pmid: "26593900"
title: "Efeitos Protetores do Cardamomo no Infarto do Miocárdio Induzido por Isoproterenol em Ratos"
authors: "Goyal SN, Sharma C, Mahajan UB, Patil CR, Agrawal YO, Kumari S, Arya DS, Ojha S"
journal: "International journal of molecular sciences"
pubdate: "2015 Nov 17"
doi: "10.3390/ijms161126040"
source: "PMC Full Text"

Efeitos Protetores do Cardamomo no Infarto do Miocárdio Induzido por Isoproterenol em Ratos

Autores

Goyal SN, Sharma C, Mahajan UB, Patil CR, Agrawal YO, Kumari S, Arya DS, Ojha S

Periodico

International journal of molecular sciences (2015 Nov 17)

Conteudo

Efeitos Protetores do Cardamomo no Infarto do Miocárdio Induzido por Isoproterenol em Ratos
O cardamomo é uma especiaria popular comumente usada em culinárias para dar sabor desde os tempos antigos. Possui inúmeros benefícios à saúde, como melhorar a digestão, estimular o metabolismo, e exibe efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios. O presente estudo investigou o efeito do cardamomo nas alterações hemodinâmicas, bioquímicas, histopatológicas e ultraestruturais no infarto do miocárdio induzido por isoproterenol (ISO). Ratos albinos Wistar machos foram divididos aleatoriamente e tratados com extrato de cardamomo (100 e 200 mg/kg por via oral) ou soro fisiológico por 30 dias, com administração concomitante de ISO (85 mg/kg, subcutâneo) no 29º e 30º dias, em intervalos de 24 h. As injeções de ISO nos ratos causaram disfunção cardíaca evidenciada pela diminuição dos índices de pressão arterial, frequência cardíaca, contratilidade e relaxamento, juntamente com aumento da pré-carga. O ISO também causou uma diminuição significativa nos antioxidantes endógenos, superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, depleção das enzimas dos cardiomiócitos, creatina quinase-MB, lactato desidrogenase e aumento da peroxidação lipídica. Todas essas alterações na função cardíaca e ventricular esquerda, bem como nos antioxidantes endógenos, peroxidação lipídica e enzimas miocárdicas, foram melhoradas quando os ratos foram pré-tratados com cardamomo. Adicionalmente, os efeitos protetores foram fortalecidos pela melhora na histopatologia e nas alterações ultraestruturais, o que especifica a preservação dos cardiomiócitos dos efeitos deletérios do ISO. Os resultados do presente estudo demonstram que o cardamomo protege significativamente o miocárdio e exerce efeitos cardioprotetores por meio da eliminação de radicais livres e atividades antioxidantes.

1. Introdução
   Infarto do miocárdio (IM) é caracterizado por um desequilíbrio entre a oferta e a demanda de sangue coronariano, que resulta em lesão isquêmica miocárdica e danifica os cardiomiócitos. Estudos pré-clínicos, bem como vários estudos clínicos, mostraram que durante a lesão isquêmica, o estresse oxidativo produzido pela geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) desempenha um papel fundamental no desenvolvimento do IM. A isquemia ultrapassa um nível grave em um período prolongado no IM e resulta em lesão ou morte permanente das células miocárdicas. O IM é a doença cardíaca isquêmica mais encontrada clinicamente e continua sendo a principal causa de morte e incapacidade em todo o mundo. Manifesta-se por alterações hemodinâmicas, bioquímicas e histopatológicas, acompanhadas de alterações nos índices de pressão arterial, frequência cardíaca, comprometimento ventricular e pré-carga, bem como diminuição de antioxidantes endógenos, escape de enzimas marcadoras de lesão cardíaca e peroxidação lipídica. Essas alterações são consequentes ao aumento exacerbado de EROs, como ânion superóxido e radicais hidroxila, em tecidos isquêmicos, resultando em dano oxidativo a lipídios de membrana, proteínas, carboidratos e DNA. Portanto, benefícios terapêuticos por meio de antioxidantes podem ser úteis para evitar o início e as consequências adicionais das doenças cardíacas isquêmicas. Numerosos antioxidantes sintéticos revelaram limitações ao apresentar propriedades pró-oxidantes, tóxicas e/ou mutagênicas, deslocando, assim, a atenção dos pesquisadores para os antioxidantes de origem natural.

Desde os tempos antigos, acredita-se que as especiarias e plantas medicinais indianas exibem atividade antioxidante e demonstraram desempenhar um papel importante no manejo de várias doenças em humanos, incluindo doenças cardiovasculares. Recentemente, uma atenção especial tem sido dada aos "antioxidantes de origem natural promotores de saúde", que são comumente usados com frequência em nossa dieta. Estes são incluídos regularmente em quantidades específicas para enfrentar as diversas alterações relacionadas a doenças, seguindo uma abordagem preventiva. Ervas e suplementos dietéticos têm sido defendidos como uma abordagem econômica e inofensiva para uso terapêutico, bem como para medidas preventivas. Além disso, essas intervenções dietéticas podem oferecer proteção substancial para enfrentar as doenças cardiovasculares relacionadas ao estilo de vida, que estão em alta.
Dentre várias especiarias populares, o cardamomo (Elettaria cardamomum Maton), comumente conhecido como “Chhotielaichi” e designado como a “Rainha das Especiarias”, é uma especiaria aromática distinta, frequentemente utilizada nas culinárias oriental, árabe, escandinava e até ocidental por seu aroma característico. Ele ocupa uma posição de destaque nos alimentos e mantém enorme importância comercial por estar presente nos hábitos alimentares de milhões de pessoas no mundo todo. Os principais componentes do cardamomo consistem em óleo, cujos constituintes principais são 1,8-cineol (representando 50% ou mais), com quantidades vestigiais de α-terpineol, citronelol, α-felandreno, sabineno, mirceno-borneol, cânfora, γ-terpineno, p-cimeno, terpinoleno, linalol e α e β-pineno.

Em diversos estudos experimentais, o cardamomo demonstrou apresentar propriedades anticancerígenas, gastroprotetoras, anti-hipertensivas, anti-inflamatórias e imunomoduladoras. Vários estudos mostraram que o cardamomo é um potente bloqueador da formação de peróxidos lipídicos e um sequestrador de ânions superóxido e radicais hidroxila. O estresse oxidativo gerado pelos radicais livres desempenha um papel crítico na patogênese do IM, e o cardamomo é relatado como exercendo potente atividade antioxidante e de sequestro de radicais livres. Além das atividades antioxidantes, também são relatadas propriedades hipotensoras, fibrinolíticas, vasorrelaxantes e antiplaquetárias, que podem contribuir substancialmente para suas ações cardioprotetoras.

Portanto, a presente investigação teve como objetivo avaliar o potencial do cardamomo como agente cardioprotetor em modelo animal de IM induzido por isoproterenol (ISO), que representa um importante modelo animal para a avaliação experimental de agentes cardioprotetores. O ISO é uma catecolamina sintética e agonista β-adrenérgico que causa alterações bioquímicas, funcionais e estruturais graves no coração e recapitula o IM humano. O presente estudo também elucida o mecanismo de sua eficácia terapêutica, corroborando as alterações hemodinâmicas e bioquímicas com estudos ultraestruturais e histopatológicos.

2. Resultados

2.1. Efeito Per Se do Cardamomo

Apenas o cardamomo (100 e 200 mg/kg) administrado por um período de 30 dias aos ratos do grupo controle normal não produziu alterações significativas nos parâmetros hemodinâmicos, bioquímicos e histopatológicos em comparação ao grupo controle normal.

2.2. Efeito do Tratamento com Cardamomo nos Parâmetros Hemodinâmicos

As injeções de ISO induziram uma diminuição significativa na frequência cardíaca e na pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e pressão arterial média (PAM) em comparação ao grupo controle normal (Tabela 1). No entanto, o tratamento com cardamomo (100 e 200 mg/kg) preveniu significativamente (p < 0,05) o declínio induzido por ISO nos índices de pressão arterial, PAS, PAD e PAM. Da mesma forma, a redução na FC também foi atenuada pelo tratamento com cardamomo em comparação aos ratos controle ISO. Embora o cardamomo na dose de 100 mg não tenha mostrado aumento significativo na PAS em comparação aos ratos controle ISO.
Efeito do cardamomo sobre parâmetros hemodinâmicos no infarto do miocárdio induzido por isoproterenol em ratos.

Tratamentos SAP (mm de Hg) DAP (mm de Hg) MAP (mm de Hg) FC (batimentos/min) Normal 146 ± 21 138 ± 20 141 ± 23 390 ± 42 ISO 91 ± 18 a 76 ± 18 a 81 ± 19 a 234 ± 28 a C (100) 150 ± 25 136 ± 24 142 ± 26 402 ± 37 C (200) 153 ± 22 141 ± 28 144 ± 24 396 ± 40 C (100) + ISO 100 ± 14 119 ± 15 b 125 ± 18 b 344 ± 52 b C (200) + ISO 102 ± 15 126 ± 24 b 135 ± 22 b 356 ± 46 b
Os dados são expressos como média ± DP e analisados por meio de análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Dennett. a
p < 0,05, quando comparado ao controle normal; b
p < 0,05, quando comparado ao controle ISO.
2.3. Efeito do Tratamento com Cardamomo sobre a Função Ventricular Esquerda
Os ratos do controle ISO apresentaram declínio significativo na contratilidade (+LVdP/dtmax; Figura 1A) e (−LVdP/dtmax; Figura 1B) em comparação ao grupo controle normal. Embora o tratamento apenas com cardamomo na dose de 200 mg/kg tenha prevenido significativamente (−p < 0,05) o (+) LVdP/dtmax em comparação ao grupo controle doente induzido por ISO. O tratamento com cardamomo em ambas as doses (100 e 200 mg/kg) melhorou significativamente (−p < 0,05) o (+) LVdP/dtmax. Por outro lado, o cardamomo na dose de 200 mg/kg melhorou significativamente (−p < 0,05) o declínio no (−) LVdP/dtmax em comparação ao grupo controle ISO, mas a dose de 100 mg/kg não conseguiu melhorar significativamente o (−) LVdP/dtmax. Após a deficiência contrátil ventricular esquerda, nos animais do controle ISO, um aumento significativo (−p < 0,05) na pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (LVEDP), que representa a pré-carga, também foi observado em comparação ao grupo controle normal (Figura 1C). O tratamento com cardamomo (100 e 200 mg/kg) atenuou significativamente (−p < 0,05) o LVEDP elevado em comparação ao grupo controle ISO.
Efeito do cardamomo sobre a pressão diastólica final do ventrículo esquerdo no infarto do miocárdio induzido por isoproterenol em ratos: (A) (+) LVdP/dtmax; (B) (−) LVdP/dtmax; e (C) LVEDP. Os dados são expressos como média ± DP e analisados por meio de análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Dunnett. ** p < 0,01 e *** p < 0,001, quando comparado ao controle normal (n = 6–8), ###
p < 0,001, quando comparado ao controle ISO (n = 6–8).
2.4. Efeito do Tratamento com Cardamomo sobre os Marcadores de Lesão Miocárdica
A administração de ISO produziu uma diminuição significativa (p < 0,05) nas enzimas indicadoras de lesão miocitária, creatina quinase fração miocárdica (CK-MB) e lactato desidrogenase (LDH) no coração em comparação ao grupo controle normal (Tabela 2). No entanto, o tratamento com cardamomo (100 e 200 mg/kg) preveniu significativamente (p < 0,05) a depleção das enzimas miocárdicas.
Tratamentos CK-MB (UI/mg de Proteína) LDH (UI/mg de Proteína) Normal 176,32 ± 16,25 242,50 ± 18,21 ISO 76,50 ± 8,32 a 134,26 ± 12,92 a C (100) 181,22 ± 14,86 241,62 ± 14,48 C (200) 179,53 ± 15,16 251,84 ± 17,33 C (100) + ISO 150,25 ± 13,72 b 196,67 ± 20,12 b C (200) + ISO 163,00 ± 12,55 b 229,11 ± 16,76 b
Os dados são expressos como média ± DP e analisados por análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste post hoc. a
p < 0,05, quando comparado ao controle normal (n = 6–8); b
p < 0,05, quando comparado ao controle ISO (n = 6–8).
2.5. Efeito do Tratamento com Cardamomo na Glutationa Reduzida e na Peroxidação Lipídica
Uma queda significativa (p < 0,05) no conteúdo de glutationa reduzida (GSH) e indução de peroxidação lipídica, evidenciada pelo aumento do nível de malondialdeído (MDA) no coração dos animais do grupo controle ISO, foi observada em comparação ao grupo controle normal. O tratamento com cardamomo (100 e 200 mg/kg) preveniu significativamente a depleção de GSH do coração e inibiu a peroxidação lipídica (conteúdo de MDA), conforme evidenciado pela restauração do conteúdo de GSH e redução da formação de MDA no coração dos animais quando comparado ao grupo controle ISO (Tabela 3).
Efeito do cardamomo na glutationa e na peroxidação lipídica no infarto do miocárdio induzido por isoproterenol em ratos.
Tratamentos GSH (µmol/g de Tecido) MDA (nmol/g de Tecido) Normal 2,42 ± 0,68 90,85 ± 10,25 ISO 1,16 ± 0,32 a 312,36 ± 11,48 a C (100) 2,49 ± 0,61 76,45 ± 13,32 C (200) 2,71 ± 0,70 78,46 ± 11,68 C (100) + ISO 1,98 ± 0,27 b 123,46 ± 14,23 b C (200) + ISO 2,10 ± 0,75 b 93,88 ± 15,74 b
Os valores representam a média ± DP de 6–8 ratos e foram avaliados por análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Dunnette. a
p < 0,05, quando comparado ao controle normal; b
p < 0,05, quando comparado ao controle ISO.
Efeito do cardamomo nas enzimas antioxidantes no infarto do miocárdio induzido por isoproterenol em ratos.
Tratamentos SOD (U/mg de Proteína) CAT (U/mg de Proteína) GSHPx (U/mg de Proteína) Normal 10,35 ± 2,02 24,28 ± 2,12 1,96 ± 0,21 ISO 5,80 ± 1,44 a 16,76 ± 1,66 a 0,64 ± 0,13 a C (100) 11,20 ± 1,65 23,83 ± 3,24 1,79 ± 0,30 C (200) 10,98 ± 1,78 25,74 ± 2,95 1,88 ± 0,20 C (100) + ISO 8,48 ± 2,43 b 20,64 ± 3,12 b 1,35 ± 0,37 b C (200) + ISO 9,56 ± 2,68 b 22,78 ± 2,43 b 1,86 ± 0,28 b
Os valores representam a média ± DP de 6–8 ratos e foram avaliados por análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Dennett. a
p < 0,05, quando comparado ao controle normal; b
p < 0,05, quando comparado ao controle ISO.
No grupo controle ISO, a administração de injeções de ISO reduziu significativamente (p < 0,05) as atividades das enzimas antioxidantes endógenas: superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSHPx) no coração em comparação ao grupo controle normal (Tabela 4). No entanto, o tratamento com cardamomo (100 e 200 mg/kg) preveniu significativamente a redução nas atividades das enzimas antioxidantes SOD, CAT e GSHPx (p < 0,05) em comparação ao grupo controle ISO.
2.7. Efeito do Tratamento com Cardamomo nas Alterações à Microscopia de Luz (Histopatologia) do Miocárdio
O exame histopatológico foi pontuado e classificado com base na gravidade das alterações, apresentado na Tabela 5. O coração do grupo controle normal apresentou uma histoarquitetura intacta e homogênea, sem necrose, edema e inflamação (Figura 2A). O coração dos ratos que receberam ISO apresentou necrose confluente pivotal das fibras musculares com infiltração celular, edema, aumento do tecido conjuntivo entre as fibras miocárdicas e miofagocitose, juntamente com extravasamento de hemácias (Figura 2B), enquanto os ratos tratados com cardamomo 100 (Figura 2C) e 200 mg/kg (Figura 2D) seguido pela administração de ISO mostraram proteção contra lesão miocárdica, evidenciada por diminuição da mionecrose, bem como edema e extravasamento de hemácias com inflamação mínima. A proteção observada com cardamomo na dose de 200 mg/kg pareceu exercer uma proteção notável contra a necrose miocárdica induzida por ISO.
Efeito do cardamomo na histopatologia no infarto do miocárdio induzido por isoproterenol em ratos. Micrografia de luz do miocárdio (Aumento 100×): (A) grupo normal que recebeu soro fisiológico mostrando arquitetura normal do miocárdio; (B) grupo controle doente que recebeu duas injeções subcutâneas de ISO mostrando necrose das miofibrilas e edema através da penetração de células inflamatórias e extravasamento de hemácias; (C) grupo tratado com cardamomo 100 mg/kg mostrando menor necrose miocárdica e edema após administração de ISO; e (D) grupo tratado com cardamomo 200 mg/kg mostrando necrose miocárdica cônica e edema após administração de ISO.
Efeito do cardamomo nas alterações histopatológicas no infarto do miocárdio induzido por isoproterenol em ratos.
Tratamentos Mionecrose Inflamação Edema Normal − − − ISO +++ +++ +++ C (100) − − − C (200) − − − C (100) + ISO ++ ++ + C (200) + ISO + + −
(+) Leve, (++) Moderado, (+++) Grave; (−) nulo.
2.8. Alterações Ultraestruturais por Microscopia Eletrônica
O coração do grupo controle normal apresentou uma ultraestrutura intacta e homogênea, sem necrose, edema e inflamação (Figura 3A), enquanto o coração dos ratos que receberam ISO apresentou necrose confluente das fibras musculares com edema (Figura 3B). Ratos tratados com cardamomo 100 (Figura 3C) e 200 mg/kg (Figura 3D) seguido pela administração de ISO exibiram proteção contra dano miocárdico, evidenciada por diminuição da mionecrose, edema com aparência mínima de inflamação.
Efeito do cardamomo nas alterações ultraestruturais na necrose miocárdica induzida por ISO (Magnificação 5600×): (A) arquitetura normal em ratos tratados com veículo; (B) rato induzido por ISO mostra necrose miocárdica; e (C) cardamomo (100 mg/kg) e (D) cardamomo (200 mg/kg) mostram arquitetura quase normal do coração.
3. Discussão
A presente investigação revela que o cardamomo exerce cardioproteção contra o IM induzido por ISO ao melhorar a disfunção hemodinâmica e dos ventrículos esquerdos, inibir a peroxidação lipídica e aproveitar o sistema de defesa antioxidante endógeno, juntamente com a preservação histológica e ultraestrutural dos cardiomiócitos, refletida pela redução do extravasamento de enzimas marcadoras de lesão dos miócitos.
O IM induzido por ISO é um modelo animal in vivo extensivamente empregado para a avaliação experimental de agentes cardioprotetores, pois é clinicamente pertinente ao recapitular as características do IM humano. A administração de injeções subcutâneas de ISO causa desequilíbrio entre a oferta e a demanda de oxigênio pelos cardiomiócitos, aumentando o cronotropismo e o inotropismo importantes para a função miocárdica evidente e o aumento da sobrecarga de cálcio no miocárdio. Além disso, os metabólitos e a auto-oxidação do ISO também estão envolvidos na patogênese da isquemia miocárdica, gerando radicais livres. Após a administração de ISO, uma queda acentuada nas atividades dos sistemas antioxidantes endógenos do coração leva à perda gradual do equilíbrio pró-oxidante/antioxidante, que se acumula nos cardiomiócitos e se manifesta como dano oxidativo. Os sistemas enzimáticos antioxidantes endógenos, compostos por SOD, CAT e GSHPx, são a primeira linha de defesa celular contra o estresse oxidativo e combatem a formação de várias EROs, incluindo ânions superóxido e radical hidroxila. A redução drástica nas atividades da SOD e da CAT após a administração de ISO indica a irresistibilidade dos radicais livres, que causam dano oxidativo às células miocárdicas.
Além disso, também observamos uma diminuição significativa nas atividades da enzima GSHPx e do GSH em animais tratados com ISO, enquanto o tratamento com cardamomo melhorou as ações da SOD e da CAT e inibiu o consumo de GSH, juntamente com a restauração da atividade da GSHPx, o que aponta para o potencial antioxidante e de eliminação de radicais livres do cardamomo. Em estudos anteriores, o cardamomo foi descrito como um dos antioxidantes e eliminadores de radicais livres eficazes por sustentar os antioxidantes enzimáticos, a primeira linha de defesa. O presente estudo demonstrou a atividade antioxidante do cardamomo e endossa seu efeito cardioprotetor mediado por seu efeito antioxidante no miocárdio. O ISO danifica os mecanismos protetores antioxidantes e torna o miocárdio mais vulnerável à peroxidação lipídica, evidenciada pelo aumento nos níveis de malondialdeído, devido à degradação oxidativa dos ácidos graxos na membrana miocárdica. O aumento da formação do produto de degradação da peroxidação lipídica, o MDA, é uma indicação da gravidade da lesão celular ao coração induzida pelo ISO, e isso pode estar relacionado com alterações na estrutura da membrana e inativação enzimática. Em nosso estudo, o nível diminuído de MDA com aumento simultâneo de GSH após o tratamento com cardamomo pode ser razoavelmente especulado como resultado de ações aumentadas da defesa antioxidante no miocárdio.
O cardamomo demonstrou estar envolvido na eliminação de EROs e conferir defesa contra a peroxidação lipídica, de acordo com observações anteriores que demonstraram mecanismo antioxidante contra os danos oxidativos induzidos por radicais livres em órgãos do corpo. Relatos anteriores mostraram que a atividade antioxidante de diversos extratos protege contra infarto do miocárdio (IM), por exemplo, Punica granatum L. e Scilla hyacinthine em ratos. No miocárdio, o aumento excessivo do conteúdo de MDA tem sido associado a lesão estrutural, que eventualmente resulta em hemodinâmica perturbada e disfunção contrátil. Foi demonstrado que o ISO causa alterações hemodinâmicas, evidenciadas por uma diminuição acentuada nas pressões arteriais sistólica, diastólica e média, bem como na frequência cardíaca. Após a alteração dos parâmetros hemodinâmicos, o ISO também induziu disfunção ventricular significativa, representada por dinâmica ventricular reduzida; ±LVdP/dtmax e LVEDP no grupo controle ISO. No entanto, o tratamento com cardamomo atenuou significativamente as alterações hemodinâmicas induzidas pelo ISO, corrigindo os índices de pressão arterial. O tratamento com cardamomo também melhorou a função contrátil dos ventrículos esquerdos, conforme corroborado pela melhora dos estados inotrópico ((+) LVdP/dtmax, marcador de contração do coração) e lusitrópico ((−) LVdP/dtmax, marcador de relaxamento do coração) do coração. Além disso, o cardamomo também atenuou o aumento da LVEDP, um sinal alternativo de pré-carga que, aparentemente, representa melhora da função contrátil do ventrículo esquerdo. A melhora da hemodinâmica e da função contrátil dos ventrículos esquerdos pelo tratamento com cardamomo indica claramente seu efeito favorável sobre a função hemodinâmica e contrátil do coração durante a agressão isquêmica causada pelo ISO.
Além de prejudicar a hemodinâmica e a função ventricular, a administração de ISO também aumenta o escape das enzimas miocárdicas; CK-MB e LDH do coração servem como sinal de lesão miocárdica. Essas enzimas cardios específicas estão presentes no miocárdio e são liberadas no sangue após lesão dos miócitos e ruptura dos compartimentos subcelulares e celulares. No entanto, ratos tratados com cardamomo mostraram uma restauração significativa das enzimas CK-MB e LDH, indicando que o cardamomo preservou a membrana dos miócitos e tornou os cardiomiócitos menos vazados, atribuído à estabilização das membranas dos miócitos como consequência da inibição da peroxidação lipídica e da ruptura da membrana. Além disso, o exame histopatológico do tecido miocárdico em animais controle normais revelou uma membrana celular intacta e unida, sem sinais de edema, inflamação e infiltração de células inflamatórias. Enquanto o exame histológico do miocárdio de ratos injetados com ISO revelou mionecrose coagulativa, edema e infiltração de células inflamatórias. Por outro lado, ratos tratados com cardamomo exibiram mionecrose condensada, edema e redução da permeação de células inflamatórias. Integrando a recuperação histológica com a recuperação bioquímica e hemodinâmica, o cardamomo parece não ser tóxico para os cardiomiócitos, provavelmente pela restauração da defesa antioxidante endógena contra o ISO.

Da mesma forma, estudos de microscopia eletrônica também estabeleceram que o tratamento com cardamomo induziu proteção contra a necrose miocárdica induzida por ISO, evidenciada pela ultraestrutura regular na maioria das áreas da membrana miocárdica em comparação com animais controle doentes induzidos por ISO. A melhora ultraestrutural dos cardiomiócitos corroborou ainda mais a ação cardioprotetora da administração oral de cardamomo na necrose miocárdica induzida por ISO que mimetiza o IAM. Os fitoconstituintes, esteróis, ácidos fenólicos, flavonoides e flavanóis presentes no cardamomo foram descritos como potenciais cardioprotetores contra danos oxidativos evidentes. Assim, nossos resultados especificam que o cardamomo tem a capacidade e o potencial de proteger contra a disfunção cardíaca mediada pelo estresse oxidativo em IAM experimental induzido por ISO em ratos. O resultado do presente estudo pode ter valor terapêutico futuro, particularmente para pacientes vulneráveis ao desenvolvimento de doença cardíaca isquêmica.

4. Experimental
   4.1. Substâncias Químicas
   Todos os reagentes químicos e substâncias bioquímicas utilizados no estudo foram de grau analítico e de altíssima pureza. Os padrões de enzimas e o isoproterenol utilizados neste estudo foram adquiridos da Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA.
   4.2. Extrato Vegetal e Composição
   Os frutos foram obtidos no mercado local, Khari Baoali, Nova Delhi e autenticados por um botânico. O espécime comprovante (EC-MI-2009) foi depositado no Laboratório Cardiovascular, Departamento de Farmacologia, Instituto de Ciências Médicas da Índia, Nova Delhi.
   As frutas secas autenticadas foram moídas até formar um pó fino. Diferentes valores extrativos do pó de fruta foram determinados separadamente por maceração do fármaco por 48 h em temperatura ambiente com agitação ocasional em soluções aquosa, n-hexano, tolueno, benzeno, clorofórmio, acetato de etila, metanol e hidroalcoólica, ou seja, mistura de metanol e água na proporção de 70:30, e submetidos à análise por cromatografia em camada delgada (CCD) em vários solventes. As placas foram observadas sob luz ultravioleta. O extrato seco ao ar foi esterilizado utilizando água destilada. A solução foi ainda filtrada usando pano de musselina e centrifugada a 5000 rpm por 15 min. O sobrenadante assim obtido foi filtrado através de papel de filtro Whatmann nº 1 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em condições assépticas e o filtrado foi coletado em um tubo de ensaio estéril pré-pesado. Os extratos aquosos foram preparados na concentração final de 200 mg/mL. O extrato aquoso foi selecionado para o estudo por conter o valor extrativo máximo, extraindo o maior número de compostos bioativos. O extrato foi ainda submetido à triagem fitoquímica para detectar diferentes metabólitos secundários seguindo protocolos padrão. Os testes revelam a presença de esteroides, flavonoides, fenólicos, aminoácidos e alcaloides.
   4.3. Animais Experimentais
   Ratos Wistar (machos, 200–225 g) foram utilizados no presente estudo experimental. Os animais foram obtidos do Central Animal House Facility do All India Institute of Medical Sciences, Nova Deli, Índia. Eles foram mantidos em condições laboratoriais padrão sob ciclos naturais de luz e escuro, umidade (60% ± 10%) e temperatura ambiente constante (25 ± 5 °C). Os animais foram alimentados com dieta peletizada (Gulmohar Feed, Deli, Índia) e água da torneira ad libitum. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal Institucional do All India Institute of Medical Sciences, Nova Deli, Índia e está em conformidade com o Comitê para o Propósito de Controle e Supervisão de Experimentos em Animais (IAEC, nº 2007).
   Indução de Infarto do Miocárdio Experimental
   Isoproterenol foi preparado recentemente e injetado (85 mg/kg) por via subcutânea em dois dias consecutivos. Os animais foram sacrificados após a última injeção, ou seja, 48 h após a primeira injeção de isoproterenol.
   4.4. Desenho Experimental
   Os animais foram divididos aleatoriamente em seis grupos (n = 12).
   4.4.1. Grupo 1 (Tratado com Veículo/Normal)
   Os ratos foram tratados com o veículo por via oral por 30 dias e tratados com solução salina s.c. no 28º e 29º dia.
   4.4.2. Grupo II (ISO/Controle Doente)
   Os ratos foram tratados com o veículo por via oral por 30 dias e desafiados com ISO (85 mg/kg s.c.) no 28º e 29º dia.
   4.4.3. Grupos III–IV (Cardamomo 100 ou 200 mg/kg apenas)
   Os ratos foram tratados com cardamomo por via oral por 30 dias e desafiados com solução salina s.c. no 28º e 29º dia.
   4.4.4. Grupos V–VI (Cardamomo 100 ou 200 mg/kg + ISO)
   Os ratos foram tratados com cardamomo por via oral por 30 dias e desafiados com ISO (85 mg/kg s.c.) no 28º e 29º dia.
   Ratos foram tratados com cardamomo (doses respectivas) por via oral por 30 dias e desafiados com ISO (85 mg/kg s.c.) no 28º e 29º dia.

4.5. Avaliação da Função Hemodinâmica e Ventricular Esquerda

Resumidamente, os ratos foram anestesiados com injeção intraperitoneal contendo pentobarbitona sódica (60 mg/kg) e atropina (0,1 mg/kg) para diminuir as secreções broncotraqueais e manter a frequência cardíaca, particularmente durante o período de cirurgia em todos os grupos experimentais. A cirurgia para medição dos parâmetros hemodinâmicos foi realizada conforme o método de Ojha et al. (2008).

4.6. Avaliação dos Parâmetros Bioquímicos no Coração

Processamento do Tecido Cardíaco

Para todas as estimativas bioquímicas no coração, um homogeneizado do tecido miocárdico foi preparado em solução salina tamponada com fosfato (10%). A alíquota do homogeneizado resfriado foi usada para estimar o conteúdo de MDA e GSH. O homogeneizado foi centrifugado e o sobrenadante obtido foi utilizado para a estimativa de Catalase e SOD, Proteína total, e as enzimas marcadoras de lesão de miócitos, CK-MB e LDH.

4.7. Avaliação dos Estudos Histopatológicos

Os tecidos cardíacos foram fixados em formalina tamponada (10%) e cortados em quatro segmentos e embebidos em parafina. Das seções embebidas em parafina fixadas em formalina, cortes seriados finos de 4 μm de espessura foram cortados e corados. Após a coloração com hematoxilina e eosina (H & E), essas seções foram examinadas usando microscópio de luz (Nikon, Tóquio, Japão). As lâminas foram avaliadas quanto à necrose miocárdica, infiltração de células inflamatórias e edema. Um mínimo de 10 campos por lâmina foi examinado e pontuado em uma escala de grave (+++), moderado (++), leve (+) e ausente (−).

4.8. Estudos Ultraestruturais por Microscopia Eletrônica

Os tecidos cardíacos foram lavados em tampão fosfato (0,1 M, pH = 7,4, 6 °C) e fixados por 2 h em tetróxido de ósmio a 1% em tampão fosfato a 4 °C. O procedimento restante foi seguido conforme Ojha et al. (2008).

4.9. Análise Estatística

Os dados foram expressos como média ± desvio padrão (DP) e analisados usando análise de variância de uma via (ANOVA) seguida pelo teste post hoc de Dunnette ou Bonferroni. O valor de p menor que 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

5. Conclusões

O presente estudo demonstra que o cardamomo tem potencial para proteger contra o IM restaurando antioxidantes endógenos, preservando a histopatologia e a ultraestrutura do miocárdio, e melhorando a função cardíaca. Os achados deste estudo sugerem o cardamomo como um adjuvante na profilaxia do IM ou como um mediador benéfico no retardo do início, progressão e desenvolvimento do IM, em pacientes que estão em risco de desenvolver doença cardíaca isquêmica. No entanto, para uso em humanos, mais estudos são necessários.

Contribuições dos Autores
Concebeu e desenhou os experimentos: Sameer N. Goyal, Dharamvir Singh Arya e Shreesh Ojha.
Realizou os experimentos: Sameer N. Goyal e Charu Sharma.
Analisou os dados: Sameer N. Goyal, Charu Sharma, Umesh B. Mahajan, Chandragouda R. Patil, Yogeeta O. Agrawal, Dharamvir Singh Arya e Shreesh Ojha.
Contribuiu com reagentes, materiais e ferramentas de análise: Dharamvir Singh Arya.
Escreveu o primeiro rascunho: Sameer N. Goyal e Santosh Kumari.
Auxiliou na revisão do artigo: Sameer N. Goyal, Charu Sharma, Yogeeta O. Agrawal e Shreesh Ojha.
Analisou os dados, coletou referências e elaborou o manuscrito: Sameer N. Goyal, Charu Sharma, Umesh B. Mahajan, Yogeeta O. Agrawal e Shreesh Ojha.
Conflitos de Interesse
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Referências
Novas observações sobre inchaço miocárdico pós-isquemia/reperfusão
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