pmid: "38375189"
title: "Um Anticorpo Biespecífico e Tetravalente Direcionado a Vias Inflamatórias e Pruritogênicas na Dermatite Atópica."
authors: "Tietz J, Gunde T, Warmuth S, Weinert C, Brock M, Simonin A, Hess C, Johansson M, Spiga F, Muntwiler S, Wickihalder B, Mahler D, Diem D, Zeberer J, Heiz R, Flückiger N, Shiraishi N, Miyake Y, Takahashi N, Fehrholz M, Bertolini M, Lichtlen P, Urech D, Snell D"
journal: "JID innovations : skin science from molecules to population health"
pubdate: "2024 Mar"
doi: "10.1016/j.xjidi.2024.100258"
source: "PMC Full Text"

Um Anticorpo Biespecífico e Tetravalente Direcionado a Vias Inflamatórias e Pruritogênicas na Dermatite Atópica.

Autores

Tietz J, Gunde T, Warmuth S, Weinert C, Brock M, Simonin A, Hess C, Johansson M, Spiga F, Muntwiler S, Wickihalder B, Mahler D, Diem D, Zeberer J, Heiz R, Flückiger N, Shiraishi N, Miyake Y, Takahashi N, Fehrholz M, Bertolini M, Lichtlen P, Urech D, Snell D

Periodico

JID innovations : skin science from molecules to population health (2024 Mar)

Conteudo

Um Anticorpo Biespecífico, Tetravalente, Visando Vias Inflamatórias e Pruritogênicas na Dermatite Atópica

A inibição da sinalização de IL-4/IL-13 melhorou dramaticamente o tratamento da dermatite atópica (DA). No entanto, em muitos pacientes, as respostas clínicas são lentas para se desenvolver e permanecem modestas. De fato, alguns sintomas da DA dependem de IL-31, que é apenas parcialmente reduzida pela inibição de IL-4/IL-13. Assim, há uma necessidade não atendida de tratamentos para DA que bloqueiem concomitantemente as vias de IL-4/IL-13 e IL-31. Nós projetamos o NM26-2198, um anticorpo biespecífico tetravalente projetado para realizar essa tarefa. Em linhagens celulares repórter, o NM26-2198 inibiu concomitantemente a sinalização de IL-4/IL-13 e IL-31 com uma potência comparável à da combinação de um anticorpo anti-IL-4Rα (dupilumabe) e um anticorpo anti-IL-31 (BMS-981164). Em PBMCs humanos, o NM26-2198 inibiu a regulação positiva de CD23 induzida por IL-4, demonstrando ligação funcional ao FcγRII (CD32). O NM26-2198 também inibiu a secreção do biomarcador de DA, quimiocina regulada por ativação do timo (TARC), em amostras de sangue de doadores humanos saudáveis. Em macacos cynomolgus machos, o NM26-2198 exibiu farmacocinética favorável e inibiu significativamente o coçar induzido por IL-31 na dose de 30 mg/kg. Em um estudo toxicológico de boas práticas de laboratório com doses repetidas em macacos cynomolgus, nenhum efeito adverso do NM26-2198 foi observado na dose semanal de 125 mg/kg. Juntos, esses resultados justificam a investigação clínica do NM26-2198 como tratamento para DA moderada a grave.

Introdução

A dermatite atópica (DA) é uma doença cutânea crônica impulsionada por células T auxiliares do tipo 2, caracterizada por inflamação sistêmica, disfunção de barreira e prurido persistente. Pacientes com DA moderada a grave experimentam prurido intenso, complicações infecciosas, comorbidades sistêmicas, transtornos de saúde mental e comprometimento da qualidade de vida. O primeiro agente biológico aprovado para tratamento de DA moderada a grave, dupilumabe, melhorou medidas compostas de gravidade da DA em estudos de fase III. A gravidade e a área do eczema foram reduzidas em 75% em cerca de metade dos pacientes tratados com dupilumabe em até 16 semanas. O dupilumabe também melhorou os escores de desfechos secundários relacionados ao prurido, mas as melhorias no prurido foram incompletas (cerca de 50% de melhora média após 16 semanas) e tipicamente apresentaram início lento (∼20% de melhora média após 2 semanas). O prurido é um dos sintomas mais preocupantes para pacientes com DA, pois induz o ciclo coceira-coçar, que reforça a inflamação cutânea, e porque está fortemente associado ao comprometimento da qualidade de vida. Assim, o tratamento da DA moderada a grave pode exigir terapias adjuvantes direcionadas diretamente ao prurido. Além disso, como o coçar é um dos principais contribuintes para a disfunção de barreira e persistência da doença, um alívio mais rápido e completo da coceira pode melhorar a rapidez e a magnitude da eficácia do tratamento.
Dupilumabe bloqueia o IL-4Rα, inibindo assim a sinalização de IL-4 e IL-13, devido à necessidade de IL-13Rα1 heterodimerizar com IL-4Rα. O dupilumabe ajudou a estabelecer o papel central dessas citocinas na patogênese da DA. Estudos de inibidores seletivos de IL-13 apoiam ainda mais esse papel. No entanto, o prurido na DA depende de outra citocina derivada de T auxiliar 2, a IL-31, que estimula diretamente as terminações nervosas cutâneas, macrófagos e queratinócitos. Embora o tratamento com dupilumabe possa reduzir a expressão de IL-31 na pele, o dupilumabe não reduz diretamente os níveis séricos de IL-31 em pacientes com DA. Estudos clínicos mostraram que um anticorpo monoclonal direcionado ao IL-31RA, o nemolizumabe, reduz parcialmente o prurido e a inflamação em pacientes com DA moderada a grave ou prurigo nodular. Assim, a inibição direta de IL-31 é uma estratégia adjuvante promissora para alívio mais rápido e completo da coceira em pacientes com DA. No entanto, a terapia combinada com dupilumabe e nemolizumabe provavelmente será cara, clinicamente desafiadora e onerosa para os pacientes. Além disso, até o momento desta redação, o nemolizumabe não está aprovado para uso clínico fora do Japão. Os inibidores de JAK estão disponíveis, mas apresentam sérias preocupações de segurança. Portanto, há uma forte necessidade não atendida de opções de tratamento de ação rápida, eficazes, seguras e clinicamente convenientes que tenham como alvo múltiplas vias de citocinas envolvidas na DA.

Para atender a essa necessidade não atendida, desenvolvemos o NM26-2198, um terapêutico baseado em anticorpo que antagoniza concomitantemente as vias de citocinas centrais para a ativação imune inflamatória na DA (IL-4 e IL-13) e aquelas centrais para o prurido atópico (IL-31). NM26-2198 é uma molécula de fragmento variável de cadeia única IgG4 tetravalente biespecífico direcionada a IL-4Rα e IL-31 com peso molecular de 202 kDa. Neste relatório, descrevemos as propriedades bioquímicas e as atividades funcionais in vitro e in vivo do NM26-2198. Estes estudos apoiam o desenvolvimento clínico do NM26-2198 para o tratamento de DA moderada a grave.

Resultados e Discussão
IL-4, IL-13 e IL-31 alteram cooperativamente a expressão de genes relacionados à DA em amostras de pele humana
Análise de RNA-seq de biópsias de pele humana saudável de 3 doadores tratados com IL-4, IL-13 e IL-31 a 50 ng/ml por 72 h.(a) Gráficos de vulcão mostrando genes cuja expressão foi significativamente alterada (vermelho) pelos tratamentos com IL-4 + IL-13 (esquerda), IL-31 (meio) e IL-4 + IL-13 + IL-31 (direita). (b) Mapa de calor mostrando a expressão relativa de genes específicos de acordo com a condição de tratamento e doador com base nos escores Z das linhas de todas as amostras do estudo, dos quais FLG, FLG2,IL-24,CXCL-11, IL13Ra2,IL-33,LCN2, K6B, GZMB, CCL17, e CCL13 são conhecidos por desempenhar um papel importante na DA. Outros genes importantes conhecidos por desempenhar um papel em processos inflamatórios e neurais, queratinócitos e/ou função de barreira também são destacados à direita. (c) Gráfico de barras mostrando mudanças na expressão (valores de P ajustados por transformação logarítmica) de agrupamentos de genes associados a termos selecionados de processos biológicos da ontologia genética após tratamento com as ILs indicadas. Não houve enriquecimento dos termos mostrados para IL-31. (d, e) Gráficos de barras mostrando os principais termos de processos biológicos da ontologia genética enriquecidos após tratamento com citocinas. DA, dermatite atópica; h, hora; K6B, queratina 6B; RNA-seq, sequenciamento de RNA.

DA está associada à regulação positiva e negativa de centenas de genes, incluindo efeitos diferenciais na pele lesional versus não lesional, bem como mudanças na expressão de genes envolvidos em respostas inflamatórias e imunes sistêmicas. O perfil de transcriptoma pode ser útil para prever respostas terapêuticas; de fato, mudanças nos padrões de expressão gênica em pacientes com DA tratados com dupilumabe foram correlacionadas com melhorias patológicas e clínicas. Assim, usamos o perfil de expressão gênica para explorar a justificativa biológica para combinar a inibição de IL-4/IL-13 com a inibição de IL-31 como um potencial tratamento para DA. Amostras de biópsia de pele humana normal de 3 doadores humanos saudáveis foram tratadas ex vivo com IL-4, IL-13 e IL-31 isoladamente ou em combinação. O tratamento com IL-4 e IL-13 induziu mudanças significativas na expressão gênica nesses tecidos, mas IL-31 isoladamente teve efeitos limitados (Figura 1). No entanto, a combinação das três citocinas induziu significativamente mais mudanças na expressão gênica do que IL-4/IL-13 ou IL-31 isoladamente. Em particular, a expressão de genes relacionados à função neurológica e de queratinócitos foi alterada (Figura 1c). A expressão de genes relacionados a vias inflamatórias também foi alterada durante o tratamento com todas as três citocinas, sugerindo um papel inflamatório para IL-31 além de seu papel na sinalização neurológica. Esses dados são consistentes com os efeitos do tratamento com nemolizumabe em marcadores neuronais e inflamatórios em pacientes com prurigo nodular.
Estes resultados fornecem evidências iniciais de uma justificativa biológica para a combinação de inibidores das vias de citocinas IL-4/IL-13 e IL-31 no tratamento da DA, consistente com observações de ensaios clínicos descritas na introdução. Os resultados também são consistentes com os de um estudo recente em 12 pacientes com DA, que mostrou que o tratamento com dupilumabe reduziu significativamente alguns biomarcadores de DA (níveis séricos de IgE, IL-22 e quimiocina regulada por ativação do timo [TARC]), mas não afetou o número de fibras nervosas intraepidérmicas, que estão associadas à gravidade do prurido e correlacionadas positivamente com os níveis de IL-31.

Um IgG4 tetravalente, biespecífico, direcionado às vias de citocinas de DA
Representação esquemática (esquerda) e modelo estrutural (direita) do NM26-2198. O modelo estrutural foi preparado utilizando o software BIOVIA Discovery Studio.

Devido à justificativa biológica e clínica para a inibição concomitante das vias de IL-4/IL-13 e IL-31 como tratamento para DA, desenvolvemos uma molécula baseada em anticorpo que visa simultaneamente ambas as vias. NM26-2198 é um IgG4 recombinante, tetravalente, biespecífico, no qual fragmentos variáveis de cadeia única anti-IL-31 com capa λ são fundidos às extremidades C-terminais de ambas as cadeias pesadas de IgG4 anti-IL-4Rα por meio de ligantes peptídicos flexíveis (Gly4–Ser)2 (Figura 2). Um arcabouço de IgG4 foi escolhido devido à sua função efetora reduzida. Para prevenir a troca de braços Fab, a região central da dobradiça da cadeia pesada contém uma mutação S228P.

As sequências anti-IL-4Rα e anti-IL-31 foram originalmente derivadas de anticorpos monoclonais de coelho. As regiões determinantes de complementaridade foram enxertadas em arcabouços aceptores de domínio variável humano. O arcabouço anti-IL-31 foi projetado a partir de sequências consenso humanas e de linhagem germinativa para estabilidade e solubilidade favoráveis usando a tecnologia de capa λ. Os fragmentos variáveis de cadeia única foram então posteriormente modificados para melhorar a estabilidade para uso em altas concentrações.

NM26-2198 exibe ligação alvo de alta afinidade e inibição potente e concomitante da sinalização de IL-4R e IL-31.
Cinética de ligação do NM26-2198 e inibição da sinalização celular.(a) Sensorgramas de SPR da ligação do NM26-2198 ao IL-4Rα em modo cinético multiciclo. (b) Sensorgrama de SPR da ligação do NM26-2198 ao IL-31 em modo cinético de ciclo único. Linhas coloridas representam os dados experimentais, e linhas pretas mostram o ajuste de um modelo de interação 1:1. (c) Sensorgrama de SPR mostrando a ligação concomitante do NM26-2198 ao IL-4R humano (imobilizado) e ao IL-31. (d) Concentração de SEAP no sobrenadante de células repórter HEK-Blue IL-4/IL-13 STAT6 medida usando o ensaio colorimétrico QUANTI-Blue e relatada como média (DP) da densidade óptica. As células foram cultivadas na presença de IL-4 (0,05 ng/ml, 23,8 pM) por 24 horas para induzir a secreção de SEAP. O meio de cultura também continha as concentrações indicadas de dupilumabe ou NM26-2198 na presença ou ausência de excesso de IL-31 (9,9 nM). (e) Média (DP) das concentrações de SEAP em experimentos semelhantes a (d), exceto que as células foram cultivadas na presença de IL-13 (0,3 ng/ml, 23,8 pM) em vez de IL-4. (f) Média (DP) da quimioluminescência de células U2OS modificadas indicando heterodimerização induzida por IL-31 de IL-31RA e OSMR após 6 horas de incubação com IL-31 (10 ng/ml, 0,63 nM) e as concentrações indicadas de BMS-981164 ou NM26-2198 na presença ou ausência de excesso de domínio extracelular de IL-4R (50 nM). (g) Média (DP) das concentrações de CCL2 no sobrenadante de células BEAS-2B cultivadas após 24 horas de incubação com as ILs e antagonistas indicados. As concentrações dos antagonistas foram 1 mg/ml (5 nM de dupilumabe e 5 nM de BMS-981164, 6,7 nM de NM26-2198). Os resultados são média (DP) de 1 experimento independente. Os valores de P são baseados no teste de Dunnett realizado após um P geral = 0,012 pela ANOVA. ∗ P < 0,05 e ∗∗ P < 0,01. (h) Concentrações de CCL2 no sobrenadante de células BEAS-2B após 24 horas de incubação com IL-4 (1 ng/ml) e IL-31 (10 ng/ml) e as concentrações indicadas de dupilumabe + BMS-981164 ou NM26-2198. a e b são representativos de 3 experimentos, e c–h correspondem a 1 experimento. Poços duplicados foram usados para os experimentos mostrados em d–h. OSMR, receptor de oncostatina M; SEAP, fosfatase alcalina embrionária secretada; SPR, ressonância de plasmon de superfície; STAT6, transdutor de sinal e ativador de transcrição 6.

A ligação do NM26-2198 ao domínio extracelular de IL-4Rα humano recombinante e ao IL-31 foi avaliada por ressonância de plasmon de superfície (SPR) (Figura 3a e b). As constantes de dissociação de equilíbrio médias (±DP) foram 209 ± 68 pM para IL-4Rα humano (n = 3) e 193 ± 88 pM para IL-31 humano (n = 3). A ligação concomitante ao IL-4R humano e ao IL-31 humano também foi demonstrada por SPR (Figura 3c).
Em seguida, estudamos a capacidade do NM26-2198 de inibir qualquer uma de suas vias-alvo (IL-4/IL-13, IL-31) isoladamente ou na presença de quantidades excessivas da outra via-alvo. As Figuras 3d e 3e mostram que o NM26-2198 inibiu a secreção do produto do gene repórter do transdutor de sinal e ativador da transcrição 6 (STAT6) induzida por IL-4 e IL-13 em células HEK-Blue com uma potência comparável à do dupilumabe. A presença de uma concentração excessiva de IL-31 (9,9 nM) não teve efeito na inibição da sinalização de IL-4 ou IL-13 pelo NM26-2198. Da mesma forma, o NM26-2198 inibiu a produção de beta-galactosidase ativa induzida por IL-31 em uma linhagem de células de osteossarcoma (células PathHunter U2OS) com potência similar à do anticorpo anti-IL-31 de referência BMS-981164. A inibição pelo NM26-2198 não foi afetada pela adição de excesso de IL-4Rα (Figura 3f).
Para testar se o NM26-2198 pode inibir concomitantemente a sinalização de IL-4/IL-13 e a sinalização de IL-31, utilizamos células epiteliais brônquicas humanas (células BEAS-2B), que expressam as subunidades dos receptores de IL-4 tipo I e tipo II (IL-4Rα, γcomum e IL-13Rα1), bem como as subunidades do receptor de IL-31 (IL-31RA e OSMRβ). As células foram incubadas por 24 horas em condições controle ou na presença de várias combinações de IL-4, IL-31, dupilumabe, o anticorpo anti-IL-31 BMS-981164 e NM26-2198. Conforme mostrado na Figura 3g, IL-4 e IL-31 estimularam a liberação de CCL2, e a incubação com ambas as citocinas induziu efeitos aditivos. O dupilumabe e o BMS-981164 inibiram a secreção de CCL2 induzida por IL-4/IL-31, e a incubação com ambos os anticorpos exerceu antagonismo adicional. O NM26-2198 antagonizou a secreção de CCL2 pelo menos tão eficazmente quanto a combinação de dupilumabe e BMS-981164. A Figura 3h mostra as curvas dose-resposta para a inibição da liberação de CCL2 induzida por IL-4/IL-31 pelo NM26-2198 ou pela combinação de dupilumabe e BMS-981164. Considerados em conjunto, os resultados mostrados na Figura 3 demonstram que o NM26-2198 se liga tanto ao IL-4Rα quanto à IL-31 de forma independente e concomitante, e inibe a sinalização por ambas as vias com potência comparável à da combinação de dupilumabe e BMS-981164.
NM26-2198 inibe potentemente a regulação positiva de CD23 induzida por IL-4 em PBMCs e a secreção de TARC em sangue total
Inibição da expressão de CD23 induzida por IL-4 em monócitos e células B humanas e da secreção de TARC induzida por IL-4 em sangue humano total pelo NM26-2198.(a–c) Expressão geométrica média de CD23 em (a) monócitos, (b) células B ingênuas ou (c) células B de memória medida por citometria de fluxo após incubação de PBMCs por 48 horas com IL-4 (2 ng/ml) e as concentrações indicadas de NM26-2198, sua versão silenciada com IgG1-Fc PRO2142 ou dupilumabe. (d–f) Secreção de TARC (CCL17) em amostras de sangue humano total de 3 doadores após incubação por 24 horas com IL-4 (1 ng/ml) e as concentrações indicadas de dupilumabe ou NM26-2198. A secreção foi quantificada por ELISA, e os valores mostrados são médias (DP) de medições em duplicata para cada concentração. TARC, quimiocina regulada pela ativação e expressa pelo timo.
Uma das marcas registradas das respostas imunes induzidas por IL-4 e IL-13 é a regulação positiva de CD23 (o receptor de IgE de baixa afinidade, FcεRII) em monócitos e células B. Anticorpos anti-IL-4Rα demonstraram inibir a regulação positiva de CD23 induzida por IL-4, mas sua potência depende das características da ligação do anticorpo ao FcγRII (CD32). Como o NM26-2198 possui uma porção Fc de isotipo IgG4 e tem fragmentos variáveis de cadeia única anti-IL-31 ligados às suas extremidades C, foi importante avaliar sua potência para a inibição da regulação positiva de CD23. Estudamos os efeitos do NM26-2198 na expressão de CD23 induzida por IL-4 em monócitos e células B em PBMCs de doadores humanos saudáveis. A incubação de PBMCs com IL-4 por 48 horas aumentou a expressão de CD23 em monócitos, células B ingênuas e células B de memória, e esse efeito foi inibido pelo NM26-2198 em cada tipo celular de forma dose-dependente (Figura 4a–c). A concentração inibitória média para o NM26-2198 foi comparável à do dupilumabe, que também é um IgG4. Uma versão com Fc silenciado do NM26-2198 (PRO2142) demonstrou uma diminuição significativa na atividade neste ensaio, particularmente em monócitos, consistente com estudos anteriores mostrando que a ligação do Fc ao FcγRII é essencial para a inibição da regulação positiva de CD23 induzida por IL-4 em células imunes. Esses experimentos demonstram que o NM26-2198 reteve a ligação ao FcγRII. O NM26-2198 não induziu citotoxicidade celular dependente de anticorpos detectável usando células B Ramos como células-alvo e PBMCs humanos como células efetoras. Da mesma forma, o NM26-2198 não induziu citotoxicidade dependente do complemento em células B Ramos na presença de complemento humano. O rituximabe usado como controle positivo mostrou atividade potente em ambos os ensaios (dados não mostrados).

Outra marca registrada da DA e das respostas imunes induzidas por IL-4 e IL-13 é o aumento das concentrações séricas da quimiocina TARC de célula T auxiliar tipo 2. A Figura 4d–f mostra os níveis de TARC em sangue total humano anticoagulado com EDTA de 3 doadores saudáveis após 24 horas de incubação com IL-4 e as concentrações indicadas de NM26-2198 ou dupilumabe. Tanto o NM26-2198 quanto o dupilumabe inibiram a secreção de TARC, mas sua potência relativa variou entre os 3 doadores. A concentração inibitória média para a inibição da secreção de TARC induzida por IL-4 pelo NM26-2198 variou de 328 a 490 pM e foi em média 409 ± 81,1 pM. A inibição da secreção de TARC induzida por IL-13 pelo NM26-2198 teve potência semelhante (286 ± 142 pM, dados não mostrados), o que é importante devido a evidências de que a IL-13 tem um papel importante na patologia da DA. Esses resultados são consistentes com os resultados de ensaios clínicos nos quais o tratamento com dupilumabe reduziu os níveis séricos de TARC em pacientes adultos com DA e sugerem que o NM26-2198 pode ter um efeito semelhante em pacientes.

O NM26-2198 exibe uma longa meia-vida sérica em macacos cynomolgus e elimina os sintomas de prurido desencadeados pela IL-31
Em ensaios de SPR, o NM26-2198 exibiu cinética de ligação e afinidades para IL-4Rα de macaco cynomolgus (constante de dissociação de equilíbrio = 144 ± 49 pM, n = 3) e IL-31 (constante de dissociação de equilíbrio = 103 ± 14 pM, n = 3) semelhantes às dos alvos humanos (constante de dissociação de equilíbrio média = 209 pM para IL-4Rα e 193 pM para IL-31).

Farmacocinética do NM26-2198 e inibição da coceira induzida por IL-31 em macacos cynomolgus.(a, b) Níveis séricos médios (DP) do fármaco nos tempos indicados após administração intravenosa (verde) ou subcutânea (laranja) de doses únicas de NM26-2198 a macacos cynomolgus (n = 6 por condição de tratamento, exceto n = 5 para o grupo de 3 mg/kg). (c) Linha do tempo do tratamento do estudo de coceira conforme descrito no texto. Os macacos foram agrupados de acordo com o tratamento basal (dia −28 ao dia −18). (d) Número de eventos de coceira durante 3 horas após a injeção de IL-31 menos 3× o número de eventos de coceira durante a 1 hora anterior à injeção de IL-31. Círculos preenchidos indicam resultados de cada macaco; barras indicam a média para cada condição de tratamento. ∗P < 0,05 (0,017) para macacos tratados com 30 mg/kg versus veículo com base no teste de Dunnett realizado após um P geral = 0,003 por ANOVA.

A farmacocinética de doses únicas de NM26-2198, administradas por injeção intravenosa (IV) ou subcutânea (SC), foi estudada em macacos cynomolgus. Os níveis séricos médios do fármaco nos tempos designados após a administração de 3 níveis de dose são mostrados na Figura 5a para administração IV (e 5 mg/kg SC) e na Figura 5b para administração SC em dose mais alta. As concentrações séricas de NM26-2198 aumentaram com o aumento dos níveis de dose para ambas as vias de administração IV e SC. A meia-vida sérica média do NM26-2198 foi de 7 a 10 dias em doses acima de 1 mg/kg. A depuração mais rápida da dose IV de 1 mg/kg provavelmente se deve à disposição do fármaco mediada pelo alvo IL-4Rα.
Em seguida, estudamos os efeitos do NM26-2198 nos sintomas de coceira em macacos cynomolgus. Macacos machos que não apresentavam sintomas de coceira basais intensos foram randomizados em 5 grupos de tratamento: veículo ou 1 de 4 doses de NM26-2198 (0,03, 0,3, 3 e 30 mg/kg). Entre 28 e 18 dias antes do tratamento, os macacos receberam uma injeção IV de IL-31 de cynomolgus (1 μg/kg) e foram agrupados de acordo com esse tratamento basal (Figura 5c). Gravações de vídeo do comportamento dos macacos foram usadas para monitorar os eventos de coceira por 1 hora antes da injeção e por 3 horas após a injeção. No dia 1, os macacos receberam uma injeção SC do tratamento aleatoriamente designado. No dia 3, a injeção de IL-31 de cynomolgus e os procedimentos de gravação de vídeo foram repetidos para avaliar como o tratamento afetou o número de eventos de coceira. A Figura 5d mostra o número médio normalizado pelo tempo de eventos de coceira em cada um dos grupos de tratamento. Os macacos nos grupos de 3 mg/kg e 30 mg/kg de NM26-2198 apresentaram frequência média de coceira menor do que aqueles no grupo tratado com veículo, e esse efeito foi estatisticamente significativo para o grupo de 30 mg/kg (P geral = 0,003 por ANOVA; P = 0,017 para o grupo de 30 mg/kg vs grupo veículo pelo teste de Dunnett). Deve-se notar que este não é um modelo de DA, mas apenas reflete a inibição do comportamento de coceira induzido por IL-31.

Toxicologia de boas práticas de laboratório em macacos cynomolgus
Um estudo formal de toxicologia de boas práticas de laboratório de 4 semanas com doses repetidas foi conduzido em macacos cynomolgus, no qual os macacos receberam 5 doses semanais de NM26-2198 por via SC (5, 25 ou 125 mg/kg) ou por via IV (125 mg/kg). Nenhum achado relacionado ao tratamento foi observado. Os macacos não apresentaram evidências de alterações patológicas macroscópicas; alterações histopatológicas; inflamação no local da injeção; alterações oftalmológicas; ou alterações cardiovasculares, respiratórias ou neurológicas durante o período de estudo de 4 semanas. Com base nesses resultados, o nível sem efeito observado para NM26-2198 em macacos cynomolgus é de 125 mg/kg, bem acima do nível de dose necessário para a eficácia demonstrada no experimento anterior. Considerados em conjunto, os resultados apresentados neste artigo justificam a investigação clínica de NM26-2198 como tratamento para DA, e um estudo clínico de fase I está em andamento (NCT05859724).

Materiais e Métodos
Anticorpos de referência e reagentes selecionados
O dupilumabe foi produzido pela Evitria AG a partir de dados de sequência publicados (número CAS 1190264-60-8) ou adquirido na farmácia (Dupixent, Sanofi). O BMS-981164 foi produzido pela Evitria AG com base na sequência publicada nas patentes US8470979B2 e WO09071696. O NM26-2198 foi fabricado pela Numab Therapeutics AG. Anticorpos CCL2 e anticorpos para coloração de PBMC foram adquiridos da Biolegend (San Diego, CA). IL-4, IL-13 e IL-31 foram adquiridos da PeproTech (Rocky Hill, NJ).

Análise de sequenciamento de RNA de amostras de pele humana
Amostras de tecido de biópsia por punch de pele foram coletadas de doadores humanos saudáveis e cultivadas a 37 °C (5% de dióxido de carbono [CO2]) em uma mistura (1:1) de meio RPMI e meio William’s E (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) com 10 ng/mL de hidrocortisona (Sigma-Aldrich, Merck, Burlington, MA), 10 μg/mL de insulina (Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça), 2 mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich) e 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco). O tratamento com IL-4, IL-13 e IL-31 foi realizado no início da cultura e após 48 horas. As amostras foram coletadas após 72 horas para extração de RNA.
O sequenciamento de RNA foi realizado em um NovaSeq 6000 usando um comprimento de leitura de 2 × 100 pb com uma saída de aproximadamente 30 M de clusters (6 Gb) por amostra. As leituras brutas aparadas foram alinhadas a um HG19 modificado usando STAR (versão 2.7.3). As regiões pseudoautossômicas foram mascaradas no cromossomo Y (chrY:10001-2649520, chrY:59034050-59363566). As contagens normalizadas foram calculadas com DESeq2 (versão 1.40.1). Gráficos de vulcão, mapa de calor e gráficos de barras foram gerados com R (versão 4.3.0) usando o pacote ggplot2 (versão 3.4.2) e pheatmap (versão 1.0.12). A análise de enriquecimento de conjuntos gênicos foi realizada usando clusterProfiler (versão 4.9.0) e DOSE (versão 3.26.1). Os gráficos de vulcão são representativos dos resultados de todos os 3 doadores.
Afinidade de ligação e ligação concomitante por SPR
A análise de SPR foi realizada em um instrumento Biacore T200 (Cytiva, Uppsala, Suécia). Para IL-4Rα, NM26-2198 foi capturado em um chip sensor CM5 (Cytiva) usando um anticorpo IgG-Fc (Kit de Captura de Anticorpo Humano, Cytiva). Uma série de titulação do domínio extracelular de IL-4Rα com cauda de histidina (Sino Biological, Pequim, China) foi injetada em tampão salino HEPES (0,05% de Tween-20, pH 7,5). O chip sensor foi regenerado com cloreto de magnésio. Para IL-31, NM26-2198 foi injetado sobre um chip sensor CM5 com IL-4R-Fc Tag (R&D Systems, Freiburg, Alemanha), seguido por IL-31. A ligação concomitante a IL-4R e IL-31 foi avaliada usando um chip sensor CM5 com IL-4R-Fc imobilizado, seguido por um fluxo sequencial de NM26-2198 e IL-31. A ligação a IL-4Rα e IL-31 de macaco foi medida usando o domínio extracelular de IL-4Rα com His (Acro Biosystems, Newark, DE) e IL-31 com His (Sino Biological) de macaco cynomolgus. As cinéticas foram calculadas com o software de avaliação Biacore (versão 3.2, Cytiva, modelo de Langmuir 1:1).
Inibição da sinalização de IL-4 e IL-13
Ensaios utilizaram células HEK-Blue IL-4/IL-13 STAT6 (hkb-il413, InvivoGen, Toulouse, França), que produzem fosfatase alcalina embrionária secretada através da via STAT6 em resposta a IL-4 ou IL-13. Um total de 50.000 células por poço foram semeadas em placas de 96 poços em DMEM com alta glicose e 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (Sigma-Aldrich). NM26-2198 ou dupilumabe foram adicionados com IL-4 humana ou IL-13 humana. Após 24 horas de incubação a 37 °C e 5% de CO2, os sobrenadantes foram transferidos para uma nova placa, e a fosfatase alcalina embrionária secretada foi quantificada usando QUANTI-Blue (InvivoGen) com um leitor de placas Tecan (Infinite M-Plex, Grödig, Áustria). As curvas de inibição foram ajustadas usando um modelo de regressão logística de 4 parâmetros no GraphPad Prism 9.1.0.
Inibição da sinalização de IL-31
Ensaios utilizaram linhagem celular PathHunter U2OS IL31RA/OSMRβ de dimerização (DiscoverX, Celle-l’Evescault, França), que produz um sinal quimioluminescente após dimerização induzida por ligante de OSMRβ/IL31RA. Um total de 10.000 células por poço foram semeadas em placas de 96 poços em Reagente de Plaqueamento de Células para Ensaio 5 durante a noite (DiscoverX) antes da adição de NM26-2198 ou BMS-981164 com IL-31. Após 6 horas (37 °C, 5% CO2), uma solução de detecção foi adicionada por uma hora (Kit de Detecção Flash Path Hunter, DiscoverX), e a luminescência foi medida.
Inibição simultânea da sinalização de IL-4 e IL-31
Ensaios utilizaram células BEAS-2B (LCR-9609, ATCC, Manassas, VA), nas quais a liberação de CCL2 é aumentada em resposta à estimulação aditiva por IL-31 e IL-4. Um total de 25.000 células por poço foram semeadas em placas de 96 poços em 100 μl de DMEM/Mistura Nutriente F-12 Ham (Sigma-Aldrich, Irvine, Reino Unido) com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (Sigma-Aldrich) e incubadas durante a noite (37 °C, 5% de CO2). Após 2 etapas de lavagem, IL-4 e/ou IL-31 foram adicionadas com ou sem NM26-2198 ou uma combinação de dupilumabe e BMS-981164. Os sobrenadantes foram coletados após 24 horas.
Para quantificação de CCL2 por ELISA, placas de 96 poços foram revestidas com 1 μg/ml de um anticorpo CCL2 de camundongo em PBS. As placas foram bloqueadas com PBS (0,2% de Tween, 1% de BSA). Diluições seriadas de CCL2 em tampão Low Cross (Candor, Wangen, Alemanha) e os sobrenadantes foram adicionados. CCL2 foi detectado com 0,25 mg/ml de um anticorpo CCL2 de hamster biotinilado e com 100 ng/ml de estreptavidina-peroxidase de rábano (Stereospecific Detection Technologies, Baesweiler, Alemanha). SureBlue Reserve foi adicionado (SeraCare, Milford, MA) e em seguida ácido clorídrico. A densidade óptica foi lida a 450 nm.
Inibição da expressão de CD23 induzida por IL-4 em monócitos humanos e células B ingênuas e de memória
PBMCs humanas foram isoladas de sangue total fresco de doadores saudáveis de acordo com um protocolo Leucosep adaptado usando tubos com barreira porosa integrada e centrifugação por gradiente de densidade, primeiro a 800g sem freios e depois a 300g com freios. Um total de 400.000 PBMCs foram semeadas por poço em uma placa de 96 poços em 100 μl de meio (RPMI, Irvine Scientific; 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor, Sigma-Aldrich). NM26-2198 ou dupilumabe foi adicionado com IL-4 humana. Após 48 horas de incubação (37 °C, 5% CO2), a solução de bloqueio de FcR (Human TruStain FcX, BioLegend) foi adicionada, e as PBMCs foram coradas para análise por citometria de fluxo (Novocyte, AECA Biosciences, San Diego, CA) usando anticorpos de camundongo anti-humano CD14-PerCP/Cy5.5, CD19-ficoeritrina, CD27-FITC e CD23-aloficocianina. A média geométrica de monócitos CD23, células B CD23 ingênuas e de memória selecionadas foi usada para avaliação.
Inibição da secreção de TARC induzida por IL-4 em sangue total humano
Sangue periférico humano foi coletado em tubos estéreis contendo EDTA. Um total de 160 μl por poço de diluições seriadas de NM26-2198 ou dupilumabe foi adicionado a uma placa de 96 poços com IL-4 em IMDM (Thermo Fisher Scientific, Paisley, Reino Unido; contendo 1% de soro fetal bovino inativado pelo calor). Após a adição de 40 μl de sangue total por poço, as placas foram incubadas por 24 horas (37 °C, 5% CO2) e centrifugadas por 10 minutos a 1000g. Os sobrenadantes foram coletados e congelados a −20 °C. A TARC foi quantificada usando o kit ELISA DuoSet humano TARC/CCL17 (R&D Systems, Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do kit.
Estudos em macacos cynomolgus
A avaliação farmacocinética foi realizada em macacos cynomolgus machos de origem africana (Maurício) na Charles River Laboratories. Os níveis séricos de NM26-2198 foram determinados usando um ELISA farmacocinético validado. Um estudo de coceira foi realizado no Shin Nippon Biomedical Laboratories administrando uma dose única (SC) de NM26-2198 a macacos cynomolgus machos. Quarenta e oito horas depois, IL-31 de cynomolgus foi administrada por via intravenosa, e a frequência e duração do comportamento de coçar foram avaliadas.
Análise estatística
Os dados são expressos como média ± DP da média. A expressão diferencial foi avaliada usando o teste Wald dentro do DESeq2, e a taxa de falsa descoberta foi controlada usando a correção de Benjamin–Hochberg. Para comparação dos resultados do ensaio BEAS-2B, ANOVA com comparações pareadas com células estimuladas (IL-4 + IL-31) usando o teste posthoc de Dunnett foi realizada assumindo distribuição normal da amostra (n = 2 por grupo). Para análise do estudo de coceira em cynomolgus, ANOVA com comparações pareadas com veículo usando o teste de Dunnett dos valores log-transformados foi realizada após confirmar distribuição normal pelo teste de Shapiro–Wilk. Os testes estatísticos foram realizados usando GraphPad Prism 9.1.0. Para todos os testes, P < .05 foi considerado estatisticamente significativo.
Todos os estudos com macacos cynomolgus estavam em conformidade com as leis aplicáveis de bem-estar animal e de acordo com os comitês locais. As instalações de teste Charles River Laboratories e Shin Nippon Biomedical Laboratories são credenciadas pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.
Para estudos com sangue humano, os doadores forneceram consentimento informado por escrito. As amostras de sangue foram coletadas, anonimizadas e utilizadas de acordo com a aprovação ética do Blutspende Zurich (BASEC Nr. Req 2020-00983). Todas as amostras de pele humana foram obtidas após consentimento informado e por escrito do paciente (todas do sexo feminino) e aprovação do comitê de ética (Ethik-Kommission der Ärztekammer Westfalen-Lippe 2015-602-f-S; Ethik-Kommission Ärztekammer Berlin Eth-10/15).
Declaração de Disponibilidade de Dados
Para solicitar dados, entre em contato com DS na Numab Therapeutics AG pelo e-mail d.snell@numab.com.
ORCIDs
Julia Tietz: http://orcid.org/0009-0006-5103-0842
Tea Gunde: http://orcid.org/0000-0002-9167-622X
Stefan Warmuth: http://orcid.org/0000-0001-6872-8805
Christopher Weinert: http://orcid.org/0000-0003-3313-9458
Matthias Brock: http://orcid.org/0000-0001-6445-0631
Alexandre Simonin: http://orcid.org/0009-0009-3022-8974
Christian Hess: http://orcid.org/0009-0006-4556-6288
Maria Johansson: http://orcid.org/0009-0001-3106-1629
Fabio Spiga: http://orcid.org/0000-0002-0541-3141
Simone Muntwiler: http://orcid.org/0009-0006-3231-4639
Belinda Wickihalder: http://orcid.org/0009-0003-1207-105X
Dana Mahler: http://orcid.org/0009-0003-2944-3040
Dania Diem: http://orcid.org/0009-0005-3215-8018
Julia Zeberer: http://orcid.org/0009-0001-6009-4163
Robin Heiz: http://orcid.org/0009-0008-7017-538X
Naomi Flückiger: http://orcid.org/0009-0004-3475-7543
Noriko Shiraishi: http://orcid.org/0009-0005-6206-424X
Yoshihide Miyake: http://orcid.org/0009-0007-7038-5670
Nobuaki Takahashi: http://orcid.org/0000-0001-8802-301X
Markus Fehrholz: http://orcid.org/0000-0003-2183-2415
Marta Bertolini: http://orcid.org/0000-0002-5927-6998
Peter Lichtlen: http://orcid.org/0009-0002-3441-0553
David Urech: http://orcid.org/0009-0003-2167-7440
Daniel Snell: http://orcid.org/0000-0003-0107-4821
Conflito de Interesses
Os autores são funcionários da Numab Therapeutics AG. NS, YM e NT são funcionários da Kaken Pharmaceutical. MB e MF são funcionários da Monasterium Laboratory - Skin & Hair Research Solutions GmbH. A pesquisa e a preparação do manuscrito foram apoiadas pela Numab Therapeutics AG.
Referências
Dermatite atópica
Abrocitinibe versus placebo ou dupilumabe para dermatite atópica
Um papel fundamental para a sinalização de IL-13 através do receptor de IL-4 tipo 2 na dermatite atópica experimental
Manejo de longo prazo da dermatite atópica moderada a grave com dupilumabe e corticosteroides tópicos concomitantes (Liberty AD Chronos): um estudo de fase 3, randomizado, duplo-cego, controlado por placebo, de 1 ano
Eficácia e segurança de upadacitinibe vs dupilumabe em adultos com dermatite atópica moderada a grave: um ensaio clínico randomizado
Um receptor de IL-31 expresso em neurônios sensoriais medeia a coceira dependente de células T auxiliares: envolvimento de TRPV1 e TRPA1
Desenho e produção de novos anticorpos biespecíficos tetravalentes
Interleucina-31: a citocina "coceira" na inflamação e na terapia
IgG4 humano: uma perspectiva estrutural
Dupilumabe com corticosteroide tópico concomitante em adultos com dermatite atópica com resposta inadequada ou intolerância à ciclosporina A, ou quando este tratamento é clinicamente desaconselhável: um ensaio clínico de fase III randomizado, controlado por placebo (Liberty AD CAFÉ)
Interleucina 13 é um fator estimulante de células B
Modulação da desregulação neuroimune e epitelial em pacientes com prurigo nodular moderado a grave tratados com nemolizumabe
Interleucina 31, uma citocina produzida por células T ativadas, induz dermatite em camundongos
STAR: alinhador de RNA-seq universal ultrarrápido
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Citar este artigo como: JID Innovations 2023.100258