculares que impulsiona IgE anafilática
Um estudo de associação genômica ampla das concentrações plasmáticas totais de IgE no Framingham Heart Study
Normalização e estabilização de variância de dados de RNA-seq de célula única usando regressão binomial negativa regularizada
Análise genômica ampla destaca a contribuição das vias do sistema imunológico para a arquitetura genética da asma
Sequenciamento completo do exoma baseado em trio em pacientes com suspeita de erros inatos da imunidade esporádicos: Um estudo de coorte retrospectivo
Análise de variante baseada em gene do sequenciamento completo do exoma em relação à contagem de eosinófilos
Análise de associação genômica ampla de 350.000 caucasianos do UK Biobank identifica novos loci para asma, febre do feno e eczema
Determinantes genéticos de características das células sanguíneas influenciam a suscetibilidade à leucemia linfoblástica aguda infantil
Stat6 é necessário para mediar as respostas à IL-4 e para o desenvolvimento de células Th2
Aproveitando o enriquecimento funcional poligênico para melhorar o poder do GWAS
Tratamento da dermatite atópica com creme de ruxolitinibe (inibidor de JAK1/JAK2) ou creme de triancinolona
Ativação do fator de transcrição STAT6 em células T Jurkat pela proteína Tip do herpesvírus saimiri
STAT6 e a regulação da expressão de CD23 na leucemia linfocítica crônica B
Diferenciação em fenótipo de memória efetora potencializa a reversão da latência do HIV-1 em células T CD4+
Produção, concentração e titulação de vetores lentivirais pseudotipados baseados em HIV-1
Uma nova assinatura de expressão gênica em sangue total para multimorbidade de asma, dermatite e rinite em crianças e adolescentes
Base estrutural para o reconhecimento de DNA por STAT6
Alterações locais e sistêmicas nos transdutores de sinal e ativadores de transcrição (STAT) associados a aneurismas da aorta abdominal humana
Compreensão mecanicista da imunodeficiência combinada na deficiência completa de CARD11 humana
Ensaios homogêneos de extensão de proximidade baseados em anticorpos fornecem detecção sensível e específica de proteínas de baixa abundância no sangue humano
Distúrbios atópicos primários
A interleucina-13 regula positivamente a expressão de eotaxina em células epiteliais das vias aéreas por um mecanismo dependente de STAT6
As células mieloides CD11b+ são os mediadores-chave da migração de células Th2 para as vias aéreas na inflamação alérgica
Requisitos para a expressão gênica induzida por interleucina-4 e caracterização funcional de Stat6
Distúrbios atópicos primários
Síndrome de hiper-IgE, atualização de 2021
Assinaturas de RNA-seq normalizadas pela abundância de mRNA permitem a deconvolução absoluta de tipos de células imunes humanas
Resultados diagnósticos moleculares de 700 casos: O que podemos aprender com uma análise retrospectiva do sequenciamento clínico do exoma?
Enumeração robusta de subconjuntos celulares a partir de perfis de expressão tecidual
Circuitos transcricionais densamente interconectados controlam estados celulares na hematopoiese humana
Oitenta e oito variantes destacam o papel da regulação de células T e da remodelação das vias aéreas na patogênese da asma
UCSF Chimera – um sistema de visualização para pesquisa e análise exploratória
Detecção e interpretação de influências genéticas compartilhadas em 42 características humanas
Fatores de risco genéticos compartilhados e distintos para asma de início na infância e início na idade adulta: estudos de genoma e transcriptoma amplos
A seleção negativa em genes humanos subjacentes a erros inatos depende do desfecho da doença e tanto do modo quanto do mecanismo de herança
CADD-Splice – melhorando a predição de efeito de variantes em todo o genoma usando pontuações de splicing derivadas de aprendizado profundo
Limma potencializa análises de expressão diferencial para estudos de RNA-seq e microarranjos
Mutações recorrentes do domínio de ligação ao DNA de STAT6 no linfoma primário de células B mediastinal
Testes estatísticos moderados para avaliar diferenças na abundância de tags
Um atlas interpopulacional de associações genéticas para 220 fenótipos humanos
Variantes de perda de função seletiva em causam síndrome de hiper-IgE com comprometimentos distintos do fenótipo e função de células T
A deficiência completa de NFAT1 humana causa uma tríade de contraturas articulares, osteocondromas e malignidade de células B
Falta de resposta Th2 induzida por IL-4 e troca de classe de IgE em camundongos com gene Stat6 interrompido
Asma moderada a grave em indivíduos de ascendência europeia: um estudo de associação genômica ampla
Servidor web SIFT: Predição de efeitos de substituições de aminoácidos em proteínas
GWAS identifica quatro novos loci de esofagite eosinofílica
Predominância da polarização Th2 pela vitamina D através de um mecanismo dependente de STAT6
A via de sinalização STAT6 controla as respostas do centro germinativo promovidas após o direcionamento de antígeno para células dendríticas convencionais tipo 2
Uma variante germinativa de ganho de função do STAT6 está associada a alergias de início precoce
Papel essencial do Stat6 na sinalização de IL-4
Oito novos loci de susceptibilidade e variantes causais putativas na dermatite atópica
Sequenciamento do exoma e o manejo de distúrbios neurometabólicos
COSMIC: O Catálogo de mutações somáticas em câncer
Mutações heterozigóticas de ganho de função do STAT1 subjazem um fenótipo clínico inesperadamente amplo
Priorização de genes causais candidatos para asma em loci de susceptibilidade derivados do UK Biobank
Erros inatos da imunidade manifestando-se como distúrbios atópicos
SnapShot: Sinalização Jak-STAT II
Mecanismos e consequências da sinalização Jak-STAT no sistema imunológico
A base poligênica e monogênica de traços e doenças sanguíneas
Estudos de associação genômica ampla e mapeamento fino do HLA identificam loci de risco e vias genéticas subjacentes à rinite alérgica
SWISS-MODEL: Modelagem por homologia de estruturas e complexos proteicos
IL-4 induz fosforilação de serina do domínio de transativação do STAT6 em linfócitos B
Mutações ativadoras do STAT6 no linfoma folicular
A paisagem exômica do linfoma folicular difuso negativo para t(14;18) com deleção de 1p36
Síndrome de hiper-IgE humana: Singular ou plural?
Ligações genéticas e experimentais compartilhadas entre traços relacionados à obesidade e subtipos de asma no UK Biobank
Uma análise genômica ampla de traços cruzados do UK Biobank destaca a arquitetura genética compartilhada da asma e doenças alérgicas
Genética compartilhada da asma e transtornos de saúde mental: Uma análise genômica ampla de traços cruzados em larga escala